主题:MHC

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动物和人能闻到免疫系统相关基因 从而影响择偶


  据国外媒体报道,近日,科学家提出一项理论,认为动物和人类能够闻到与免疫系统有关的特定基因,从而影响他们对配偶的选择。

  这里所提到的特定基因被称为主要组织相容性复合体(MHC)。对于人类和动物来说,选择那些与自身拥有的MHC基因不同的配偶是很有意义的,这将使后代拥有更为多样的免疫基因,从而对疾病更具抵抗力。但是在此之前,科学家并未发现人类和动物身上的MHC基因所散发出来的气味信息。

  如今,德国蒂宾根大学的免疫学系和蛋白质组研究中心的研究人员和萨兰大学的科学家进行合作,成功找到了MHC基因的气味信息。

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  MHC基因决定了细胞的表面向免疫系统杀伤细胞呈现出何种MHC缩氨酸。这些MHC缩氨酸通常由机体自身的蛋白质所构成,所以不会引起任何反应,而如果是来自于病毒的MHC缩氨酸,则会被免疫系统的杀伤细胞所攻击。 

  根据目前的一种理论,MHC缩氨酸同时也发散着含有MHC基因信息的气味。通过实验,科学家们发现了一些能够识别和区分多种MHC缩氨酸的特殊细胞。 

  通过对小白鼠进行实验,研究人员发现MHC缩氨酸能够在尿液中自然产生,而这些MHC缩氨酸能够让小白鼠识别出大多数其他同类的基因。 

  然而,到目前为止,研究人员还尚未在人类的尿液,汗液或者唾液里侦测到MHC缩氨酸。(尚力) 

日期:2013年3月26日 - 来自[免疫系统]栏目

为什么“有害的”免疫基因能够得以保留

  为什么小鼠、人以及其他的脊椎动物携带着上千种不同的基因并被表达成称为MHCs的免疫系统蛋白质,甚至这其中的一些基因却使得脊椎动物更易于感染或发生自身免疫疾病,对于这个问题生物学家已经发现了新的证据。“主要组织相容性复合体”(MHC)的蛋白质在脊椎动物的大多数细胞表面被发现。他们把与自身相似的蛋白质与外源的蛋白质相区分,并引发对这些外来侵略者的免疫反应。MHCs能识别入侵的病菌,排斥或接受移植的器官,并在帮助脊椎动物寻求可兼容的配体中起作用。虽然任何特定的个体中有不超过12种的MHC的6个基因,但是产生的MHC蛋白质的六个人类基因的其中任一个,在任何地方的人群中有从数百到2300个品种。

  “为什么相同的MHC基因在人群中有这么多不同的版本,”Kubinak说,“这个谜底主要在于许多人携带的MHCs使得他们对于一些病原体(包括艾滋病病毒,疟疾和B型、C型肝炎)和自身免疫性疾病(I型糖尿病、类风湿关节炎、红斑狼疮、多发性硬化症、肠易激综合症、强直性脊柱炎)具有易感性。

  科学家已经提出了为什么在脊椎动物种群中存在这么多的MHC基因变异的三个理论(无脊椎动物没有MHCs),并说所有三种理论可能参与维持MHCs的极大多样性:

理论一

  一个有更多的MHC变异体的个体比拥有较少变异体的个体具有更好的免疫反应能力,因此,随着时间的推移,有更多MHCs的生物体更容易生存。然而,这个理论不能解释的MHC多样性的充分程度。

理论二

  以往的研究表明,人类和其他动物被有“外来”MHCs的配体而不是与自身有相同MHCs的配体吸引。拥有不同的MHC变异体的父母生出的儿童具有更多的MHCs,因而拥有更强大的免疫系统。

  机体与病原体之间对抗的共同进化:“我们有一个有机体,并且微生物可以感染它,”Kubinak说,“微生物进化从而更好地感染生物体,生物体进化出更好的防御系统以对抗感染。”一个解释在MHC基因极大的多样性的理论是,随着时间的推移这些利益的相互竞争有利于保持MHCs更多的多样性。”

  “你自然地保留了战胜疾病的基因”,Kubinak说,“他们帮助你生存,所以随着时间的推移那些MHC基因在人群中更常见,因为人们携带着这些基因去存活并产生后代。”

理论三

  病原体如致病的病毒、细菌或寄生虫感染动物,动物则用MHCs来识别侵略者并引发免疫反应来消灭入侵的病原体以进行自我防护。但随着时间的推移,一些病原体的变异并演变得不易被MHCs识别,从而逃脱免疫反应。结果,这些病原体过多繁殖。失去对细菌的战斗力的MHCs变得不太常见,因为携带它们的人易于患病。有人认为,这种疾病易感性的MHC基因最终应该从种群中消失,但他们通常不会。

  为什么一些MHCs基因变得消失的同时另外一些可以持续存在,这有两个原因。

  首先,一些现在稀有的MHCs基因获得优势,因为他们不再是针对正在进化中的微生物,他们重获了发现并击败相同细菌的能力,这些细菌他们早先能击败,后来这些细菌的突变体他们也能击败。

  第二,有些稀有MHCs基因可以对完全不同的微生物发起有效的免疫反应。

  通过允许一种疾病的病毒在小鼠体中迅速进化,Potts、Jason Kubinak和其他犹他大学的科学家对于技术上称为“对立的共同进化”的这种基因和细菌之间的军备竞赛提出了新的实验依据。该研究结果发表在本周的网上期刊“国家科学院学报”(PNAS)上。

  犹他州立大学的生物学家韦恩·帕兹说:“这项研究的结果解释了为什么有这么多版本的MHC基因,以及为什么那些造成疾病易感性的基因被保留而不被消除。”“这些基因都参与了一个永无休止的”军备竞赛”,这导致他们在任何时间点都能很好抵抗一些感染,而却不能抵抗其他感染和自身免疫病。”研究员研究了60只遗传相同的小鼠,此外,这些小鼠被分成b、d、k三组,每组具有各自不同的MHC基因种类。叫做友好病毒的一种小鼠白血病病毒在组织培养基中生长后被用来感染三个MHC类型组中的两个。病毒在小鼠体内快速增长并在脾脏和肝脏内攻击、扩散和复制12天。收集脾中的病毒颗粒,疾病的严重程度由测量体重和脾脏肿大的重量来评估。然后,从第一轮三对小鼠(b、d、k各一对)中获得的病毒被用来感染具有同样MHC类型的另外三对小鼠。对此实验过程进行重复直到每组MHC类型中的10对小鼠都被感染,这样的时间允许病毒突变。

  在第一个实验中,生物学家发现,友好病毒可适应其攻击的小鼠细胞,并逃脱MHC变异体(b、d或k)的攻击。接下来,研究者发现,病毒适应只是针对于特异的MHC蛋白。比如,能适应并致病b型MHC类型小鼠的病毒,却能被d、k类型MHC的小鼠有效攻击。

