阿托伐他汀对实验性变态反应性脑脊髓炎豚鼠模型发病的影响(pdf)
【摘要】 目的 探讨阿托伐他汀对实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)的防治作用。方法 皮下注射粗制碱性髓鞘蛋白(MBP)建立EAE模型，EAE模型分为高、低剂量治疗组和对照组。治疗组造模前7天开始灌胃阿托伐他汀直至整个实验结束，对照组不用阿托伐他汀。结果 治疗组的潜伏期比对照组缩短(P＜0.01或P＜0.05)，低剂量组的潜伏期比高剂量组潜伏期长，两者具有统计学的差异(P＜0.05)；治疗组的进展期明显缩短(P＜0.01)；病情高峰期神经功能缺失评分，高剂量治疗组与对照组相比，明显降低(P＜0.01)；EAE对照组的死亡率高达50%，EAE低剂量组的死亡率为20%，EAE高剂量组无死亡，各组间差异具有显著性(P＜0.05)。结论 阿托伐他汀具有延长EAE动物发病潜伏期，缩短病情进展期，减轻中枢神经系统损害作用，降低高峰期死亡率。
【关键词】 EAE；HMG-CoA抑制剂
Effect of atorvastatin on experimental allergic encephalomyelitis in guinea pig
RONG Ben-bin，LI Zuo-xiao.The Affiliated Hospital，Luzhou Medical College，Sichuan 646000，China
【Abstract】 Objective To explore the prophylaxis and treatment effects of atorvastatin on experimental allergic encephalomyelitis(EAE).Methods The experimental EAE mould was established by subcutaneous administrating coarse myelin basic protein (CMBP) in Guinea pig，and all the subjects were divided into two groups as control group and treatment group;The treatment group mice were divided into low dose group and high dose group perfused with atorvastatin transgastricly seven days before the mould，and the control group didn’t use atorvastatin.Results The delitescence of the treatment group was significantly shorter than the control group(P＜0.001)，and the delitescence of the low dose group was shorter than the high dose group(P＜0.05).The progression of the treatment group was significantly shorter than the control group(P＜0.01).Comparing to the control group，the maximal disease score was significantly decline in the high dose group(P＜0.01).Conclusion Atorvastatin could postpone the delitescence of the EAE mould animal，prevent the progression of the disease，alleviate the damage of the central nervous system and reduce mortality rate at fastigium.
【Key words】 EAE;HMG-CoA inhibitor
