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胶束纸色谱分离和鉴别槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯衍生物的研究*

来源:中国色谱网 作者:佘戟莫丽儿梁念慈 2007-5-18

摘要: 摘要目的:探讨胶束纸色谱法在分离、鉴别黄酮类及其水溶性衍生物中的应用。方法:采用高于临界胶束浓度(CMC)的十二烷基硫酸钠SDS溶液作展开剂,通过纸色谱分离和检测槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯衍生物,考察了SDS胶束浓度、有机改性剂及浓度、荧光强度对分离效果的影响。L-1的SDS胶束水溶液为适宜的胶束浓度,加入体积......


   

摘要 目的:探讨胶束纸色谱法在分离、鉴别黄酮类及其水溶性衍生物中的应用。
方法:采用高于临界胶束浓度(CMC)的十二烷基硫酸钠SDS溶液作展开剂,通过纸色谱分离和检测槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯衍生物,考察了SDS胶束浓度、有机改性剂及浓度、荧光强度对分离效果的影响。
结果:0.01~0.02mol.L-1的SDS胶束水溶液为适宜的胶束浓度,加入体积分数为2%~4%的异丙醇或正戊醇可以显著地改善样品分离效果;SDS溶液也使样品的荧光强度得到肯定的增强。
结论:SDS胶束纸色谱法可以简便、快速、准确、定性地检测和分离黄酮类及其水溶性衍生物。

 

  槲皮素(quercetin)、金雀异黄素(genistein)同属于黄酮类化合物,具有广泛的抗肿瘤、抗血小板、抗氧化等药理作用[1~2]。因不溶于水,使其在研究和应用中受到限制。本研究组将槲皮素、金雀异黄素转化为水溶性的硫酸酯钠并探讨了它们的生物活性变化[3]。文献报道
[4~5],检测植物成分中的黄酮类硫酸酯盐成分时多采用纸上电泳法,但此法测定样品时需在电压300V,电流10mA下通电4h的条件下进行。操作繁锁,周期较长,并对不带电荷的成分难以监测。胶束色谱(micellar chromatography,MC)是一种新型的色谱技术,因用含有高于临界胶束浓度、具有两性的表面活性剂作流动相,适用于分析结构和性质差别细微的样品,对带电成分和非带电成分均有较好的分离选择性[6]。本实验采用胶束纸色谱分析槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯衍生物,并对影响胶束纸色谱分析和分离的某些因素进行了考察。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

  槲皮素(Q)、金雀异黄素(G)均为美国Sigma公司产品;槲皮素-7-硫酸酯钠(Q1)、槲皮素-7,
4′-二硫酸酯二钠(Q
2)、金雀异黄素-7-硫酸酯钠(G1)、金雀异黄素-7,4′-二硫酸酯二钠(G2)均为本室合成,结构经FAB-MS,1 H-NMR,13C-NMR确定;十二烷基硫酸钠(SDS)为上海化学试剂采购供应站日本进口分装;其它试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

  精确配制SDS浓度为0.0081,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05mol.L-1的水溶液作为展开剂(0.0081mol.L-1为SDS的CMC)进行实验,并在一定浓度下依次分别加入体积分数为2%,4%,6%,8%的甲醇、异丙醇、正戊醇、正丁醇、冰乙酸。新华三号滤纸切割成2.5cm×12cm的纸条,毛细管点样。药品溶解在甲醇中,展开前层析缸密闭,以展开剂蒸气饱和1h,上行法展开约10cm左右。
点样量:Q,Q
1,Q2均为0.5μl,而G,G1,G2则均为2μl(因G,G1,G2的检出灵敏度较低)。

1.3 显色

  以10g.L-1FeCl3溶液喷洒后,各药品点显紫黑色,以初步鉴定样品酚型结构的存在。在365nm的紫外光照射下,对原始样品点、非SDS溶液展开并经50g.L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点、SDS胶束水溶液展开并经50g.L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点,3种不同情况下的荧光表现进行比较。结果见表1,图1,图2。

1.4 数据处理

  每次做两组平行实验,测2次,共4个Rf值,求其平均值及标准差。以SDS浓度为横坐标,相应浓度的Rf为纵坐标,求出直线回归方程,所有数据均进行t检验

2 实验结果

2.1 胶束浓度对药品迁移的影响

  以0.0081,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05mol.L-1的SDS胶束水溶液作展开剂进行实验,常温下得结果见表1。

表1 药品在不同浓度的SDS水溶液中的Rf值.±s,n=4

浓度

   Q

Q1

   Q2

   G

   G1

G2

(mol.L-1)

   (P<0.05)

