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三七叶甙质量标准的研究

    【摘要】  目的  对三七叶甙质量标准进行研究,采用HPLC法测定三七叶甙中Rb1、Rc和Rb3的含量。方法  采用ODS色谱柱(150mm×4.0mm,5μm),乙腈-水为流动相,检测波长为205nm,按外标法定量。结果  人参皂甙Rb1、Rc和Rb3在0.85~5.1μg范围内呈现良好线性关系(r分别为:0.9988,0.9991,0.9997),平均加样回收率分别为:99.21%,97.32%,98.25%,RSD分别为2.1%,1.9%,2.9%,n=5。结论  本方法准确,可靠,适宜该制剂的质量控制。

    【关键词】  质量标准;HPLC法;三七叶甙;人参皂甙Rb1;人参皂甙Rb3;人参皂甙Rc

    【Abstract】  Objective  This paper reports a simultaneous determination method of ginsenoside Rb1、Rc and Rb3 in sanqi leave using HPLC.Methods  The ODS column (5μm,150mm×4.0mm) was used.The mobile phase consisted of acetonitrile water,The UV detector wavelength was 205nm.Results  The calibration curve of ginsenoside Rb1、Rc and Rb3 were  linear (r :0.9988,0.9991,0.9997 ) within the range of 0.85~5.1μg for puerarin ,the average recovery of ginsenoside Rb1、Rc and Rb3 were  99.21%(RSD 2.1% n=5)),97.32%(RSD 1.9% n=5),98.25%(RSD 2.9% n=5) .Conclusion  The method is accurate and reliable,suitable for the quality control of the drug.

    【Key words】  qualification;ginsenoside Rb1;ginsenoside rb3;ginsenoside Rc;HPLC

    三七为五加科(araliacease)人参属植物。对三七中化学成分的研究始于20世纪30年代初期,70年代,发现三七中含有一些与人参相似的化学成分,而引起了国内外植物药学界的重视。迄今为止,从三七[Panax notogineseng(Burk,)F.H.chen]的不同生长部位中分离到20种单体皂甙成分[1],三七的地下部分和地上部分的皂甙不尽相同,含量各异。据报道[2],在三七叶中以人参皂甙Rb3和Rc含量最高,是三七叶甙抗衰老作用的有效成分之一。目前,对三七叶甙的分析方法采用碘量法[3],该方法主要是根据皂甙中的羟基进行定量,所以不能保证测定结果的准确性。为完善其质量标准,保证药品质量,本文对该制剂进行了质量标准研究,采用HPLC法对三七叶甙中的人参皂甙Rb1、Rc和Rb3的含量进行检测。该方法快速、准确,可作为该制剂的质量控制。现将结果报道如下。

    1  仪器及试药

    1.1  仪器  Agilent 1100高效液相色谱仪:具有可变波长紫外检测器和色谱工作站。

    1.2  试药  乙腈为色谱纯;水为乐百士纯净水;人参皂甙Rb1、Rc和Rb3对照品,含量分别为99.2%,98.21%,96.73%(归一化法测定)由云南省天然药物研究中心提供;三七叶甙由云南文山特安呐制药有限公司提供,批号为:20010904。

    2  溶液制备

    2.1  对照品溶液的制备  精密称取对照品人参皂甙Rb1、Rc和Rb3各适量,加水配置成Rb1、Rc、Rb3均为0.17mg/ml的混合溶液,作为对照品溶液。

    2.2  供试品溶液的制备  精密称取三七叶甙0.2g(精确到0.0002g),置于10ml容量瓶中,加入适量水,超声10min,冷却至室温,再用水定容至刻度,摇匀,即得供试品溶液。

    3  色谱条件及系统适应性试验

    色谱柱为 Extend ODS柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相为乙腈-水(梯度洗脱:29:71   10min    40:60);流速为1.0ml/min,柱温为22℃,检测波长为205nm;进样量为20μl。按上述色谱条件分别对对照品溶液和供试品溶液进行分析,色谱图见图1,分离效果较好。

    图1  对照品(A)和供试品(B)的色谱图

    4  线性关系考察

    精密吸取上述对照品溶液5,10,15,20,25,30μl,在上述色谱条件下进样,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标作标准曲线。人参皂甙Rb1、Rc和Rb3的回归方程(n=6)分别为:
y=217.38x+34.789  r=0.9988
y=87.116x+25.201  r=0.9991
y=134.83x+21.033  r=0.9997
表明人参皂甙Rb1、Rc和Rb3在进样量为0.85~5.1μg之间线性关系良好。

