主题:脊髓

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从督脉论脊髓和脑病发病机制

王殿华 河北医科大学附属以岭医院

西医学神经内科的一些病种,诸如运动神经元病、脊髓空洞症、脊髓炎、多发性硬化、遗传性脊髓型共济失调等均是脊髓病。而中医学文献中对有关脊髓的解剖、生理、病理等记载描述甚少,中医学如何认识这些疾病,其病位如何确立,病因及发病机理如何?笔者通过查阅传统中医文献资料,结合多年的临床实践,发现督脉循行路线与脊髓解剖部位密切相关,督脉反映或代表了脊髓的部分或绝大部分功能,督脉病证大多是脊髓和脑的病症,而督脉功能的正常发挥,与肾和络脉的作用密不可分。

督脉、肾、络脉密不可分

关于督脉

督脉属奇经八脉,为“阳脉之海”,是经络系统中具有主导地位的经脉之一,《灵枢·营气》:“上额,循巅,下项中,循脊,入骶,是督脉也。”《难经·二十八难》:“督脉者,起于下极之俞,并于脊里,上至风府,入属于脑。”另《素问·骨空论》又明确指出督脉旁络入肾。

督脉主要生理功能包括以下三点:

一是督脉为原气所发,能温煦脏腑,敷布命火。督脉起于小腹正中,正当“丹田”,为男子藏精、女子蓄血之处,即如《针灸大成》督脉条言:“督任原是通真路”,指督脉为原气所发,是翰旌元气的通路;督脉联络诸经,且通过其分支与肾相连,肾为命门之所在,内藏元阳,为全身脏腑器官动力之源,且元阳要借助于任督之脉通行而布达全身。

二为“阳脉之海”,总督诸阳。督脉循行于背部正中线,背为阳能联系手三阳经和足三阳经,使阳经之气都交会于督脉的大椎穴;带脉出于第二腰椎,阳维脉会于风府、哑门,督脉与之均有联系,所以,督脉为“阳脉之总纲”和“阳脉之海”,能调节全身阳经,总督一身阳经之脉气。

三是反映脑髓的功能。督脉与脑髓关系最为密切,《灵枢·经脉》载:“督脉者……与太阳起于目内眦,上额交巅,入络脑,还出别下项。”《难经·二十八难》亦云:“督脉者,起于下极之俞……入属于脑”。《内经》、《难经》早期的论述,即初步阐明了督脉在循行上与脑髓的密切关系,督脉的循行决定了其和脑髓的密切关系,且与现代解剖学中脑和脊髓的部位和功能相当吻合。所以循行于脊髓和脑的督脉反映并代表着脊髓的绝大部分功能。

关于肾

肾位于腰部,脊柱之两侧,左右各一,肾的主要生理功能有藏精之职,主骨生髓通于脑,寓含元阴、元阳。《素问·六节藏象论》曰:“肾者主蛰,封藏之本,精之处也。”《素问·上古天真论》曰:“肾者主水,受五脏六腑之精而藏之。”肾藏之精,有先后天之分,先天之精禀受于父母的生殖之精;后天之精来源于机体从饮食中摄取的营养成分和脏腑代谢所化生的精微物质,二者相互依存,相互滋生、充养,始能充分发挥其生理效应。肾藏精,精化为气,通过三焦,输布全身,促进机体的生长、发育和生殖机能,并调节人体的生理代谢和功能活动。肾精为先天之本,主骨生髓充脑,为作强之官,伎巧出焉。肾精充足,则筋骨隆盛,动作矫健,髓海有余则轻劲多力,自过其度。

关于络脉

络脉是从经脉横支别出,像树枝状细分,纵横交错,遍布全身,广泛分布于脏腑组织间的网络系统。络脉具有特殊的立体网络结构,不仅密切全身经络与脑髓的直接联系,同时也是脑髓、督脉与肌肉筋脉、四肢百骸联系的重要通路。《素问·缪刺论》云:“今邪客于皮毛,入舍于孙络,留而不去,闭塞不通,不得入于经,流溢于大络,而生奇病也。夫邪客大络者,左注右,右注左,上下左右,与经相干,而布于四末。”这一记载,论述了经络,尤其是络脉与中枢神经系统的关系,大络病变的左右交叉与脑之病变特点相似。至明代《人镜经》明确指出:“其脊中生髓,上至于脑,下至尾骶,其两旁附肋骨,每节两向皆有细络一道,内连腹中,与心肺系,五脏通。”提出大脑与脊髓神经中枢发出分支形成支配全身的神经网络,调节控制脏腑功能,这与中医运行经气的络脉通道相吻合。

督脉、肾、络脉密不可分

肾、督脉、络脉解剖生理密不可分,生理上相互联系。张介宾《类经·经络类》论述脑髓与肾精的关系,云“精藏于肾,肾通于脑,脑者阴也,髓者骨也,诸髓皆属于脑,故精成而脑髓生”。张锡纯认为:“脑为髓海,乃聚髓处,非生髓之处,究其本源,实乃肾中真阴真阳之气酝酿化合而成……缘督脉上升灌注于脑。”可见,脑髓赖肾精充养,始能亏而复盈,而肾与脑髓的联系,又赖督脉经气之转输与灌注。生理上,肾精是督脉和络脉生理活动的基础物质,肾精化气源源不断地充养督脉和络脉,使其发挥各自的生理功能,肾精充足,督脉盈盛而不空虚,始能输精于上,布达于周,发挥各自的生理功能。

脊髓和脑病的发病机制

肾督亏虚 感邪而得病

肾为先天之本,藏精主骨生髓,肾中阴阳为机体正气之本,对机体的免疫机能起着重要的调节作用。肾内藏元阴元阳,为生命活动之根。由于先天禀赋不足,或后天调养失当,致精血匮乏,肾无所藏,肾精亏虚,督脉空虚,所以风、寒、湿热等六淫邪气及邪毒易入侵督脉而发病。如湿热或热毒之邪侵袭督脉,督病脉伤,其用失职,可出现高热、寒战,肢体瘫痪,二便失禁等;督脉有病,又可传递病邪于脑,而有神昏、谵语等症出现。病及络脉可出现肢体麻木、疼痛等。此类病症多见脊髓炎,如病毒性脊髓炎、细菌性化脓性脊髓炎、结核性脊髓炎、急性播散性脑脊髓炎、多发性硬化等。皆因肾精不足,督脉空虚,感受时邪六淫所致。

