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调控基因表达的 miRNA

来源:科学通报 作者: 2006-12-21

摘要: microRNAs(miRNAs)是一类长约22核苷酸的非编码的单链RNA分子,它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。1993年,Lee等人用经典的定位克隆的方法在线虫(C。elegans)中克隆了lin-4基因,并通过定点突变发现lin-4并不编码蛋白,而是产生一种小RNA分子。这种小RNA分子能以不完全互补的方式与其靶mRNA的3‘非翻译端的特定区......


  micro  RNAs  (miRNAs)  是一类长约22核苷酸的非编码的单链  RNA  分子,它们广泛存在于从植物、线虫到人类的细胞中。最早发现的是  lin-4  和它的靶  mRNA,即  lin-14。1993年,Lee  等人用经典的定位克隆的方法在线虫  (C.  elegans)  中克隆了  lin-4  基因,并通过定点突变发现  lin-4  并不编码蛋白,而是产生一种小  RNA  分子。这种小  RNA  分子能以不完全互补的方式与其靶  mRNA  的3'非翻译端的特定区域相互作用来抑制  lin-14  的表达,最终导致  lin-14  蛋白质合成的减少,这种现象叫做转译抑制。通过转译抑制,  lin-4  控制着  C.elegans  幼虫由  L1  期向  L2  期的转化。为什么一个只有22  nt  的  RNA  分子起着如此重要的调节作用?当时人们无法解释,只能认为是一种稀少的个别现象。但是,2000年第2个  miRNA  let-7  及其人类和果蝇中同源物的发现改变了人们的看法,  miRNA  可能是一类进化上保守的、在生命中起着重要调控作用的分子。它们能有效地抑制相关蛋白质的合成,导致靶  mRNA  的降解,或者其他形式的调节机制来抑制靶基因的表达,产生基因沉默。近年来发现  miRNA  可能在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用,miRNA  序列、结构、丰度和表达方式的多样性,使其可能作为蛋白质编码  mRNA  的强有力的调节子。miRNA  的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识,补充了在  RNA  水平对靶  mRNA  分子进行更迅速和有效的调节,展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。miRNA  的发现也是对中心法则中  RNA  次要的中介角色的重要补充,它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其发育等方面的重要问题。  



1  miRNA  的产生  



  迄今为止,在植物、线虫、果蝇和哺乳动物中已发现了一千多个  miRNA  基因(见表1)。这些  miRNA  基因首先在细胞核内转录成前体转录本  (pri-miRNA),并被加工成前体  pre-miRNA,然后被转运到细胞质被加工成成熟的  miRNA  (见图1)。Lee  等人第一次证明一大类  miRNA  由多聚酶Ⅱ  (Pol  Ⅱ  )转录,而且一些  miRNA  的转录本(如  let-7  )具有5'帽和3'  poly(A)  的结构,Pol  Ⅱ  的抑制剂能够抑制  pri-miRNA  的积累,而  Pol  Ⅱ  能与  miRNA  的启动子免疫共沉淀。Rodriguez  等人在基因组水平对  miRNA  的转录也进行了分析,哺乳动物中由内含子编码的  miRNA,其转录酶应该是  PolⅡ,Rodriguez  等人检测的  miRNA  与90个蛋白编码基因有关。但是并不能排除  miRNA  还有其他多聚酶,寻找与  miRNA  相关的其他聚合酶还有待进一步的研究。Pri-miRNA  在核内被  RNase  Ⅲ  核酸酶  Drosha  加工成长约70  nt  的发夹状的  pre-miRNA。最近的报道指出,Drosha  和另外的一些成分(如人类中的  DGCR8  蛋白、果蝇中的  Pasha  蛋白)构成一个微小  RNA  处理器  (microprocessor)  的复合体,pri-miRNA  在这个  microprocessor  中被加工成  pre-miRNA。关于在  pri-miRNA  之前  miRNA  基因的转录本是如何加工的,人们所知甚少。线虫  miRNA  基因  let-7  前体是一个相对较长,且具有  poly(A)  结构,Bracht  等人发现  let-7  转录本经历一个反式剪辑  (trans-splicing)  的过程,生成一个叫做  SL1RNA(spliced  leader1)  的中间体。pre-miRNA  在  Exportin5  的帮助下从核进入胞质内,这个过程还需要一个  G  蛋白因子  Ran  参与。能与  exportin5  结合的  pre-miRNA  必须具有大于16  nt  配对的茎和3'末端有2个悬垂碱基的结构特点,末端如果是5'悬垂碱基将会抑制  exportin5  对它的转运。胞质中  pre-miRNA  在  Dicer  酶的作用下,被切割成双链的  miRNA:miRNA*  配对分子,然后成熟的  miRNA  分子被解链,单链的  miRNA  进入一个核糖蛋白复合体  miRNP  (也叫  RISC),miRNA  通过与靶基因的3'  UTR  区互补配对,指导  miRNP  复合体对靶基因  mRNA  进行切割或者翻译抑制。  