  在第三个实验中,研究人员发现,病原体适应力(由脾病毒颗粒的数量来衡量)与病原体的毒力相关(由脾脏肿大程度和重量衡量)。所以病毒逃脱b型MHC 使得这种类型MHC的小鼠病情加重。Potts说:“这个实验首先证明了一种病毒与MHC基因对抗的共同进化。”

  使用抗生素以提高奶牛和其他牲畜的生产力是人类疾病越来越抵抗抗生素的一个重要原因。通过选择性育种获得更多的牛奶和牛肉的方法可减少牲畜的遗传多样性,包括其MHCs。因此,牛群繁殖中获得更多的MHCs可提高其抗病能力,从而减少抗生素的需求。

  由于濒危物种数量的减少,所以遗传多样性减少,这使得它们更容易成为细菌的目标。Potts说,在濒危物种中繁殖有保护作用的MHCs以巩固它们的疾病防御力将会令人满意。

  MHCs的异常变异在人与其他生物中对新出现的传染病的传播和演变是非常重要的。实际上,研究人员使用病毒在小鼠中进化从而创建了新出现的疾病。“这是一个模型,验证了一旦情况改变了,病毒具有更强的毒力,”波茨说,“继而会出现新的疾病。”

日期:2012年2月16日 - 来自[遗传与基因组]栏目

感染或诱发免疫相关基因发生变异

近日,发表于《自然通讯》上的一篇新的文章\"Rapid  and  adaptive  evolution  of  MHC  genes  under  parasite  selection  in  experimental  vertebrate  populations\"指出,MHC变异体对抵抗疾病是必须的,而且当前在人群中普遍适应的MHC等位基因分布可以使下一代个体更好的抵抗这种疾病,直到另一种疾病发生使其他个体因为其所携带的MHC等位基因变异体可以健康的抵抗这种疾病并且繁衍出更多的后代。现在,这个新的适应性MHC等位基因将传播。用这种方法,大量的MHC多态性被维持,从而引发器官移植的持续不断出现问题,但也有助于我们在每一代人中都能出现更强壮的孩子。
免疫基因一种特殊形式的大的变异可以使器官移植变得非常复杂。另一方面我们又需要这样一种大的变异来对抗传染性疾病。这就是为何这些基因在性伴侣选择中同样发挥重要作用的原因。目前为止,支持这些固定的遗传变异在进化上的机制还是一个谜。在对刺鱼的一项研究中,来自普龙马克思普朗克进化生物学院及来自基尔大学亥姆霍兹海洋研究中心的科研人员发现传染性疾病的复发决定于哪一个个体在种群中产生一定特别大数量的后代以及哪些免疫基因在下一个宿主后代中出现的频率升高。因此,传染病是该变异的驱动力。
我们都读到或听到过成功的器官移植案例。尽管操作技术在改善,但这一临床成就往往因为很难发现合适的受体而变得格外复杂。这是因为免疫系统中实质上的基因(在人类中叫白细胞抗原,HLA)在人群中具有复杂的多样性,而且要保证移植成功则不允许供体和受体间HLA有差别。如果HLA不同,HLA分子会识别新的器官不属于自己,从而立即引发对移植的肝脏或心脏的免疫反应。在人群中存在超过1000个HLA免疫基因变异体(叫做“等位基因”,),任何两个个体都可能不同,因此会造成不相容。
有趣的是,肝脏移植的一个难题是当人选择他们的配偶进行移植时是一种优势。作为人,通过味觉,我们更喜欢那些为我们自己的系列HLA等位基因提供最好补充的人。这是因为我们已经逐渐形成了为我们的孩子提供最好的抵抗传染性疾病基因组合的行为。如果为了能够选择最佳配偶,最好的方式是找更多的可能的配偶,并且这些配偶能够携带不同HLA等位基因组合。这个在个体HLA等位基因的高度可变性,即多态性,是例外的。在所有其他基因中,任何两个个体间都及其相似。这迫使维持该多态性时非常严格,因为提供给我们的后代最理想的免疫基因组合的同时造成器官移植变得非常复杂,并且目前仍然是个未解之谜。
令科学家兴奋的是,HLA多态性在其他脊椎动物中是非常相似的,在其他脊椎动物中叫做MHC(主要组织相容性复合体)多态性,包括3-刺刺鱼——一种在所有北半球的湖泊和河流发现的小鱼。与HLA相同,MHC基因的主要功能是抵抗疾病。科研人员假设MHC的多态性在天然种群中通过一代到下一代的疾病变化而得以维持,这样,这些恰巧含有抵抗疾病的MHC等位基因的个体是健康的,并且具有繁衍更多携带那个有益等位基因的后代的优势。
为了验证这个观点,来自德国普龙马克思普朗克进化生物学院及来自基尔大学亥姆霍兹海洋研究中心的两组科研人员在一个巨大的户外中型实验生态系统中建立了具有相同遗传背景的3-刺刺鱼实验种群,其中每一个种群都感染一种或两种寄生虫疾病.刺鱼准许选择天然的繁殖行为并且雌鱼能选择最好的配偶繁衍后代。令人感兴趣的是雄三刺刺鱼在交配季节喉咙部位显示出强烈的红色-这是雄鱼的一种健康标志。
研究人员追踪了两代刺鱼间MHC等位基因频率的改变情况。结果支持他们的假设,科学家发现仅仅那些对特殊的父母已经感染的寄生虫病分别提供抗性的MHC等位基因的频率在下一代中才会升高。
日期:2012年1月20日 - 来自[遗传与基因组]栏目

我学者揭示免疫识别新机制 为疫苗设计提供新思路

   我国科学家在天然免疫学领域又获新发现:免疫学中的重要经典分子——主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子具有新的非经典功能,即能够通过维持激酶Btk持续激活的方式增强抗感染天然免疫应答反应。4月21日最新一期《自然免疫学》杂志以封面标题论文的形式,发表了中国工程院院士、医学免疫学国家重点实验室主任曹雪涛率领的第二军医大学免疫学研究所、浙江大学医学院免疫学研究所和中国医学科学院的研究团队这一研究成果。

 

  据介绍,抗感染天然免疫识别机制以及功能调控的研究并据此指导新型疫苗设计和抗感染药物研发,是当今免疫学领域的前沿性重要科学问题。作为一种重要的免疫识别受体,Toll样受体(TLRs)能够识别并感知病原微生物的组分和入侵机体,并迅速触发天然免疫应答;另一方面,病原微生物也可通过干扰TLRs活化而达到免疫逃逸的目的。目前,对于TLRs充分活化及如何有效触发天然免疫应答的分子机制尚不十分清晰。

 

  免疫学中的重要经典分子MHCⅡ类分子除了抗原提呈的经典功能之外,还有什么新功能?曹雪涛研究小组提出了抗原提呈细胞有效表达MHCⅡ类分子是否为天然免疫所必需,即病原微生物是否可以通过下调抗原提呈细胞有效表达MHCⅡ类分子而逃逸免疫系统的杀伤和清除问题。通过一系列体内外功能试验,他们发现,MHCⅡ类分子可显著促进TLR信号激活的巨噬细胞和树突状细胞产生炎性细胞因子,MHCⅡ类分子缺陷小鼠天然免疫功能显著低下。他们还通过质谱分析发现,MHCⅡ类分子通过结合共刺激分子CD40,进而与酪氨酸激酶Btk相互作用,从而维持Btk持续活化,最终通过激活的Btk与TLR通路中重要接头蛋白分子MyD88和TRIF相互作用,促进TLR触发的天然免疫应答反应。