笔者认为,多发性硬化复发-缓解病机转化病机为:急性发作期肾督亏虚,外感之邪入里化生浊毒,浊毒肆虐,损督、伤髓,败坏形体,督脉和脑髓损伤最为严重,症状复杂多变;急性发作期过后,邪气衰退,正气耗伤,进入缓解期,此正气不足,以督脉亏损,髓海空虚,络脉瘀滞为主,可出现头晕昏沉,肢体倦怠,腰痛或腰膝酸软无力,胸背束带感,肢体麻木、疼痛或僵硬等症。此时,督脉已伤,督阳虚乏不振,若再感邪气,外邪引动宿邪复燃,内外相激,浊毒旋即再生,则疾病转入复发期,在残留部分症状和体征基础上,临床上表现出症状加重或产生新的症状。总之,本病的形成是由肾督亏虚,复感外邪,气化不利,化生浊毒,督络受损,戕害督阳和脑髓,败坏形体而致。

肾督亏虚 正衰而自病

督脉下络于肾,肾精主骨生髓,如肾精亏损,精血不足,可致督脉空虚;而督脉虚损,耗竭肾精,又会导致肾精不足,是以肾督亏虚,正衰而自病。肾督亏虚,正衰而自病者多见于先天性、遗传性脊髓病或脊髓变性疾病。如脊髓栓系综合征、遗传性共济失调、运动神经元病、亚急性脊髓联合变性、脊髓空洞症等。此类疾病的共有症状肌肉萎缩、肢体无力或行走不稳等,皆由肾督亏虚,四肢、筋脉失于温煦、濡养所致。督脉下络于肾,上通于脑,总督一身之阳气,诸阳经行于周身肢体以运行气血,维持肢体动作活动。今肾督亏虚而诸阳经失养可见头昏头重,精神萎靡,脊背畏冷,腰膝酸软,倦怠乏力,肢体弱而不用。肾督亏虚,髓海不足,则有眩晕、眼球震颤、平衡障碍及步态不稳等遗传性共济失调或亚急性联合变性病的常见症状,故《灵枢·海论》曰:“髓海有余,则轻劲多力,自用过度,髓海不足,则脑转耳鸣,胫酸眩冒,目无所见,懈怠安卧。”肾督亏虚,不能充养脑髓,脑髓不充则精神将夺,精神夺则生命功能低下而不能化生精气营血,进而导致形体脏腑受损,病情加重,进而导致语言謇涩,呼吸、吞咽困难,肢体瘫痪痿废失用等,此多见于运动神经元病的发病过程。

络脉之病为重要病理机转

肾督亏虚,精血不足,正气虚损,营卫失调,卫外机能低下,外邪可由体表之络入侵,一方面可直接入里伤督而发病;另一方面又可影响络脉中气血运行,叶天士曾言:“邪与气血而凝,结聚络脉。”络脉气滞不行,血运不畅,气滞于络,血瘀在络,气失温煦之功能,血失濡养之职,每多出现四肢或躯体疼痛、怕冷等症。

肾督亏虚,精血不足,络脉中气血不足而失却濡润,又可出现络虚不荣的病理机制,如脊髓空洞症因络虚不荣而临床常表现为一侧肢体或四肢末端病变节段以下感觉减退,痛温觉丧失,皮肤营养障碍;又因络虚不荣,营卫失和,可见半侧躯体皮肤多汗或无汗。络虚不荣每多兼有络脉气血运行不畅之病理因素,所以脊髓空洞症、亚急性脊髓联合变性等病还常见有肢体麻木不仁或疼痛等。

肾督亏虚,精气不足引起的络脉之病,有从表而入络之新病(随后入里,肾督亏虚,感邪而得病大多为此类),也有病之日久,“久病入络”之多年痼疾(肾督亏虚,正衰而病或感邪病者均可见有),亦有络病贯穿于整个疾病的过程之中,如多发性硬化其发病、进展和病情反复,均与络脉相关,络脉即是受病之所,又是毒邪传导的途径。

日期:2011年10月25日 - 来自[临床讨论]栏目

脊髓损伤难题未来三五年内有望攻克

  “转化医学”在新兴的细胞治疗学领域将不断有临床上的新突破。今天上午在同济大学附属同济医院举行的“2011同济干细胞转化医学国际论坛”上,论坛学术委员会主席孙毅教授称,在未来3-5年内,干细胞治疗有望攻克一个世界性的难题——脊髓损伤。  
  据了解,总投资1亿元人民币、成立于去年底的同济大学干细胞研究同济医院临床转化中心,以建立国内一流的干细胞基础与转化研究机构为发展目标,已引进并组建了以美国加州大学洛杉矶分校副教授(终身)、同济大学教授孙毅博士为核心的一支近20人的干细胞研究专业团队,致力于干细胞基础研究与临床应用的有效“衔接”。
  孙毅在接受本报采访时表示,近年来,干细胞已经成为生命科学界最有前景的研究领域。干细胞移植技术在神经退行性疾病、自身免疫病、白血病等重大疾病的治疗中取得的突破性成就,更是令人欢欣鼓舞。她同时介绍说,干细胞研究同济医院临床转化中心未来的工作,主要是用细胞移植的方法治疗脊髓损伤,并建立干细胞治疗脊髓损伤的临床标准化体系。在不久的将来,还将扩展到用干细胞治疗帕金森病等其他疾病的研究领域。
  由同济大学附属同济医院主办、同济大学干细胞研究同济医院临床转化中心主办的“2011同济干细胞转化医学国际论坛”,邀请了来自中、美、日等国的干细胞研究领域专家,就国际上利用干细胞治疗疾病的最新进展、在临床治疗中创新技术等作专题演讲。据悉,本月底,美国加州再生医学研究所与同济医院干细胞临床转化研究中心将签约共同建立“中美加州干细胞转化研究中心”。(首席记者  施捷)
日期:2011年10月25日 - 来自[神经科]栏目

