主题:蛋白酶

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我科学家在寨卡病毒药物靶点研究中获新突破

由天津大学杨海涛教授和南京大学籍晓云教授领导的科研团队近日在揭示寨卡病毒关键药物靶点方面取得重要突破,成功解析了寨卡病毒NS2B-NS3pro蛋白酶复合物原子分辨率水平的三维结构。该蛋白酶复合物在寨卡病毒整个生活周期中起关键调节作用。这项研究为开发治疗寨卡病毒的特效药物奠定了重要的结构基础。相关研究成果已在线发表于自然出版集团发行的学术刊物《细胞研究》上。该集团的旗舰刊物《自然》是世界上最重要的科研学术期刊之一。

杨海涛教授和籍晓云教授领导的科研团队在研究中发现,寨卡病毒的NS2B-NS3pro蛋白酶复合物是一个关键抗病毒药物靶标。因为只有该蛋白酶复合物被激活,并完成一系列水解反应后,病毒才能启动复制过程。科研人员成功解析了寨卡病毒NS2B-NS3pro蛋白酶复合物的晶体结构,揭示了病毒蛋白酶被激活的关键分子机制。“NS2B-NS3pro蛋白酶复合物好像一把‘小剪刀’,它被激活后,会把跟病毒复制相关的一条长链蛋白质‘剪断’,分离后的多个蛋白质‘小单元’进行组装后,才能启动病毒的复制。”研究团队成员、天津大学生命科学学院博士生陈侠介绍,“我们最终想要实现的是对蛋白酶进行抑制,不让它被激活及发挥作用。”

利用该蛋白酶复合物作为药物靶点,科学家们已经成功筛选到一种被称为“aprotinin”的有效抑制剂。“aprotinin”是一种临床药物,并在手术中被用于止血。它对寨卡病毒蛋白酶活性有很好的抑制作用,该抑制剂的发现将有助于进一步开发抗寨卡病毒的药物。此外,研究还发现,寨卡病毒蛋白酶存在一种特殊的“自抑制”状态。据此,科学家们提出了一种全新的抗病毒药物设计策略——如果能设计一种化合物可以将病毒蛋白酶锁定在“自抑制状态”,将会导致该酶无法被激活,最终达到抑制病毒复制的目的。

据美国疾病控制与预防中心最新的数据显示,寨卡病毒已经传播到60多个国家和地区。寨卡病毒感染除了能够造成新生儿小头畸形,还能引发格林-巴利综合征。而后者是一种严重的神经系统疾病,能导致患者瘫痪甚至死亡。

日期:2016年12月2日 - 来自[技术要闻]栏目

合肥研究院等在冷等离子体作用蛋白酶研究中取得进展


等离子体诱导蛋白溶液中长寿命活性基团的成分和浓度变化

近期,中国科学院合肥物质科学研究院等离子体物理研究所应用等离子体研究室程诚、沈洁等人与合肥研究院医学物理与技术中心以及中国科学技术大学教授夏维东课题组合作,在等离子体作用蛋白酶研究方面取得进展。

  

近年来,等离子体医学成为低温等离子体领域的研究热点。微生物失活和诱导细胞凋亡是等离子体医学的一个重要组成部分,而等离子体在生物分子层面上的作用机理尚不明晰。作为细胞的重要组成,蛋白在等离子体作用下的特性表现,对于掌握等离子体在生物医学过程中的作用机制,并从分子层面提供理论解释具有重要意义。

  

课题组采用乳酸脱氢酶(LDH)液为蛋白模型,通过研究发现等离子体可以使这种蛋白有效失活。结合圆二色谱和动态光散射仪等检测手段,研究不同处理方式给蛋白酶活力带来的变化,证实蛋白酶的失活与其二级结构的修饰有着重要的联系。通过对等离子体作用后液体中引发产生的长寿命活性基团进行检测,比较两种不同处理方式蛋白酶活力的差异,最终推测等离子体引发产生的长寿命活性基团是导致蛋白酶活力变化和其二级结构变化的主要原因。这为进一步深入解析等离子体医学的分子机制奠定了一定的基础。

  

该研究得到了国家自然科学基金以及合肥研究院院长基金资助。

  

上述研究已被《科学报告》(Scientific Reports)杂志接受发表(Scientific Reports 5, 10031,2015)。

日期:2015年5月28日 - 来自[技术要闻]栏目

当明胶“邂逅”新型蛋白酶


▲中国科学院天津工业生物技术研究所的研究人员正在做实验。

新型蛋白酶法制备明胶工艺对于资源利用和环境维持都有重要意义,同时对于现有骨素处理和明胶提取设备具有很好的兼容性。此外,在生产方面,无需额外添加独特工艺设备,传统工艺的工厂可以快速转化为使用酶法工艺,便于扩大生产规模。

明胶是胶原的水解产物,广泛应用于医药、食品、纺织、化工、电子、造纸、印刷等30多个行业,化学制备法一直是明胶生产的传统工艺。近年来,随着对各类酶的研究进展与绿色工艺的革新,酶法制备明胶工艺成了研究者不断探索的新方向。

近日,中国科学院天津工业生物技术研究所研究员宋诙带领研究组,通过对土壤样品宏基因组测序,发现了一种能够用于明胶制备的新型蛋白酶,并以该酶为基础对蛋白酶法制备明胶工艺进行了优化。

宋诙告诉《中国科学报》,新型蛋白酶法制备明胶工艺对于资源利用和环境维持都有重要意义,同时对于现有骨素处理和明胶提取设备具有很好的兼容性。此外,在生产方面,无需额外添加独特工艺设备,传统工艺的工厂可以快速转化为使用酶法工艺,便于扩大生产规模。

工艺需不断优化

2010年世界明胶需求量约为44.5万吨,预计未来五年明胶需求增长率可达到年均增长9%。由于客观原因,我国传统骨明胶制备工业多集中于骨资源丰富地区,如内蒙古、青海、甘肃等地。