    5  方法精密度试验

    取上述对照品溶液重复进样6次,测得人参皂甙Rb1、Rc和Rb3峰面积的RSD分别为0.52%,0.23%,0.16%。

    6  方法重复性试验

    取三七叶甙样品(批号为:20010901)共5份,按2.2项制备溶液,测得人参皂甙Rb1、Rc和Rb3的含量RSD分别为4.1%,2.8%,2.2%。

    7  回收率试验

    取已测知含量的三七叶甙样品(批号为20010904)0.0502,0.1023,0.1522,0.2033,0.2563g供试品5份,分别加入等量的对照品人参皂甙Rb1 0.55mg,Rc 0.15mg和Rb3 0.09mg,按2.2项制备溶液,测定,结果平均回收率分别为99.21%,97.32%,98.25%,RSD分别为2.1%,1.9%,2.9%。

    8  样品含量的测定结果

    按上述方法对不同批号的三七叶甙样品进行了测定,结果见表1。

    表1  样品含量的测定

    Tab 1  Results of sample determination(略)

    9  讨论

    三七叶甙水溶性较好。本文对比了甲醇、乙醇和水作为溶剂的测定比较,结果发现采用用水直接溶解的方法,样品回收率高,杂质含量最低,提取最完全,并且简便快速,适宜生产过程中的质量控制。

    【参考文献】

    1  甘烦远,郑光植.三七化学成分研究概况.中国药学杂志,1992,27(3):138.

    2  陈德昌.中药化学对照品工作手册.北京:中国医药科技出版社,2000,36.

    3  地方标准.滇Q/WS  784-1985.

    (编辑:石  岚)

    作者单位: 1 661100 云南蒙自,红河学院化学系
    2 650106 云南昆明,云大科技股份有限公司
    3 650091 云南昆明,云南大学药学院

日期:2006年8月19日 - 来自[2006年第6卷第2期]栏目

人参皂甙Rg1和Rb1对脐血CD34+细胞凋亡的影响

 【摘要】 目的 探讨人参皂甙Rg1和Rb1对体外培养体系中撤除细胞因子引起的脐血CD34 + 细胞凋亡的干预作用。方法 免疫磁珠法纯化获得脐血CD34 + 细胞,在含有TPO(50μg/L)、SCF(50μg/L)的StemSpan TM SFEM无血清液体培养基中培养7天后,撤除细胞因子实验组加入不同浓度Rg1、Rb1,24h和72h后收集细胞,流式细胞仪FITC-Annexin-V/PI双色荧光标记检测细胞凋亡率,比色法检测Caspase-3活性。结果 撤除细胞因子24h后,撤因子组细胞凋亡率为(24.79±2.80)%,Rgl(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L)各组细胞凋亡率均降低,分别为(12.35±2.07)%、(11.87±1.20)%和(13.91±0.50)%(P<0.01);Rb1各组(5mg/L、10mg/L)的细胞凋亡率分别为(17.88±0.65)%、(20.61±0.85)%(P<0.01);撤除细胞因子24h和72h对照组,Caspase-3活性设为1.00,Rg1-2.5组(0.72±0.09,0.57±0.22,P<0.01),Rg1-5组(0.51±0.11,0.42±0.10,P<0.01),Rg1-10组(0.63±0.06,P<0.01;0.83±0.12,P>0.05),Rb1-5组(0.54±0.18,0.32±0.18,P<0.01)Rb1-10组(0.87±0.07,P>0.05;0.55±0.03,P<0.01),Caspase-3活性均低于对照组。结论 人参皂甙Rg1、Rb1能拮抗因撤除细胞因子诱导脐血CD34 + 细胞凋亡,此作用与Caspase-3信号通路有关。

关键词 细胞凋亡 脐血CD34 + 细胞 Caspase-3 人参皂甙

Effects of ginsenosides Rg1and Rb1 on the

apoptosis of CD34 + cells isolated from umbilical cordal blood

Guo Ruolin,Wan Xiaohua,Chen Xiaojian,et al.

 Tianjin Hospital,Tianjin300211.