 

  该研究揭示了MHCⅡ类分子除了经典的抗原提呈功能之外,还具有通过调控TLRs信号通路参与天然免疫反应的新功能,所发现的MHCⅡ类分子结合CD40和维持激酶Btk持续活化的分子机制,为新型抗感染疫苗设计及寻找免疫治疗新途径提出了新的方向和思路。

 

  延伸阅读

 

  在同期《自然免疫学》配发的专题评论中,加拿大蒙特利尔大学教授Walid Mourad在《MHCⅡ类分子的意想不到的功能》一文中评价:“该论文为人们深入、全面认识MHCⅡ类分子的非经典免疫功能及其作用机制提出了新的方向”。此外,新一期出版的《自然免疫学综述》也为此论文发表了题为《隐藏在细胞内的MHCⅡ类分子的新功能》的评论,认为该工作为天然免疫识别及其信号转导领域增添了新的认识。(记者白毅报道)

日期:2011年5月11日 - 来自[免疫系统]栏目

向HIV提出挑战的独特基因MHC基因

据3月10日的《科学  -  转化医学》杂志报道说,在猴子中的一种更为多元的免疫反应会导致对猴免疫缺陷病毒(或称SIV,这是在非洲灵长类中所发现一种逆转录病毒)的更好的控制。  这些发现提示,以类似的方法来拓展在人体内的免疫反应可能成为正在探求中的研发成功HIV疫苗的一个关键部分。  某些对感染了HIV的患者的研究表明,当个体的免疫反应变得更为宽泛的时候,这种疾病可以受到抑制;具体地说,也就是当HIV这种病毒有更多的部位可以被免疫系统的T细胞所识别的时候。  如今,Shelby  O’Connor及其同僚用感染了相同SIV病毒株的毛里求斯食蟹猴来测试一种更为多样化的免疫反应是否会真的导致更好的疾病控制。  
MHC基因可制造出使T细胞能够识别入侵物的分子。  这些猴子的特别之处是它们在MHC基因多元性上是有限的,这使得研究人员能够辨识出对同一组MHC基因来说的纯合子(以2份同样的基因形式存在)相对于杂合子(某基因具有2种不同的形式)的动物。  文章的作者发现,纯合子(这些动物只有12个独特的MHC基因)动物血中的病毒数是杂合子动物(它们的独特MHC基因数量更多,大约有20个)血中病毒数量的近80多倍。  通过检验在这些动物体内所复制的病毒的核算序列,研究人员获得了一个针对SIV免疫反应的详细的瞬象。  该数据提示,具有更多样免疫反应的动物可产生更多的T细胞,因此也可更有效地限制病毒的复制能力,并成功地阻止该疾病的发展。  这一研究是建立在从前所观察到的现象之上的,在这些观察中显示,受到HIV感染的人如果有较多的MHC基因的话,他们也会有类似的益处。因此这些结果支持这样的理念,即应该设计可诱发对HIV具有最广泛细胞免疫反应的疫苗。  
日期:2010年3月12日 - 来自[HIV/AIDS]栏目

异基因型和同基因型MHC Ⅱ类基因转染对小鼠肥大细胞瘤免疫原性的影响

异基因型和同基因型MHC Ⅱ类基因转染对小鼠肥大细胞瘤免疫原性的影响

中国免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学

作者:隋拥君 唐佩弦 侯春梅 毛宁

单位:隋拥君(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850);唐佩弦(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850);侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850);毛宁(军事医学科学院基础医学研究所,北京100850)

关键词:MHCⅡ类基因转染;异基因型;同基因型;致瘤性;免疫原性

  摘 要 目的:提高肿瘤细胞的免疫原性。方法:将异基因型或同基因型的MHCⅡ类基因转染至小鼠肥大细胞瘤P815中,用此细胞接种同系小鼠,1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型P815细胞,观察小鼠的存活情况。结果:转同基因型MHCⅡ基因的P815细胞接种同系小鼠后,4/10不成瘤,而异基因型MHCⅡ基因转染组,10/10不成瘤。1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型的P815细胞,同基因型转染组2/4不成瘤,异基因型转染组7/10不成瘤。结论:研究说明MHCⅡ基因转染具有使肿瘤细胞的致瘤性下降、免疫保护能力提高的作用;并且异基因型比同基因型MHCⅡ类基因转染的效果更佳。

  中国图书分类号 R733

Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene transfection and their effects on immunogenicity of murine mastocytoma

SUI Yong-Jun TANG Pei-Xian HOU Chun-Mei et al.

  (Institute of Basic Medical Sciences ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850)

  Abstract:Objective:To enhance the immunogenicity of tumor cells.Methods:Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene was transfected into murine mastocytoma P815.Then the transfected cells were inoculated into the syngeneic mice and one month later ,mice free of tumors were challenged with wild type P815 cells.The survival rate of the mice was observed.Results:4/10 mice were free of tumors when inoculated with syngeneic MHC class Ⅱ gene modified P815 cells,while 10/10 mice were free of tumors when inoculated with allogeneic one.One month later,the mice free of tumors were challenged with wild type P815 cell and the survival rate of syngeneic group was 2/4,while the allogeneic one was 7/10.Conclusion:Expression of MHC class Ⅱ molecular remarkably reduced the tumorigenicity of the modified cells and vaccination with MHC class Ⅱ-expressing P815 cells protected the mice from subsequent challenge with wild type P815 cells.Furthermore,allogeneic MHC class Ⅱ transfection was better than syngeneic one in their ability to generate immune-protection effects.