同时,由于传统骨明胶制备工艺要经历多次浸酸、水洗、浸灰、中和等步骤,对淡水需求量极大,而上述地区的淡水资源却十分缺乏。地区资源与传统工艺的局限限制了明胶工业的发展,对明胶工艺的革新提出了迫切的要求。

20世纪80年代,酶法制备明胶工艺出现,明胶制造酶法工艺主要是采用生物酶作用于动物的骨或皮,降解其中的胶原大分子生产明胶。

据宋诙介绍,通过利用酶法制备骨明胶,可以省略多次酸碱水洗步骤,简化为酸、酶处理一步反应,缩短了工艺流程,还能够减少90%以上的淡水消耗量,同时节约了大量能源和酸碱试剂。

“由于其可缩短生产周期、减少环境污染、易于自动化控制及细化明胶品质,是明胶制备技术的发展趋势。”中国科学院天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术研究组的研究人员谭明补充道。

但是,酶法制备明胶还存在着一些不足。首先,目前酶解使用的蛋白酶提取自动植物(如动物内脏、木瓜、菠萝等),其制备过程存在污染和耗能问题。其次,动植物来源的蛋白酶产品稳定性有待提高,酶活性低。第三,蛋白酶活性容易受水解产物的影响,容易失去活性。此外,酶法制备明胶还存在形成的胶原水解产物专一性差,影响了明胶产品质量;明胶制备过程中途需要人为大幅调节pH值等问题,限制了酶法制备明胶工艺的发展。

新型蛋白酶助力绿色工艺

在上述背景下,中国科学院天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术的研究队伍将目光投向了明胶酶法制备中新型酶的研究。

宋诙认为,上述酶法制备明胶的不足是由蛋白酶本身的局限造成的,但是目前国内外市场上都还没有专用于明胶制备的高温蛋白。

因此,宋诙的研究团队从极端土壤环境里能生存的微生物中提取相关基因,然后对得到的高温蛋白酶进行特异性分子改造并进行了外源表达,得到了大量工业蛋白酶。

随后,他们从获得的新蛋白酶里进行筛选研究,对一些可能制备明胶的蛋白酶进行初步检测,通过工艺过程和产品指标等综合评价,寻找到了一种酶法制备明胶效果较优的新型蛋白酶。

同时,宋诙的研究团队对酶法制备明胶的工艺进行了革新,将后续的提胶过程由传统的多道提胶工艺改为两道提胶。在运用该新型蛋白酶制备明胶的工艺中,第一道提胶占明胶得率达12%,已接近传统酸碱法多道提胶步骤的得率总和,该新型蛋白酶法制备明胶的总得率也超过了传统方法的14%~15%,达到17%。

宋诙介绍说,相对于传统酸碱法制备的明胶,酶法明胶的蛋白电泳条带更集中,更单一,所得明胶的冻力值可达250 bloomg以上,黏度值可达4.0 mPa·s,与传统法相当。明胶总生产周期从60多天缩短到5天,减少90%淡水用量,同时减少大量能源和化学制剂消耗,实现了明胶制备的绿色工艺。

产业化还需“说服”厂家

据悉,宋诙的研究团队下一步要做的是根据明胶的技术指标(冻力、黏度、透过率),对温度特性、pH 特性、作用效率等蛋白质特性继续进行分子改造。

“我们还要优化最佳酶的复配方案,探索和优化应用于明胶绿色酶法制备工艺的复合酶配方,优化新型酶生物制备明胶工艺,并与合作企业一起进行工艺的放大及工业化生产示范。整个工艺成熟到能投产,还需要1~2年时间。”宋诙说。

瞄准酶法制备明胶产业化的还有中科院的另一支研究队伍,据该研究团队一位不愿透露姓名的研究员介绍,该研究团队的酶法明胶生产工艺已在宁夏、内蒙古等省区开展了工业化实验和实施,部分企业产品已经上市形成销售,并将进一步在其他地区进行推广。

但是,这位研究员认为,对于酶法制备明胶工艺而言,要想在产业化进程中完全替代传统化学工艺,还有一段很长的路要走。

该研究员指出,在产业化中,酶法制备还有一些重要问题,如酶法制备明胶生产工艺的稳定性,酶法明胶在食品、药品等下游企业中的接受和认可过程等。

宋诙表示,目前大部分明胶制备厂家采用传统化学法,如果改成酶法,需要给企业证明新工艺能带来巨大的经济效益。

“要改造传统工艺和建立新的生产线,许多企业不能接受这个风险,而当前一些大企业没有太大竞争压力,对工艺革新的兴趣不大,因此,如何进一步证明酶法工艺能带来巨大价值,对我们来说是一个挑战。”宋诙强调。

《中国科学报》 (2014-05-13 第8版 生物)

日期:2014年5月14日 - 来自[技术要闻]栏目

宋诙小组发现能够用于明胶制备的新型蛋白酶


 

■本报实习生 李勤

 

新型蛋白酶法制备明胶工艺对于资源利用和环境维持都有重要意义,同时对于现有骨素处理和明胶提取设备具有很好的兼容性。此外,在生产方面,无需额外添加独特工艺设备,传统工艺的工厂可以快速转化为使用酶法工艺,便于扩大生产规模。

 

▲中国科学院天津工业生物技术研究所的研究人员正在做实验。

 

明胶是胶原的水解产物,广泛应用于医药、食品、纺织、化工、电子、造纸、印刷等30多个行业,化学制备法一直是明胶生产的传统工艺。近年来,随着对各类酶的研究进展与绿色工艺的革新,酶法制备明胶工艺成了研究者不断探索的新方向。

 

近日,中国科学院天津工业生物技术研究所研究员宋诙带领研究组,通过对土壤样品宏基因组测序,发现了一种能够用于明胶制备的新型蛋白酶,并以该酶为基础对蛋白酶法制备明胶工艺进行了优化。

 