2  寻找  miRNA  基因  



2.1  克隆方法寻找  miRNA  基因  



  2001年  miRNA  研究开始飞速发展。Lagos-Quintana  等人设计出一种专门克隆小片段  RNA  的方法(见图1(a)),在2  h  的果蝇胚胎的裂解液里和  Hela  细胞的总  RNA  中克隆了37个新的  miRNA  基因。Lau  等人用稍微改进的克隆方法在线虫中找到了55个  miRNA  基因。Lee  等人运用生物信息学和  cDNA  文库相结合的方法找到了13个  miRNA。随后掀起了寻找  miRNA  基因的热潮。Lagos-Quintana  等人继续他们寻找  miRNA  基因的工作,2002年和2003年用同样的方法分别在小鼠和人特异组织中克隆了34和31个新的  miRNA,并提出由于在克隆中已知的  miRNA  重复出现和  rRNA  的干扰,用同样的克隆方法找到新的  miRNA  会越来越难,这与后来  Lim  等人用  MiRscan  计算机程序估计人类中只剩下40个未知  miRNA  基因的结论一致。近来,寻找  miRNA  的方法越来越成熟,Ambros  等人对克隆寻找  miRNA  的方法进行了总结。  



  继而,人们将寻找  miRNA  基因的目光转向特异的组织和发育的特异阶段。Mourelatos  等人用小片段克隆的方法在  HeLa  细胞中克隆了31个  miRNA,Houbavity  等人在小鼠  ES  细胞中克隆了15个  miRNA,Dostie  等人和  Kim  等人在哺乳动物神经细胞中分别找到了53和40个  miRNA,Ambros  等人在线虫中又找到21个  miRNA,Aravin  等人在果蝇的不同发育阶段找到了63个  miRNA,Wang  等人在籼稻中找到了20个  miRNA  基因。Pfeffer  等人在  EB  病毒的基因组中,找到5个编码  miRNA  的基因,这为  miRNA  基因家族添加了病毒中的成员。最近研究人员又在另3种病毒中找到了29个病毒  miRNA。Suh  等人在人胚胎干细胞中找到了36个  miRNA  基因,这些  miRNA  随着胚胎的发育表达量逐渐减少。Seitz  等人在人的  14q32  区域找到46个  miRNA  基因,发现它们多数在人的胚胎中表达,只由母性染色体表达,并且受到上游200  kb  处的一个甲基化区域  (IG-DMR)  调节。Kasashima  等人运用克隆的方法检测了  TPA  诱导人白血病细胞  HL-60  分化前后  miRNA  表达谱的变化,找到了3个新的  miRNA,并发现不同  miRNA  在分化前后表达量不同。现在科学家们已在不同的种属中克隆了大量的新  miRNA  基因。  



