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白介素-10基因多态性与中国东部哮喘病相关性研究

来源:INTERNET 作者:纪霞 张为忠 张七一等 2005-8-9

摘要: 【摘要】 目的 探讨中国东部哮喘病人白介素-10(Interleukin-10,IL-10)基因多态性与哮喘病的关系,为哮喘病诊断提供早期筛查方法。方法 建立哮喘病人DNA文库,采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)检测184例健康对照及147例哮喘病人血液中白细胞IL-10基因多态性并测定血清中IgE水平。结果 PCR-RFLP......


    【摘要】 目的 探讨中国东部哮喘病人白介素-10(Interleukin-10,IL-10)基因多态性与哮喘病的关系,为哮喘病诊断提供早期筛查方法。方法 建立哮喘病人DNA文库,采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)检测184例健康对照及147例哮喘病人血液中白细胞IL-10基因多态性并测定血清中IgE水平。结果 PCR-RFLP的结果用限制性部分存在(R)和/或缺乏者(r)表示,哮喘病人在IL-10基因操纵子-627的多态性变化中,C和A碱基的发生频率分别为67%和33%;正常人则分别是78.3%和21.7%(P<0.05,OR1.8,95%CI1.3,3.2)。3种不同类型的基因型分析发现哮喘病人的纯合子突变型(A/A)的发生率是17%,野生型和杂合子突变型则分别是50.3%和32.7%;正常对照组中,纯合子突变型的发生率仅为7.1%,野生型和杂合子突变型的发生率则分别为63.6%和29.3%(P<0.01,OR3.5;95%CI1.4,11.5)。纯合子突变型血清中IgE水平明显高于非突变型,(P<0.01)。结论 IL-10基因的操纵子区域有一个RsaI多态性位点,此位点的变化与血清IgE水平升高密切相关。同时推断此RsaI位点可影响IL-10的表达,从而导致IL-10分泌量的减少,而易于诱发哮喘发生。   

  Qingdao Municipal Hospital,Shandong266011.
   
  【Abstract】 Objective To investigate the association between the C627A polymorphism of the IL-10gene and asthma in an East-Chinese population.Methods A case-control study conducted in Qingdao,China.Reˉstriction fragment length polymorphism of amplified IL-10gene products was used to analyse the frequency of the C627A polymorphism in two groups including147asthma cases and184normal individuals.Total serum IgE levels were assayed.Results The C627A polymorphism of IL-10gene was found in Chinese population.The allele freˉquencies in asthma and controls were33%and21.7%,respectively,for the A allele(mutant)and67%and78.3%,respectively,for the C allele(wild type)(P<0.05,OR1.8,95%CI1.3,3.2).The IL-10genotype freˉquencies in asthma patients and controls were:17%(A/A),32.7%(A/C),50.3%(C/C)and7.1%(A/A),29.3%(A/C),63.6%(C/C),respectively(P<0.01,OR3.5,95%CI1.4,11.5).Serum concentration of IgE was significantly higher in carriers of an IL-10mutant allele compared with subjects with no mutant allele(P<0.01).Conclusion Carriage of the mutant allele of the IL-10C627A polymorphism is associated with elevated serum levels of IgE and development of asthma.
   
  Key words asthma IL-10 IgE gene polymorphism  

  支气管哮喘(哮喘)是临床的常见病和多发病,发病率呈日渐上升的趋势,严重地威胁着人们的生命健康和生活质量,其发病与遗传基因密切相关,但并非是单基因遗传性疾病,与多位点基因的突变有关 [1]  。本研究采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法分别检测健康对照和哮喘病人血液中白细胞IL-10基因的多态性变化,探讨IL-10基因多态性与哮喘病相关性。

  1 材料和方法

    1.1 研究对象 147例哮喘病人(年龄18~65岁)均来自青岛地区。经病史、体检、胸片和肺功能检查确诊为哮喘。所有病人抽取外周静脉血3ml提取DNA,同时进行血清总IgE定量和嗜酸性粒细胞计数的测定。选择与病人年龄、性别相匹配的184名正常健康人作对照。

    1.2 哮喘病人DNA文库的建立 抽取哮喘病人的外周静脉血3ml,用肝素抗凝后,分离出白细胞,然后用DNA提取试剂盒(Qiagen,USA),分离提取全基因组DNA。提取后的DNA进行定性、定量分析,所有DNA其紫外光吸收值A260/A280均大于1.8。然后将DNA置于-20℃冰柜长期保存。正常健康人的DNA提取方法,也用以上方法进行。

  1.3 寡核苷酸DNA引物的合成 覆盖IL-10基因操纵子区域-627位点的寡核苷酸引物由Invitrogen公司(USA)合成。上游引物顺序是:5’CCCTTGTACAGGTGATGTGA-3’;下游引物顺序是:5’TTAGGTCTCTGGGCCTTAGT-3’。