脊髓损伤后的轴突再生

颈部脊髓损伤受害者经常需要机械呼吸机来帮助呼吸,呼吸障碍是这些患者的一个主要死因。造成这种症状康复困难的因素有两个:第一,第四胸椎以上的损伤会破坏神经脉冲从脑干中的呼吸中心向脊髓中的“膈运动核”传播;第二,受伤时,成年脊髓轴突往往不会再生。通过用一个脊髓损伤大鼠模型进行研究,Jerry  Silver及其同事发现细胞外基质分子含量增加,这会影响受伤后轴突的再生。通过采用一个利用软骨素酶来消化特定细胞外成分的策略,同时结合在脊髓受损部分进行周围神经自体移植,本文作者们得以能够演示呼吸活动的显著恢复,而这种恢复需要再生才能实现。这项研究表明,在某些类型的脊髓创伤之后横膈膜功能的再生和恢复是有可能的。
日期:2011年7月26日 - 来自[神经科]栏目

前路手术选择性治疗无骨折脱位的颈脊髓中央损伤综合征

【摘要】  目的 探讨颈椎前路手术治疗无骨折脱位的颈脊髓中央损伤综合征的适应证和效果。方法 回顾性分析自2004年1月以来我科收治的无骨折脱位的颈脊髓中央损伤综合征的病例资料,筛选其中21例接受前路减压植骨融合手术治疗的病例,根据影像学特点分为有1~3个节段的退变性颈椎管狭窄组17例和有4~5个节段的发育性颈椎管狭窄组4例,二组均施行颈椎前路椎间减压、植骨融合、内固定手术,前者行1~3个节段手术;后者施行2~4个节段手术。手术前后均采用ASIA评分系统评定神经功能。记录手术方式、融合节段、术前及术后神经功能、融合情况,判断颈椎前路手术治疗无骨折脱位的颈脊髓中央损伤综合征的适应证和效果。结果 退变性颈椎管狭窄或者椎间盘突出的病例,接受前路减压植骨融合手术后ASIA评分有明显升高;发育性颈椎管狭窄的病例,接受严重受压的2~4个节段前路减压植骨融合手术后ASIA评分有一定恢复。结论 对于非发育性颈椎管狭窄的颈脊髓中央损伤综合征患者,根据脊髓受压和局限性椎管狭窄的节段,实施1~3个节段的前路减压植骨融合手术可以起到减压并为神经功能恢复创造有利条件的目的;对于长节段发育性椎管狭窄病例,实施后路椎管成形术或者一期前后路联合手术是更好的选择。

【关键词】  前路手术;颈脊髓;脊髓中央损伤综合征;退变性椎管狭窄;发育性椎管狭窄

 Abstract: Objective To evaluate the feasibility and effect of anterior cervical decompression and fusion (ACDF) in the treatment of central cord syndrome of cervical spinal cord injury (CSCICCS) without fracture or dislocation.Methods Totally 21 cases of CSCICCS treated by ACDF since January 2004 were retrospectively analyzed. The patients were divided into degenerative spinal canal stenosis group (characterized by 1~3 stenotic segments) and developmental spinal canal stenosis group (characterized by 4~5 stenotic segments). All patients were subjected to ACDF, 1~3 stenotic Segments In Degenerative spinal canal stenosis group and 2~4 stenotic segments in developmental spinal canal stenosis group. American spinal injury association (ASIA) scale was used to assess the neurologic function. The radiographic characteristics, levels of fusion, and neurological function were analyzed and documented in detail. Results In degenerative spinal canal stenosis group, the ASIA scores increased significantly in 17 cases. However, no or moderate ASIA scores increase was observed in developmental spinal canal stenosis group after receiving ACDF. Conclusion It is feasible and effective for patients with degenerative stenotic CSCICCS to undergo ACDF which including 1~3 segments according to the conditions of spinal cord compression and segments of spinal canal stenosis and for patients with long developmental stenotic segments, opendoor expansile cervical laminoplasty or anterior and posterior combined operation is the better choice.

  Keywords: anterior approach; cervical spinal cord; central cord syndrome; degenerative spinal canal stenosis; developmental spinal canal stenosis

  无骨折脱位的颈椎过伸性损伤多导致脊髓中央损伤综合征,简称脊髓中央综合征(central cord syndrome,CCS)。以往多采用保守治疗,近年来认为早期手术治疗能够改善神经功能预后[12],但是手术方式的选择仍存在较多争论。对于在退变性和发育性颈椎管狭窄基础上导致的CCS是否采用相同的手术方式目前报道少。本文回顾性研究2004年1月至2010年1月间,我科收治的无骨折脱位的颈脊髓中央损伤综合征(central cord syndrome of cervical spinal cord injury, CSCICCS)的病例资料,筛选其中21例接受前路减压植骨融合手术(anterior cervical decompression and fusion,ACDF)治疗的病例,分析其术前影像学特点、记录手术方式、融合节段、术前及术后神经功能、融合情况等以探讨CCS手术治疗方式的选择。

  1 资料与方法

  1.1 纳入标准

  本组病例安以下标准筛选:①符合CCS临床诊断标准;②影像学检查无骨折脱位;③行ACDF手术;④随访6个月以上。

  1.2 临床资料

  2004年1月至2010年1月,共有符合上述纳入标准之病例21例(表1),其中男性15例,女性6例,年龄40~73岁,平均55.6岁。受伤原因:车祸伤10例,高处坠落伤5例,平地摔伤6例。受伤至手术时间:5 h至5 d。所有病例均经X线片、CT检查排除颈椎骨折脱位,MRI显示颈髓损伤节段对应的椎间盘均有不同程度突出,从前方压迫颈髓,黄韧带均增厚呈皱折样突入椎管,其中有17例患者有不同程度的颈椎退变性狭窄,表现为椎体前后缘骨赘增生、椎间隙高度降低,狭窄节段为1~3个节段;4例患者为发育性椎管狭窄,狭窄节段达4~5个节段。MRI检查发现颈脊髓内异常信号15例,无明显异常6例。本组病例均采用ACDF术式,随访时间6~72个月(平均38个月)。