0.0081

 0.08±0.012

0.14±0.041

0.48±0.031

0.34±0.056

0.47±0.035

0.85±0.031

0.01

 0.08±0.021

0.13±0.015

0.50±0.058

0.37±0.036

0.46±0.05

0.80±0.032

0.02

 0.14±0.042

0.11±0.008

0.46±0.057

0.64±0.016

0.44±0.042

0.77±0.031

0.03

 0.23±0.007

0.11±0.012

0.43±0.056

0.76±0.04

0.41±0.016

0.73±0.041

0.04

 0.27±0.025

0.10±0.013

0.37±0.05

0.86±0.034

0.56±0.006

0.78±0.008

0.05

 0.29±0.01

0.11±0.008

0.35±0.042

0.89±0.029

0.44±0.021

0.73±0.018

图1 Q、Q1、Q2间的△Rf值与SDS浓度的关系

图2 G、G1、G2间的△Rf值与SDS浓度的关系

  从图1可见,随着胶束浓度的增加,Q和G的Rf值增加,且G的Rf值增幅尤其显著;但Q1,Q2,G1,G2则随胶束浓度增加,Rf值均呈下降趋势,迁移速度减慢。样品间的分离效果通过其△Rf值能够充分体现出来,△Rf值越大,则反映样品间的分离效果越好,从图1可见,△Rf(QQ2)值和△Rf(Q1Q2)随SDS浓度增加而降低,在低浓度下有较大的△Rf值,但△Rf(QQ1)随SDS浓度呈曲线状态,在较大的SDS浓度情况下有较好的分离效果。
从图2中也表出相似的结果,△Rf(G
1G2)随SDS浓度增加逐渐下降,虽然△Rf(GG2)随SDS浓度增加呈U型变化,但无论△Rf(G1G2)还是△Rf(GG2)都是在低浓度时有最大的△Rf值,而△Rf(GG1)同样是随SDS浓度增加而增加。
总结以上结果,从△Rf值和斑点效果上综合考虑,无论对槲皮素及其衍生物还是金雀异黄素及其衍生物,选择浓度为0.01~0.02mol
.L-1的胶束水溶液用于分离和鉴定是适宜的,此时,所有的△Rf值均大于0.05。

2.2 有机改性剂对药物迁移的影响

  单独使用SDS溶液作为展开剂,所有样品均有不同程度的拖尾现象存在,且随SDS溶液浓度的增大,拖尾现象愈明显,Q,G二样品的拖尾情况尤其严重。
为了减少拖尾,改善分离效果,我们在0.01,0.02mol
.L-1的SDS胶束水溶液中,分别加入体积分数为2%,4%,6%,8%的甲醇、异丙醇、正丁醇、正戊醇和冰乙酸作为改性剂进行分离效果考察。实验显示,随着有机改性剂的加入,各硫酸酯衍生物的迁移速度都有不同程度的降低,但对Q和G则有少许增强,影响不大。如:当在0.02mol.L-1的SDS胶束水溶液中加入体积分数为4%异丙醇,则Q,Q1,Q2和G,G1,G2的△Rf值分别为:0.12,0.11,0.36,0.58,0.68,0.86。从斑点效果看,甲醇、正丁醇、冰乙酸作为有机改性剂对样品拖尾现象没有多大改善;不同体积比的异丙醇、正戊醇则在一定程度上改善了展开中的拖尾现象。异丙醇对4种硫酸酯衍生物有较满意的改善效果,而正戊醇则更有利于Q和G的斑点改善。但当有机改性剂在展开剂中占的比例越大,则对斑点效果的改善越不明显。异丙醇或正戊醇在展开剂中所占的比例为2%~4%之间为适宜。

2.3 胶束水溶液对药物荧光的影响

  各样品在不同展开剂下受紫外光照射所表现的荧光情况,见表2。

表2 槲皮素、金雀异黄素及其衍生物在不同展开剂下的荧光比较(365nm)

展开剂

Q

Q1

Q2

G

G1

G2

甲醇溶液

黄色

黄色

黄色

紫红色

紫红色

紫红色

非SDS溶液+

淡黄色

土黄色

黄绿色

淡兰绿色

淡黄绿色

青兰色

5%AlCl3

 

 

 

 

 

 

SDS溶液+

亮绿色

亮橙黄色

亮橙黄色

淡兰绿色

黄绿色

亮青兰色

 5%AlCl3

 

 

 

 

 

 