【Abstract】 Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg1and Rb1during umbilical cordal blood hematopoietic cells apoptosis induced by growth factors withdrawal.Methods Human umbilical cordal blood CD34 + stem cells were purified and obtained steriley.CD34 + cells were cultured in StemSpan TM SFEM serum-free medium containing cytokines TPO(50μg/L)and SCF(50μg/L)for7days.Then cells were collected and maintained in the same medium with the growth factors deprivation for24h and72h.The experimental groups were respectively treated with Rg1or Rb1with different concentrations.FITC-Annmexin-V/PI flow cyloanalyzer and Caspase-3colorimetˉric assay were respectively used to determine cell apoptosis rate and the activity of Caspase-3.Results 24hours afˉter the cytokines withdrawal,the apoptosis rate in control cells was(24.79±2.80)%;the apoptosis rate in Rg1(2.5 mg/L,5mg/L,10mg/L)groups were(12.35±2.07)%,(11.87±1.20)%and(13.91±0.50)%(P<0.01);in Rb1groups(5mg/L,10mg/L)were(17.88±0.65)%,(20.61±0.85%)(P<0.01)respectively.24hours and72hours after cytokines deprivation,Caspase-3activities in control groups were taken as1.00,the values in Rg1-2.5group were0.72±0.09and0.57±0.22(P<0.01),in Rg1-5group were0.51±0.11and0.42±0.10(P<0.01),in Rg1-10group were0.63±0.06(P<0.01)and0.83±0.12(P>0.05);in Rb1-5group were0.54±0.18and0.32±0.18(P<0.01),in Rbl-10group were0.87±0.07(P>0.05),0.55±0.03(P<0.01).Conclusion These results demonstrated that apoptosis induced by growth factors withdrawal of umbilical cordal blood hematopoietic cells can be inhibited by Rg1and Rb1and this effect was involved with Caspase-3signal pathway.

Key words apoptosis umbilical cordal blood CD34 + cells caspase-3 ginsenosides

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序的一种主动性的死亡过程,它涉及细胞内一系列的信号转导和调控过程。在造血过程中,细胞凋亡在调控细胞增殖、分化的平衡中起重要作用。人参“补气养血”的功效虽然已经在临床上应用已久,但机理并未阐明。近年来对人参的主要成分人参皂甙的研究很多,多集中在促进 ˇ 基金项目:天津市科委自然科学基金资助项目(编号:013608511)造血祖细胞增殖,诱导髓性白血病细胞凋亡,增强机体免疫功能等方面。国内学者研究发现人参皂甙不但能促进造血干/祖细胞增殖,并且能诱导定向分化 [1] 。但人参皂甙Rg1和Rb1对造血干细胞凋亡的影响尚未见报道。本研究观察了人参皂甙Rg1和Rb1对撤除细胞因子引起的脐血造血细胞凋亡的拮抗作用,以期在细胞水平上为人参皂甙“补气养血”功效的作用机制提供更多的实验室证据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 脐血采自天津医科大学第二附属医院和天津市中心妇产科医院,无菌条件下采集正常足月分娩的胎儿脐带血,母亲和新生儿均应健康,肝素抗凝。采集后4h内用相对密度为1.077的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞(MNC),洗涤,计数备用。

1.2 CD34 + 细胞的分离及纯度分析 利用德国Miltenyi Biotec公司CD34 + 细胞单克隆抗体免疫磁珠分离系统(MACS)分离富集CD34 + 细胞备用。分离方法依试剂盒说明书进行。流式细胞仪检测CD34 + 细胞纯度:取纯化后细胞3×10 4 加入10μl FITC-CD34荧光抗体,阴性对照为FITC-IgG荧光抗体(BD公司产品),用FACScan(BDIS公司)流式细胞仪分析,结果用LysisⅡ软件处理。

1.3 CD34 + 细胞液体培养扩增 取24孔板,StemSpan TM SFEM无血清液体培养基建立1ml/孔培养体系,CD34 + 细胞5×10 4 个/孔,每孔加入细胞因子TPO50μg/L、SCF50μg/L,置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中,培养7天。收集细胞,PBS洗涤2遍后悬浮于MACS缓冲液中,台盼蓝染色计数细胞总数。

1.4 人参皂甙Rg1和Rb1撤除细胞因子引起脐血细胞凋亡的干预作用 24孔板中,取扩增7天后脐血细胞5×10 4 个/孔,1ml/孔,撤因子组不加任何细胞因子;人参皂甙干预组加入不同浓度的Rg1(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L),分别设为Rg1-2.5组,Rg1-5组,Rg1-10组;不用浓度的Rb1(5mg/L、10mg/L),分别设为Rb1-5组,Rb1-10组,混匀,撤因子组设6个复孔,其他每组设3个复孔。置于37℃、5%CO 2 、100%饱和湿度的CO 2 孵箱中,分别取培养24h和72h的适量细胞,以备用于细胞凋亡检测。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率 撤除细胞因子培养24h后,各取1×10 6 个细胞,PBS洗涤,并用1×Binding Buffer(试剂盒中提供)使浓度为1×10 6 个/ml;转移1×10 5 个细胞(100μl)到5ml流式专用管,另取等量3管细胞做对照管;实验管加入5μl FITC-Annexin-Ⅴ和5μl PI,3个对照管:(1)只加5μl FITC-Annexin-Ⅴ;(2)只加5μl PI;(3)两者都不加;混匀,25℃避光孵育15~30min;各管加入400μl1×Bindˉing Buffer,1h之内用流式细胞仪CellQuest软件分析,观察Annexin V + /PI - 早期凋亡细胞群,检测细胞凋亡率。