  1.3 患者分组

  退变性椎管狭窄组(A组),病例17例,狭窄水平1~3个节段;发育性椎管狭窄组(B组),病例4例,狭窄水平4~5个节段(表1)。表1 狭窄节段数及术前、术后ASIA评分分布表

  1.4 神经功能评定

  采用美国脊柱损伤学会(American Spinal Injury Association,ASIA)评分修订标准判定脊髓损伤程度:A级,完全性损害;B级,不完全损害,有部分感觉,无运动功能;C级,不完全损害,有部分感觉和运动功能,肌力在3级以下;D级,不完全损害,有部分感觉和运动功能,肌力大于等于3级;E级,正常感觉和运动功能。有效为治疗前后脊髓功能提高1个级别;提高2个级别以上为良好;达到E级为治愈;本级不变或下降为无效。

  1.5 手术方式

  本组病例均在全麻下行标准颈前路减压、植骨融合、钉板系统内固定术,植骨材料为自体髂骨块、钛笼或Cage(填充物为自体骨)。减压范围为脊髓损伤对应的椎间隙或者椎体,减压方式为单纯椎间盘摘除、刮除椎体后缘骨赘、切除增生的后纵韧带直至显露硬脊膜;均未采用椎体次全切除减压方式。减压完毕用20%甘露醇250 mL加地塞米松10 mg浸泡术野。植骨选用带三面皮质骨的自体髂骨块15例、Cage 6例,在颈椎牵引位下嵌入椎间隙,用Orion(17例)或者Zephir(4例)钛板固定。术后使用费城颈托辅助制动,次日下床活动;常规弥可葆、甘露醇及地塞米松静滴、高压氧治疗2个疗程。术后第1、2、3、6、12个月复查1次,之后每年复查1次。

  2 结果

  2.1 一般情况

  本组患者无死亡、神经损伤症状加重者。发生围手术期并发症4例:细菌性肺部感染1例(术后1周),消化系统系霉菌感染2例(术后2周),泌尿系统霉菌感染1例(术后10 d)。经相应治疗后治愈。

  2.2 影像学结果

  术后X线片提示颈椎序列及生理曲度得到恢复,内固定位置良好,随访时间6~72个月(平均38个月),随访期间X线片未发现内固定失败,发现钛笼向下终板方向轻度沉降1例,螺钉周围钉道形成2例。植骨在3~6个月达到骨性融合,植骨融合率为90.5%(19/21)。MRI检查显示椎管减压彻底,无新增脊髓异常信号出现(图1)。

  2.3 术后神经功能恢复情况

  A组共有13例病例神经功能上升大于等于1级(平均上升1.5级),2例神经功能无明显改善,有效率达88.2%;B组共有1例病例神经功能恢复1级,3例无显著改善,有效率为25%。

  3 讨论

  3.1 脊髓中央损伤综合征的选择性手术治疗

  早在1954年,Schneider等就描述CCS的临床表现特征,并提出保守治疗的原则[3],因为传统理论认为脊髓损伤的不可修复性,手术干扰会加重脊髓损伤,导致不可挽回的损失,而CCS临床表现为不完全性和脊柱序列的相对完整,故一般主张保守治疗。然而大量临床资料显示,中央综合征患者中40%以上合并椎间

  a、b:术前显示第5~6颈椎椎间盘明显突出,脊髓受压;c、d:术后显示突出椎间盘减压彻底,脊髓信号正常图2 颈椎前路减压手术前后MRI影像,示减压效果盘突出、椎管狭窄等病理基础,为手术治疗找到了依据[4]。多项研究显示,早期手术能够显著改善CCS的神经功能预后[1,58],本组病例证实了手术治疗对CCS的有效性。前路减压、植骨融合、内固定术能够有效治疗短节段退变性椎管狭窄基础上的CSCICCS。本组病例中,17例为退变性颈椎管狭窄基础上的CCS,狭窄节段为1~3个节段,而减压节段为1~3个节段,其中15例患者神经功能得以显著恢复,有效率高达88.2%。该结果充分说明,对于以退变性椎管狭窄为病理基础的CCS,采用短节段前路椎管减压、椎体间植骨融合、前路钉板系统内固定的手术方式能够获得满意的治疗效果。而对于发育性椎管狭窄为病理基础的CCS,采用多个椎间隙的分段减压策略多难以达到满意效果。可能的原因在于发育性椎管狭窄患者的局部致伤因素更多的来自于后方增生的黄韧带、后柱骨性结构发育异常及后纵韧带的骨化,而单纯前路椎间隙减压难以直接解除后柱的狭窄因素,不能为脊髓功能恢复提供满意的环境。而对于发育性椎管狭窄或涉及3个节段以上的椎管狭窄多采用后路椎板“开门”手术[9]。

  3.2 围手术期注意事项

  CCS的患者多为老年人,合并其他内科疾病及骨质疏松的几率大,围手术期应密切注意全身情况,术后定期翻身拍背、吸痰及合理运用抗生素,避免肺部及泌尿系统感染或者二重感染。本组发生此类并发症的患者均予以及时治疗后治愈。1例肺结核复发者考虑系创伤后免疫力低下、术后输注地塞米松等综合因素所致,转入呼吸科继续治疗。术后随访发现部分高龄患者内固定松动,考虑系骨质疏松所致,因此对此类患者应该延长外固定时间。