2.2  检测  miRNA  表达的方法  



  检测  miRNA  最常用和直接的方法是  Northern  杂交,除此之外,还有  RT-PCR,液相杂交和基因芯片技术等。Lee  等人通过  Drosha-siRNA  下调  Drosha,抑制  pri-miRNA  的加工,再用  RT-PCR  的方法检测  miRNA  的表达。Sempere  等人通过  Northern  杂交的方法对已知的119个  miRNA  基因的表达做了检测,发现有一些是在特异的组织表达,有一些只是在不同组织的表达量不一样,而在脑组织表达的  miRNA  的作用方式表明这些  miRNA  与脑神经元的分化相关。  Allawi  等人将荧光方法引入  miRNA  的研究中,设计出一种新的方法叫“Modified  Invader”分析,可快速而灵敏地分析  miRNA,能从50~100  ng  总  RNA  或者是1000个细胞的裂解液中检测到目的  miRNA。  



  miRNA  基因芯片技术是一种更理想的快速有效的检测  miRNA  表达图谱的方法。这一方法被  Liu  等人首次报道用来检测  miRNA  在不同肿瘤细胞中的表达图谱,245个哺乳动物的  miRNA  被检测了,结果的重复性很好,而且被  Northern  杂交、RT-PCR  所证实。之后,Esau  等人运用  miRNA  芯片技术,检测细胞内的  miRNA  表达图谱,并且找到了  miR-143  和它的靶基因。Calin  等人通过  miRNA  芯片技术,比较了哺乳动物中  B  细胞淋巴瘤和正常细胞中  miRNA  的表达图谱,为  miRNA  在肿瘤临床应用中,提出了新的思路。Miska  等人运用  miRNA  芯片检测了小鼠脑发育中138个  miRNA  基因的表达图谱。在芯片的基础上,Nelson  等人发展出一种叫做  RAKE  (RNA-primed,array-based  Klenow  enzyme  assay)  的方法能够在特定的细胞和肿瘤中同时检测所有的  miRNA  的表达图谱。  



  原位杂交技术用来检测  miRNA,更直观的展示出  miRNA  的表达方式,是了解  miRNA  的时空表达谱更方便的方法。Johnson  等人通过在  let-7  启动子后加  GFP  基因来跟踪检测线虫中  let-7  的时空表达。  Mansfield  等人根据  miRNA  的作用机制设计出一种带  Laz  报告基因的检测方法,被叫做“miRNA  sensor”,能特异的从原位检测到  miRNA  的表达。  



2.3  计算机软件预测  miRNA  基因  



    miRNA  是由一个约70  nt  的茎环结构前体而来,并且在进化上是保守的,因此可用计算机的方法来识别。  



  MiRscan  是一个能特异的识别2个物种间的同源序列的程序。Lim  等人用它在  C.elegans  和  C.  briggsae  中寻找到同源的发卡结构,通过已知  miRNA  的训练后,它去给那些发卡结构片段打分,以预测线虫中的  miRNA。Lim  等人用同样的方法,在脊椎动物里寻找  miRNA  基因,并预测出人的  miRNA  基因数在200~255之间,这个数字大约是人类基因组的1%。2004年,MiRscan  程序又被用来检测了线虫中  miRNA  基因上下游序列的同源性,和内含子中产生  miRNA  的寄主基因的同源性  (host  gene),并且找到了一个非常一致的序列模块,运用这个不断改进的  MiRscan,又在线虫中发现了9个  miRNA,并被  PCR  实验所证实。  



  MiRseeker  是根据  miRNA  的3个特点开发出来的:(i)  miRNA  的保守性,需要形成一个70~100  nt  的前体;(ii)  在相似的物种中,miRNA  是很保守的;(iii)  在相距较远的物种间,miRNA  是有一定的分歧的。它包括以下3个步骤:(i)  通过  AVID  寻找果蝇中基因间的保守的序列;(ii)  通过  mfold  辨认此序列是否能形成保守的茎环结构,并给这个结构打分评价;(iii)  评价  miRNA  在不同物种中的分歧模式。最后,miRseeker  也需要通过生物化学的方法,加以验证。  