3 讨 论

  Armstrong等[6]认为在胶束流动相中有静电、疏水、立体3种效应在起作用,由此使胶束溶液具有独特的选择性,可同时分离亲水物质和疏水物质。Q为五羟基黄酮醇,G为三羟基异黄酮,皆不溶于水,但Q1,Q2,G1,G2则均为溶于水的硫酸酯钠衍生物。因此,选择合适浓度的SDS胶束水溶液,就能够有效地分离和鉴别槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯钠衍生物。
在正相胶束色谱中,溶质的分配是在固定相、水相、胶束相三相之间进行的,极性大的分子分配于胶束外部水相中,极性小的分子分配于胶束内部空腔中
[7],这样,混合物中不同性质的物质在胶束水溶液中展开时的迁移速度是不一样的。
实验结果表明,在同类物质的比较中,Rf(Q
2)>Rf(Q1)、Rf(G2)>Rf(G1)。因为Q2和G2为二硫酸酯二钠,极性和亲水能力皆大于同类的一硫酸酯钠Q1和G1。但比较不同类的物质时,在相同浓度的SDS胶束水溶液中,Rf(G)>Rf(Q),G的Rf值随SDS水溶液的浓度增加获得显著增加,而Q的Rf值则随SDS水溶液的浓度增加而上升缓慢;在Q1和G1,Q2和G2之间,相同浓度的SDS水溶液中,Rf(G1)>Rf(Q1),Rf(G2)>Rf(Q2),这显然是因为Q和G分属于不同类的黄酮化合物,分子的立体结构不同导致G的疏水性远强于Q的疏水性,使G更容易进入胶束的疏水空腔,迁移速度随之增大。但硫酸酯钠衍生物Q1,Q2和G1,G2由于与SDS胶束具有相同的电荷,相互之间存在着静电斥力,与SDS胶束水溶液的作用属于反键合型,随着SDS水溶液的浓度增加,这种作用的静电斥力也随之增加,使样品亲附流动相的能力减弱,导致它们的Rf值随SDS水溶液的浓度增加而有一定的降低。而Q和G分子中并无电荷,因此随SDS水溶液的浓度增加,Q、G的Rf值也增加。
胶束纸色谱作为一种分配色谱,由于固定相吸附力较强,而流动相运载能力较弱,导致样品斑点存在拖尾,因此,加入少量有机改性剂润湿固定相,可以减少拖尾,改善分离效果。在本实验条件下,加入体积分数为2%~4%异丙醇可令Q
1,Q2,G1,G2 的迁移斑点圆而清晰,可有效抑制拖尾现象;加入体积分数为2%~4%的正戊醇,则令Q,G样品的斑点效果得到改善。有机改性剂实际上是通过改变原来溶质的分配性质而起作用的,故过多的有机溶剂加入会使胶束溶液的流动相变性,导致胶束溶液的分配性质趋于复杂,斑点效果反而难以得到改善。
由于SDS胶束水溶液使槲皮素、金雀异黄素及其硫酸酯钠衍生物的荧光强度得到肯定的增强,因此,通过荧光检测上述样品的灵敏度也得到提高。当不同样品间的△Rf值较小时(如Q
2和G1),提高荧光分析能力能进一步有效地鉴别分离样品。
胶束纸色谱操作简便、省时、无环境污染,只要选择适宜的SDS水溶液的浓度,加入一定量的有机改性剂,采用荧光检测法,就能准确、有效地分离和鉴别结构和性质差别细微的黄酮类硫酸酯衍生物,这为研究和应用水溶性黄酮类化合物提供了又一简便、快速、准确的分析方法。

*本课题为广东省重点学科专项基金[粤高教科(1996)4号]和广东医学院青年科学基金[广东医科青9704]共同资助项目

作者单位:佘戟 莫丽儿 梁念慈 (湛江524023广东医学院化学教研室)

参考文献

 [1] Ioku K,Tsushida T,Takei et al.Antioxidative avtivity of quercetin and quercetin monoglucoside in solution and phospholipid bilayers.Biochim Biophys Acta,1995,1234(4):99.
 [2] Barnes S,Peterson TG.Biochemical targets of the isoflavone genistein in tumor cell lines.The Society for Experimental Biology and Medicine,1995,208:103.
 [3] 佘戟,莫丽儿,宋芝娟,等.水溶性槲皮素的研究.中国药物化学杂志,1997,7(1):53.
 [4] Hannoufa A,Brown RH,Ibrahim RK,et al.Variations in flavonoid sulphate patterns in relation to photosynthetic typrs of five FLAVERIA species.Phytochemistry,1994,36(2):353.
 [5] Ahmed AA,Mabry TJ.Flavonoids of IPHIONA SCABRA.Phytochemistry,1987,26(5):1517.
 [6] Armotrong DW,Nome F.Selectivity in pseudophase liquid chromatography.Anal Chem,1983,55:2317.
 [7] 刘汉成,王丽丽,张炜,等.胶束反相HPLC最佳化研究.分析测试通报,1990,9(5):63.

(收稿:1998-03-17)

 

 


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