  3.3 颈脊髓中央损伤综合征的预后因素

  因为颈脊髓为中枢神经系统,神经元再生能力有限并伴有继发性的轴突坏死、脱髓鞘等病理性改变,故传统理论认为颈脊髓中央损伤综合征的预后不佳,这也是通常采用保守治疗的依据之一。但是随着药物治疗及手术技术的进步,越来越多的研究显示手术有利于CCS神经功能的恢复[68]。本组病例也证实了早期手术减压可以为损伤脊髓提供有利的局部生物力学环境,从而为神经功能恢复提供可能。结合文献可以发现,CCS的预后不佳常和以下因素有关:局部不稳定[10](椎前高信号、椎间盘突出、后纵韧带骨化)、脊髓内部高信号、年龄大[11]、手功能差、肛周感觉异常、合并脊髓空洞和Chiari畸形[12]等,存在Lhermitte's sign(莱尔米特征:病人低头时,引起短暂迅速的电击样感觉,由上向下传播)则多提示预后较好。

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   [1] Stevens EA, Powers AK, Branch CL Jr. The role of surgery in traumatic central cord syndrome[J]. Neurosurgery Quarterly, 2009,19(4):222-227.

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日期:2011年6月30日 - 来自[2010年第19卷第5期]栏目

嗅鞘细胞移植治疗脊髓横断伤8例疗效观察

【摘要】  目的 用嗅鞘细胞移植法治疗脊髓横断伤,探讨该方法是否有助于脊髓损伤神经功能的恢复。方法 取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养2~3周,然后将其移植到脊髓损伤部位的上下处。结果 嗅鞘细胞移植后3个月、6个月和1年随访,8例患者的脊髓功能均有不同程度的改善。结论 嗅鞘细胞移植有助于脊髓损伤患者脊髓神经功能的恢复。

【关键词】  嗅鞘细胞;移植;脊髓损伤

 [Abstract] Objective To evaluate olfactory ensheathing cells(OECs)transplantation in treating complete spinal cord injury.Methods Olfactory bulb was got and trypsinized too single OECs.The cells were cultured for 2-3 weeks,and then transplanted into the upper and lower sites between injury and normal spinal cord.8 cases of patients with spinal cord injury of 22 to 53 years were treated.All of 8 patients expressed complete spinal cord injury.Results Between 3 months and 1 year after OECs transplantation the patients showed recovery in spinal cord function.Conclusion OECs transplantation can help patients with complete spinal cord injury to recover their spinal cord function obviously.

  [Key words] olfactory ensheathing cell;transplantation;spinal cord injury

  脊髓横断损伤所致的感觉、运动功能的丧失历来是难以治疗的疾病,目前仍无有效的治疗方法。脊髓损伤后神经功能的恢复主要取决于神经轴突的再生情况。许多试验研究表明嗅鞘细胞有产生这种微环境的良好能力:嗅鞘细胞具有许旺细胞和胶质细胞的双重特性,能分泌细胞粘附分子和多种神经生长因子;虽然嗅鞘细胞并不能直接抑制胶质瘢痕的形成,但能够形成一个化学和物理屏障来防止再生轴突与胶质瘢痕中的抑制因子接触。以此促进神经突触再生,重建连接,使损伤脊髓神经再生和恢复脊髓部分神经功能,为脊髓损伤的治疗带来了一线光明[1~4]。我科从2006年6月-2009年5月应用嗅鞘细胞移植治疗了8例脊髓横断损伤患者,治疗效果显著,现报告如下。

  1 资料与方法

  1.1 细胞培养

  现取16~24周引产胚胎的嗅球,以0.25%胰蛋白酶消化,终止消化后用含20%胎牛血清的DFl2培养基吹打成单细胞悬液,接种于未涂胶的玻璃培养瓶,置5%CO2孵箱37℃培养12h后将培养上清连同未贴壁细胞转种于另一个未涂胶的玻璃培养瓶,再培养12h;调整细胞密度为1×106/ml,种植于经poly-L-Lysine处理的6孔板,培养7天,加入Ara-C(终浓度为10μmol/L)作用48h,清洗后培养液中添加forskolin和BPE(终浓度分别为20μmol/L和20μg/ml),继续培养10天左右,行S-100常规免疫组化染色以确定纯度。细胞移植前培养液中加入BrdU孵育48h(作用浓度5μmol/L)。

  1.2 患者情况

  8例患者均为横断性脊髓损伤,男6例,女2例;年龄最小22岁,最大53岁,平均34.6岁。损伤原因中5例为车祸伤,3例为坠落伤。颈段脊髓损伤3例,胸段脊髓损伤5例,均为完全性脊髓损伤。伤后时间为3~8个月不等。其中,4 例伤后曾行脊髓后路减压手术,所有患者均接受过神经营养药物、高压氧、针灸等综合治疗。

  1.3 外科手术和细胞移植

  在全麻下行病变节段后方入路,以脊髓损伤平面为中心,后正中纵行切开硬脊膜长约7cm,显露出脊髓,松解局部粘连,切断相邻节段齿状韧带。在脊髓损伤平面及上下两个节段共3个层面分多点注入1ml嗅鞘细胞悬液,约1×106个。术后常规给予止血、抗感染等处理,给予非那根25mg和甲泼尼龙20mg,目的是防止或减少细胞移植可能产生的过敏反应。

  1.4 术后切口恢复情况

  本组8例患者手术切口愈合良好,无切口感染无脑脊液漏发生。术后复查脊髓MRI较术前无水肿等异常改变。

  1.5 脊髓神经功能评定

  嗅鞘细胞移植后随访时间3个月、6个月和1年。采用美国脊髓损伤学会制定的评分标准,进行术前和术后随访评定对比。

  2 结果

  嗅鞘细胞移植术后随访,采用美国国立急性脊髓损伤研究会脊髓损伤神经功能评分标准,检查患者并与术前的检查结果对比,8例患者损伤的脊髓功能均有不同程度的恢复和改善。8例患者脊髓损伤的功能评分见表1。随访结束时患者的运动功能改善不明显,3例颈椎损伤致脊髓损伤的患者中有2例有损伤平面的运动根性恢复,表现为损伤平面的关键肌肌力的增加,而损伤平面以下的运动功能无任何恢复,使运动评分增加不明显;感觉功能(触觉和痛觉)均有明显的恢复,感觉平面下降2~7个脊髓节段,使感觉评分明显增加。表1 患者脊髓功能术前分数和术后平均分数