  Key words:MHC class II gene transfection  Allogeneic  Syngeneic  Tumorigenicity Immunogenicity

  小鼠的肥大细胞瘤细胞系P815表达肿瘤特异性抗原P815A等[1],但是一般情况下,免疫力健全的同系小鼠却无法产生针对P815细胞的免疫应答。其中的一个原因可能是P815细胞只表达MHCⅠ类抗原,而不表达Ⅱ类抗原。在肿瘤免疫中,至少需要2种T细胞:CD8T细胞识别肿瘤细胞上与MHCⅠ分子结合的特异性抗原,直接杀伤肿瘤细胞[2];CD4T细胞识别抗原提呈细胞上的与MHCⅡ类分子结合的特异性抗原,激活后为CD8T细胞的激活提供辅助信号[3]。如果肿瘤细胞能够表达MHCⅡ类抗原,即可直接激活CD4+T细胞,而不需要经过宿主APC,可能会诱导更加有效的抗肿瘤免疫反应。在本研究中,我们用小鼠的肥大细胞瘤系P815,分别将小鼠的IAk和IAd基因转移到其中,构建了异基因型(Allogeneic)和同基因型(Syngeneic)MHC Ⅱ 类基因转染的模型,比较了它们的致瘤性和免疫原性的改变。

  1 材料与方法

  1.1 细胞系 小鼠肥大细胞瘤细胞系P815培养于DMEM培养液中,添加10%的小牛血清。

  1.2 细胞转染 采用Lipofectamine转染法或者磷酸钙共沉淀法。连接在pcEXV-3载体中的IAkα和IAk β cDNA(由 Ostrand-Rosenberg S提供[4])各10 μg以及pLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞;连接在pcEXV-3载体中的IAd α和IAd β cDNA(由 Steiman R提供)各10 μg以及PLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞,具体操作过程参照说明书。以上2种转染体都用600~800 μg/ml的G418进行筛选,直到出现抗性克隆。用转PLXSN空载体的P815细胞作对照。

  1.3 流式细胞术检测细胞表面MHCⅡ类分子的表达 MK-D6mAb(ATCC)针对小鼠的IAd;OX-6(Sigma)mAb针对小鼠的IAk。流式细胞术分析过程如下:细胞经PBS洗涤后,调节细胞浓度为1×107ml-1,取100 μl细胞悬液加10 μl抗IAd或IAk抗体,室温孵育30 min,用含1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后,加FITC标记的羊抗小鼠二抗10 μl,室温孵育30 min,1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后,2%多聚甲醛固定,用于FCM检测(仪器为美国B-D公司FACStar)。

  1.4 动物实验 同DBA/2雄性小鼠(北京医学科学院药品鉴定所)40只,随机分成4组,每组10只,分别皮下注射1×105以下各组细胞:P815、P815-空载体、P815-IAk和P815-IAd。3次/w观察肿瘤的生长情况。4 w 后,未成瘤的小鼠进行以下的实验:每只小鼠皮下注射1×105的野生型的P815细胞,3次/w观察肿瘤的生长情况,15 w后结束实验。

  2 结果

  2.1 同基因型和异基因型MHCⅡ类基因转染模型的构建 P815细胞是在DBA/2纯系小鼠(H-2 IAd)中诱导的肥大细胞瘤,经过FACS检测发现,其MHCⅡ类抗原的表达为阴性(见图1)。将IAd cDNA转到P815细胞后所获得的P815 -IAd细胞,因为MHCⅡ类抗原的表达与同系小鼠的MHCⅡ类抗原相一致,所以是同基因型MHCⅡ类抗原转染的模型;同样,将IAk cDNA转到P815细胞后所获得的P815-IAk细胞成为异基因型MHCⅡ类抗原转染的模型。我们应用lipofectamine转染法或者磷酸钙共转染的方法,在600~800 μg/ml G418浓度下经过大约14~21 d左右的筛选,分别获得了对G418具有抗性的以上2种细胞。为了检测这2种细胞中MHCⅡ类抗原的表达,我们用流式细胞术进行了分析,结果(见图1)表明:此2种细胞中都有相应的MHCⅡ类抗原的表达。

图1 流式细胞术分析野生型及转基因P815细胞中MHC Ⅱ基因的表达

  Fig.1 Flow cytometric analyses of syngeneic or allogeneic MHC class Ⅱ gene expression on wild type and transfected P815 cells

  Note:a.P815-IAd cells were staining of fluorescent conjugate without IAd mAb;b.P815 cells were staining of IAd mAb plus fluorescent conjugate;c.P815-IAd cells were staining of IAd mAb plus fluorescent conjugate;d.P815-IAk cells were staining of fluorescent conjugate without IAk mAb;e.P815 cells were staining of IAk mAb plus fluorescent conjugate;f.P815-IAk cells were staining of IAk plus fluorescent conjugate

  2.2 转染MHCⅡ类基因的P815细胞的致瘤性下降 转染了同基因型和异基因型MHCⅡ类基因的P815-IAd和P815-IAk细胞接种在P815细胞的同系小鼠DBA/2皮下后都不同程度出现了肿瘤生长缓慢或者不成瘤、小鼠的生存期延长或者长期存活的现象,表明其致瘤性出现了下降。从图2中我们可以看到,转染MHCⅡ类抗原的P815细胞的致瘤性是:P815-IAk<P815-IAd,其中P815-IAk组10只小鼠在接种1个月后全部未成瘤,而对照组全部成瘤且瘤体平均直径超过16 mm。P815-IAd组仅部分小鼠(4只)不成瘤,但成瘤小鼠的瘤体直径小于对照组(P<0.01)。

图2 MHCⅡ类基因转染到P815细胞体内生长的影响

  Fig 2 Effects of MHC Ⅱ genes transfection on P815 cells growth in vivo

  Note:P815-IAd has two lines,one(n=6) represents 6 mice with large tumor burdens;the other(n=4) represents 4 mice free of tumor

  2.3 转染MHC Ⅱ类基因的P815细胞的免疫原性提高 第1次接种未成瘤的小鼠,在接种后1个月第2次接种野生型的P815细胞,结果如表1所示。我们发现2组小鼠的免疫原性都有所提高,可以保护后续的野生型P815细胞的攻击。它们对免疫原性提高的能力是:P815-IAk>P815-IAd,显示了异基因型MHC Ⅱ类基因转染比同基因型MHC Ⅱ类基因转染具有更良好的作用效果。

表1 表达异基因型或同基因型MHC Ⅱ类分子的DBA/2小鼠P815细胞免疫保护野生型P815细胞的攻击

  Tab.1 DBA/2 mice immunized with P815 cells expressing allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ genes are protected against challengess of wild-type P815 cells

Cell injection No.of mice

  surviving1)

No.of mice surviving after a

  secondary challenge with P8151)

P815(105) 0/10 /
P815-PLXSN(105 0/10 /
P815-IAk(105 10/10 7/10
P815-IAd(105 4/10 2/4

  Note: 1)DBA/2 mice were injected with 1×105 cells and mice free of tumor at 4 w were challenged with 1×105 wild type P815 cells3 讨论

  转入异基因型MHCⅡ类基因后能够引起有效的抗肿瘤反应,尽管已有报道[5],但对其详细作用机理目前尚没有很好的解释。我们推测:异基因型MHC Ⅱ分子介导的反应可分成2个阶段。第1阶段,T细胞识别和杀伤的是表达异基因MHCⅡ分子的肿瘤细胞,是一个典型的同种异体识别(Allorecognition)排斥反应[6];在第2阶段,T细胞必须识别和杀伤不表达MHCⅡ分子的肿瘤细胞,可能是一个正常的T细胞激活反应,即CD4+记忆性T细胞提供CD8+T细胞活化的必需因子,放大原本较低的肿瘤特异性反应,而后者的激活可介导肿瘤细胞的杀伤。