EAE是实验动物发生的一种局限在神经系统内的迟发型超敏型自身免疫性疾病［１］，具有与人类多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎相同的免疫及病理特征［２］，是人类中枢系统脱髓鞘病的动物模型。他汀类药物是3-羟甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，目前研究在发挥降脂同时发挥免疫调节作用。本实验探讨他汀类药物是否对EAE动物具有保护作用，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
使用大白鼠5只，300～３５０g；豚鼠，共30只，雌雄各半，体重250～３５０g，由泸州医学院实验动物科提供，均为1级合格动物，合格证号：川医动字第2401115。
1.2 药品和试剂
福氏完全佐剂(Freund’s adjuvant complete，含卡介苗10mg/ml)Sigma公司产品；阿托伐他汀钙片(Atorvastatin Calcium Tablets)，北京红惠生物制药股份有限公司生产。
1.3 方法
1.3.1 粗制MBP抗原制备
将大白鼠处死后，迅速取出脊髓，用匀浆器制成50%的匀浆，与等量福氏完全佐剂(卡介苗10mg/ml)混合，用注射器抽打至油包水乳剂。
1.3.2 EAE模型的建立与分组
用粗制碱性髓鞘蛋白(MBP)抗原注入豚鼠后足掌皮下，每侧0.2ml造EAE模型。EAE模型分为高、低剂量治疗组和对照组。EAE模型治疗组20只：高剂量组10只，造模前1周开始灌胃阿托伐他汀4mg/(kg·d)直至整个实验结束；低剂量组10只，造模前1周开始灌胃阿托伐他汀1mg/(kg·d)直至整个实验结束。EAE模型对照组10只，不服阿托伐他汀。
1.3.3 用药方法
为保证等容积给药，将阿托伐他汀钙配成0.4mg/ml、0.1mg/ml两种浓度的溶液，阿托伐他汀大、小剂量分别相当于人用量的10、2.5倍剂量，高剂量组4mg/kg，用0.4mg/ml浓度的药；低剂量组0.05mg/kg，用0.1mg/ml浓度的药，给药容积均为1ml/100g。
1.3.4 豚鼠EAE模型的症状评分
0分：无明显异常；1分：后肢无力；2分：后肢麻痹；3分：后肢麻痹伴前肢无力；4分：四肢瘫痪或死亡。
1.3.5 实验终止
EAE模型组及EAE模型治疗组四肢瘫痪、死亡或连续3天症状评分无加重时作为EAE发病高峰，处死动物；未发病动物观察2个月处死。假手术组与正常对照组3周后处死动物。
1.4 统计学分析
计量资料以均数加减标准差（x±s）表示，进行单因素方差分析，组间两两比较用Bonferroni法进行检验；计数资料采用Fisher’s exact test检验。变量间相互关系采用直线相关分析。统计学处理由SPSS 11.5软件完成。P＜0.05为差异有显著性，检验水准α＝0.05。
2 结果
2.1 临床症状
EAE模型组及EAE模型治疗组所用的豚鼠均发病，潜伏期14～３０天不等。患病豚鼠表现为体重下降，肢体无力，自伤后肢，重者四肢瘫痪、抽搐、死亡。取脑组织及脊髓作病理检测，HE染色，光镜下可见血管周围炎性细胞浸润及脱髓鞘改变，证实EAE模型成功。
2.2 阿托伐他汀对EAE模型发病的影响
见表1。表1 阿托伐他汀对EAE模型发病的潜伏期、进展期、高峰期症状评分影响 (略) 注：与对照组比较，t=3.71，P＜0.01；Δ与对照组比较，t=4.95，P＜0.05；＃与低剂量组比较，t=3.03，P＜0.05
结果表明：治疗组的潜伏期比EAE模型组短(P＜0.01或P＜0.05)，低剂量组的潜伏期比高剂量组潜伏期长，两者具有统计学的差异(P＜0.05)，提示阿托伐他汀能延长EAE动物发病潜伏期，抑制EAE动物模型发病能力大小与阿托伐他汀剂量有关；高低剂量组进展期差异无显著性，但与EAE模型相比，治疗组的进展期明显缩短(P＜0.01)；病情高峰期神经功能缺失评分，与EAE模型相比，高剂量治疗组明显降低(P＜0.01)，但低剂量组与EAE模型相比差异无显著性。
2.3 阿托伐他汀对EAE豚鼠模型发病高峰期死亡率
见表2。表2 高、低剂量治疗组和模型对照组发病高峰期死亡情况比较（略）注：Fisher’s exact test，P＜0.05