1.6 Caspase-3活性测定 撤除细胞因子培养24h、72h后,取1×10 5 个细胞,洗涤,加100μl细胞裂解液;冰浴10min,离心10000×g,1min,移上清入另一新管,取出20μl以测总蛋白值;其余上清移入96孔酶标,加入50μl细胞裂解液,50μl2×反应缓冲液工作液,5

日期:2005年9月22日 - 来自[2004年第2卷第4A期]栏目

人参皂苷Rb1对体外培养雪旺细胞作用的实验研究

   【摘要】 目的  研究人参皂苷Rb1对体外培养雪旺细胞增殖分化的影响,探讨其促进神经再生的作用和机制。 方法  选用8个月月龄的新西兰兔的坐骨神经体外培养第2代,加入不同浓度的人参皂苷Rb1,继续培养10天,相差显微镜观察计数,绘制各自的增殖曲线;在36h和72h对各组细胞进行流式细胞分析。 结果  活细胞计数含20μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.3天,明显优于对照组(P<0.01);用含20μg/ml人参皂苷Rb1培养36h、72h后雪旺细胞增殖的流式细胞仪分析,处于S期的雪旺细胞较对照组明显增高(P<0.01)。 结论  人参皂苷Rb1有促进体外培养雪旺细胞快速增殖分化的作用,从而为促进神经损伤的再生途径提供一些新的药物使用基础研究。
    
  【关键词】  人参皂苷Rb1;雪旺细胞;细胞增殖
      
  Effects of GinsenosideRb1on the cultured schwann cells in vitro
     
  YANG Lei,LIU Li-jun,XIAO Jian-de,et al.

  The Second People's Hospital,Shenzhen518035,China
   
  【Abstract】 Objective To study the effects of Ginsenoside Rb1on the proliferation and differentiation of Schwann's cells and discuss the mechanism of nerve regeneration induced by Ginsenoside Rb1.Methods The sciatic nerve of New zealand rabbit of8months old was cultured in vitro and the second generation was used.Ginsenoside Rb1with different concentrations were dropped into the culture medium for10days.Numbers of cells were counted by contrast microscope and proliferation curves were drawn individually.Furthermore,analysis of cells were made by flow cytome-ter.at36h and72h.Results Double proliferation time of Schwann's cells cultured in20μg/ml Ginsenoside Rb1was5.3d which superior to has was obvious difference from the control group(P<0.01).The numbers of Schwanns cell at synthesis phase were increased significantly which cultured in20μg/ml Ginsenoside Rb1(P<0.01).Conclusion Ginsenoside Rb1has the function of stimulating proliferation and idfferentiation of Schwann's cell in vitro,and suqqests the important role in nerve regeneration.
   
  【Key words】 Ginsenoside Rb1;schwann's cell;proliferation and differentiation of and suqqests
      
  雪旺细胞是周围神经再生和周围神经组织工程研究的重要细胞,不仅为神经修复提供支撑,尚可诱导神经纤维生长的方向。近年来发现 [1] 尚有胶质细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、霍乱毒素、血小板生长因子、转移生长因子以及cAMP类似物质等,均能刺激雪旺细胞生长,但是均有其局限性。应用中药治疗周围神经的损伤在临床上确有积极的疗效。为了解周围神经损伤后人参皂苷Rb1是否可以促使雪旺细胞增殖分化,从而促进周围神经损伤后的修复问题,我们设计了本实验研究。

  1 材料与方法
    
  1.1 药品与试剂 人参皂苷Rb1购自长春白求恩医科大学基础医学实验室。DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶(含1mmolEDTA-4Na)、胶原蛋白酶和新生小牛血清为美国Gibco公司产品,L-多聚赖氨酸(相对分子质量为15万~30万,Sigma公司);兔抗鼠S-100蛋白酶联免疫细胞化学试剂盒(北京中山生物公司)。
   
