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PCR在突变基因检测时的应用

来源:医学加加 作者: 2007-9-25
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摘要: 分子生物学在医学领域中的应用越来越广泛,基因突变在肿瘤和遗传病的发生过程中的作用也日益受到重视,因此检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)也成为了分子生物学,医学遗传学以及肿瘤学研究 中的热点。基因突变((gene mutation)是癌基因激活,抗癌基因失活以及遗传病发生的原因,从广义上讲,基因......


  分子生物学在医学领域中的应用越来越广泛,基因突变在肿瘤遗传病的发生过程中的作用也日益受到重视,因此检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)也成为了分子生物学,医学遗传学以及肿瘤学研究 中的热点。

  基因突变((gene mutation)是癌基因激活,抗癌基因失活以及遗传病发生的原因,从广义上讲,基因突变包括点突变,染色体突变和基因组突变等三种形式,后两种基因突变涉及的基因较多,可以通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体来检出.也可以在细胞的有丝分裂间期用标记探针检出,而点突变涉及的范围较少,是肿癌和遗传病发生的主要分子机制,是基因分析的主要研究内容.一般来说,基因突变的检测方法包括:应用基因探针直接检测;应用PCR 技术检测;利用探针技术进行分析。

  利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满足这际工作的需要,自从PCR技术问世以来,建立于PCR技术基础上的突变基因检测技 术发展迅速,它不仅能在短时间内检出发生突变的基因,而且即使获得极微量的组织 亦可经PCR扩增而进行中种检测,加上PCR技术与探针杂交技术,RFLP技术及PCR直接 测序的结合,改换方法得以迅速发展和推广,大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因 的研究进展.

  一、点突变的PCR直接检出

  (一)用PCR直接检测缺失:

  当基因内缺失时,可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物,然后进行PCR,对其产物行琼糖凝胶电泳,溴乙锭染色,紫外检测仪下检测有无特异 性的扩增产物,即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失.

  1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚,其缺失部位亦较为固 定,即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR,然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色,短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段,该方 法是检测基因片段缺失最为快速的方法,在实际应用中,为了避光因某些原因引起的 扩增失败而导致假阴性结果的出现,常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因 引物,同时加以扩增,以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应 用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时,常用一对引物扩 增缺失区域,同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段,然后电泳检测.若同时 即有α和β基因的特异性扩增产物,则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失,为Bart胎儿水肿综合征.

  2.多对引物的多重PCR检测缺失:对于某些遗传病的致病基因来说,其缺失具有明显的异质性,即在不同患者其缺 失片段有所不同,因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出,在这种情况 下,我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域,即用同一PCR体系扩增多个 外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段,若某一特异性的扩增产物带缺如,则可判定为该片段的缺失,该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行 的检测途径,目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测 中,用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出,另外还有人用9对物 进行两组多重PCR,大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变.

  3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测:有报道,PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检 测.

  (二)单个碱量置换的PCR直接检出

  1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析

  PCR产物的酶解分析,主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位 点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位 点发生改变时,则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段,然后用相应 的内切酶进行处理,电泳检测,与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切 位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改,正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp,经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段,但镰状细胞贫血的 突变使该切点消失,OxaNI消化后仍为294bp的片段,而杂合子则是有294、191和103 三个片段。用引方法检测突变快速可简便,但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关 并引起进次复时不能因此方法检测,因此其应用受到限制,反能检出点突变的极少一 部分.

  2.3'特异PCR,扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.

  以上三种方法结构是基于以下机理,只是不同作者的采用的名河差别而异.

  在PCR扩增时,引物的延伸是从其3'未端开始的,而这种延伸的进行要求引物3'端 的碱基与模板需完全配对,只有这样引物才能延伸,扩增才得以进行下去而得到预期 的扩增产物,若引物3'端与模板不能配对,则引物的延伸即阻断,不能得到相对应的 扩增产物,基于以上事实,可利用3'端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的 突变位点,此即3'特异PCR,扩增阻滞突变系统及等位特异PCR.该反应系统包含两个 PCR扩增反应,有两对引物但它们的3'端有差异,一为正常引物,另一为3'端编食突 变的引物,正常引物只与正常模板互解,PCR时扩增相应的产物,而食突变的引物只 与突变的模板附扩增出相应的产物.扩增完成后可直接同琼脂糖电泳技术检测分析结 果。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子,而且能检出杂合子个 体,在这种情况下,同一个体的DNA模板利用突变引物和正常引物均能引发扩增反应. 尚可利用多对突变引物和正常引物进行多重3'-特异PCR,可攻DNA分子上的多位点变 化的鉴定准确快速,简便。

  3.PCR直接测序

  DNA序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法,它不仅可确定突变的部队,而且还可确定突变的性质.PCR直接测序是指对PCR产物进行的直接序列分析,而不是 家传的测序技术先将DNA待测片段克隆于测序载体上,这不仅大大的简化了操用步 骤,节省大量的人力和物力,而且可实现自动化操用,加之新的荧光检测技术的应 用,使测序的效率大大提高.

  采用PCR循环直接测序时,应首先将扩增产物转化为单链测序模板,目前常用的 转化方法为不对称PCR,即在反应体系中引物浓度的差异来形成单链DNA,通常侧引物 的浓度为100∶1.当某一引物被耗尽后,另一引物扩增的片段即为单链然后即可用于 测序,此外,获得单链DNA还有磁珠俘获法,外切酶消化法及Genomic amplification with transcript sequeucing法(简称GAWTS法).PCR直接测序的最新发展是将双脱氧 络子技术与PCR技术相结合进行循环测序,在PCR反应体系中同时将ddNTP加入,并利 用同位素或荧光素标记的引物引导扩增后,得模板的扩增与测序同时进行,其特异在 于使用的模板量小且不需分离单链.

  应用PCR测序有以下优点:

  (1)附模板的要求,模板需要量小.

  (2)方法简便,操作易于标准化,自动化.

  (3)测序效率高,准确,在短时间即可完成.

  

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