  另一方面,转入异基因MHC Ⅱ 类基因可以使肿瘤细胞异种化(Xenogenization),从而更容易被机体的免疫系统所识别。Lake等报道的相关识别(Associative recognization)指出:位于同一细胞表面的不同分子是由免疫系统共同加工提呈的。在我们的实验体系中,T细胞识别转入的抗原性较强的MHC Ⅱ 类分子的同时,也可能识别同一细胞上相对较弱的肿瘤相关抗原,从而引起针对P815细胞的免疫反应[7]

  根据近几年的文献报道,将MHCⅡ类基因转导至肿瘤细胞如:小鼠纤维肉瘤、小鼠黑色素瘤细胞或小鼠白血病细胞系中,都可以降低其致瘤性并且提高其免疫原性[4,5,8,9]。根据转入的MHC Ⅱ类基因的型以及瘤细胞的不同,可以将它们分成2大类:即异基因和同基因型MHCⅡ类基因转染。由于这些实验是在不同的实验条件下进行的,因此很难比较它们的作用效果。在本实验中,我们选用小鼠的肥大细胞瘤细胞系P815,分别将小鼠的IAk和IAd基因转移至其中,构建了异基因和同基因MHC Ⅱ基因转染的模型,并发现异基因型优于同基因型。这一结果的获得,对临床选择何种MHCⅡ类基因转移具有一定的指导意义。众所周知,临床中MHC配型是非常繁琐的事情,选择相配的MHC相当困难。我们的实验结果提示:在应用MHC Ⅱ类基因转移治疗恶性肿瘤的实践中,异基因型比同基因型MHCⅡ类基因具有更大的优越性。

  作者简介:隋拥君,女,29岁,博士,助理研究员,主要研究方向

  为肿瘤基因治疗和实验血液学;

  唐佩弦,男,71岁,博士生导师,研究员,主要研究方向

  为肿瘤基因治疗和实验血液学

  参考文献:

  [1]Rosato A,Zambon A,Milan G. CTL response and protection against P815 tumor challenge in mice immunized with DNA expressing the tumor-specific antigen P815A.Hum Gene Ther,1997;8(12):1451

  [2]Townsend A,Bodmer H.Antigen recognition by class I restricted T lymphocytes.Annu Rev Immunol,1989;7:601

  [3]Germain R,Malissen B.Analysis of the expression and function of class  Ⅱ major histocomatibility complex encoded molecules.Annu Rev Immunol, 1986;4:251

  [4]Ostrand-Rosenberg S,Thakur A,Clements V.Rejection of mouse sarcoma cells after transfection of MHC class II genes. J Immunol,1990;144:4068

  [5]Leach D,Callahan G.Fibrosarcoma cells expressing allogeneic MHC class II antigens induce protective antitumor immunity. J Immunol,1995;154:738

  [6]Sherman L,Chattopadhyay S.The molecular basis of allorecognition. Annu Rev Immunol,1993;11:385

  [7]Lake P,Mitchison N A.Associative control of the immune response to cell surface antigens.Immunol Commun,1976;5:795

  [8]Ostrand-Rosenberg S,Basker S,Patterson N et al.Expression of MHC class II and B7-1 and B7-2 costimulatory molecules accompanies tumor rejection and reduces the metastatic potential of tumor cells.Tissue Antigens ,1996;47:41

  [9]James R,Edwards S,Hui K et al.The effect of class II gene transfection of the tumourigenicity of the H-2K-negative leukaemia cell line K36.16.Immunology, 1991;72:213

收稿日期:1998-07-09

  修改日期:1998-09-28


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

γδT细胞的抗原识别机制

γδT细胞的抗原识别机制

中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 述评

作者:何维

单位:中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫室,北京 100005

  T细胞表面表达两类抗原受体(TCR):TCRαβ和TCRγδ。TCRαβ可特异地识别由抗原呈递细胞(APC)表面Ⅰ类或Ⅱ类MHC分子呈递的抗原肽,而TCRγδ则主要以MHC非限制方式识别各类抗原。最近对TCRγδ所识别的抗原类型及方式进行了较为深入的研究,本文就其进展作一述评。

  1 TCRγδ的多样性和分布特点提示其抗原识别的特殊性

  同TCRαβ和免疫球蛋白(Ig)类似,TCRγδ基因由重组的V、D、J和C区组成。虽然γ、δ位点的V区多样性不及α和β,但其连接区多样性则使TCRγδ存在甚至超过TCRαβ多样性的潜能[1]。然而,许多γδT细胞亚群仅取用了其受体库中很有限的一部分,一些特定的Vγ、Vδ和连接区序列的组合导致TCRγδ结构单调化[1]。小鼠γδT细胞有3种发育途径:第一组在胎儿胸腺中发育,分批产生的γδT细胞分别进入特定的上皮组织。这些细胞重组单一的γ/δ基因,并具有单一的连接区序列,表现出单一的特异性。Vδ5细胞进入皮肤,Vδ6细胞进入生殖道上皮和舌;第二组在成年胸腺中发育,大多表达Vγ1或Vγ4或少量Vγ2或Vγ7,并具有广泛的连接区多态性,其库容较大,主要分布在外周血中,偶尔也进入粘膜组织;第三组的发育是非胸腺依赖性的,主要为Vγ7和Vγ1,有较大的连接区多态性,主要分布在小肠上皮。因此,γδT细胞的抗原特异性覆盖了从单一特异性到极端可变的范围[2]。γδT细胞在不同分布部位的预先设定提示它们可能是识别特定抗原的特殊T细胞群体,而并非象TCRαβ细胞分布一样具有随机性。在人类中,Vδ仅取用δ链中的一种。成人外周血中大于70%的Vδ表达Vδ2,其余为Vδ1。Vδ2与VR9共表达,而Vδ1与Vγ中某一种共表达[3]

  2 γδT细胞的抗原识别类型与机制

  2.1 MHC分子  一些文献报道小鼠和人γδT细胞可识别MHC Ⅰ和Ⅱ类分子。人类外周血γδT细胞(Vδ9)可识别同种异体树突状细胞(DC)/单核细胞表面的MHCⅡ类分子[4]

  1987年Matis 等利用同种异体APC在体外刺激无胸腺小鼠的脾细胞建立了一些MHC限制性的γδT细胞系[5]。它们识别同种异体细胞上非己的MHC分子并呈现特异性反应,但其特异性不同于传统的αβT细胞。例如,γδT细胞系LBK5可识别MHCⅡ类分子I-E的多个等位基因产物[6]。IEK是小鼠Ⅱ类MHC分子,可结合各种肽段和超抗原,刺激αβT细胞活化。Schild 等发现LBK5对IEK识别时,结合于IEK的肽段并不传递特异性,同时经典的抗原处理也未启动[7]。各种细胞对LBK5刺激能力的不同都可归结为其表面MHC分子表达的情况,而与细胞来源、类型和影响MHC-肽段装载的因素无关。结合在平皿上的IEK蛋白对LBK5的刺激与表达IEK的细胞引起的刺激强度相仿,这些结果表明LBK5是直接识别IEK分子的。