  1.2 雪旺细胞的体外培养 选用8个月月龄的新西兰兔1只,于静脉麻醉下在双侧坐骨神经中段用1-0号线结扎神经。术后7天在静脉麻醉下对结扎神经近、远端2.0cm的坐骨神经进行取材。取材后在解剖显微镜下仔细剥离神经外膜及其周围的粘连组织后,将神经剪成0.5mm 3 的小碎块后种植于培养皿中,加入适量培养液(80%的DMEM,20%的小牛血清),待雪旺细胞长满培养皿后进行纯化传代。先将组织块移出至新的预留有培养液的培养瓶内做再次移植,继之顺序应用低浓度酶快速消化法、差速贴壁分离法和抗有丝分裂法去除成纤维细胞、纯化雪旺细胞。具体方法如下 [2] :(1)将0.125%胰蛋白酶液加入培养瓶中,倒置相差显微镜下观察见SC收缩后,立即终止消化,轻轻吹打,收集脱落的细胞,接种于新的培养瓶内;(2)将培养瓶移入培养箱内1h,振摇后吸出悬液重新接种;(3)重新接种的细胞培养24h后,更换含阿糖胞苷10mol/L的培养液作用48h,再换用常规培养液继续培养、传代。
   
  1.3 雪旺细胞的增殖指数 将培养纯化后的雪旺细胞计数后按每孔10万个浓度接种在预先涂有多聚赖氨酸的24孔细胞培养板上。实验分成5组(每组12孔):A组为空白对照组,B组为含50ng/ml神经生长因子(nerve grwoth facotr,NGF)培养液组,C组为含10μg/ml人参皂苷Rb1组,D组为含20μg/ml人参皂苷Rb1组,E组为含100μg/ml人参皂苷Rb1组。每2天换培养液1次,共作用10天。在相差显微镜下行形态学观察,每2天在每个培养皿中随机选取3个视野进行雪旺细胞计数,并做好标记;以后计数时,每个视野的标记均位于指针的尖端。并用4%甲醛将细胞固定后行S-100免疫染色,并计数染色阳性的细胞。用上述两种方法来判定雪旺细胞增殖数量及其纯度。各组比较时,以增殖指数(proliferation index,PI=各次观察细胞数/初次观察细胞数)为指标,结果用两样本均数比较的t检验进行统计学分析。
   
  1.4 流式细胞仪检测 将培养纯化后的雪旺细胞按上述分成5组,培养48h后,吸出培养瓶中培养液,加入0.125%胰蛋白酶,加入量以能覆盖细胞为度,室温下作用2~3min。消化过程中,倒置显微镜下观察监视细胞状态,当见到细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,细胞相互间隙变大时,立即加入20%小牛血清雪旺细胞培养液终止消化。吸出消化液,加入适量培养液,用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱落形成细胞悬液,终止消化。吹打后将细胞悬液移入离心管中,离心(1000rpm,10min),用PBS洗涤并充分吹打成单细胞悬液,然后固定于预冷的75%乙醇30min,再次离心弃上清液,加入0.01%RNA酶,37℃水浴,振荡10min,离心(1000rpm,10min);弃上清液,加入0.5%PI,调整细胞浓度到5000左右,避光染色30min后上机检测(波长480nm)G0/G1期之前的亚二倍体峰。

  2 结果
    
  2.1 倒置显微镜观察 显示培养6天的雪旺细胞大量增殖,连接成片,胞体较小,梭形,两侧突起纤长,胞核明显呈卵圆形或长圆形,胞体四周常有亮边,大部分呈双极突起,少数呈三极突起,细胞易呈极性排列成栅栏状,部分细胞聚成堆。雪旺细胞免疫组化鉴定:雪旺细胞对抗S-100蛋白呈阳性反应,培养6天后的雪旺细胞纯净度达95%(见图1)。
   
  2.2 活细胞计数 对照组A组雪旺细胞的倍增时间为7.8天,B组含50ng/mlNGF培养液组的倍增时间为5.5天,C组含10μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为6.1天,D组含20μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.3天(8天时雪旺细胞生长情况见图2),E组含100μg/ml人参皂苷Rb1组的倍增时间为5.6天。各组雪旺细胞的增殖曲线见图3,细胞计数统计分析,两组间均数比较进行t检验。结果B、C、D、E组与A组比较,P<0.01。B组与D组比较,P>0.05。
   
  2.3 雪旺细胞增殖的流式细胞分析 测定结果B组、C组、D组、E组,在培养36h和12h后,处于S期的雪旺细胞较对照组A组有明显的提高(见表1),两者差异有非常显著性(P<0.01)。B组与C组、D组、E组比较,在培养36h和72h后,处于S期的雪旺细胞两者差异均无显著性(P>0.05)。

  表1 各组雪旺细胞增殖的流式细胞分析 (略)
    