  Legendre  等人用“ERPIN”代替“blast”从基因组中搜寻与已知  miRNA  类似的  miRNA  基因,输入已知  miRNA  软件可以根据已知  miRNA  的结构从基因组中搜寻到结构类似的候选  miRNA  基因。  



  除了专门用于寻找  miRNA  基因的程序和软件外,象  mfold  和  Srnaloop  是  RNA  折叠中常用的软件。Hofacher  等人报道在维也纳  RNA  网站  (http://rna.tbi.univie.ac.at/)  提供了一个界面能够调用多个常用的  RNA  二级结构预测软件。  



2.4  miRNA  的命名及  Rfam  数据库  



  miRNA  种类越来越多,而且在研究中发现,很多  miRNA  是同源的,为了防止  miRNA  的混淆,最初的研究者就给发现的  miRNA  作了命名规则:  



  (i)  miRNA  简写成  miR-No.,它的基因简写成  mir-No.;  



  (ii)  高度同源的  miRNA  在  No.  其后加英文字母(小写,一般从  a  开始);  



  (iii)  多基因拷贝的再在后面加  -No.  (如  miR-2a-1)。  



  之后人们又对命名规则作了补充。不同物种中同源的  miRNA  最好用同一个名字;如果一个前体的2个臂分别产生1个  miRNA,则根据克隆实验,看看哪个是主要的成熟产物,次要的在后面加“*”号,如  miR-56  和  miR-56*  (*表示量少的);如果不能区分表达量的多少,可以如下表达,如:miR-142-5p  (表示在5'端的臂,以前有人用  miR-142-s)  和  miR-142-3p  (表示3'端的臂,以前有人用  miR-142-as)。在  Rfam  数据库中,在每个  miRNA  名称前加上了物种的名称,如:hsa-miR-138。植物中  miRNA  的基因用斜体表示,如  MIR156。  



  为了更好地管理  miRNA,方便人们查询,研究者们建立了  miRNA  的数据库  http://www.sanger.ac.uk/  Software/Rfam/mirna/。现在这个数据库已经更新到了6.0版本(2005年4月),共有1650个  miRNA  (见表1)。  Rfam  只有在文章发表后才给新发现的  miRNA  一个确定的名字,在发表前作者可以用一个临时的名字命名送审。  



3  miRNA  的靶基因  



  虽然现在已经找到了过千个  miRNA,并提出它们在细胞增殖、分化、代谢与死亡中发挥着重要的调节作用,但是至今为止,真正确认功能的  miRNA  还是微乎其微。从1993年发现第1个  miRNA  到现在,在动物中发现的确认功能的  miRNA  不超过10个(见表2)。  



3.1  基因筛选和定位克隆寻找  miRNA  靶基因  



  通观科学家们寻找  miRNA  及其靶基因的方法发现,现在已知靶基因的  miRNA  多是通过传统的基因筛选  (gene  screen)  和定位克隆的方法发现的(见图2)。Brennecke  等人发现  bantam  基因及其靶基因  hid,包括典型的如下几个过程:(i)  Bantam  基因表达  miRNA  的证据:(1)  通过插入突变,找到  bantam  这个位点,能够促进组织过度生长;(2)  bantam缺陷的个体,具有生长缺陷或者是蛹化期致死;(3)  在  2  个物种间比对  (在  Drosophila  与  Anopheles  用  Clustal  W  程序比对),发现一个约90  nt  的区域非常相似,有  30/31  nt  是相同的,再用  mfold  进行预测发现2个物种内的这段区域能形成相似的稳定的发卡结构;(4)  用这31  nt  作探针,通过  Northern  杂交在野生和  Gal4  诱导表达的  L3  期中找到这个21  nt  RNA  和它的更大的前体。(ii)  证明  hid  是  bantam  的靶基因的过程:(1)  用计算机预测的方法找到前凋亡基因  hid  的3'  UTR  区,有3个能与  bantam  作用的靶点,而且直接观察发现还有2个靶点;(2)  对比这些3'  UTR  区在2个物种的同源性  (D.pseudoobscura  与  D.melanogaster),发现它们高度同源;(3)  表达报告基因  tubulin-EGFP,在它的末尾连上  hid  的3'  UTR  区的靶点,同时转入  EP  表达的  bantam,发现  GFP  荧光明显下降,而且5个靶点同时存在的效果要比单个的好;(4)  同时表达  bantam  和  hid,通过原位杂交,能检测内源表达的  hid  也能被  bantam  抑制。根据一个  miRNA  可能调节多个靶基因的观点,发现  bantam  能够促进细胞的增殖,很可能  bantam  还具有一个细胞增殖负调控的靶基因。  