由表2可以看出：EAE对照组的死亡率达50%，阿托伐他汀治疗组的死亡率为20%，高剂量治疗组的EAE无死亡，各组间死亡率的差异统计学上具有显著性意义(P＜0.05)。提示阿托伐他汀能明显降低发病动物高峰期的死亡率。
3 讨论
EAE具有多发性硬化(MS)相同的病理和免疫特征。目前认为MS发病是机体免疫调节紊乱造成Ts细胞数量减少和功能缺陷，Th细胞功能相对亢进，最终导致B细胞过度活化而产生以抗髓鞘碱性蛋白抗体为主的自身免疫性疾病［３］。Th亚群即Th1／Th2分布及功能异常与MS的免疫发病密切相关。Th1分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2等，促进MS的发病，而Th2分泌IL4、IL-6、IL10等，抑制MS的发病［４］。
他汀类药物包括阿托伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀等，都是3-羟甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。目前资料证实，该类药具有抗炎和免疫调节作用。Nath N［５］等初步发现洛伐他汀调节Th1分化，降低血清IFN-γ、TNF-α水平，增强Th2细胞分泌活性，使血清IL-4、IL-5、IL-10增高，可缩短被动免疫诱发的SJL/J鼠EAE模型的病程并减轻EAE模型的病情严重程度。Timothy Vollmer［６］等对30例复发-缓解型多发性硬化患者服用斯伐他汀6个月，头颅MRI证实脑内多发性硬化病灶数量减少44%，总病区大小减少41%，认为与该药抑制多发性硬化的炎性成分有关。
本组实验结果表明，阿托伐他汀延长豚鼠EAE模型发病潜伏期，显著减少了神经系统损害的病程进展期(P＜0.01)，降低了高峰期神经功能缺失评分和死亡率，提示阿托伐他汀对EAE动物模型发病有保护作用。同时高剂量组EAE发病潜伏期、最大神经功能评分和发病高峰期死亡率均较低剂量组差异有显著性，提示阿托伐他汀对EAE模型发病的保护作用呈剂量依赖关系。
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作者单位： 646000 四川泸州，泸州医学院附属医院神经内科
【摘要】 目的 建立昆明鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎模型，为研究多发性硬化的免疫病理机制及实验性治疗的研究提供实验依据。方法 用不同剂量同源脊髓匀浆皮下注射致敏昆明鼠制作模型，观察比较不同剂量诱导发病的临床表现及病理结果。结果 各组小鼠均有一定程度的发病，病理有血管周围细胞浸润和脱髓鞘表现。结论 用同源脊髓匀浆加福氏佐剂间隔1周2次皮下注射可以成功诱导昆明鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎，在0.5～100mg的剂量水平之间，病情与诱导免疫剂量不存在线性关系。
关键词 实验性自身免疫性脑脊髓炎 昆明鼠 动物模型
Bao Jian，Hu Xueqiang
Neurology Department of The3rd Auxiliary Hospital，Zhongshan University，Guangzhou510630.
【Abstract】 Objective To establish experiemental autoimmune encephalomyelitis model in Kunming mice.In order to provide the experimental value for research on the immunopathology and experimental therapy in MS.Methods Kunming mice we