宋诙告诉《中国科学报》,新型蛋白酶法制备明胶工艺对于资源利用和环境维持都有重要意义,同时对于现有骨素处理和明胶提取设备具有很好的兼容性。此外,在生产方面,无需额外添加独特工艺设备,传统工艺的工厂可以快速转化为使用酶法工艺,便于扩大生产规模。

 

工艺需不断优化

 

2010年世界明胶需求量约为44.5万吨,预计未来五年明胶需求增长率可达到年均增长9%。由于客观原因,我国传统骨明胶制备工业多集中于骨资源丰富地区,如内蒙古、青海、甘肃等地。

 

同时,由于传统骨明胶制备工艺要经历多次浸酸、水洗、浸灰、中和等步骤,对淡水需求量极大,而上述地区的淡水资源却十分缺乏。地区资源与传统工艺的局限限制了明胶工业的发展,对明胶工艺的革新提出了迫切的要求。

 

20世纪80年代,酶法制备明胶工艺出现,明胶制造酶法工艺主要是采用生物酶作用于动物的骨或皮,降解其中的胶原大分子生产明胶。

 

据宋诙介绍,通过利用酶法制备骨明胶,可以省略多次酸碱水洗步骤,简化为酸、酶处理一步反应,缩短了工艺流程,还能够减少90%以上的淡水消耗量,同时节约了大量能源和酸碱试剂。

 

“由于其可缩短生产周期、减少环境污染、易于自动化控制及细化明胶品质,是明胶制备技术的发展趋势。”中国科学院天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术研究组的研究人员谭明补充道。

 

但是,酶法制备明胶还存在着一些不足。首先,目前酶解使用的蛋白酶提取自动植物(如动物内脏、木瓜、菠萝等),其制备过程存在污染和耗能问题。其次,动植物来源的蛋白酶产品稳定性有待提高,酶活性低。第三,蛋白酶活性容易受水解产物的影响,容易失去活性。此外,酶法制备明胶还存在形成的胶原水解产物专一性差,影响了明胶产品质量;明胶制备过程中途需要人为大幅调节pH值等问题,限制了酶法制备明胶工艺的发展。

 

新型蛋白酶助力绿色工艺

 

在上述背景下,中国科学院天津工业生物技术研究所基因工程与微生物应用技术的研究队伍将目光投向了明胶酶法制备中新型酶的研究。

 

宋诙认为,上述酶法制备明胶的不足是由蛋白酶本身的局限造成的,但是目前国内外市场上都还没有专用于明胶制备的高温蛋白。

 

因此,宋诙的研究团队从极端土壤环境里能生存的微生物中提取相关基因,然后对得到的高温蛋白酶进行特异性分子改造并进行了外源表达,得到了大量工业蛋白酶。

 

随后,他们从获得的新蛋白酶里进行筛选研究,对一些可能制备明胶的蛋白酶进行初步检测,通过工艺过程和产品指标等综合评价,寻找到了一种酶法制备明胶效果较优的新型蛋白酶。

 

同时,宋诙的研究团队对酶法制备明胶的工艺进行了革新,将后续的提胶过程由传统的多道提胶工艺改为两道提胶。在运用该新型蛋白酶制备明胶的工艺中,第一道提胶占明胶得率达12%,已接近传统酸碱法多道提胶步骤的得率总和,该新型蛋白酶法制备明胶的总得率也超过了传统方法的14%~15%,达到17%。

 

宋诙介绍说,相对于传统酸碱法制备的明胶,酶法明胶的蛋白电泳条带更集中,更单一,所得明胶的冻力值可达250 bloomg以上,黏度值可达4.0 mPa·s,与传统法相当。明胶总生产周期从60多天缩短到5天,减少90%淡水用量,同时减少大量能源和化学制剂消耗,实现了明胶制备的绿色工艺。

 

产业化还需“说服”厂家

 

据悉,宋诙的研究团队下一步要做的是根据明胶的技术指标(冻力、黏度、透过率),对温度特性、pH 特性、作用效率等蛋白质特性继续进行分子改造。

 

“我们还要优化最佳酶的复配方案,探索和优化应用于明胶绿色酶法制备工艺的复合酶配方,优化新型酶生物制备明胶工艺,并与合作企业一起进行工艺的放大及工业化生产示范。整个工艺成熟到能投产,还需要1~2年时间。”宋诙说。

 

瞄准酶法制备明胶产业化的还有中科院的另一支研究队伍,据该研究团队一位不愿透露姓名的研究员介绍,该研究团队的酶法明胶生产工艺已在宁夏、内蒙古等省区开展了工业化实验和实施,部分企业产品已经上市形成销售,并将进一步在其他地区进行推广。

 

但是,这位研究员认为,对于酶法制备明胶工艺而言,要想在产业化进程中完全替代传统化学工艺,还有一段很长的路要走。

 

该研究员指出,在产业化中,酶法制备还有一些重要问题,如酶法制备明胶生产工艺的稳定性,酶法明胶在食品、药品等下游企业中的接受和认可过程等。

 

宋诙表示,目前大部分明胶制备厂家采用传统化学法,如果改成酶法,需要给企业证明新工艺能带来巨大的经济效益。

 

“要改造传统工艺和建立新的生产线,许多企业不能接受这个风险,而当前一些大企业没有太大竞争压力,对工艺革新的兴趣不大,因此,如何进一步证明酶法工艺能带来巨大价值,对我们来说是一个挑战。”宋诙强调。

 

《中国科学报》 (2014-05-13 第8版 生物)

日期:2014年5月13日 - 来自[技术要闻]栏目

天津工业生物所研发出明胶制备用新型蛋白酶及配套工艺

明胶(Gelatin)是胶原的水解产物,广泛用于医药、食品、纺织,化工,电子,造纸,印刷等30多个行业。随着明胶市场的细分,目前对明胶的质量要求进一步显现出高标准、系统化和专业化的新特点。传统酸碱法生产明胶工艺由于周期长、卫生条件难以控制、设备改进困难,以及对环境造成污染等原因,难以满足日益增长的明胶市场的系统需求。我国西部地区原料丰富、湿度适宜,是我国明胶的主要产地,但传统明胶酸碱法制备工艺生产过程中的酸、碱排放对水体和空气的污染十分严重,同时,传统工艺耗水量大、耗能高的缺点又加剧了西部水资源和电能紧张的状况。 