  Chen  等人的方法略有不同。他们先用  miRNA  的  cDNA  克隆的方法在小鼠骨髓中克隆了100多个  miRNA,并且特别的研究了其中3个的功能。结果发现在造血干细胞中异位表达  miR-181  能够促进造血干细胞的定向分化,但是没有找到它的靶基因。Xu  等人通过  P  插入元件找到突变子,发现具有死亡抑制的功能,并证明编码  miR-14。通过功能缺失和异位表达的方法,证明  miR-14  有着抑制  reaper  导致的细胞死亡和参与脂肪代谢的功能。实验提出  miR-14  可能的靶点是  Drice,但没有直接的证据证明。  



3.2  计算机程序对靶基因的预测  



  从已有的资料看来,传统的方法寻找  miRNA  的靶基因比较艰难,由于目标不明确,效率较低。研究人员想到用生物信息学的方法来取代大量的分子克隆的工作,并且获得很好的目的性。  



  Stark  等人的方法是首先构建一个在  D.melanogaster  和  D.pseadoobscura  中保守的3'  UTR  数据库,能覆盖  D.melanogaster  三分之二的基因。用  HMMer  比对程序,找到能与  miRNA  前8个碱基配对的3'  UTR  靶序列;然后再用  mfold  对整个  miRNA:  mRNA  靶序列进行动力学检测,并给出  AG  值;最后计算  Z  值,取  Z≥3  作为筛选靶序列的阈值。通过这一程序成功的在数据库里找到5个已知的  miRNA  和它们的靶基因,同时预测出3个新的  miRNA  和它们的靶基因:miR-7  和  Notch,miR-2  和前凋亡基因、  miR-277  和代谢酶类(但随后的生物学实验证据并不强)。结果可在  http://www.russell.embl.de/miRNAs  查询。  



  Enright  等人开发出一种计算机预测的方法:先从  D.melanogaster  和  D.pseadoobscura  中通过  blastn  和  AVID  比对构建出3'  UTR  序列库;然后用  MiRanda  算法评价,MiRanda  是一个类似于  Smith-Whatman  的算法,但它是用来检测互补配对的(其中允许  G  :  U  配对),此外这一算法还加入了  RNA  二级结构预测的程序(来源于  RNAlib  ),能够从动力学角度预测  miRNA  :  靶  mRNA  的稳定性;再将前面的结果在3种生物中检验保守性  (D.melanogaster,D.pseudoobscura  和  A.gambiae),最后给出  S  值和  ΔG  值。这个方法考虑了以下几个特点:(i)  局部位置的互补比对;(ii)  RNA-RNA  双链自由能的预测;(iii)  靶位点的保守性。结果显示,靶基因多是发育阶段特异表达的、与细胞分化、形态、发育协调相关的基因,而且有很多是转录因子。其中,作者提出3'  UTR  调节很类似于转录中的5'  promoter  的调节,这说明在这2个机制之间可能有一定的联系。结果可在  http://WWW.microrna.org  查询。  