  3 讨论
    
  雪旺细胞是周围神经的重要支持和营养细胞,是维持周围神经再生微环境的最基本因素,不仅为神经修复提供 支撑,还可以通过表达、分泌多种蛋白质肽类等生物活性物质,诱导、刺激和调控轴突的再生和髓鞘的形成 [3] 。因此,神经损伤后刺激雪旺细胞合理地分裂增殖可以达到加速周围神经再生的目的。实验证明,外源性NGF能有效防止损伤近端神经元胞体和近端神经纤维的变性,促进轴突的再生,缩短神经再生至靶器官的时间 [4] 。但以上研究多较侧重于单一促神经生长因子及其受体的研究,其疗效多不确定,且价格昂贵,难以在临床推广应用。
   
  人参(Panax gingseng C.A.Meyer)作为“大补元气,安神益智”的滋补珍品,已有2000多年的历史。人参皂苷Rb1是人参的主要有效成分,它们显示出的多方面的生物学活性均有利于使机体功能正常化和抗衰老 [5] 。人参在应用治疗神经系统疾病中,可以促智抗衰老,保护大脑皮层运动神经元,对周围神经系统也有类似神经营养因子样作用。
   
  通过实验表明,中药人参皂苷Rb1可以促进体外培养雪旺细胞的增殖,其中以20μg/ml作用最明显,细胞生长明显优于DMEM组,与NGF组相近,而且在作用持续时间上略优于NGF组。我们使用流式细胞仪对雪旺细胞增殖周期进行检测,流式细胞仪(FCM)是对细胞等生物粒子的理化及生物学特征(如大小、内部结构、DNA含量、细胞表面表达等)进行快速测量并分类收集的高技术。其特点是快速、灵活、大量、灵敏、可定量。大量的文献报道已证实,DNA细胞增殖周期的分析,对反映细胞群体的增殖活性具有重要意义。流式细胞仪在体外培养36h和72h时流式细胞分析S期的百分比与对照组相比,差异均有显著性(P<0.01)。测定结果显示药物浓度为20

日期:2005年8月8日 - 来自[论著]栏目

视网膜母细胞瘤病人体细胞中RB1基因突变的检测

  【摘要】 目的  检测视网膜母细胞瘤(RB)病人体细胞中RB1基因突变,探讨RB1基因突变的分子生物学机制。 方法  应用PCR-SSCP技术筛查RB病人白细胞基因组DNA,测序分析确定突变。 结果  在12例RB病人中,确定3例RB1基因生殖细胞性突变。他们分别是第10外显子中T至A杂合性突变,将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;第10外显子1bp碱基缺失(GAT→AT),发生阅读框架改变;第22外显子中A至T杂合性突变,将精氨酸序列变为终止密码。 结论  这3例RB1基因生殖细胞性突变的方式为点突变和小缺失,这些突变改变了RB1基因的遗传信息,致使异常的RB1基因蛋白产生,导致视网膜母细胞瘤的发生。
     
      
  Detection of heterozygous mutations of RB1gene in patients with retinoblastoma
     
  Sheng Xunlun,Wu Weimin,Zhuang Wenjuan,et al.
   
  Department of Ophthalmology,First People's Hospital of Qingdao Economic&Technical Development Zone,Qingdao266555.
   
  【Abstract】 Objective To study RB1heterozygous mutations in patients with retinoblastoma.Methods Genom-ic DNA was used as a template for the PCR reaction to amplify all exons of RB1gene.These PCR products were screened by single strand conformation polymorphism(SSCP)and subjected to direct sequencing.Results Three germcell muta-tions in the RB1gene were identified in collected genomic DNA from RB patients:a T to A transition(TTC→TAC)at exon10,a deletion G(GAT→AT)at exon10,a A to T transition(AAG→ATG)at exon22.Conclusion Mutations in RB1gene are involving a few base pairs in this study.As a result of such mutation,the normal function of RB is usually disrupted,and retinoblastoma occurred.
   
  Key words retinoblastoma gene mutation RB1
     
  视网膜母细胞瘤(简称RB),是婴幼儿最多见的高度恶性、致死率高的眼内恶性肿瘤。由视网膜母细胞瘤基因(RB1基因)的两条等位基因同时失活所致,分遗传型(30%~40%)和非遗传型(60%~70%)两种方式。遗传型视网膜母细胞瘤病人体细胞都携带RB1基因生殖细胞性突变,85%~90%可能会发生双眼或单眼多灶型视网膜母细胞瘤,下一代子女中约有50%的机会遗传这一突变的基因,而其中的90%会患视网膜母细胞瘤 [1,2] 。因而,基于RB1基因生殖细胞性突变检测(遗传分型、产前与症状前基因诊断),目前是视网膜母细胞瘤的预防与早期诊断的有效途径。为了进一步了解RB病人RB1基因的突变特点,为临床遗传检查提供更多可靠的信息,笔者应用分子生物学技术对RB病人体细胞中RB1基因进行突变位点的检测,并结合以前的工作 [3] ,探讨了RB1基因突变的分子生物学机制。