近日,中国科学院天津工业生物技术研究所宋诙研究员带领研究组通过对土壤样品宏基因组测序,发现一个能够用于明胶制备的新型蛋白酶,并以该酶为基础对蛋白酶法制备明胶工艺进行了优化。 

该研究使用具有自主知识产权的蛋白酶制备明胶,实现了化学工艺的生物法替代,将传统骨明胶碱法制备工艺中的多次浸酸、水洗、浸灰、中和等步骤,简化为酸-酶处理一步反应,缩短了工艺流程。同时,将后续的提胶过程由传统的多道提胶工艺改为两道提胶,明胶得率第一道胶可达12%,已接近传统酸碱法多道提胶步骤的得率总和,酶法制备明胶的总得率也超过了传统方法的14~15%,达到17%。同时,相对于传统酸碱法制备的明胶,酶法明胶的蛋白电泳条带更集中,更单一;所得明胶的冻力值可达250 bloomg以上,粘度值可达4.0 mPa·s,与传统法相当。明胶总生产周期从60多天缩短到5天,减少90%淡水用量,同时减少大量能源和化学制剂消耗,实现了明胶制备的绿色工艺。 

该研究获得了国家863项目的支持,并已申请多项国家专利,其中两项已获得授权(ZL201320431570.7 ,ZL201320431558.6)。 

日期:2014年4月29日 - 来自[技术要闻]栏目

华人博士后诸辉:“让每亩菠萝增收1000多元”

   近日,本报曾报道了农产品遭遇“丰年困局”,呼唤深加工企业的出现,而我市通过引进高层次人才,无疑给这个“炎夏”带来了一场“及时雨”。

    记者从市人力资源与社会保障局了解到,今年作为湛江市高层次产业领军人才引进的诸辉教授及其团队,结合植物生化提取先进技术,以菠萝梗、茎、叶等“废料”为主要原材料,生产出高纯度的菠萝蛋白酶等植物酶制剂药品和保健品,生产中形成的下脚料还可作为动物饲料使用。采访中,诸辉兴奋地告诉记者:“我们自豪于可以变废为宝!按照每亩菠萝地可以收到约1500公斤菠萝梗计算,该项目至少可以使每亩菠萝增收1000多元!”

    华人博士后成“酶”领域先锋

    诸辉,今年40岁,原籍广东省河源市,香港大学生物化学专业博士研究生,后到美国从事医学研究15年,获美国马里兰大学免疫学专业博士后,美国南加州大学洛杉矶儿童医院免疫学专业博士后。

    在博士后工作期间,他曾参与NIH(美国国立卫生研究院)的3个临床脑瘤研究和治疗,研发的两种疫苗正在美国加州3个医学中心使用。他发表了10篇以上的专业论文,并曾多次在国际学术会议上提交论文并发表演讲。

    他还在美国SEB酶生物工程公司担任过研发总监(SEB为美国第二大酶制剂公司,全球第五大酶制剂公司),为公司研发了多种新的酶产品,包括脯氨酸内切酶,小肽酶,半乳糖苷酶等一系列医药用酶品种。这些酶品种在欧美市场广泛使用,每年产值超过上亿美元。

    并且,诸辉作为美国酶工程协会(ETA)的理事会员,参与制定了医药保健品行业的酶产品标准,领导的实验室制定了菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、半乳糖苷酶等品种的标准品和USP/FDA/FCC检测方法。

    结缘湛江菠萝组建生产基地

    2011年,诸辉创立了美国PHILZYME生物工程公司,该公司是成立于南加州的一家以生物技术研发为主导的高科技生物工程公司。

    目前公司的主要研发项目有:新型酶制剂,以基因工程技术为核心的重组质粒在酵母细胞中高表达酶制剂;成功克隆了有内切酶活性的多肽蛋白酶及乳糖脱羧酶;肿瘤疫苗的研发,已和美国西海岸的西塞医学中心合作进行了临床2-3期的研究,并获得合作专利;菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的分离提取工艺的确定和研究。

    所谓菠萝蛋白酶,主要工艺是从大量的菠萝“废料”中提纯,诸辉把他的第一个生产基地建在了泰国,并迅速投产成为国际领先项目。但2012年,诸辉从网上发现,原来中国国内就有一片更美的“菠萝的海”——徐闻和雷州。

    他迫不及待地来到湛江开始实验,初次结果却让他傻了眼。“为什么跟泰国菠萝比起来,湛江菠萝能提取的蛋白酶那么少?”原来,这是由于两地的菠萝品种不同造成的,他慢慢放弃从菠萝皮中提取,着眼菠萝的梗、茎、叶,最终诸辉及他的研究团队得到了理想成效,甚至与泰国菠萝相比,湛江菠萝提纯的菠萝蛋白酶经济效益和药用效益更好。

    今年4月,诸辉创立雷州市科芙乐生物工程有限公司,并投入了价值数百万的设备,组建菠萝蛋白酶在湛江的大规模工业化生产。

    雷州市委副书记、市长吴国雄告诉记者,这个合作项目的落地,是世界前沿尖端技术与“沉睡深闺”的雷州优质农产品的一次成功嫁接,合作有深度,技术有高度,市场有广度。

    【对话】

    记者:世界上菠萝产地那么多,您是怎么发现并且“相中”湛江的呢?

    诸辉(笑):首先我自己也是一名广东人,有好的项目肯定想带回来。自从在网上看到湛江大面积种植菠萝的消息后,2012年我就带着研发团队或客户来回“踩点”了四、五次,发现这里的菠萝产量、蛋白酶含量和纯度都很高,与哥斯达黎加、印尼和菲律宾相比,湛江“菠萝的海”更符合我们的要求。恰好,湛江市启动一个高层次人才引进项目,我也去报名了,当时竞争还是非常激烈的,也算“过三关、斩六将”吧,最后我幸运地通过了选拔。

    记者:这个高层次人才引进计划为您提供了什么帮助?