  Lewis  等人开发了一个计算机预测的方法——TargetScan  法,用来预测哺乳动物内  miRNA  的靶基因。这一方法基于2点考虑:(i)  考虑  miRNA  :  mRNA  (靶向基因  mRNA  片段)双链结构的稳定性;(ii)  检测这些靶向基因  mRNA  的3'  UTR  区在不同物种间的保守性。此搜索方法重点强调了  miRNA  的第2~8个碱基,将这段序列作为搜索的“种子序列”,必须严格配对;然后用  RNAfold  程序向两边延展寻找配对的序列;通过  RNAeval  给出自由能  G  值;最后给出  Z  值和  R  值,Z  值越大,R  值越小,靶向的可能性就越大。通过对在人、小鼠、大鼠中保守的  miRNA  的搜索,找到了451个可能的  miRNA  靶向序列;通过对人、小鼠、大鼠、河豚4种动物中保守的  miRNA  搜索,找到了115个可能的靶向序列。结果可在网上查询  http://genes.mit.edu/targetscan。  



  Kiriakidou  等人开发一个“DIANA-microT”  的程序,通过计算机的方法来预测哺乳动物中  miRNA  的靶基因。Rehmsmeier  等人开发了一个“RNA-hybrid”的程序,来预测果蝇的  miRNA  的靶基因,他们的信息公布在互联网上  (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)。PicTar  是由  Krek  等人开发的预测  miRNA  靶基因的软件,他们搜索了8个脊椎动物物种的基因组和现有的  miRNA,它对靶基因预测具有较高的准确性。  



  John  等人运用  miRanda  软件预测了218个哺乳动物的  miRNA  基因的靶基因,发现有2000个的哺乳动物的基因有着保守的3'  UTR  靶点,这些蛋白多数涉及转录因子、miRNA  机制本身相关的蛋白、泛素机制相关的蛋白,这些可能的靶蛋白说明  miRNA  的作用构建了一个反馈调控网络,并且根据他们的预测,占基因组数量1%的  miRNA  基因可能调控着10%的基因组蛋白。预测软件在互联网上  (http://www.microrna.org)。  



  综合人们用计算机的方法预测  miRNA  的工作,发现各种计算方法都具有如下的特点:(i)  miRNA  及其靶向序列的保守性;(ii)  miRNA:靶  mRNA  配对中5'端非常重要,其他位置允许  G  :  U  配对;(iii)  miRNA  与靶向基因可能是一对多的关系。通过计算机预测出的  miRNA  靶基因,如表3所示。  



4  miRNA  的作用机制及功能  



4.1  miRNA  的作用机制  



  miRNA  转录前体  (Pri-miRNA)  首先在核内被  Rnase  Ⅲ  核酸酶  Drosha  加工成约70个核苷酸长的发夹状的  RNA,在  Exportin5  的帮助下从核内进入胞质内,然后在  Dicer  酶的作用下,单链的  miRNA  进入一个核糖蛋白复合体  miRNP,David  将其与  RISC  等同。  miRNA  通过与靶基因的3'  UTR  区互补配对,指导  miRNP  复合体对靶基因  mRNA  进行切割或者翻译抑制。MiRNA  到底是抑制还是切割取决于  miRNA  与靶序列互补配对的程度,互补配对高的可能进行切割,而配对低的就只是抑制。植物的  miRNA  与靶基因配对程度高多数是进行切割,而动物中  miRNA  与靶序列的配对性不好,多数进行翻译抑制。  