  也有大量报道γδT细胞可识别非经典的MHC类分子。从裸鼠Balb/c脾脏中分离出G8系可识别T10和T22抗原[6,7]。Porcelli 等从免疫缺陷病人身上分离出CD1c限制性的γδT细胞。 Schild 等对G8系作了深入研究,发现T10和T22有94%的同源性[7]。与LBK5相似,G8克隆对T10/T22的识别不经传统的抗原处理途径。同样,不同细胞对激活γδT细胞的能力也都归于其表面MHC表达的情况,Ⅰ/Ⅱ类抗原处理过程对其并无影响。如小鼠细胞系RMA-S和人细胞系T2在将肽类负载于MHC I类分子上都有缺陷,而转染了T22的RMA-S和T2都可激活G8细胞。非常有意思的是,G8可识别果蝇(Drosophila melanogaster)细胞上表达的T10/T22,而果蝇并不具有与哺乳类相似的免疫系统,也缺乏任何抗原处理-呈递所必需的因子。上述结果表明,这些所谓的MHC限制性的γδT细胞克隆对经典MHC的识别似乎并不通过抗原的处理和呈递。MHC分子作为抗原本身被识别,而这些细胞上负载的肽段也都并不起配基的作用。另有报道,γδ细胞克隆TgI4.4可识别一种单纯疱疹T型跨膜糖蛋白gI[8]。在抗原处理缺陷的RMA-S细胞上表达的完整的野生型 gI可被TgI4.4细胞所识别,同样,包被与平皿上的可溶性重组gI-Ig也可被识别,这表明gI是不通过抗原处理和其它分子的呈递而被直接完整识别的。γδT细胞对蛋白抗原的识别似更倾向于直接识别而不经过处理和呈递。特定的MHC分子恰好是作为抗原而非抗原呈递分子被识别的。

  2.2 非MHC分子  显而易见,相对于TCRγδ庞大的序列多态性,其经典抗原识别的种类还是太少。大量文献显示TCRγδ具有与TCRαβ截然不同的抗原识别途径。目前有两类分子被证明是TCRγδ配体:含磷酸基的非肽类小分子和热休克蛋白。

  2.2.1 磷酸化基团 人类主要的γδT细胞亚群Vγ92可在分枝杆菌感染部位中大量存在,并在体外对细菌和寄生虫起反应。研究发现分枝杆菌中的有效成分是非肽的低分子量(1~3 kD)的化合物,包含碳水化合物骨架和磷酸成分。Constant 等从结核杆菌H37RV株中分离到4种不同的水溶物:TUBag1-4。TUBag4是5'-三磷酸胸苷,其γ-磷酸为一未被确定成分的低分子量基团所取代[9]。TUBag3与4结构相似,但为尿苷而非胸苷。1和2为3和4的非核苷酸片段,活性极小。TUBag4可刺激外周血Vγ92 T细胞的扩增和其它一些特异性的γδT细胞。这些化合物同时存在于微生物和哺乳动物中。由于从分枝杆菌培养滤液或提取物中分离天然抗原比较困难, Tanaka Y 等首先合成了一系列单个碱基的磷酸化合物,并发现其中一些,尤其是单烯基磷酸化合物(Monoethyl),可模拟Vγ92 T细胞对分枝杆菌的反应[10]。其后,他们又报道了此γδT细胞的天然配基:异戊烯焦磷酸盐(Isopentenyl pyrophosphate IPP)和相关的萜类(Prenyl)的焦磷酸化盐衍生物。而用磷酸基团代替焦磷酸基团则可大大削弱它们的抗原性。IPP和相关的萜焦磷酸盐是诸如维生素、脂类和类固醇等亲脂性化合物的活性前体。这些萜焦磷酸盐中间物同时存在于细菌和哺乳类细胞中,人Vγ92 T细胞亚群对它们的识别也许可以部分解释其对一系列肿瘤细胞系的反应性。上述研究都使用了活化的γδT细胞系,无APC和额外的细胞因子的存在。后继的多数研究结果进一步显示磷酸基团活化γδT细胞需要T-T细胞相互作用,而识别本身则不需要MHC Ⅰ/Ⅱ类分子、CD1、TAP1/TAP2或DMA/DMB的表达。尽管个别研究体系中有APC的存在,但认为是非MHC限制性的,其作用可能与提供γδT细胞生长所需的细胞因子有关。 而Carena 等的研究进一步显示APC表面MHC分子在γδT细胞识别磷酸基团配体中的特殊含义[11]。CD94(NKG2-A/B异质二聚体)是大多数γδT细胞表面表达的与MHC I类分子可发生特异性结合的受体。他们发现,CD94与MHC I类分子结合时可下调磷酸化配基对γδT细胞的激活。当该配基处于低浓度时,CD94的抑制作用更明显,从而提高了γδT细胞激活的阈值。在生理情况下,该机制对防止自身免疫应答具有重要意义。

  另外一个重要的问题也初步得到了澄清,即TCRCDR3的多样性对Vγ92 T细胞磷酸化配基的特异性是否产生影响。通过取用一群随机的细胞克隆和不同配基的检验发现,所有的克隆都显示了相同形式的交叉反应性。要想选出对单一配基有特异性的克隆是不可能的。而且,无论用强的或弱的刺激物来扩增,T细胞系或克隆都显示了相同形式的交叉反应性[12]。虽然存在此种交叉反应性,但就配基结构而言,这些细胞是高度特异的。磷酸基团的数目和位置以及碳链骨架的类型对T细胞的活化都至关重要。因此,Vγ92 T寡克隆T细胞亚群具有广泛的交叉反应性而又是配基特异的。

  2.2.2 热休克蛋白(hsp)  在1990年前后,有大量的报道显示γδT细胞识别热休克蛋白家族成员。识别hsp的外周血或脐血γδT细胞亚群的表型主要为Vγ92 ,具有丰富的连接区多态性,最初的发现来自于细菌感染。人类和小鼠γδT细胞识别的主要hsp家族成员为hsp60和hsp65[13]。随后又发现一些肿瘤细胞表面高表达热休克蛋白可活化Vγ92 T细胞,如Daudi淋巴瘤表面hsp60和肺癌细胞表面的hsp72等[14,15]。热休克蛋白的单克隆抗体则至少可部分抑制该反应。该反应与靶细胞表面热休克蛋白表达含量呈正相关。在一些自身免疫性疾病中,γδT细胞对靶细胞表面hsp的识别也被证实,如γδT细胞可识别多发性硬化病人少突胶质细胞表面hsp并引起细胞杀伤[16]

  hsp作为一类高度保守的分子伴侣蛋白,广泛存在于原核和真核生物细胞中。除了构成性表达之外,在如高温、低氧、放射、感染、中毒等各种应激条件下均可诱导其高表达。热休克蛋白在蛋白折叠、转送和亚基装配中起不可或缺的作用,而且它们在许多免疫应答过程中也发挥作用。它们与一系列蛋白和肽段结合并参与抗原呈递,使得APC能处理其结合的肽段而形成稳定的MHC I类分子-肽段复合物。另一方面,通过在细胞表面表达,hsp也可能作为抗原呈递分子起作用[17],因为它的三维结构N-端肽段结合位点与MHC I类的肽段结合位点的结构相似。 在各种应激条件下,由于hsp诱导高表达而造成了γδT细胞的激活。通过其产生细胞因子和细胞毒活性的作用,γδT细胞可能发挥快速清除应激因素和受损细胞并且启动后继免疫反应的作用。