    诸辉:除了资金支持,更重要的是政策上的支持和以实际行动为我们解忧,替我们解决了厂房问题,并多次来工厂视察和现场办公。还有,我们的设备都是自己研发和订做的,对电容要求比较高,有一次遇上电容不够的问题,也是雷州市政府领导帮忙出面解决的。

    现在我们在雷州调风镇的工厂主要是提取菠萝蛋白酶,作为原料出口给国外各大制药厂。今年9月份,我们还准备进驻奋勇经济区,建厂研发生产内销为主的OTC药品。

    记者:从菠萝中提取的蛋白酶主要应用在医药的哪些方面?

    诸辉(笑):我们平常所说的酶,没有帮助食物消化的效果。但经过我们大量实验比对和临床研究表明,这种从菠萝梗、茎、叶里提取的蛋白酶具有很好的消炎作用。

    在美国,每年有5万人死于消炎药的不良反应,而菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿(包括血栓静脉炎、骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤),却不会像消炎药一样产生负面作用;将菠萝蛋白酶与各种抗生素联用,能够加快抗生素在感染部位的传输,提高其疗效从而减少抗生素的用药量;另外,它在抑制肿瘤细胞的生长和作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治方面都能起到有益作用。

    记者:能够利用菠萝废料进行“二次生产”,对农户来说是件大好事吧,我听说生产中的下脚料也能够得到利用?

    诸辉:是的,我们自豪于可以变废为宝,而且整个生产工艺不产生任何污染,生产中的下脚料经过发酵粉碎处理,还能作为奶牛和鱼虾饲料。按照每亩菠萝地可以收到约1500公斤菠萝梗,至少可以给农民每亩增收1000多元!按照每年需要种植约3.5万亩菠萝地,才能满足我们的生产线来计算,本项目预计能为当地农业每年创收3500万元。

    记者:那您打算把工作重心转移回国内吗?以后留在湛江的时间多不多?

    诸辉:肯定的!我的目标是把公司打造成国内第一,国际第二,现在因为生产车间设在雷州,销售部门设在广州,所以经常要两地飞,还有不少路要走。

    湛江是一个美丽宜人的沿海城市,拥有良好的区域优势和发展潜力,我团队中的每一位成员来过湛江后都觉得这里非常好,它是我心目中利于公司发展的理想城市。有机会的话,我还要把洛杉矶的家人接来湛江旅游。

日期:2013年8月26日 - 来自[技术要闻]栏目

一种简便的非放射性原位杂交法检测胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA

【摘要】    目的 检测大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA的表达。方法 根据大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶基因序列合成两端含有相邻胸腺嘧啶结构的单链DNA探针,完成杂交后利用抗胸腺嘧啶二聚体抗体与抗原化的单链DNA探针进行反应,再运用免疫组织化学方法从而检出组织中目标mRNA的表达。结果 大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色,其他的组织细胞均显示阴性。结论 本试验中采用的原位杂交方法操作简便安全、无放射性,并且具有很高的灵敏度和特异性。实验结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA,而其他组织细胞不表达。

【关键词】  胸腺嘧啶二聚体;原位杂交;非放射性;弹性蛋白酶;mRNA

  A Convenient Non-radio ISH Method for Detection of Pancreatic Elastase Ⅱ mRNA

    LI De-min

    (Department of TCM,The First Affiliated Hospital, Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)

    Abstract:Objective To detect the rat pancreatic elastase II mRNA in rats.Methods ISH was preformed by using Oligo-DNA probe based on the sequence of rat pancreatic elastase II mRNA,which 3' and 5' terminal conjugated with -A-T-T structure.The anti-T-T IgG antibody was used to react with haptenized Oligo-DNA in immunohistochemical process.Results Acinar cells in rat pancreas were highly labeled specifically by the probe.Conclusion It was a simple and safety ISH method with high sensitivity and specificity.The acinar cells in rat pancreas expressed pancreatic elastase Ⅱ mRNA specifically.

    Key words:Thymine-Thymine dimer;ISH;non-radio;elastase;mRNA

    常常用的检测细胞基因表达的技术,已经发展出了很多方法,其中由小路武彦等学者利用胸腺嘧啶二聚体(thymine-thymine dimer,T-T dimer)特性近年来发展出一种无放射性原位杂交方法[1],在此采用这种方法检测对大鼠组织中胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA[2]的表达进行检测。

    1  原理

    在生物细胞中有许多含有相邻胸腺嘧啶(thymine)序列的基因片段,当受到紫外线(包括阳光)照射时,任何两个相邻的胸腺嘧啶之间会形成共价键结构(即胸腺嘧啶二聚体),从而造成DNA片段的损伤。但由于T-T dimer具有半抗原的特性,所以可以利用这个特性而应用于ISH。当我们需要检测组织细胞中任何一段mRNA的表达时,可以设计并合成一段单链DNA引物(注意避免其中含有T-T构造),并在目标cDNA的两端链接上含有T-T构造的序列作为单链DNA探针。进行ISH时,用适当剂量的紫外光照射,使探针两端形成T-T dimer,将探针与mRNA杂交后,再使用抗T-T dimer的抗体与探针进行反应,那么运用简单的免疫组织化学技术即可检出组织细胞中目标mRNA的表达。

    2  方法

    2.1  DNA探针的制备

    合成的大鼠胰腺型弹性蛋白酶Ⅱ型的单链DNA片段序列为:tta-gtgccataacactcgaaaccgaggtgagacccga-att,序列为721~754(不包含3和5末端的-A-T-T序列)[2]。在ISH前用254 nm紫外线照射,能量为10kJ/m2。