re challenged subcutaneously with syngeneic spinal cord homogenate，and observed for clinical score and pathological manifestation.Results EAE presented in each group.Lymphocytes and mononucleocytes infilˉtraton was found to distribute around small blood vessels on HE stained slices.Small demyelinating plaques were seen on Bielschowsky sliver impregnation stained slices.Conclusion SSCH challenge can effectively induce EAE in Kunˉming mice.No combination was found between induction dose and clinical severity in the first part of this study.
Key words experimental autoimmune encephalomyelitis Kunming mice animal model
实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是用同种或异种中枢神经系统白质抗原或抗原特异性T淋巴细胞诱导敏感动物发生的主要累及中枢神经系统髓鞘的自身免疫性炎症，其临床表现及病理变化和多发性硬化（multiple sclerosis，MS）极其相似，是目前研究MS常用的动物模型。皮下多部位注射致敏原可以诱导多种动物（包括猕猴、豚鼠、大鼠、小鼠）发生EAE ［1］ 。不同物种的模型在临床表现和病理变化等方面各有一定的特点，在MS研究中各有其应用价值。
小鼠的遗传背景资料详尽 ［2］ ;实验材料丰富，花费少;小鼠EAE模型多表现为缓解-复发病程，并且其生命周期短，有利于复发性慢性疾病的观察研究，所以有关小鼠EAE模型的研究数量较多 ［3～7］ 。不同的鼠种对于EAE诱导的易感性有一定差别，抗原的种类和剂量等因素对诱导的成功率有一定影响。本实验通过将不同剂量同源脊髓匀浆致敏原注射于小鼠皮下部位，利用EAE临床分级、病理学检查方法观察不同免疫剂量差异对实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 本实验采用的清洁级昆明鼠40只，雌性，6～8周龄，饲养条件为清洁级，5～10只/笼，任意供水。实验期间3级以上瘫痪和濒危鼠予以单笼饲养，鼠粮用饲水浸软后喂给，每日人工喂水2次。实验动物用完全随机法分组。
1.2 方法
1.2.1 EAE模型制备 新鲜昆明鼠脊髓，加生理盐水制成同源脊髓匀浆，再加完全福氏佐剂配成油包水剂，多部位腹侧皮下注射，0.2ml/鼠。1周后用抗原加不完全福氏佐剂加强免疫1次。
昆明鼠随机分为6组，每组分别用100mg、50mg、10mg、5mg、1mg和0.5mg同源脊髓皮下注射，首次免疫同时及之后48h给予穿孔素（pertussis toxin，PT）腹腔注射，每只昆明鼠每次用量为200μg，溶于0.2ml磷酸盐缓冲液中。
1.2.2 EAE症状分级 参照国内外常用方法 ［7，8］ ，按6级计分:正常，0分;鼠尾张力障碍，1分;部分后肢瘫痪或步态不稳，2分;完全后肢瘫痪，3分;部分或完全前肢瘫痪，4分;濒死状态或死亡，5分。死亡鼠在发现死亡当日记为5分，次日起不再计分。
恢复期判断标准为起病5～10日后临床计分降为2分或以下。复发判断标准为临床计分升高至少1分（伴较明显或突然的体重下降） ［9，10］ 。
1.2.3 病理学方法 随选取不同病程昆明鼠，将头颅与脊柱一起分离，放入10%中性福尔马林中固定24～48h，再分出脑和脊髓组织，切成0.5cm厚的组织块，按常规方法脱水、透明、浸润、包埋、制成蜡块。切成4μm，分别作HE染色、轴突染色（改良Bielschowsky法）、髓鞘染色（Page氏搔络铬花青染色法）。1.2.4 统计学处理 实验数据采用社会科学统计软件包SPSS8.0for Windows进行处理。由于根据经验起病日期不呈正态分布，故先作平方根处理。各变量用X±s描述，对平均最大计分、每日平均计分和起病日期的平方根作组与组间的独立样本t检验。作散点图观察处理剂是与效应之间的关系，再作线性回归分析，并对相应的系统进行检验。P值取为0.05。