  1.4 DNA的多聚酶链反应(PCR) 100ng的基因组DNA被用来进行PCR扩增。反应试剂包括:PCR缓冲液,2mMMgˉCI 2 ,0.25mMdNTPs,10pmolDNA引物和0.75单位的TaqDNA聚合酶(Promega,USA)。PCR反应条件是:起始变性温度95℃,10min;然后变性95℃,45s;退火55℃,45s;延伸72℃,1min,总共35个循环。最后再次延伸72℃,20min。(PCR仪器:MJ.Thermal Cycler,USA)。

    1.5 限制性片段长度多态性分析(RFLP) 经PCR扩增后,IL-10基因产物的片段长度为360bp。然后,我们利用限制性内切酶RsaI对IL-10基因的PCR产物进行酶切消化。反应试剂包括:RsaI酶切缓冲液,1单位RsaI内切酶和IL-10基因的PCR产物。整个酶切反应在37℃下温育过夜。然后将RsaI的酶切片段在2%琼脂糖凝胶电泳下被分离开。共发现3种基因型,即正常野生型、杂合子突变型及纯合子突变型。

    1.6 统计学分析 应用X 2 检验进行组间差异性分析,P<0.05被认为有统计学意义。当OR值>1,表示有正相关性。

    2 结果

  RFLP的结果用R或r表示。限制性部分存在者用大写R表示,缺乏者用小写r字母表示。IL-10基因RsaI内切酶位点多态性电泳结果(见图1)为:RR型(正常野生型):可见单一条带为360bp;Rr型(杂合子突变型):可见360bp,247bp和113bp3条带;rr型(纯合子突变型)可见到247bp和113bp2条带。
   
  图1 琼脂糖凝胶电泳图像显示IL-10 基因RsaI位点基因型(略)

  注:1:100bp DNA标准; 2:正常野生型(C/C); 3:杂合子突变型(C/A); 4:纯合子突变型(A/A)。
   
  哮喘病人及正常对照组的IL-10基因RsaI内切酶位点的等位基因发生频率和基因型分布见表1和表2。从表1可见,在哮喘病人中,C和A碱基的发生频率分别为67%和33%;而正常人中,C和A碱基的发生频率则分别是78.3%和21.7%(P<0.05,OR1.8,95%CI1.3,3.2)。经过对表2中3种不同类型的基因型分析,可以发现哮喘病人的纯合子突变型(A/A)的发生率是17%,而野生型和杂合子突变型则分别是50.3%和32.7%。在正常对照组中,纯合子突变型的发生率仅为7.1%,而野生型和杂合子突变型的发生率则分别为63.6%和29.3%。经统计学分析,两组差异有显著性(P<0.01,OR3.5;95%CI1.4,11.5)。

  表1 IL-10基因RsaI多态性的等位基因频率 (略)

    表2 IL-10基因RsaI多态性位点基因型分布 (略)

  表3 IL-10基因RsaI位点多基因型与血清总IgE浓度的关系(略)

    表3表明了IL-10基因RsaI多态性位点与血清总IgE的关系(P<0.01)。在纯合子突变型的个体中,血清总IgE水平是192.2±92.7。而在杂合子突变型和野生型的个体中,其血清总IgE水平分别是167.6±89.1和89.3±60.2。研究表明,各基因型组间平均年龄、体重及身高的差异均无显著性(P>0.05)。

    3 讨论

  随着遗传学和分子生物学的兴起和发展,从基因水平上去认识疾病、诊断疾病和治疗疾病越来越受到人们的重视。目前研究发现,越来越多的疾病如哮喘病、糖尿病高血压病等疾病的发生均与基因有关。致病基因与后天环境因素的共同作用可导致疾病的发生。

    IL-10具有抑制B淋巴细胞和T淋巴细胞的功能,也可抑制IgE的分泌和组织肥大细胞的增殖,从而导致嗜酸性粒细胞的凋亡。所以IL-10是哮喘病人的发病候选基因之一 [2]  。本研究试图寻找IL-10基因多态性位点,探索其与哮喘病的关系。为此,我们收集了147例青岛地区哮喘病人的血液标本,并建立了哮喘病DNA文库。我们的研究发现,在IL-10基因上游的操纵子区域的第-627位置上胞嘧啶(C)→腺嘌呤(A)的单核苷酸多态性与哮喘病的发生有明显关系(P<0.05);同时,这个多态性位点也与哮喘病血清总IgE水平的升高明显相关(P<0.01)。