    2.2  组织标本准备

    在ISH中,组织标本的制作非常关键。用清洁磷酸缓冲液(PBS,pH7.4)配制的4%多聚甲醛对Wistar大鼠进行灌流固定过夜后,用PBS和含有30% (w/v)蔗糖和0.02% (v/v) DEPC的PBS冲洗并保存于4℃,组织取材后包埋于OCT中以制作冰冻切片。也可采用清洁酒精系列脱水后包埋于石蜡中以制作石蜡切片。大鼠胰腺组织作为阴性对照。

    2.3  原位杂交操作

    2.3.1  切出5~6 μm厚冰冻切片至于有涂层的清洁玻片上,迅速风干后置于40~45℃烘箱中2 h(如果使用石蜡切片则采用脱蜡程序)。

    2.3.2  用PBS洗3次,每次5 min;

    2.3.3  0.2 mol/L HCl处理20 min后用去离子水和PBS清洗;

    2.3.4  用蛋白酶K(proteinase K ,1 μg/ml)在37°C条件下处理10 min,再用PBS洗净;

    2.3.5  用4%多聚甲醛再次固定5 min,再用含有2 mg/ml甘氨酸(glycine)的PBS 溶液洗两次,每次15 min,PBS洗净;

    2.3.6  将标本放入40%去离子化的甲酰胺(formamide)/4xSSC 溶液中直到用于杂交;

    2.3.7  在标本上滴下20~30 μl的杂交反应液并保持在湿盒中15~17h,温度为 37℃。杂交反应液组成为:10 mmol/L Tris/HCl buffer(pH 7.3),0.6 mol/L NaCl,1mM EDTA,1xDenhardt's solution,250 μg/ml yeast tRNA,125 μg/ml salmon sperm DNA,10% dextran sulfate,40% deionized formamide,1~5 μg/ml  T-T-dimerized DNA probe。杂交反应液中不加入DNA探针则作为阴性对照。

    2.3.8  反应结束后用50% formamide/2xSSC洗5次,每次15 min。

    2.4  免疫组化操作

    采用鼠抗T-T IgG单克隆抗体作为一抗,HRP标记的二抗进行反应,通过标准的免疫组织化学方法,用DAB显色,用苏木素进行核染即完成(见图1)。过程中去掉使用鼠抗T-T IgG单克隆抗体的反应步骤同时也作为阴性对照。

    图1  大鼠胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA 在胰腺组织中的表达(苏木素核染,X550)

    Fig.1  Expression of rat pancreatic elastase Ⅱ mRNA in rat pancreas

    3  结果与讨论

    大鼠胰腺组织的外分泌腺细胞的细胞质被特异性染色,呈棕色,而细胞核以及内分泌部的细胞均显示阴性,除此外,其他部分的组织细胞同样显示阴性。实验中两种阴性对照的结果均显示阴性。研究结果提示大鼠胰腺外分泌腺细胞特异性的表达胰腺Ⅱ型弹性蛋白酶mRNA,而其他组织细胞不表达。

    这种运用T-T dimer特点进行原位杂交的方法具有很多优点。根据需要检测的mRNA的序列,可以任意合成相应的单链DNA探针,操作简便,适用范围广泛,不具有放射性,安全可靠,但在合成探针时应避免选择其中含有相邻T-T碱基的序列。合成的探针序列长度可以比较短,可以避免对探针进行标记的繁杂操作,因而合成的探针分子量较小,非常容易渗透进细胞中,灵敏度极高,特异性强。杂交完成后完全采用常规的免疫组织化学方法显色。在进行免疫染色前,可以在硝化纤维素膜(nitrocellulose filter)上进行点反应以确定使用抗体的合适浓度。抗T-T的抗体可进行不同的标记,灵活的选用两步或三步法进行,操作方便,并且可以根据需要进行多重染色(包括荧光染色),以及使免疫染色和原位杂交在同一张切片上同时进行,提供细胞蛋白质和mRNA表达情况的多重信息,进一步还可以运用这种方法进行Northern-blot等操作,或根据反应情况对目标基因片段进行定量检测。

【参考文献】
  [1]Koji T,Nakane PK. Localization in Situ of Specific mRNA Using Thymine-Thymine Dimerized DNA Probes.Sensitive and Reliable Non-radioactive in Situ Hybridization[J].Acta Pathologica Japonica,1990,40(11):793-807.

[2]Corinne M S, Patrice S, Lucien P,et al. Purification,Characterization and Substrat Specificity of Rat Pancreatic Elastase Ⅱ[J].Biochemica et Biophysica Acta,1995, 1 251:55-65.

日期:2013年2月27日 - 来自[2007年第2卷第1期]栏目

牛胰蛋白酶抑制剂的研究进展*

【关键词】  蛋白酶抑制剂

  蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)在蛋白质水解的调控中起重要作用。目前已发现100多种天然蛋白酶抑制剂。目前对丝氨酸蛋白酶抑制剂在其作用机制等方面都进行了系统的研究。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂结构和活性中心又将其分为Kunitz家族、Kazal家族、STI-Kunitz家族、hirudin及Serpins[1]。在丝氨酸蛋白酶抑制剂Kunitz家族中,均有一段保守的Kunitz结构域(Kunitz domain),其中牛胰蛋白酶抑制剂(bovine pancreatic trypsin inhibitor,BPTI)是研究得比较清楚蛋白酶抑制剂。本文复习近年来有关BPTI研究进展的国内外文献做如下综述。