2 结果
2.1 病情变化
本实验收集到有效资料的昆明鼠共39只，其中27只（约69%）在从首次诱导算起2周内出现肌力障碍;9只（约23%）在整个观察期中从未出现症状;3只（约8%）在1个月后出现轻微的肌力障碍，起病日期分别为第32、39和43日。39只昆明鼠中有10只在首次发病的急性期死亡，1只在复发期死亡。各组小鼠发病的基本情况见表1。
在接受处理的各组小鼠中，0.5mg诱导组和5mg诱导组发病比率较低，均为50%（3/6），病情也较轻，仅5mg诱导组的22号鼠病程中出现部分性后肢瘫痪，其余均表现为鼠尾张力下降，没有致死鼠。而1mg诱导组、10mg诱导组、50mg诱导组和100mg诱导组的发病比率均达80%以上（分别为6/7、7/8、6/6和5/6），其中50mg诱导组达100%;这4组的致死比率分别为57%、25%、50%和33%（4/7、2/8、3/6和2/6）。急性期致死的小鼠病情恶化急骤，多在出现轻微肌力障碍2天内突然死亡，而50mg诱导组的13号鼠表现有一个从鼠尾张力减低到濒死状态的较明显的进展过程，同组的31号鼠出现肌力障碍后第10天死前肌力障碍曾一度略有减轻。
表1 EAE诱导实验病情一览表（略）组 注:各组的平均最大计分为组内个体小鼠病程中最高计分的均数;每日平均计分为各个个体小鼠病程中的临床计分总和除以该鼠病程天数。急性期过后幸存的小鼠接近一半有不同程度的复发，各组出现肌力障碍的小鼠的平均复发次数在0.4次到1.3次之间。复发次数最多者达5次。复发期表现多较轻微，除15号鼠在复发期死亡外，其它多以鼠尾张力降低和部分性后肢瘫痪为主。
2.2 诱导剂量与病情的关系
我们用独立样本t检验分析本实验中各组间平均最大计分、每日平均计分和起病日期的平方根的差别。结果在P=0.05的水平上，平均最大计分间差异有显著性的有1mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.024）、1mg诱导组与5mg诱导组（P=0.032）、50mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.037）和50mg诱导组与5mg诱导组 （P=0.048）;每日平均计分间差异有显著性，有1mg诱导组与0.5mg诱导组（P=0.036）及1mg诱导组与5mg诱导组）P=0.034）。各组的起病日期的平方根在P=0.05的水平上未发现差异有显著性。
为了明确诱导免疫剂量与病情轻重之间是否存在某种关联，分别做平均最大计分和每日平均计分相对于免疫剂量散点图（见图1、2）并试行回归分析，其分布缺乏明显的倾向性。根据以上结果，我们推论本实验中所用剂量诱导发生EAE无明显差异。
图1 KM鼠EAE最大计分与免疫剂量的关系，剂量单位为mg
图2 昆明鼠EAE每日平均计分与免疫剂量的关系，剂量单位为mg
2.3 病理结果
镜检发现的病灶多在脊髓、脑干和小脑。HE染色切片上可见淋巴细胞和单核细胞围绕小血管周围呈袖套样浸润。髓鞘染色切片上可以见到小块脱髓鞘病灶散在分布于小血管附近。轴突染色切片上病变轴突粗细不均、扭曲断裂，着色深浅不一。所见病理改变与文献报道基本相同。
3 讨论
为了研究MS的发病机制，人们通常采用EAE、慢性病毒脱髓鞘疾病、毒素介导的有齿动物脱髓鞘等几种动物模型:其中EAE的髓鞘损害是由免疫反应介导的、对髓鞘或少突胶质细胞上的自身或外来抗原直接攻击所致，故与人类中枢性脱髓鞘疾病多发性硬化极为相似，因而成为多发性硬化的发病机制、病理及临床研究的最佳选择。
早在1933年，Rivers等 ［11］ 就开始通过注射神经组织抗原制作EAE模型。以后，逐渐引进加用福氏佐剂和穿孔素等方法以易化诱导过程。对于不同的物种，敏感抗原的种类、剂量和免疫过程有一定的差别。Brown等 ［3］ 用同源脊髓匀浆和结核杆菌合用诱导SJL/J小鼠EAE，发现该鼠种对诱导非常敏感。用低至0.025mg的同源脊髓匀浆和0.03mg结核杆菌与IFA皮下注射即可成功诱导发生EAE。
本实验采用同源脊髓匀浆作为自身抗原和福氏佐剂合用，成功诱导制作昆明鼠EAE模型，致敏后20d内出现典型EAE表现，组织病理学检查证实可见大量炎性细胞浸润，髓鞘脱失、轴突损害明显，均符合EAE的病理改变特点。表明该模型的建立方法可靠，成功率较高。不同免疫剂量的差异对EAE临床病情的改变不存在线性关系。
