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一种海洋动物的生物活性与成分鉴定

来源:中国煤炭工业医学杂志 作者:吴少杰 朱丽华 杨志娟 2007-4-26

摘要: 关键词 海洋水螅类。生物活性。化学成分 海洋水螅类Tubuaria marina属于腔肠动物门(coelenterata),其形态看上去像是海草,实际上是动物。虽然该类生物在世界各地广泛分布,但目前关于该类动物活性和化学成分的报道很少[1]。...


  关键词  海洋水螅类;生物活性;化学成分

    海洋水螅类Tubuaria marina属于腔肠动物门(coelenterata),其形态看上去像是海草,实际上是动物。在沿海水产养殖筏架上常常布满该生物,渔民将其称为“海虫子”,能危害水产养殖,故作为有害杂物除去。虽然该类生物在世界各地广泛分布,但目前关于该类动物活性和化学成分的报道很少[1]。本文研究了海洋水螅类动物Tubuaria marina的抗菌及细胞毒活性,并从中分离鉴定出了3种已知结构化合物。报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  受试菌株  受试微生物为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、白色念球菌和毛霉以及绿藻Scenedesmus subspicatus,Chlorella vulgaris和Chlorella sorokiniana。

  1.2  动物样品粗提物的制备  动物样品采自浙江舟山。采集后首先于阴凉通风处晾干,然后用95%的工业乙醇冷浸提取,每次浸泡7d,共浸泡提取3次;经过滤的浸泡液用旋转蒸发仪尽量蒸干,得到含水的粗提液用乙酸乙酯萃取至有机相几乎没有颜色,乙酸乙酯经旋转蒸发除去。剩余的动物样品再用乙酸乙酯浸泡2次,每次7d,所得的浸泡液用旋转蒸发仪蒸干。合并上述二种方法得到的粗提物,得粘稠膏状物。

  1.3  抗菌活性测试  取少量膏状粗提物用50%的氯仿/甲醇(v/v)溶液溶解,然后滴在事先灭菌的φ9mm的纸片上,使得每片纸片含粗提物1.5mg。上述纸片在无菌操作台晾干后,轻轻地贴在培养基表面。受试真菌平板于28℃培养约2d,细菌平板于37℃培养约18h,观察是否有抑菌圈出现。

  1.4  对卤虫的细胞毒活性测试  卤虫卵在室温下用海水通气孵化2d,长出幼虫后即可用于测试。取20只左右的卤虫置于细胞培养板内,粗提物用DMSO溶解后,加入细胞培养板中。培养一定时间后,在10倍解剖镜下观察统计死亡率。

  1.5  化合物分离鉴定  将上述粗提物悬浮在甲醇和环己烷两相中,剧烈振摇后静置分层,环己烷相为油脂类,故弃去。甲醇相经过硅胶柱层析分离,获得6个组分F1-6。组分F2种经Sephadex LH-20柱层析和制备薄层层析分离,得化合物1;F5和F6经反复的Sephadex LH-2柱层析,得已知化合物2和3。上述化合物通过核磁共振与质谱等手段而解析得出其结构。

  2  实验结果

  2.1  活性  见表1。对卤虫的细胞毒活性实验表明,在粗提物最大浓度为100μg/ml时,卤虫死亡率为2%,未显示出细胞毒性。

  表1  抗菌活性结果 略

  2.2  化合物结构鉴定  见图1。

  化合物1为白色固体,根据EI-MS和CI-MS得出其分子量为386,通过搜索质谱数据库,得到一系列甾醇类化合物。该化合物1H NMR显示在δ5.35(d,1H,5-H) 有一个双键氢,在δ3.51(m,1H,3-H)处的氢为与羟基碳相连的氢,δ1.02和0.66处有2个甲基单峰,分别为18-CH3和19-CH3 2个与季碳相连的甲基;δ0.88(d,3H)和0.92(d,3H)为异丙基的氢核信号,此外,在δ1.1-2.3处有复杂的亚甲基和次甲基信号峰。其13C NMR表明含有27个碳原子,其中2个不饱和碳δ140.7和121.7,一个与羟基相连的碳δ71.7。通过检索文献[2],最后确定该化合物为胆甾-5-烯-3β-醇(Cholest-5-en-3beta-ol,1)。化合物2为油状,其EI-MS得出分子量为126,用该分子量搜索质谱数据库,得出5-甲基-尿嘧啶等化合物。其1H NMR更进一步证实该化合物为胸腺嘧啶,其中δ1.70处的单峰为甲基峰,δ7.22为不饱和氢。经过对比文献[3],证实该化合物就是5-甲基-尿嘧啶(5-Methyluracil,2)。化合物3的性质与2相似,其1H NMR只显示出2个不饱和氢,即δ7.38和5.42,他们互相耦合,呈现双峰。通过比较文献,得出该化合物为尿嘧啶[4](Uracil,3)。

  图1  化合物结构 略

  3  讨论

  近年来,从海洋腔肠类动物,如海葵、柳珊瑚、软珊瑚等发现了许多高活性的新结构化合物,但对于海洋水螅类的研究并不多见。张立新等[5]的对青岛采集的海筒螅的活性研究发现,其乙酸乙酯提取物具有体外抑制肿瘤细胞生长的活性,但没有明显抗菌效果,进一步的研究从中分离出三种已知结构化合物[1]。我们的研究与之相反,在以卤虫为模型的细胞毒筛选中,未显示出细胞毒性,但是却显示出了较好的抗菌活性,特别是对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、放线菌Streptomyces viridochromogenes和真菌毛霉显示出较好的活性。这一差异可能与不同的样品采集地点有关。从二种样品中都分离出了胆甾-5-烯-3β-醇,可能是这一类动物螅茎的共有化学成分,也是一种在海洋无脊椎动物中较为常见的物质。由于样品量较少,且各种微量成分组成很复杂,我们未能鉴定出与抗菌活性有关的物质,今后应加大样品采集量,进一步分析其化学成分,以发现有活性的新结构物质。

  4  参考文献
 
  [1]  张立新,范晓.海筒螅中3种化学成分的分离鉴定[J].海洋科学,2002,26(9):5-7
 
  [2]  龚运涯.天然有机化合物的13C核磁共振化学位移[M].昆明:云南科技出版社,1986:324
 
  [3]  Laskin AI,Chevalier HA.CRC Handbook on Microbiology[M].II,Cleveland:CRC Press,1973:343
 
  [4]  Q Huang.Studies on metabolites of mycoparasitic fungi. III. New sesquiterpene alcohol from Trichoderma koningii[J].Chem Pharm Bull,1995,43(6):1035-1038
 
  [5]  张立新.山东沿海21种海洋无脊椎动物抗肿瘤活性初步筛选[J].海洋科学,2003,27(7):63-66

  河北省唐山市,华北煤炭医学院 


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