  3 γδT细胞抗原识别的结构基础

  综上所述,γδT细胞对抗原的识别与αβT细胞并不相似,而更类似于Ig对抗原的直接识别,并且无MHC限制性。TCRγδ与TCRαβ分子结构比较研究分析结果在一定程度上为此种作用差异性提供了解释。 TCRαβ和TCRγδ的二级结构与Ig类似。它们三者都通过重组V、D、J形成单一的Ig或TCR,从而形成对抗原的特异性。X线衍射研究结果显示Ig和TCRαβ的CDR3环均是识别肽段的关键结构,因此推测γ/δ链的相似区域也起类似作用。Rock 等分析了从小鼠到人Ig和TCR受体链的CDR3长度[18]。Ig轻链上CDR3短且长度相对固定,而重链CDR3长且长度范围变化大,这可能提示Ig识别从小分子到大的病原体较大范围内许多不同大小的抗原。TCRαβ的CDR3长度分布范围窄,且α、β链的CDR3长度相近,这可能反映出αβ链的功能需要,即同时接触MHC和结合肽段。TCRγδ的γ链CDR3短,长度范围小,而其δ链CDR3长且变化范围大,因此就CDR3长度而言,TCRγδ更类似于Ig而非TCRαβ。

  在混合淋巴细胞反应中,与αβT细胞同种异体反应性克隆相比,识别同种异体MHC分子的γδT细胞克隆频率是很低的;而且大多数细胞克隆有很高的交叉反应性,这在αβT细胞同种异体反应性克隆中是极罕见的,这提示TCRγδ对MHC的反应类似于Ig对MHC的识别。

  4 结论与问题

  γδT细胞抗原识别的多样性和机制复杂性使人们目前尚难以概括γδT细胞全部的生物学意义。然而现有的研究结果似乎已经揭示了γδT细胞基本功能特点。γδT细胞对抗原的非MHC限制性和无需抗原处理和呈递识别方式提示,在机体内出现机体异常变化(如应激)时,γδT细胞可作出比αβT细胞更迅速的反应。此外,γδT细胞可对αβT细胞不能识别的抗原产生应答,在功能上与后者实现互补。另外,γδT细胞免疫监视功能具有广泛性,因为其识别配体如hsp 及磷酸类小分子物质在自然界中是普遍存在的。在历经长期进化后,通过APC对抗原肽的复杂处理与加工及精确呈递,αβT细胞实现了其高度抗原特异性、严格MHC限制性和周密职责分工(Th和CTL)的免疫应答特点,使免疫系统高效、协作有序而针对性极强地清除外源生物分子或病原体。而γδT细胞则以更广泛、快速和直接的方式对体内应激事件作出反应,同时其反应手段较为笼统,即γδT细胞可同时发挥细胞毒和分泌细胞因子双重功能;但是在某些特定部位如上皮,表达特定和单一TCR受体的γδT细胞似乎为局部高频突发事件而存在。总之,在免疫应答过程中,γδT细胞可能发挥着启动、协调与互补αβT细胞功能的作用。

  γδT细胞抗原识别的研究目前在许多方面仍有待深入。γδT细胞识别蛋白抗原时所需要的基本结构要求是什么?在γδT细胞激活中,hsp到底通过何种途径起作用仍然很不明确。γδT细胞对细胞表面hsp分子的识别是直接识别,还是识别其呈递的肽段?事实上,hsp所携带的肽段的作用尚未被明确而完整地研究过。TCR的CDR3多样性究竟有何意义?既然hsp、磷酸类代谢物同时是自己和非己成分,为什么自身反应性的γδT细胞克隆在其发育中未被从细胞库中选择掉? 在这些物质引起的免疫反应中,γδT细胞的特异性是否同时指向外来物和自体成分?只有这些问题的全部澄清,人们才可对γδT细胞的生物功能作出全面和深刻的评价,并且可将其理论成果用于肿瘤和自身免疫病等的治疗。

  自94年始,我们对γδT细胞的特性、分布、亚群、受体分子的选择性取用、功能特点及其在肿瘤和自身免疫病的参与作用进行了系统的研究,以期为揭示其功能之谜提供资料和促进其理论成果在疾病的预防、诊断和治疗中的应用。

  作者简介:何维,男,43岁。留德医学博士,教授,博士生导师,中国协和医科大学基础医学院副院长,中国医学科学院基础医学研究所副所长。中国免疫学会基础免疫分会委员,北京免疫学会理事,《国外医学免疫学分册》、《中华微生物学和免疫学杂志》、《中国免疫学杂志》编委。94年回国工作后共主持国家重点基础研究发展项目(973)课题、95攻关课题、国家自然科学基金、863生物高科技计划、卫生部基金、国家博士点基金、教委基金和中美、中日和中德合作研究项目及医科院各种课题15项。科研集中在γδ型T细胞在抗感染免疫、肿瘤免疫和自身免疫中的作用,IL-15基因克隆与表达研究及其IL-15转基因瘤苗抗肿瘤作用,超氧化与免疫在衰老中的关系,胸腺退化的基因调控和老年性痴呆免疫学诊断等方面。目前共发表论文35篇(国外8篇),出版专著两部,获省部级科研二等奖一项。

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收稿1999-09-17


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

抗MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响

抗MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响

中国免疫学杂志 1999年第3期第15卷 肿瘤免疫学

作者:张 彩 田志刚 张建华 许晓群 孙

单位:山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心,济南250062

关键词:NK细胞;MHC I类分子;细胞毒活性

张 彩 田志刚 张建华 许晓群 孙

  中国图书分类号 R392.1

  摘 要 目的:探讨NK细胞杀伤与靶细胞表面MHC I类分子的关系。方法:用HLA-ABC单抗培养上清或腹水封闭靶细胞K562表面的HLA-ABC分子后,分别观察了外周血新鲜NK细胞、纯化NK细胞、LAK细胞和CD3AK细胞对K562细胞杀伤能力的变化。结果:外周血新鲜NK细胞和纯化NK细胞对K562的杀伤率明显提高,CD3AK细胞的杀伤力明显降低,LAK细胞的杀伤无明显变化。结论:NK细胞通过其表面受体识别靶细胞上的MHC I类分子而传递杀伤抑制性信号,抗HLA-ABC单抗封闭了靶细胞上的HLA-ABC等位基因而阻止了阴性信号的传导。

The effect of anti-MHC class I monoclonal antibody on NK-mediated cytolytic activity

ZHAHG Cai,TIAN Zhi-Gang,ZHANG Jian-Hua et al.

  Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062

  Abstract Objective:To study the relation of cytolytic activity of NK cells and MHC class I molecules on target cells.Metheds:The changes of cytolytic activity of fresh NK cells seperated from peripheral blood,purified NK cells,LAK cells and CD3AK cells were observed when target cells were cultured with anti-HLA-ABC monoclonal antibody for 30 minutes.Results:The cytolytic activity of fresh NK cells and purified NK cells from LAK cells was highly increased,but that of CD3AK cells was lowered.The cytotxicity of LAK cells was not affected.Conclution:NK cell can recognize the MHC class I molecules on target cells and then inhibit its cytolytic activity by transmitting kill-inhibitory signals.The anti-HLA-ABC monoclonal antibody had prevented the delivering of negative signals by blocking the MHC class I molecules on target cells.

  Key words NK cells MHC class I molecules Cytolytic actioity

  NK细胞是表型和功能上独特的淋巴细胞亚群,是机体抵抗病毒感染和肿瘤生长的第一道防线,不需预先刺激即可介导广谱的杀瘤效应。由于NK细胞对不表达MHC分子的肿瘤细胞同样具有较高的杀伤能力,多年来人们通常认为NK细胞介导的细胞毒效应是MHC非限制性的。近年来,随着对NK细胞研究的深入,人们发现NK细胞杀伤的敏感性与靶细胞上MHC I类分子的表达密切相关,对不表达MHC I类分子或表达量较低的靶细胞杀伤力强,对表达MHC I类分子高的靶细胞杀伤力较弱或不杀伤。这方面的研究已逐步成为肿瘤免疫学研究的热点内容之一[1~4]。本文初步观察了MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响,现报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 K562细胞为本室常规传代培养 鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR单抗杂交瘤细胞(ATCC引入)培养上清及腹水、新鲜兔血清均为本室自制。

  1.2 LAK、CD3AK细胞的诱导 常规分离正常人外周血淋巴细胞,调至2×106~3×106ml-1,用rhIL-2 1 000 U/ml诱导LAK细胞;用rhIL-2 200 U/ml、CD3单抗培养上清20 μl/ml诱导CD3AK细胞。均诱导8~10 d。

  1.3 纯化NK细胞的制备[5] 以补体依赖细胞毒法去除LAK细胞中的T细胞,剩余细胞即为较纯的NK细胞。即将LAK细胞悬液加入抗CD3单抗培养上清,37℃ 30 min后加新鲜兔血清,37℃ 1 h,以去除其中的T细胞。用淋巴细胞分离液分离活细胞,并经表型测定(间接SPA法)确定为NK细胞。

  1.4 细胞毒活性测定 用MTT法,将K562细胞先与不同量的HLA-ABC或HLA-DR单抗上清或腹水作用30 min后,洗3遍,再加效应细胞,并设不加单抗对照组,效靶比为10∶1。采用10%SDS溶解甲颗粒[6]

  2 结果

  2.1 HLA-ABC单抗对外周血NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后靶细胞对NK杀伤的敏感性有提高的趋势,以2.5 μl单抗腹水组提高幅度最大(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清及腹水对其杀伤力无明显影响,见图1。

图1 抗MHC I类单抗对新鲜NK细胞杀伤能力的影响

  Fig.1 Effect of anti-MHC I MoAb on cytotoxicity of fresh NK cells seperated from peripheral blood

  2.2 HLA-ABC单抗对LAK细胞中纯化NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与K562细胞作用后,LAK细胞的杀伤率略有所降低。而去除T细胞后的纯化NK细胞的杀伤有提高的趋势,以5 μl单抗腹水组提高最明显(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清或腹水对LAK及NK细胞的杀伤均无影响,见图2。

图2 抗MHC I类单抗对LAK和纯化NK细胞杀伤能力的影响

  Fig.2 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of LAK cells and purified NK cells

  2.3 HLA-ABC单抗对CD3AK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后,靶细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性明显降低(P<0.001),见图3。

图3 抗MHC I类单抗对CD3AK细胞毒活性的影响

  Fig.3 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of CD3AK cells

  3 讨论

  现已发现,NK细胞存在识别靶细胞表面分子的触发性受体(Killer-cell activatory receptors,KARs)和杀伤抑制性受体(Killer-cell inhibitory receptors,KIRs)。杀伤抑制性受体识别靶细胞上的MHC I类分子,并传递阴性信号[2,3]。因此,NK细胞对MHC I类分子表达量高的靶细胞杀伤力弱或不杀伤,对MHC I类分子缺乏或突变的靶细胞则杀伤能力强。用MHC I类基因转染后,可使对NK裂解敏感的靶细胞转为完全或部分抵抗。

  本文用MHC I类单抗与靶细胞事先孵育后,发现外周血新鲜NK细胞及纯化NK细胞对靶细胞的杀伤率有提高的趋势。由于NK细胞也能通过ADCC作用杀伤靶细胞,我们用鼠抗人HLA-DR单抗培养上清或腹水与靶细胞K562孵育作为对照组,发现不能增加NK细胞的裂解能力(见图1,2)。在以前的试验中曾用其他非MHC类单抗(如鼠抗人IL-6、IL-1单抗,均属IgG类)与靶细胞孵育后,均不增强NK杀伤的能力。因此,可以说明本试验NK杀伤能力的提高并非是由于NK细胞ADCC的作用。提示靶细胞上的MHC I类分子被单抗封闭后,使NK细胞的杀伤抑制性受体不能识别MHC I类分子而阻止了阴性信号的传导,从而使NK细胞杀伤能力明显增强。国外学者曾在测NK细胞毒活性之前先用鼠抗人HLA-DR单抗与靶细胞孵育或直接用HLA-ABC单抗的(Fab)’2片段与靶细胞作用来消除ADCC的影响,均得到类似的结果[7,8]。CD3AK细胞是以T细胞为主的异质性群体,与NK细胞相反,T细胞,尤其是CTL细胞,通过识别靶细胞上的MHC I类分子传递阳性信号而杀伤相应的靶细胞。MHC I类单抗能遮蔽CTL细胞的MHC识别位点而阻止CTL的杀伤,故MHC I类单抗对CD3AK细胞的杀伤起明显的抑制作用。NK细胞和CTL细胞识别MHC I类分子产生的不同结果,使二者的功能相互补充,共同完成机体的免疫监视任务。MHC I类单抗对LAK细胞的杀伤无明显影响,可能与LAK细胞中NK细胞与T细胞识别MHC I类分子产生的不同效应有关。

  克隆分析提示,不同的NK细胞亚群能识别不同的MHC I类等位基因,即NK细胞对MHC I类等位基因的识别存在克隆异质性[2,3]。NK细胞存在识别MHC I类分子的受体库。因此,用NK克隆技术进行研究将更为合理。此工作正在进行中。

  作者简介:张 彩,女,32岁,助理研究员,主要从事免疫学研究;

  田志刚,男,42岁,研究员,博士,博士生导师,主要从事免疫学和分子生物学研究

  4 参考文献

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〔收稿1997-08-25 修回1998-03-05〕


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