  线虫中,lin-4  RNA  并不降低  lin-14  和  lin-28  的  mRNA  水平,但能降低它们的蛋白水平。Let-7  也通过与  lin-41  的3'  UTR  区配对,来抑制  mRNA  的表达,并不进行切割。现在普遍认为,细胞中的  miRNA  能与靶基因  mRNA  的3'  UTR  部分配对,指导  miRNP  对其翻译的抑制。这与现在所知的真核基因的翻译调控主要是在3'  UTR  区域的思想一致,最近  Xie  等人在人、小鼠、大鼠和狗的基因组比对分析指出,在3'  UTR  区域存在大量的调节结构域,而近一半的这些调节结构域与  miRNA  的调节有关。其中  miRNA  的5'端的2~8个核苷酸对于  miRNA  与3'  UTR  的配对非常重要。首先,miRNA  的2~8个核苷酸能很好的与靶序列配对;其次,靶序列在不同物种中通常保守;再次,miRNA  的2~8碱基在同源的  miRNA  中保守。因此,人们用此来预测  miRNA  的靶基因。miRNA  抑制  mRNA  的翻译机制至今为止是个迷。David  提出2种可能性:(i)  在  mRNA  起始翻译后,miRNA  通过与3'  UTR  作用抑制翻译的进行,这样可能可以通过检测  mRNA  上的核糖体的密度而加以证实;(ii)  mRNA  的翻译并不被阻止,但是翻译的多肽不断的被  miRNP  复合体,或者再结合别的蛋白复合体切割,当然这需要肽酶参与。这些机制的研究可以和  siRNA  的作用相结合起来,近来关于  Argonaute  蛋白  PAZ  结构域晶体结构的测定揭示了  RISC  与  RNA  结合的作用机制。当然  miRNA  抑制机制的揭示有待于  miRNA  领域的深入研究。  



4.2  miRNA  的功能  



  miRNA  是一种广泛存在的对基因表达进行微调的分子.在人类基因组中  miRNA  基因占据大约1%的数量,虽然在不同的时空发育阶段,它们的表达量不同,但是多种  miRNA  在同一个细胞中的表达使得细胞处在一种内在的  miRNA  环境中,这个环境控制着成千上万的编码基因的  mRNA  水平,使得各种蛋白的表达处在一个适合的水平。Bartel  等人将这些  miRNA  比作微型电阻,根据  miRNA  与靶基因互补的程度,执行从切割(100%抑制)到微弱抑制的不同的抑制作用。象  lin-4  作用于  lin14  和  lin28;let-7  作用于  lin41  和  hbl-1,起着明显的表型改变,是在  miRNA  家族中为数较少的,更多的则是起着微调的作用。像  miR-7  和  miR-14  有着多个靶基因,它们从一个整体上起着介导某一功能的作用。由于有多个靶点,有些  miRNA  会有大量的表达,比如  miR-2  在一个细胞内有约50000个拷贝,这远多于普通  mRNA  的表达量。通过芯片技术  Lee  等人研究了通过导入某些  miRNA  能够导致上百个基因  mRNA  水平的下调,虽然并不能完全肯定所有的这些下调基因是由  miRNA  直接导致,但这给出了直接证据证明一个  miRNA  可以调控多个靶基因。另一些则是多个  miRNA  作用于一个靶基因上,而最近开发的同时检测所有  miRNA  的表达图谱的技术,使研究者能更方便地从整体上掌握特定的时空阶段  miRNA  产生的生物学效应。miRNA  这种转录后微调的优点有如下几点:  



  (i)  比从蛋白水平的调节更节省能量;  



  (ii)  相对于转录调节,miRNA  的效果更快而且是可逆的;  



  (iii)  对于一些只需微量蛋白改变的现象,只有通过  miRNA  来达到。比如对某种蛋白来说,1~2个  mRNA  拷贝就足以过量表达,这时就需要  miRNA  来调节控制蛋白的水平;  



  (iv)  内含子中编码的  miRNA  是一种细胞内资源的高效利用。  



  就像前面提到的一样,miRNA  主要通过抑制它的靶基因来起调控作用,至今为止没有发现有上调能力的  miRNA。从表2和表3可以看出,miRNA  的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。  Lewis  等人的预测结果发现,预测的  miRNA  的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然  miRNA  的作用也是特异的,特别是5'端的2~8个碱基,特异性的靶向与它的靶基因,但是与  siRNA  不同的是  miRNA  的特异性并不是那么强,在生物体内往往一个  miRNA  作用于多个靶基因,如  lin-4  作用于  lin14  和  lin28,let-7  作用于  lin41  和  Hbl-1(见表2),这就是人们提出的“多个靶点”的假说。人们也提出可能多个  miRNA  调控一个靶基因。因此,miRNA  的调控作用很可能是一种调控网络,它需要接受某些信号的刺激,从整体上调控有机体的生命活动。  