  3 讨论

  神经外科既往认为中枢神经细胞的轴突损伤在自然条件下几乎不能再生。近年来, Feron等 [5]研究嗅鞘细胞在脊髓损伤中的修复作用,认为最近的神经科学的进展改变了轴突不在损伤平面以后有生长能力的观点,提出神经恢复分为4步:细胞存活、轴突新生(生长)、轴突正确连接损伤部位、建立正常有功能的突触。一些研究发现,当中枢神经损伤后,改变中枢神经系统受损伤的局部环境,受损的神经轴突具有再生能力并可恢复部分脊髓功能。Woodhall等[6]通过不同方法证实了嗅鞘细胞表达神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经生长因子等。嗅鞘细胞在其膜上表达出很多与细胞结合和轴突生长相关的分子,嗅鞘细胞还能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子。

  嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的可能机制:嗅鞘细胞促进受损轴突再生并促进功能恢复的能力是多因素综合作用的结果,概括如下:首先,在体外嗅鞘细胞表达多种神经营养因子,而这些神经营养因子都有促进轴突发芽和再生的能力。例如,受损的上行感觉神经元轴突对神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子-3易感,受损的红核脊髓和皮质脊髓的轴突对脑源性神经营养因子易感,脑源性神经营养因子有促进红核脊髓轴突再生,使皮质脊髓轴突存活的能力。嗅鞘细胞和嗅鞘细胞的膜上还表达那些参与细胞粘附和促进突起生长的分子。黄红云等[7]在动物实验研究基础上,对脊髓损伤晚期患者进行嗅鞘细胞移植治疗,结果所有患者损伤脊髓功能均有改善,从而改变了目前脊髓损伤晚期功能恢复临床尚无有效治疗方法的现状。

  笔者认为,嗅鞘细胞移植后,脊髓损伤患者神经功能恢复的机制在早期可能以损伤修复为主,随后可能兼有损伤修复和神经再生两方面的作用,最后则可能将以神经再生的作用为主。在本文治疗的8例脊髓损伤性截瘫患者中,嗅鞘细胞移植后的初步结果表明,脊髓神经功能均有不同程度的改善。本试验选择患者的标准是:外伤时间超过3个月,脊髓除原发损伤外,没有压迫性因素,神经功能稳定3个月以上,因此试验中嗅鞘细胞移植后受损脊髓功能改善这一结果,可排除脊髓功能自身恢复的可能性。此5例患者都曾接受过手术减压,或给予神经营养药物、针灸、高压氧以及康复治疗等常规性治疗,但都未有肯定性效果,因此也可排除脊髓减压和康复治疗作用的可能性。笔者认为:嗅鞘细胞移植,对脊髓损伤患者的脊髓神经功能恢复有帮助作用,同时也具有脊髓神经修复作用。随着时间的延长和患者自身锻炼的增强疗效会更加明显,嗅鞘细胞移植是安全可行的,但需进一步长期检测一些滞后的副作用和远期疗效。目前,临床研究的任务十分艰巨,临床治疗的病例数少,时间短,只能是一个初步的结果,要考虑到各种可能的不良后果,有待今后进一步研究探索。

【参考文献】
   1 Skinner AP,Paelmieke S,Lakatos A,et a1.Nasal and frontal sinus mucosa of the adult dog contain numerous olfactory sensory neurons and ensheathing glia.Res Vet Sci,2005,78(1):9-15.

  2 Bretzner F,Liu J,Currie E,et a1.Undesired efected a con.binatorial treatment for spinal cord injury-transplantation ofolfactory ensheathing cells and BDNF infusion to the rednucleus.Eur J Neurosci,2008,28(9):1795-1807.

  3 Franssen EH,De Bree FM ,Verhaagen J.Olfactory ensheathing glia:their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.Brain Res Rev,2007,56(1):236-258.

  4 Kocsis JD,Lankford KL,Sasaki M ,et a1.Unique in vivoproperties of olfactory ensheathing cells that may contribute to neural repair and protection following spinal cord injury.Neurosci Len,2009,456(3):137-142.

  5 Feron F,Perry C,Cochrane J,et a1.Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human spinal cord injury . Brain,2005,128(12):2951-2960.

  6 Woodhall E,Weat AK,Chuah MI.Culture olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, gila cell line-derived neurotrophic factor and tlleir receptors.Molecular Brain Research,2001, 88:203-213.

  7 黄红云,王洪美,陈琳.胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤影响功能恢复的因素.中国临床康复,2006,10(9):1-3.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2011年第8卷第2期]栏目

嗅鞘细胞移植治疗6例颈胸髓横断伤

【摘要】  目的 用嗅鞘细胞移植法治疗脊髓横断伤,探讨该方法是否有助于脊髓损伤神经功能的恢复。方法 取胚胎嗅球,消化成单个嗅鞘细胞后,培养2~3周,然后将其移植到脊髓损伤部位的上下处。结果 嗅鞘细胞移植后3个月、6个月和1年随访,6例患者的脊髓功能均有不同程度的改善。结论 嗅鞘细胞移植有助于脊髓损伤患者脊髓神经功能的恢复。

【关键词】  嗅鞘细胞;移植;脊髓损伤

[Abstract] Objective To evaluate olfactory ensheathing cells(OECs)transplantation in treating complete spinal cord injury.Methods Olfactory bulb was got and trypsinized too single OECs.The cells were cultured for 2~3 weeks,and then transplanted into the upper and lower sites between injury and normal spinal cord.8 cases of patients with spinal cord injury of 22 to 53 years were treated.All of 6 patients expressed complete spinal cord injury.Results Between 3 months and 1 year after OECs transplantation the patients showed recovery in spinal cord function.Conclusion OECs transplantation can help patients with complete spinal cord injury to recover their spinal cord function obviously.