  1 BPTI的结构

  Kunitz 家族来源广泛,自然界的动、植物及微生物机体内都发现此类抑制剂的存在。Kunitz 家族的代表是BPTI,它是研究最早的Kunitz型蛋白酶抑制剂。Kunitz在1936从牛胰脏中纯化并结晶[2],发现具有抑制激肽释放酶和胰蛋白酶的功能。它由58个氨基酸残基组成,分子内六个半胱氨酸形成3对二硫键,其活性中心为Lys15-Ala16-Arg17(赖氨酸15-丙氨酸16-精氨酸17,KAR)。其中一对二硫键(Cys14-Cys38)位于分子表面,它使两段肽链(Cys32-Cys42,Cys9-Cys21)连接在一起,这一对二键被还原和重新氧化后不影响抑制剂活力。另外两对二硫键(Cys5-Cys55,Cys30- Cys51)位于分子内部,一旦还原后即失活[3]。整个分子呈梨形,由两条反平行的β-折叠,两段α-螺旋,β-转角和一些环组成[4]。它最主要的结构特征是含有两片180度扭曲的反平行β-折叠,这个折叠分别和β-转角与一对二硫键(Cys14-Cys38)相连,这个分子的主要片段1~14和38~58残基沿着β2折叠来回弯曲折叠,以使末端残基1和残基58能够在β转角处相互靠近,二硫键的共价连接也使这两端靠拢并和β-转角(30~51残基组成)靠近。N端的残基形成了一个短的螺旋段,C端形成了一个更长的、有规律的α-螺旋(残基48~56)[4]。分子的自然折叠和半胱氨酸以独特的方式共价连接使整个分子变的紧凑、稳定[5]。分子内部含有一个能容纳4个水分子的疏水核心,这个分子的活性位点在一个溶剂暴露的环区(loop)。它由15 个氨基酸残基组成,这个环和酶活性位点高度互补,其中关键活性残基P1位点与丝氨酸蛋白酶的S1特异性束缚“口袋”中的酶活性位点结合。X-晶体衍射的方法测定了β-胰蛋白酶和BPTI在P1位点的10种突变体形成的复合物的结构[6],抑制剂的专一性是由P1位置氨基酸残基的性质决定的,P1位置是Lys或Arg的抑制剂对胰蛋白酶有抑制作用。

  2BPTI的生物学功能

  BPTI对丝氨酸蛋白水解酶具有广谱的抑制作用,能通过形成可逆性的酶-抑制物复合体抑制如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶、凝血酶及各种组织或血浆激肽释放酶等,每一复合物有特定的解离常数,解离常数越低,抑制其酶活性所需的BPTI浓度就低。(1)抑制中性粒细胞激活和脱颗粒具有抗炎作用:BPTI通过抑制人体多种以丝氨酸为活性中心的酶尤其是激肽释放酶、纤溶酶以及Ⅻ因子来抑制多路炎症反应途径[7]。可防止过氧化产物形成、内皮细胞损伤、保护脏器功能。(2) BPTI抑制循环中的纤溶酶,阻止血小板激活,保护糖蛋白受体及止血功能:能够抑制尿激酶型-纤溶酶原激活剂(u-PA)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤溶酶原的激活[8],保护血小板功能。并且可以直接与纤溶酶结合,从而使纤溶酶失活,减少术后大出血。(3)抑制激肽释放酶的激肽形成和血管活性效应,防止缺血再灌注损伤。(4)减少补体激活,抑制C3a和C5a产生。(5)BPTI在pH 1.1和10.5时,以单体占优势,在中性pH时以二聚体占优势。对高温、酸、碱和酶都很稳定,在稀酸中加热至100℃,在2.5%三氯乙酸中加热至80℃都未见活性损失。(6)等电点偏碱性,pH在10~10.5之间。

  3BPTI的临床应用

  丝氨酸蛋白酶的正常作用受到破坏或与机体自身存在的抑制剂之间的平衡发生异常,均会引起机体组织的损伤,用BPTI可对这些损伤进行防治。在临床上BPTI广泛用于急性胰腺炎、手术后器官功能衰竭以及再灌注损伤、早产、肺气肿、脑水肿、肿瘤的浸润和转移等疾病治疗和预防。

  3.1应用于急性胰腺炎的治疗急性胰腺炎发病时,胰腺中的血清淀粉酶、溶酶体酶、组织蛋白酶B以及苹果酸脱氢酶的水平均会显著增高,溶酶体酶、组织蛋白酶B能激活胰蛋白酶原,从而激活许多其他的消化酶,导致多种蛋白酶在胰腺内的过度累积,引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死等症状。炎性介质及毒素的进一步释放将导致全身的炎性反应综合征,严重时会出现多器官障碍。胰蛋白酶抑制剂可以抑制许多对导致急性胰腺炎起关键作用的酶,如胰蛋白酶、磷脂酶A、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等,并能抑制溶酶体酶,稳定溶酶体膜,从而起到对胰腺的保护作用。目前临床上应用的几种胰蛋白酶抑制剂类药物对急性胰腺炎均有显著疗效。

  3.2应用于心脏外科手术体外循环在心脏外科手术体外循环过程中机体处于一种非生理状态,同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的大量释放,体内很多丝氨酸蛋白酶释放也较多,而其抑制剂消耗较大,引起二者平衡的失调,导致凝血异常以及心脏、肺、肾等重要器官和血管的内皮损伤,并可引起术后出血、器官功能衰竭及再灌注损伤等。BPTI在心脏外科手术体外循环中既有抗凝血作用,又有止血作用:其抗凝血作用是因为它可以抑制舒血管素的活化,并可抑制激肽释放酶,间接抑制凝血因子Ⅻ的活化,阻断内源性凝血途径;其止血作用是由于它能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子,阻止纤维蛋白溶酶原的活化,同时可预防血小板损伤。另外BPTI还可通过降低纤维蛋白原的降解产物水平来减轻其对再灌注心肌的损害[9]。

  3.3应用于脑血管疾病的防治在临床上,脑水肿、脑缺血、蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛都是治疗的难题。有关BPTI的临床研究表明,BPTI有可能成为治疗上述疾病的新手段。防治脑水肿BPTI与类固醇激素具有相同程度的抑制脑血管通透性增高的作用,可明显地抑制脑含水量的增高[10],BPTI也可显著降低脑含水量及乳酸水平。其作用机制尚不明确,但基本认为是:(1)保护血脑屏障;(2)抑制溶酶体酶活化;(3)稳定细胞膜。另外,BPTI还可能通过阻止血液及脑组织中缓肽酶的生成,进而抑制花生四烯酸的释放,达到改善脑水肿的作用。防治脑缺血BPTI可防止因急性脑缺血所造成的ATP下降和脑水肿,减轻缺血时的代谢障碍,抑制血管活性物质的产生,从而改善缺血后再灌注时的充血情况。说明BPTI对脑缺血有保护作用。