  miRNA  的研究现在还处在理论水平上,讨论关于  miRNA  的应用还为时过早,但  miRNA  作为体内正常表达的基因,是否与人类疾病和植物培育相关,还有待进一步的研究。以  miRNA  为靶点或者以  miRNA  为治疗手段的设想,以后可能会成为焦点。而  Calin  等人报道的  miRNA  基因芯片技术也很可能成为肿瘤诊断的工具。Suh  等人报道,在人胚胎干细胞中表达的  miRNA  与其他细胞类型的  miRNA  有很大的不同,miRNA  作为人器官定向分化的调节子,为以后人器官体外培植带来促进作用。miRNA  作用和功能的揭示必定给  miRNA  的应用带来广阔前景。  



5  展望  



  自从在四膜虫中发现核酶以来,引起了整个生物学界对  RNA  及其作用的关注,也让人们就生命起源的问题争论了十几年。在人们对生命由  RNA  起源的争论降温的时候,1998年,Fire  等人报道在线虫中发现了  RNAi  的现象,重新又将人们的视线转到  RNA  上来。RNAi  是一个强大而特异的基因沉默机制,可成为研究基因功能和疾病治疗的有用工具,这是生物研究领域里的一个突破性研究成果。miRNA  研究的飞速发展也得益与  RNAi  的发现。但与此不同的是,miRNA  是生物体内源的小  RNA  分子,研究表明它们在生物体内不仅仅是代谢的产物,而是机体有目的编码的重要的调控分子。它们参与生物体的生长、发育、衰老、死亡的调控。随着研究的深入,  miRNA  将在生命起源和物种进化、基因表达调控的复杂性、疾病发生和发展的机制等方面起到更为深远的作用。同时,miRNA  的研究亦将为  RNAi  技术的应用提供新的依据、思路和空间。现在,欧美等发达国家已将有关  miRNA  的研究广泛而深入地运用到组织器官的定向发育,细胞生长分化的时空调节,信号通路的开启和关闭,细胞周期的监测与调控、学习与记忆,肿瘤的逆分化、肥胖、衰老和死亡,疾病的防治以及有目的的基因表达调控上。  



  寻找调控的  miRNA  基因以及  miRNA  的靶基因,揭示  miRNA  具体的作用机制是非常重要的。就目前的研究来看,虽然在各个物种中发现的  miRNA  数量不少,但是能给出直接证据证明  miRNA  的靶基因及其功能的  miRNA  很少,而且多数是通过筛选突变子获得的,这说明现在寻找  miRNA  基因的研究与它功能的研究是脱节的,也证明人们通过现有方法得出的  miRNA  的一些观点可能存在问题(如人类  miRNA  上限为255个的报道)。现在摆在科学家们面前的两大问题就是:在各种生物中找齐这些  miRNA  和找到它们的靶基因并揭示它们的功能,这也可以说是后基因组时代需要解决的问题之一。当然结合  RNAi  和生物信息学的方法会使  miRNA  功能的研究更简便,而且有可能开辟一条共同的研究路线,逐一找到  miRNA  的靶基因并揭示它们的功能。由于  miRNA  基因对于生物的生长,发育,分化非常重要,而且具有特异的时空表达的特点,人们可以设计出  miRNA  的检测芯片,在不同的生物、不同的发育时期、不同的组织细胞内,检测  miRNA  的表达图谱,更精确地掌握生命发展调控的过程。全部  miRNA  基因功能的揭示可能将会给人们对生命现象的理解带来一场新的革命。  



        注:

        (1)参考文献:略;需者可与本站Email联系,或到中国水稻研究所图书馆查阅;

        (2)文章来源:科学通报,2005年  第50卷  第13期;

        (3)作者单位:中国科学院生物物理研究所  等。

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