  [Key words] olfactory ensheathing cell;transplantation;spinal cord injury

  脊髓横断损伤所致的感觉、运动功能的丧失历来是难以治疗的疾病,目前仍无有效的治疗方法。脊髓损伤后神经功能的恢复主要取决于神经轴突的再生情况。许多试验研究表明嗅鞘细胞有产生这种微环境的良好能力:嗅鞘细胞具有许旺细胞和胶质细胞的双重特性,能分泌细胞黏附分子和多种神经生长因子。虽然嗅鞘细胞并不能直接抑制胶质瘢痕的形成,但能够形成一个化学和物理屏障来防止再生轴突与胶质瘢痕中的抑制因子接触,以此促进神经触突再生,重建连接,使损伤脊髓神经再生和恢复脊髓部分神经功能,为脊髓损伤的治疗带来了一线光明[1~4]。本科从2007年7月—2010年10月应用嗅鞘细胞移植治疗了6例脊髓横断损伤患者,治疗效果显著,现报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 细胞培养

  取16~24周引产胚胎的嗅球,以0.25%胰蛋白酶消化,终止消化后用含20%胎牛血清的DFl2培养基吹打成单细胞悬液,接种于未涂胶的玻璃培养瓶,置5%CO2孵箱37℃培养12h后将培养上清连同未贴壁细胞转种于另一个未涂胶的玻璃培养瓶,再培养12h;调整细胞密度为1×106/ml,种植于经poly-L-Lysine处理的6孔板,培养7天,加入Ara-C(终浓度为10~5mol/L)作用48h,清洗后培养液中添加forskolin和BPE(终浓度分别为20μmol/L和20μg/ml),继续培养10天左右,行S-100常规免疫组化染色以确定纯度。细胞移植前培养液中加入BrdU孵育48h(作用浓度5μmol/L)。

  1.2 患者情况

  6例患者均为横断性脊髓损伤,男5例,女1例;年龄最小18岁,最大58岁,平均31岁。损伤原因中3例为车祸伤,3例为坠落伤。颈段脊髓损伤2例,胸段脊髓损伤4例,均为完全性脊髓损伤。伤后时间为3~8个月不等。其中,3 例伤后曾行脊髓后路减压手术,所有患者均接受过神经营养药物、高压氧、针灸等综合治疗。

  1.3 外科手术和细胞移植

  在全麻下行病变节段后方入路,以脊髓损伤平面为中心,后正中纵行切开硬脊膜长约7cm,显露出脊髓,松解局部粘连,切断相邻节段齿状韧带。在脊髓损伤平面及上下两个节段共三个层面分多点注入1ml溴鞘细胞悬液,约1×106个。术后常规给予止血、抗感染等处理,给予非那根25mg和甲泼尼龙20mg,目的是防止或减少细胞移植可能产生的过敏反应。

  1.4 术后切口恢复情况

  本组6例患者手术切口愈合良好,无切口感染,无脑脊液漏发生。术后复查脊髓MRI较术前无水肿等异常改变。

  1.5 脊髓神经功能评定

  嗅鞘细胞移植后随访时间3个月、6个月和1年。采用美国脊髓损伤学会制定的评分标准,进行术前和术后随访评定对比。

  2 结果

  2.1 脊髓功能恢复评定

  嗅鞘细胞移植术后随访,采用美国国立急性脊髓损伤研究会脊髓损伤神经功能评分标准,检查患者并与术前的检查结果对比,6例患者损伤的脊髓功能均有不同程度的恢复和改善。6例患者脊髓损伤的功能评分见表1。随访结束时患者的运动功能改善不明显,2例颈椎损伤致脊髓损伤的患者中有1例有损伤平面的运动根性恢复,表现为损伤平面的关键肌肌力的增加,而损伤平面以下的运动功能无任何恢复,使运动评分增加不明显;感觉功能(触觉和痛觉)的恢复均有明显的恢复,感觉平面下降2~7个脊髓节段,使感觉评分明显增加,见表1。表1 患者脊髓功能术前分数和术后平均分数