  3.4应用于肺再灌注损伤的防治再灌注损伤在肺移植后期是个很严重的问题,再灌注过程中引起血管内皮细胞发生某些变化,激活沉积在夹紧的一侧肺上的中性粒细胞[11],活化的中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶,该酶能够使胶原蛋白分解,结果导致渗透性加速性肺水肿。BPTI对中性粒细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞组织蛋白酶G有抑制作用,并可以稳定溶酶体膜,避免损伤的进一步发展。

  3.5其他方面的应用(1)骨科的应用:柯广珍报道,用静脉滴注BPTI代替控制性降压在髋关节置换术中止血。选择40例患者分为两组,结果止血效果相同,但静滴BPTI组避免了控制性降压平均动脉压下降、心率增快的副作用,表明BPTI法优于降压法。王震宇等用BPTI与透明质酸钠联合应用治疗骨性关节炎,也取得了良好的效果。(2)预防肠粘连 :曹天生等取成年雌鼠,开腹,按Galili法制成小肠与子宫左前壁粘连模型,关腹前分别于腹腔内置入2.0ml生理盐水,50000kIU BPTI 2.0ml,两周后,开腹观察粘连程度。生理盐水组粘连率为95%,抑肽酶组为45% ,表明抑肽酶抑制肠粘连有效。丁敏等的实验报道也证明了,BPTI抑制肠粘连有良好效果。(3)用于预防感染引起的早产:因感染引起的绒毛膜羊膜炎是迫切早产的主要发病机制之一,炎性介质浓度过高以及随之而产生的多形核中性粒细胞弹性酶(PMNE)在其中有重要的作用[12]。临床实验证明BPTI可以通过抑制相关的炎性介质,如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)以及白介素8(IL-8),并抑制PMNE以防止早产。(4)抑制肿瘤的浸润与转移:肿瘤的转移是肿瘤的恶性特征之一,是大多数实体瘤患者死亡的主要原因。基底膜是细胞外基质的一种,其破坏是肿瘤浸润转移的标志。肿瘤细胞对基底膜的浸润可分为3步:黏附、溶解和转移。其中溶解过程是由蛋白酶降解瘤细胞下方的基底膜。由此可见,蛋白溶解酶在瘤细胞浸润、转移中的作用必不可少,其中多种丝氨酸蛋白酶浓度与肿瘤的侵袭呈正相关。研究证明,人体内许多肿瘤细胞上都有蛋白酶抑制剂的受体[13],BPTI与受体的结合能够调节纤维蛋白酶的活性,抑制其对蛋白质的分解作用,阻断肿瘤细胞的浸润和转移过程,并重新修复细胞屏障。此外,BPTI还可用于治疗肺气肿、关节炎等,在胰岛的移植过程中还可抑制各种丝氨酸蛋白酶的活性,从而提高移植的成功率[14]。

【参考文献】
    1Bode W,Huber R.Natueal protein proteinase inhibitors and their interaction with protein- ases.Eur J Biochem,1992,204:433-451.

  2Kunitz M.Isolation of crystalline protein compound of trypsin and of soybean tryp sininhibitor. Physiol,1946,10(8):311-320.

  3Barbar E ,Hare M,Makokha M. NMR-detected order in core residues of denatured bovine pancreatic trypsin inhibitor.Biochemistry , 2001,40(32):9734-9742.

  4Czapinska H ,Otlewski J, Krzywda S. High resolution structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor with altered binding loop sequence.J MOL Biol,2000,32(2):1237-1249.

  5Anruch W,Berndt KD ,Chavea M . The NMR solution structure of Kunitz-type proteinase inhibitors from the sea anemone Anemonia stichodactyle helianthus.Eur J biochem ,1993,212(19):675-684.

  6Hagihara Y,SHhiraki K,Nakamura T. Screening for stable mutants with amino acid pairs substituted for the disulfide bond between residues 14 and 38 of bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI) .J Biol Chem,2002,277 (52) :51043-51048.

  7Otlewski J, Jaskolski M, Buczek O, et al. Structure-function relationship of serine proteasepro- tein inhibitor interaction.Acta Biochim Pol ,2001,48(2):419-28.

  8Miler BE,Levy JH.The inflammatory response to cardiopulmomary bypass.Cardiothorac Vasc Anesth ,1997,11(3):355-360.

  9Kanayama N,Maehara K,She L.Urinary trypsin inhibitor sup-presses vascular smooth muscle contraction by inhibition of Ca2+ influx.Biochem Biophys Acta ,1998,1381(2):139-146.

  10Kamiya T,Katayama Y,Kashinagi F.The role of bradykinin in mediating ischemic brain edema in rats.Stroke,1993,24(4):571-576.

  11Tomohiro H,Yukio H.The effect of protease inhibitor on reperfusion injury after unilateral pulmonary ischemia.Transplantation,1998,55(2):254-258.

  12Kanayama N,Maradny E,Halim A.Urinary trypsin inhibitor supresses premature cervical ripening.Obster Gynecol Reprod Biol,1995,60(2):181-186.

  13Kobayashi K,Gotoh J,Hirashima Y.Inter-α-trypsin inhibitor bound to tumor cells is cleaved into the heavy chains and the l ight chain on the cell surface.J Biol Chem,1996,271(19):11362-11367.

  14Lu WT, Lakey JR, Juang JH, et al.Effect of trypsin inhibitor on islet isolation from fresh and cold preserved rat pancreas.Transplantation Proceedings,2003,35(1):488-489.

日期:2013年2月26日 - 来自[2012年第12卷第11期]栏目
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