    IL-10是一种抗炎细胞因子。在正常情况下,存在于健康人的呼吸道中,可降低细胞的免疫性和过敏反应。IL-10基因的操纵子DNA顺序多态性位点的变化可使IL-10基因的转录发生异常,从而导致IL-10蛋白合成的减少或功能障碍,诱发哮喘病的发作。本研究主要调查研究哮喘病人IL-10基因-627位点上胞嘧啶(C)→腺嘌呤(A)的单核苷酸多态性的变化,以确定IL-10基因操纵子顺序与哮喘病发生的关系。哮喘是一种与呼吸道炎症过敏反应相关的一种复合性疾病。在哮喘发作的过程中,呼吸道内存在大量的由淋巴细胞分泌的IL-4(白介素-4)和IL-5(白介素-5),以及嗜酸性粒细胞。由于IL-10可抑制IL-4和IL-5的表达、降低嗜酸性粒细胞存活寿命及抑制其合成,所以IL-10是有效的抗炎、抗过敏因子。实验发现,剔除IL-10基因的小鼠,可发生致命性过敏性气管及肺部的曲菌病,且伴有大量的干扰素γ(IFN-γ)、IL-4和IL-5合成增多 [3]  。与正常人的健康肺相比,哮喘病人所含有的IL-10因子分泌明显减少。
   
  最初,人们是从小鼠体内发现了IL-10因子,它是由淋巴细胞产生的,具有抑制IFN-γ和IL-2分泌的作用。后来发现,人体内的淋巴细胞也可产生IL-10,且能抑制IL-4和IL-5的表达。与小鼠不同的是,人体内单核细胞是IL-10产生的主要来源。IL-10除了对淋巴细胞产生的某些细胞因子的抑制作用外,也对单核巨噬细胞产生的IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和TNFα有较强的抑制作用 [4]  。总之,健康人呼吸道内的IL-10具有保护气道免遭吸入抗原所致的过敏性高反应状态的作用。由于IL-10具有广泛抑制嗜酸性粒细胞存活周期及抑制IgE产生的作用,所以IL-10对人体其他过敏性疾病都有一定的控制作用。
   
  正常情况下,在IL-10的调控下,肺脏对外来抗原具有一定的不敏感性。一旦IL-10含量降低,就造成肺脏的潜在敏感状态,此时若有呼吸道炎症或外来抗原存在,哮喘即可发生 [4]  。所以,呼吸道中IL-10浓度与哮喘的严重程度及伴发症有密切关系。而IL-10含量的减少常常与IL-10基因的异常调控有关。本研究发现了在IL-10基因的操纵子区域有一个RsaI多态性位点,此位点的变化与哮喘病有密切相关。因此可以推断,此RsaI位点影响了IL-10的表达,从而导致IL-10分泌量的减少,而易于诱发哮 喘发生。我们的另一个重要发现是,此IL-10多态性位点与血清总IgE水平的升高有密切关系。IL-10对IgE的影响可能是通过抑制IL-4和IL-13的IgE的分泌而间接发挥作用的 [3]  。本研究只发现了IL-10多态性与IgE水平的相关性,尚不能确定IgE的升高是由于IL-10基因调控异常的直接结果或是由于IL-10对分泌IgE的细胞因子抑制作用减弱所致。
   
  最近人们发现,IL-10基因的多态性变化与系统性红斑性狼疮的严重程度明显相关。从而进一步证实IL-10与免疫性疾病的关系。当然,最终确定IL-10基因多态性与哮喘病的关系还要依赖于IL-10基因功能性研究。例如是否凡是具有野生型的IL-10基因位点的人就可使IL-10的分泌增加,而具有突变型的IL-10基因个体则有较少的IL-10的分泌。随之而来,是否他们的免疫反应能力而由此不同呢?所有这些都是我们今后要更加进一步研究的。一旦确定了这些关系,就使我们搞清了哮喘病发病机制,就可以进行哮喘病的早期诊断性筛查,同时可指导哮喘病新药的开发,最终彻底治愈哮喘病。

  参考文献
    
  1 Hopkin J.Mechanisms of Asthma.Medicine,2003,41-44.

    2 Prescott SL.New concepts of cytokines in asthma:Is the Th2/Th1paradigm out the window?J.Paediatr.Child Health,2003,39:575-579.

    3 Hobbs K,Negri J,KlinnertM,et al.Interleukin-10and transforming growth factor-βpromoter polymorphisms in allergies and asthma.Am J Respir Crit Med,1998,158:1957-1962.

    4 Rosenwasser L.J,Borish L.Genetics of atopy and asthma:the ratioˉnale behind promoter-based candidate gene studies(IL-4and IL-10).Am J Respir Crit Med,1997,156:152-155.
    

  ˇ基金项目:山东自然科学基金资助项目(Z2002CO3)

  作者单位:266011山东省青岛市立医院呼吸科
   
          澳大利亚新南威尔士大学利物浦医院 


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