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IgG的分离与提纯

来源:医学加加 作者: 2007-9-25
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摘要: (一)材料与试剂配制1.动物血清2.硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7。mlB液:0。80g加H2O至 1 000ml取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。00ml溶化后过滤,然后再加20%NaOH500。...


  (一)材料与试剂配制 1.动物血清 2.硫酸铵饱和溶液 硫酸铵  800g~850g H2O  1 000ml 加热至绝大部分溶质溶解为止,趁热过滤,置室温过夜,然后以28%NH4OH调pH至7.0(不调pH值也可以)。 注:硫酸铵以质量优者为佳,因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属,可在溶液中通入H2S,静置过夜后滤过,加热蒸发H2S即可。 3.0.01Mol/L pH7.4PB液 A液:0.10Mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O15.60g 加H2O至  1 000.ml B液:0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O  35.80g 加H2O至   1 000ml 取A液19ml,B液81ml加水至1 000ml即可。 4.1%BaCl2溶液 5.纳氏液 HgI  115.00g KI  80.00g 加H2O至500.00ml 溶化后过滤,然后再加20%NaOH500.00ml,混合即可。 6.0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。 7.洗脱液:0.03Mol/L的NaCl液。 8.透析袋(或玻璃纸)。 (二)操作方法 1.取20ml血清,加生理盐水20ml,再逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成20%(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,充分混合后,静置30min。 2.3 000r/min离心20min,弃去沉淀,以除去纤维蛋白。 3.在上清液中再加(NH4)2SO4饱和溶液30ml,使成50%(NH4)2SO4溶液,充分混合,静置30min。 4.3 000r/min离心20min,弃上清。 5.于沉淀中加20ml生理盐水,使之溶解,再加(NH4)2SO4饱和溶液10ml,使成33%(NH4)2SO4溶液,充分混合后,静置30min。 6. 3 000r/min离心20min,弃上清,以除去白蛋白。重复步骤5,2~3次。 7. 用10ml生理盐水溶解沉淀,装入透析袋。 8. 透析除盐,在常水中透析过夜,再在生理盐水中于4℃透析24h,中间换液数次。 以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4+(取3~4ml透析液,加试剂1~2滴,出现砖红色即认为有NH4+存在),直至无SO42-或NH4+出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。 9.离心去沉淀(去除杂蛋白),上清液即为粗提IgG (即γ球蛋白,如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白,Euglobin,含γ球蛋白)。 10.过DEAE-纤维素层析柱。(装柱过程见层析技术)。以0.01Mol/L pH7.4PBS(0.03Mol/L NaCl)洗脱,收集洗脱液。 也可采用SephadexG150或G200柱。 11.蛋白质及其定量鉴定(见本章第八节)。 12.IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。 ⑴ 区带电泳:玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后,只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时,同时可用全血清样品,不同浓度(NH4)2SO4盐析样品进行电泳,以资比较。 ⑵ 琼脂双相双扩散鉴定:预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散,如IgG提纯的话,则在两样品孔之间出现一条沉淀线。 ⑶ 免疫电泳鉴定:(操作见第三章免疫电泳部分)。孔内加待测样品,电泳后,在槽内加抗IgG血清,琼脂扩散24h,观察结果。如果提取的IgG纯的话,则只出现一条弧形的沉淀线,且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳,以资比较。 ⑷ 圆盘电泳鉴定:用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带,而纯化的IgG则只有一条区带。 13.IgG的浓缩与保存 ⑴ IgG的浓缩:参看本章第九节。 ⑵ IgG的保存:一般浓缩至1%以上的浓度,再分装成小瓶冻干保存,或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存,注意防止反复冻融。 (三)IgG的简易快速提取法 应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG,不仅操作复杂、需时较长,处理过程中样品体积大大增加,而且透析时变性严重,容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足,特别是当大量提取IgG时,则往往采取下列的简易办法。 1. DEAE-纤维素直接提取法 取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。 ⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中,加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液,静置30min,去上清细粒,再重复一次。 ⑵用布氏漏斗(内放两层滤纸)过滤。 ⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例,加入各成分,充分搅拌。 ⑷于4℃中放置1h,中间搅拌数次。 ⑸用布氏漏斗抽滤,再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素,抽滤。滤液即为提取的IgG液。 2.DEAE-SephadexA-50为弱碱性阴离子交换剂,经NaOH将Cl-型转变为OH-型后,可吸附酸性蛋白,血清中除γ-G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时,酸性蛋白均被DEAE-SephadexA-50吸附,只有γ-G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ-G。这种提取法流程大大缩短,纯化前后样品体积变化不大,而且所得γ-G无变性现象。经过四次处理,其纯度也较好。缺点是收集量少,损耗大。 ⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE-SephadexA-50若干克,悬浮于蒸馏水中,1h后倾去上层小颗粒,然后用0.50Mol/L NaOH处理1h,蒸馏水洗至中性,再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h,水洗至中性,最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。 ⑵ 取一定的血清量,加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液,再加液体体积1/4的滤干的DEAE-SephadexA-50,混合、4℃放置1h,不时搅拌、抽滤、收集滤液。 ⑶ 再用同样重量的DEAE-SephadexA-50处理滤液。反复处理三次。(全程共四次)。获得滤液即为γ-G制品。 ⑷ DEAE-SephadexA-50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱,抽滤至滤液中无蛋白(OD280﹤0.04)后,再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。 (四)禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法) 1.试剂 ⑴ 5%葡聚糖硫酸盐 ⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液 ⑶ 无水硫酸钠 ⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液 ⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液 2.操作方法 ⑴ 取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。 ⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g,缓慢加入,混匀,静置30min,3 000r/min离心去上清。 ⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g/ml,同上法离心去上清。 ⑷ 重复步骤⑶,加Na2SO4,使成0.14g/ml。 ⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐48h。 ⑹ 过SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。 ⑺ 如要进一步提纯,则用第二峰再过DEAE—纤维素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为IgG。 也可以按以下操作方法进行: ⑴ 以18%硫酸钠(W/V)提取一次,再以14%的硫酸钠提取一次。 ⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入无水硫酸钠,离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中4℃透析,直至无SO42-为止。 ⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。 ⑷ 过SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡IgG。


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