与以往报道相比，本实验的发病比率稍低，总体为69%，1mg诱导组为86%。原因可能在于鼠种差别和所用的结核杆菌的种类和剂量不同。另外，本实验的致死比率较高，急性期死亡者病情恶化迅速，除了鼠种差别外，可能还同我们在实验中加用穿孔素有关。本实验中0.5mg诱导组和5mg诱导组的临床病情较轻，发病比率也较低，但是综合考虑最大计分、每日平均计分和起病日期等其它指标，尚不能认为这是免疫剂量差别所造成的结果，同时统计学分析没有发现免疫剂量与病情之间存在关联。因此，我们考虑这些表现可能与昆明鼠是远交系小鼠，个体的免疫反应特点变异性较大有关。
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（收稿日期:2004-06-26） （编辑罗 彬）
作者单位:510630广州中山大学附属第三医院神经内科
摘要： 实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)是研究人类多发性硬化(MS)的 经典动物模型，EAE发 病和愈复过程中细胞凋亡的情况也是目前神经生物学的研究热点。研究者们发现，EAE时CNS 损伤区有自身反应性T淋巴细胞的凋亡，而且这种细胞凋亡促进了EAE的愈复和耐受状态的形 成，这就为EAE乃至人类MS的防治提供了一条新思路。有关EAE其他细胞 凋亡和影响细胞凋亡的因素也有一些研究。本综述对近年来这些方面的研究进展做了较为 全面的回顾。
中图分类号:R744.5＋1；R329.2 文献标识码： A
文章编号： 1006-2963 （2000）03-175-05
实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是T细 胞介导的中枢神经系统（central nervous system, CNS）脱髓鞘疾病，是人类脱髓鞘疾病 ——多发性硬化 （multiple sclerosis, MS）的经典动物模型。研究EAE的发病及愈复机制 ，对于MS的预防和治疗都有重要意义。有关EAE发病机制的研究近年来有以下进展：（1）介 导EAE发病的淋巴细胞更具体地归类为CD4+Vβ 8.2+T细胞；（2）淋巴细胞产生的细胞 因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNF、IFN-γ、TGF-β等，直接参与炎症反应或反应的修 复；（ 3）NO参与EAE的发病，但不同的研究者用不同的动物和诱导方式以及不同的NOS拮抗剂，得 出不同结果［1，2］，因而NO的作用有待进一步明确；（4）Fas/Fas-L系统促进少 突 胶质细胞的损伤，参与EAE的发病［3-6］；（5）细胞凋亡(apoptosis)与EAE发病有 关，尤其在EAE的愈复和免疫耐受形成中起重要作用。
细胞凋亡与免疫系统的关系极为密切，淋巴细胞的凋亡涉及到自身免疫性疾病的康复及耐 受机制的形成。对于EAE也不例外。
早在60年代中期，就有人发现EAE病程中有细胞死亡，并认为是少突胶质细胞、单核细胞和 淋巴细胞死亡。随着凋亡概念的出现和检测技术的发展，Pender等从形态学上证实EAE中的 细胞死亡以凋亡的形式出现，并认为其中有少突胶质细胞，而后又发现更多的凋亡细胞是T 淋巴细胞，还有一些为巨噬细胞［7］。这些研究成果激起学者们的浓厚兴趣，促进 了对此问题的深入探讨。
目前，对凋亡淋巴细胞的进一步分类、影响凋亡的因素以及凋亡的意义等，都有了很多新的 发现。
1 EAE中凋亡的细胞
1.1 少突胶质细胞 Pender等在证实EAE病程中有细胞凋亡存在的同时发 现：凋亡细胞出现 在CNS的灰质和白质中；白质中的凋亡细胞与正常的有髓纤维毗邻，慢性EAE中则与脱髓鞘的 纤维毗邻；灰质中的凋亡细胞与神经元胞体和髓鞘毗邻；在含有髓鞘碎片、毗邻脱髓鞘轴突 的巨噬细胞中有凋亡的细胞体。前人也曾注意到，Cuprizone中毒小鼠CNS中正在死亡 的少突胶质细胞有明显的染色质边集和核分裂，形成几个大的致密团块。于是，根据凋亡细 胞的大小和位置，Pender等推测凋亡的细胞为少突胶质细胞。但是，对于这种细胞的定性， 却没有更具说服力的证据。曾有人提出不同观点，认为EAE时少突胶质细胞不是凋亡，而是 细胞溶解。用TUNEL技术检测EAE的凋亡细胞，也未检测到呈阳性反应的少突胶质细胞，从而 否定了少突胶质细胞的凋亡［8］。