  1 资料与方法
    
  1.1 一般资料 共收集散发RB病人12例,4例为双眼RB,其他8例为单眼RB,年龄1~5岁;同时收集了12例无亲属关系的健康人作为正常对照组。

  1.2 方法
   
  1.2.1 DNA提取 采外周静脉血10ml,应用DNA分离试剂盒(Promega公司产品)提取全血白细胞DNA。

  1.2.2 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 应用美国PE公司2400型PCR仪。参照Toguchida[4] 报道的方法进行PCR引物设计。PCR反应体系:10×Buffer2μl(含MgCl 2 10mmol/L),2×dNTP2μl(2mmol/L)引物2μl(10mmol/L),DNA模板1μl(1mmol/L),Taq plus I DNA聚合酶0.5μl(5 10 u/L),加双蒸水至100μl。95℃变性1min进入循环。95℃30s,退火30s,退火温度50℃~70℃(不同外显子,不同温度)。72℃延伸30s,共30个循环。最后72℃再延伸7min。PCR扩增产物的分析:取扩增产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶电泳后进行EB染色,同时加Marker标记DNA相对分子质量。透射紫外线观察DNA电泳带,照相。
   
  1.2.3 单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析 将PCR产物置95℃下变性10min,加入10%非丙烯酰胺电泳槽孔中,50℃,2h,电压200~400V,银染、显带、干燥。
   
  1.2.4 DNA测序 通过SSCP分析如发现有变异带出现,则将该PCR产物利用双脱氧末端终止法进行直接测序。
    
  2 结果
    
  通过PCR-SSCP分析,在12例病人中发现3例SSCP电泳有变异DNA单链带(图1~3)。其中2例经临床及病理检查确诊为双眼RB,1例为单眼RB。这3例病人均无家族史。PCR产物克隆测序分析显示:例1(3号)双眼RB病人10号外显子5'端至3'端第22bp处发生T→A置换,由TTC变为TAC,将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列(图1);例2(7号)双眼RB病人10号外显子5'端至3'端第64bp处发生1bp碱基缺失(GAT→AT)(图2),发生阅读框架改变;例3(14号)22号外显子5'端至3'端第36bp处发生A→T置换,由AGA变为TGA,将精氨酸序列变为终止密码(图3)。
    
  3 讨论
    
  RB1基因(视网膜母细胞瘤易患基因)位于人类13号染色体长臂1区4带,有27个外显子,分布范围180kb,转录一4.7kbmRNA,其蛋白产物为一115kb核内磷酸蛋白。各种原因致使RB1基因失活是视网膜母细胞瘤发生的直接原因。
   
  RB分遗传性和非遗传性两种。遗传性和非遗传性病例发病特征的差别可以用Knudson的二次突变学说解释。Knudson于1971年提出的二次突变学说认为RB发生要经历两次突变。遗传性第一次突变是生殖细胞突变,由此发育而来的子代所有体细胞均带有一次突变,表现肿瘤易感性。视网膜任何一个细胞只需发生一次突变即可发生RB,而其他部位体细胞也只需一次突变即可发生恶性肿瘤,故RB发生早,多中心,发生第二肿瘤危险性高,且可遗传。这种生殖细胞突变可以来自病人父母的遗传(有家族史),但以胚胎发育早期的生殖细胞新发生的突变更多见(无家族史),非遗传型RB病人中,生殖细胞遗传了正常的两个RB基因,两次突变需发生于同一视网膜细胞才可能发病。因为同一细胞连续发生两次突变可 能性非常小、故这些病例总是单侧单中心性发生,且发病晚。而所有体细胞遗传了正常的RB基因。所以发生二次恶性肿瘤的危险性与正常人相同 [2] 。
   
  国内临床上对视网膜母细胞瘤做出诊断时大多数患儿已近晚期,只好行眼球摘除术以保性命。应用分子生物学及分子遗传学方法检测RB1基因突变,结合基因连锁分析,可在分子水平上进行RB1的产前及产后早期诊断和遗传咨询。应用PCR—SSCP直接测序方法可以检测出病人体细胞内RB1基因的杂合突变,尤其是对那些得不到肿瘤标本的病例更为适用。SSCP技术具有较高的敏感性,可检测至序列中单一碱基的变化。内部结构有变化的单链DNA片段在电泳中发生迁移率的变化,使相应的DNA电泳带超前或滞后异于正常应有的位置。对于经SSCP检测所发现有结构异常的标本,再对其进行序列分析。本研究中2例10号外显子电泳带显示超前的异常泳动带形,1例22号外显子电泳带显示滞后的异常泳动带形。经DNA测序均发现RB1基因突变。PCR-SSCP可检出标本DNA结构异常的存在。且处理标本量大、迅速,适用于目的基因结构异常的筛选,联合序列分析,则可最终证实基因改变的类型及确切存在的部位。
   
