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第二十三章基因诊断与基因治疗--第一节基因诊断

来源:生物化学与分子生物学 作者: 2006-1-13

摘要: 第二十三章基因诊断与基因治疗 (Gene Diagmosis and Gene Therapy) 第一节基因诊断 医生需要综合患者的病史,症状,及各种检查的结果作出临床诊断。这种用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术,称为基因诊断。 一、基因诊断的对象 1、病原生物的侵入:一般侵入体内的病原......


第二十三章 基因诊断与基因治疗

(Gene Diagmosis and Gene Therapy)

第一节 基因诊断

  医生需要综合患者的病史,症状,及各种检查的结果作出临床诊断。随着人们对疾病的病因及发病机理的认识的不断深入,临床检查的手段也在不断进步。目前看来,绝大多数疾病的发生,发展都与患者遗传背景或者其改变有关,所以临床上越来越有必要检查这种变化。这种用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术,称为基因诊断。

  一、基因诊断的对象

  1、病原生物的侵入:一般侵入体内的病原生物可通过显微镜检查各免疫学方法进行诊断。但是,直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。而肝在无法得到商业化抗体时,基因诊断就成为检测病原微生物感染,尤其是病毒感染的唯一手段。此外,由于基因碱基配对原理的基因诊断可直接检测病原微生物的遗传物质,所以诊断的特异性也大为提高。目前,基因诊断已在病毒性肝炎,受滋病等传染病的诊断中发挥了不可代替的作用。

  2、先天遗传性疾患:已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。例如:苯丙氨酸羟化酶基因突变可引起苯丙酮尿症:腺苷脱胺酶基因突变可引起重症联合免疫缺陷症(SCID);而淋巴细胞表面分子CD40或其配体(CD40L)基因突变则可引起无丙种球蛋白血症。这类疾病的诊断除了仔细分析临床症状及生化检查结果外,从病因角度作出诊断则需要用基因诊断的方法检测其基因突变的发生。此外,有些病因尚不清楚的疾病,如高血压、自身免疫性疾病等,都可能与某个或某些遗传位点的持有或改变有并。用基因诊断的方法检测这些位点的改变,不仅对临床诊断,而且对疾病的病因和发病机理的研究都具有重要的意义

  3、后天基因突变引起的疾病:这方面最典型的例子就是肿瘤。虽然肿瘤的发病机理尚未完全明了,但人们可以初步认为肿瘤的发生是由于个别细胞基因突变而引起的细胞无限增殖。无论是抑癌基因发生突变还是癌基因发生突变,如果确定这些改变的发生,都必须进行基因诊断。

  4、其它:如DNA指纹、个体识别,亲子关系识别,法医物证等。

   二、基因诊断的方法

  与疾病相关的遗传背景改变主要有两类,一是遗传物质,即DNA或RNA的水平的变化。例如病毒感染量病毒基因及其转录产物在人体内的从无到有,某些肿瘤中癌基因表达水平的从低到高。二是遗传物质的结构变化,即基因突变,如点突变引起的基因失活,及染色体转位引起的基因激活或灭活等等。所以从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。但如考虑其临床适用性,灵敏度等问题,下列几种方法可看作是有应用前景的基因诊断的方法。

  1、核酸杂交:酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开,而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行,因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交(Southern blot hybridization )和RNA印迹杂交(Northern blot hybridization)。其基本过程包括下列几个步骤。

  (1)制备样品:首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段,然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱,所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后,直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离,然后转印并交联固定。

  (2)制备探针:探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中,探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样,通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子,既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置,也就是在电泳凝胶上的位置,也就知道了它的分子大小。

  (3)杂交:首先要进行预杂交,即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子,所以杂交过程中只需变性标记好的探针,再让探针与膜在特定的温度下反应,然后洗去未结合的探针分子即可。

  (4)检测:检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置;而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。

  2、聚合酶链反应:核酸杂交反应是一对一的反应,即膜上有一个被检测分子时,相应就有一个标记的探针分子与它杂交。所以整个实验敏感性主要取决于标记探针的质量和杂交后的检测方法。在优化的条件下,核酸杂交可检测到pg水平的靶分子,约相当于106个分子。但是,在许多临床情况下,即无法得到这样的品量。这时可以用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量,达到提高敏感性的目的。

  聚合酶链反应(polymerase chain reaction ,PCR)的反应本身是在同一试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段的合成(图23-1)。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子:DNA可直接用于反应,而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA,然后用作聚合酶反应的模板。反应的引物有两条,分别位于待扩增DNA片段的两端,可启动相对方向的DNA合成。这样从一个模板分子起始的话,经过n次聚合酶反应后就可以合成2n个模板分子。假如进行了30轮反应,则可从一个待检分子合成出230,即约109个待检分子。对于一段500碱基对的DNA片段来说,这大约等于1ng的DNA。所以从很小时的样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。

  最初的聚合酶链反应是用DNA聚合酶I的Klenow片段或T4DNA聚合酶催化的。但是由于每轮反应都需要三个温度点,尤其是模板变性需在较高的温度下进行,所以最初的PCR需要在每轮反应中加入DNA聚合酶。这个问题在发现了耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)后才得以完满的解决。Taq DNA聚合酶分离自水栖高温菌,其最适反应温度为75-80摄氏度,且经90摄氏度以上的加温后仍可在温度恢复后复性。所以这种酶特别适合于在不同温度点进行循环加温与降温而不丧失酶的活性。因此被广泛应用于各种PCR。

图23-1 RCP的基本原理

  下面以爱滋病的临床检测为例,简要说明一下PCR在病毒感染的基因诊断中的应用。

组织中总RNA的提取

    ↓

利用反转录酶合成cDNA

   ↓

PCR反应:

反应液组织:反应缓冲液

                        模板(上述合成的cDNA)

                  底物(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)

                 引物(爱滋病病毒特异性引物)

          TaqDNA聚合酶

      50μl

循环:95℃,30sec(变性)

       ↓

        55℃,1min(退火)  30循环

       ↓

   72℃,1min(聚合)

检测:电泳或核酸杂交


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