1.2 淋巴细胞 Pender等虽然没有为少突胶质细胞的凋亡提供更多的证据 ，但在提出“EAE 的CNS中可能有特异性淋巴细胞的凋亡”后又进行了一系列的研究。1992年他们使用包埋 前免疫标记技术发现，CNS中10%CD4+细胞和5%αβ T淋巴细胞发生凋亡。而凋亡细胞中， 51%被OX-34标记，38%被R73标记。由此得出结论：急性MBP诱导的EAE,脊髓中的凋亡细胞至 少一半以上是T淋巴细胞，并很有可能是自身反应性的、MBP激活的特异性T淋巴细胞(即MBP -特异性T细胞)。其他研究者也发现，脑损伤区的凋亡细胞64%为T淋巴细胞。1994年他们在 被动转移的EAE模型用流式细胞仪分析细胞表型和DNA，证实了自身反应性T细胞的凋亡 ［9］。该研究发现，Vβ 8.2+T细胞在凋亡细胞中的比例是其在正常T淋巴细胞群中的 7倍，显示出凋亡细胞中Vβ 8.2+细胞的高度聚集，得出“自身反应性Vβ 8.2+T细胞 以凋亡的方式从靶器官中选择性消除”的结论。在主动诱导的EAE也得到类似的结果［1 0］。1995年他们使用有限稀释法分析发现，被动转移的EAE在发病高峰期脊髓中MBP-特 异性淋巴细胞，即Vβ 8.2+T细胞达最高比例（1146个细胞中有1个）；到恢复期，其比 例则奇迹般地降至每105个细胞中1个；同时检测的卵白蛋白(OVA)-特异性T淋巴细胞的比 例 ,在两个时期改变程度较小［11］。这种恢复期Vβ 8.2+T细胞特异性下调的现象 ，进一步证实了前面的观点［9］。1998年，他们检测了介导凋亡的蛋白，发现Vβ 8 .2+细胞中，Fas+和Fas-L+的细胞分别是Vβ 8.2Fas+Vβ 8.2Fas-L +细胞的1.4～5.8倍和1.5～8.8倍，说明Vβ 8.2+细胞表达Fas 和Fas-L的频率高 ［12］，进一步证实了“自身反应性Vβ 8.2+T细胞以凋亡的方式从靶器官中选择 性消除”。其他学者用免疫细胞化学双标技术，在被动转移EAE的SJL/J雌性小鼠也证实了CN S中T淋巴细胞的凋亡［8］。
Pender等检测了外周淋巴器官，发现主动诱导的EAE淋巴结中也有凋亡细胞的存在，但数量 较少，主要局限于生发中心，即B细胞区。检测MBP-特异性T淋巴细胞在被动转移EA E的肠系膜淋巴结中的比例同样发现，症状明显时凋亡细胞比例较高，恢复期及恢复后比例 逐渐降低，直至检测不出［11］。MBP-特异性T细胞受体的转基因小鼠胸腺中也有 Vβ 8.2+ T细胞的凋亡［13］。尚未看到关于脾内淋巴细胞凋亡的报道。
1.3 巨噬细胞及其他细胞 有研究者发现，一些非淋巴细胞的凋亡细胞， 胞浆丰富，含有 脂滴、空泡和吞噬的髓鞘碎屑，认为是巨噬细胞，并在电镜下得到证实［7］。Bruno Bonetti等采用免疫细胞化学和TUNEL技术，在被动转移EAE急性期的小鼠中观察到环绕血管 周隙的一些小胶质细胞也发生凋亡，但所占比例较低［14］。后来证实，小胶质细 胞比巨噬细胞更易于凋亡［15］。
2 EAE中细胞凋亡的机制和影响因素
研究者们在确定EAE的CNS中有MBP-特异性淋巴细胞的凋亡后提出细胞凋亡的几种可能机 制：(1)效应性T细胞完成功能后内源性程序引发的自我毁灭过程。但这一机制的可能性不大 ，因为细胞毒T细胞杀靶后可以再循环。(2)对致脑炎性T细胞有特异性定靶作用的 T细胞产 生的细胞毒性（溶细胞性细胞间的相互作用）。(3)内源性皮质醇的释放。这一机制被广泛 认可，并通过肾上腺切除后的EAE大鼠，观察到CNS内T细胞凋亡数量减少［16］而得 到进一步的证实。(4)激活诱导的细胞死亡。后来进一步研究发现，EAE恢复期间和恢复后， 脱髓鞘病变释放的MBP增多，小胶质细胞表达MHC-Ⅱ类抗原也增多，致使新进入CNS的T细胞 被激活，而此时Vβ 8.2+T细胞凋亡比例也升高［12］，为这一机制提供了证据。