  RB1基因突变发生的种类:以碱基变化为标准 [5] ,可以将突变分为点突变(置换与颠换)、小缺失、小插入及复杂突变4类。申煌煊 [6] 在分析21个RB1基因组成型突变中发现,中国人的RB1基因突变虽然也有4种不同的突变方式,但以微小突变为主。笔者采用PCR-SSCP-直接测序技术对12例RB病人RB1基因进行了研究,分析了血液白细胞中的RB1基因的启动子及27个外显子,发现3例RB1基因生殖细胞性突变,2例为双眼RB病人,1例为单眼RB病人。笔者所确定的4例(本文3例,以前1例)RB病人和1例表现型正常的RB1基因突变携带者 [3],其生殖细胞性突变方式为点突变和小缺失,均为微小突变。点突变往往改变了正常的遗传信息。本研究中标本3第10外显子5'端至3'端第22bp处发生T至A突变,将苯丙氨酸编码序列变为酪氨酸编码序列;标本14第22号外显子第36bp处发生A至T突变,将精氨酸序列变为终止密码,这就不可避免地影响了RB1基因编码的蛋白质的质量。RB1基因的缺失改变可因破坏阅读框架,产生终止密码而影响正常转录,标本7第10外显子第64bp处发生1bp碱基缺失,发生阅读框架改变。这些改变均导致RB1基因不能完成正常的转录过程而不能编码出正常的RB蛋白,从而失去了对视网膜细胞的生长、分化的负反馈调节作用,使细胞生长处于无限制地生长状态,致使视网膜母细胞瘤的发生。
   
  RB基因的检测和定性加深了笔者对人类肿瘤的理解,在肿瘤发病的分子机制及利用突变分析进行遗传咨询方面取得了很大进步。RB基因突变携带者的检测非常重要,因为它不仅引起RB,还可导致其他肿瘤。更好地认识RB1基因突变的不同类型,不仅对RB发病机制的认识有重大理论指导意义,而且可进行产前诊断和早期诊断及对家族性病例提供现实的指导服务。
    
  (本文图片见附页1)(略)
     
  参考文献
    
  1 Knudson AG Jr.Genetics of human cancer.Annu Rev Genet,1986,20:231-251.
   
  2 李红.RB遗传学及最新诊断技术.中国实用眼科杂志,1998,16(7):386-389.
   
  3 盛迅伦,吴伟民,庄文娟,等.视网膜母细胞瘤患者RB1基因突变筛选.国际眼科杂志,2005,5(2):212-214.
   
  4 Toguchida J,Mcgee TL,Paterson JC.complete genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene.Genomics,1993,17:535-543.

  5 Lohmann DR.RB1gene mutations in retinoblastoma.Hum Mutat,1999,14(4):283-288.
   
  6 申煌煊,张清垌,肖学珊,等.中国与日本视网膜细胞瘤患者RB1基因突变特性分析.癌症,2000,19(9):846-849.

  作者单位:266555青岛经济技术开发区第一人民医院眼科(* 通讯作者)
   
       266071青岛大学师范学院教育科学技术系
   
       750004宁夏医学院附属医院眼科

日期:2005年6月23日 - 来自[论著]栏目

人参皂甙Rb1GinsenosideRb1

[中文名称] 人参皂甙Rb1 
[英文名称] Ginsenoside Rb1 
[别  名]  
[化学名称] β-D-Glucopyranoside, (3β,12β)-20- [(6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]-12-hydroxydammar-24-3n-3yl 2-Oβ-D-glucopyranosyl- 
[分 子 式] C54H92O23 
[分 子 量] 1109.26 
[物理性质] 白色粉 (乙醇-丁醇), 熔点 197~198°, (α)22D +12.42°(C=0.91, 甲醇) 。IRγKBrmax cm -1: 3400 (OH), 1620 (C=C) ; 13CNMR 。 
[成分分类]  
[药理作用] 作用同人参皂甙Rc。 
[毒  性]  
[不良反应]  
[用  途]  
[成分来源] 五加科植物人参Panax ginseng C. A. Meyer 茎,根,三七 Panax notoginseng (Burt.) F. H. Chen (P. pseudoginseng var. notoginseng) 根 
日期:2005年4月7日 - 来自[中草药有效成分]栏目
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