影响细胞凋亡的因素还很多，其中CNS的内部环境就是一个重要因素，因为研究中发现T淋 巴细胞的凋亡仅限于CNS的实质。CNS的局部因素包括传导信号的失衡,细胞毒因子（TNF-α 、淋巴毒因子）、脑特异性激素和细胞毒T细胞的相互作用。此外，学者们认为脑内的星形 胶质细胞和部分小胶质细胞也能促使T细胞凋亡［14］。至于其机制，可能是由于星 形胶质细胞和部分小胶质细胞属于非专一性抗原递呈细胞，缺乏协同刺激信号所致，属于激 活诱导的凋亡。另外，过量的NO通过诱导型 NOS (iNOS) 在T细胞的凋亡中起重要作用 ［17］。体外研究也证实，活性氧和NO能诱导MBP-特异性T淋巴细胞的凋亡［18］ 。
巨噬细胞凋亡的机制及影响因素与淋巴细胞类似［7］，但无Fas/Fas-L的参与 ［15］。现只了解小胶质细胞的凋亡不通过Fas/Fas-L途径［15］（这与有些学者 的观点［8］不太一致），其余无更多的阐述。
3 EAE中细胞凋亡的意义
很早就有人提出，淋巴细胞的克隆清除可能是EAE愈复和耐受的机制。现已十分肯定，这 种淋巴细胞的“克隆清除”是以凋亡的形式发生的，并有大量研究提供了证据，证实细胞凋 亡在EAE愈复和耐受形成中的作用。
研究者联合使用光镜、免疫电镜、免疫细胞化学、原位缺口翻译等技术研究发现，EAE早期 阶段细胞凋亡较少，临床恢复时达到高峰，而此时损伤区中49%的T细胞凋亡了。在被动转移 的EAE，也有类似的发现［9］。这些除了提示人们淋巴细胞的清除与EAE的恢复有关 外，还能解释以往的一些发现:CNS损伤区无髓磷脂-特异性T淋巴细胞的积累；外周血中这 种 特异性淋巴细胞比CNS多；MS患者缓解期外周血中髓磷脂自身免疫性T淋巴细胞的数量与正常 人无明显不同。近年来，用免疫细胞化学和流式细胞分析检测介导凋亡的蛋白，进一步验证 了细胞凋亡与EAE临床恢复的一致性［12］，即Fas+和Fas-L+细胞自发病初期开 始逐渐升高，恢复初期达高峰，而Bcl-2+细胞在整个病程中变化不明显。
对于急性EAE,CNS中 T细胞的凋亡与临床愈复的关系基本明确，而与人类MS更为相似的慢性 - 复发性EAE又如何呢？有人在相同条件下，同时检测急性EAE和慢性-复发性EAE病程中细胞 凋 亡的情况，并进行了对比。结果显示慢性-复发性EAE首次发作和再次发作时细胞凋亡情况 与急性EAE类似：发病初期出现凋亡细胞，然后凋亡细胞数量逐渐增加，到恢复初期达高 峰，随后又逐渐减少，几乎减少至零；再次发作时，凋亡细胞又逐渐增加，复发高峰时其数 量也达高峰，然后又再次减少［14］。
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近年来，又有学者在碱性髓鞘蛋白反应性T细胞受体的转基因小鼠EAE恢复阶段发现CNS 中MBP-特异性T淋巴细胞的凋亡［13］，从而更明确了自身反应性T 细胞以凋亡的方式自CNS清除是EAE愈复的机制之一。
EAE的CNS中淋巴细胞以凋亡方式发生的选择性清除，有助于减少MBP-特异性淋巴细胞的产 生。但由于淋巴结内的前体能产生新的效应细胞，因而CNS内T淋巴细胞的急性清除不会产生 长期耐受，而持续、低水平的凋亡则有助于耐受状态的形成。通过后来的研究又进一步提出 ，激活诱导的T细胞凋亡可能有助于机体在急性EAE后进入耐受状态［12］。但这种 耐受状态只针对再次用抗原和佐剂主动诱导的方式，而对于被动转移MBP-特异性淋巴细胞 则不起作用。
此外，CNS内T淋巴细胞的凋亡还能尽可能减少脑损伤区以外的其他损伤。
巨噬细胞的凋亡在EAE的临床愈复中也有助于CNS炎症的消退，对缓解这一自身免疫性疾 病很重要［7］。少突胶质细胞的凋亡或损伤则在EAE的发病中起重要作用［5 ］。
综上所述，EAE病程中自身反应性、CD4+Vβ 8.2+T淋巴细胞以凋亡的方式从CNS清除， 是EAE愈复和耐受状态形成的机制之一。根据这一结论，再结合EAE时CNS中淋巴细胞凋亡的 影响因素，就为我们通过治疗EAE进而治疗人类的MS，提供了一个新的方案。我们相信， 在不久的将来，长期困扰人类的慢性自身免疫性脱髓鞘疾病——多发性硬化的治疗和预防复 发将会有新的突破。
作者简介：王惠（1972-），女，河北省保定市人，在职硕士研 究生。通讯地址：河北医科 大学基础医学研究所神经生物研究室，石家庄 050017。联系电话(BP)：96151-77718。
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