  2.2 颈髓损伤

  患者感觉平面下降,束带感减弱,敏感度增加;坐起时间增长,头部可抬起,上肢的前臂、手腕和手指的活动增加,抓握功能增强;肌张力降低,皮肤色泽恢复、分泌汗液。

  2.3 胸髓损伤

  患者感觉平面下降,束带感减弱或消失,患者坐起时间明显增长,汗液分泌增加,肌张力减轻,腱反射恢复正常;病理反射从无到有。

  3 讨论

  神经外科既往认为中枢神经细胞的轴突损伤在自然条件下几乎不能再生。近年来, Feron[5]研究嗅鞘细胞在脊髓损伤中的修复作用,认为最近的神经科学的进展改变了轴突不在损伤平面以后有生长能力的观点,提出神经恢复分为4步:细胞存活、轴突新生(生长)、轴突正确连接损伤部位、建立正常有功能的突触。一些研究发现,当中枢神经损伤后,改变中枢神经系统受损伤的局部环境,受损的神经轴突具有再生能力并可恢复部分脊髓功能。Woodhall等[6]通过不同方法证实了嗅鞘细胞表达神经生长因子、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经生长因子等。嗅鞘细胞在其膜上表达出很多与细胞结合和轴突生长相关的分子,嗅鞘细胞还能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子。嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的可能机制:嗅鞘细胞促进受损轴突再生并促进功能恢复的能力是多因素综合作用的结果,概括如下:首先,在体外嗅鞘细胞表达多种神经营养因子,而这些神经营养因子都有促进轴突发芽和再生的能力。例如,受损的上行感觉神经元轴突对神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子易感,受损的红核脊髓和皮质脊髓的轴突对脑源性神经营养因子易感,脑源性神经营养因子有促进红核脊髓轴突再生,使皮质脊髓轴突存活的能力。嗅鞘细胞和嗅鞘细胞的膜上还表达那些参与细胞黏附和促进突起生长的分子。黄红云等[7]在动物实验研究基础上,对脊髓损伤晚期患者进行嗅鞘细胞移植治疗,结果所有患者损伤脊髓功能均有改善,从而改变了目前脊髓损伤晚期功能恢复临床尚无有效治疗方法的现状。嗅鞘细胞移植后,脊髓损伤患者神经功能恢复的机制在早期可能以损伤修复为主,随后可能兼有损伤修复和神经再生两方面的作用,最后则可能将以神经再生的作用为主。在我们治疗的6例颈胸髓损伤性截瘫患者中,嗅鞘细胞移植后的初步结果表明,脊髓神经功能均有不同程度的改善。本实验选择患者的标准是:外伤时间超过3个月,脊髓除原发损伤外,没有压迫性因素,神经功能稳定3个月以上,因此实验中嗅鞘细胞移植后受损脊髓功能改善这一结果,可排除脊髓功能自身恢复的可能性。此3例患者都曾接受过手术减压,或给予神经营养药物、针灸、高压氧以及康复治疗等常规性治疗,但都未有肯定性效果,因此也可排除脊髓减压和康复治疗作用的可能性。我们认为:嗅鞘细胞移植,对脊髓损伤患者的脊髓神经功能恢复有帮助作用,同时也具有脊髓神经修复作用。随着时间的延长和患者自身锻炼的增强疗效会更加明显,嗅鞘细胞移植是安全可行的,但需进一步长期检测一些滞后的副作用和远期疗效。目前,临床研究的任务十分艰巨,临床治疗的病例数少,时间短,只能是一个初步的结果,要考虑到各种可能的不良后果,有待今后进一步的研究探索。

【参考文献】
   1 Skinner AP,Paelmieke S.Lakatos A,et al.Nasal and frontal sinus mucosa of the adult dog contain numerous olfactory sensory neurons and ensheathing glia.Res Vet Sci,2005,78(1):9-15.

  2 Bretzner F,Liu J,Currie E,et al.Undesired efected a con.binatorial treatment for spinal cord injury-transplantation ofolfactory ensheathing cells and BDNF infusion to the rednucleus.Eur J Neurosci,2008,28(9):1795-1807.

  3 Franssen EH,de Bree FM,Verhaagen J.Olfactory ensheathing glia:their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.Brain Res Rev,2007,56(1):236-258.

  4 Kocsis JD,Lankford KL,Sasaki M ,et al.Unique in vivoproperties of olfactory ensheathing cells that may contribute to neural repair and protection following spinal cord injury.Neurosci Len,2009,456(3):137-142.

  5 Feron F,Perry C,Cochrane J,et al.Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human spinal cord injury. Brain,2005,128(12):2951-2960.

  6 Woodhall E. Weat AK. Chuah MI.Culture olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, gila cell line-derived neurotrophic faetor and tlleir receptors.Molecular Brain Research,2001, 88:203-213.

  7 黄红云,王洪美,陈琳.胚胎嗅鞘细胞移植治疗晚期脊髓损伤影响功能恢复的因素.中国临床康复,2006,10(9):1-3.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2011年第9卷第2期]栏目

脊髓动静脉畸形致蛛网膜下腔出血反复漏诊1例

【关键词】  动静脉畸形;脊髓血管疾病;蛛网膜下腔出血

 脊髓动静脉畸形引起蛛网膜下腔出血是一种特殊类型的蛛网膜下腔出血,临床较少见,容易误诊,因而早期诊断、早期治疗十分重要[1]。本文就1例脊髓动静脉畸形致蛛网膜下腔出血反复漏诊及其原因报告如下。

  1 临床资料

  患者,男,32岁,因“反复头痛11年,再次发作1天” 于2009年12月6日入院,11年前患者无明显诱因出现头痛、恶心、呕吐,头痛以双侧颞部剧痛为主,院外行头颅CT提示蛛网膜下腔出血,给予保守治疗后头痛消失出院,其后间隔6~12个月不等反复出现上述症状,院外多家三甲医院行头颈CTA、MRI、全脑血管造影检查、腰穿检查均未发现颅内动脉瘤、血管畸形、肿瘤等,诊断为原发性蛛网膜下腔出血,每次发病后经治疗临床症状缓解出院。无烟酒嗜好,无结核、高血压、糖尿病、凝血功能障碍疾患等。查体:神志清楚,五官未见异常,颈亢3横指,胸8平面以下感觉减退,双侧下肢肌力减退,肌力4级。本次入院后给予全脊髓MRI检查,诊断为T8~T10平面脊髓血管动静脉畸形,后经DSA确诊。于2009年12月10日在全麻下行经胸段后正中入路硬脊膜下病灶切除术,术后经过2周治疗出院。出院后随访10个月,患者肢体肌力恢复正常,感觉完全恢复正常,未再出现头痛等蛛网膜下腔出血症状。

  2 讨论

  蛛网膜下腔出血(SAH)是多种原因所致的脑底、脑内血管及脊髓表面血管破裂出血进蛛网膜下腔引起,它并非一种疾病,而是某些疾病的临床表现,其中70%~80%属于外科范畴[2]。临床将蛛网膜下腔出血分为自发性和外伤性两类。自发性蛛网膜下腔出血常见原因有先天性动脉瘤、脑血管畸形、高血压动脉硬化,发病前多有情绪激动、咳嗽等诱因,各年龄均可发病,好发于30~60岁,女性多于男性。

  值得关注的是脊髓动静脉畸形引起蛛网膜下腔出血也不罕见,约有15%的脊髓血管畸形患者以蛛网膜下腔出血为首发症状[3],由于大多数蛛网膜下腔出血由颅内疾患所致,对于非颅内疾患致蛛网膜下腔出血患者,若无肢体感觉及运动障碍,且常规检查未发现颅内病变,常诊断为原发性蛛网膜下腔出血,导致出血原因漏诊,治疗延误,如本例患者反复颅内出血11年,饱受痛苦,造成很大的心理及经济负担。笔者认为,面对蛛网膜下腔出血,为减少漏诊,在常规的头颅CT、MRI、DSA等检查仍未发现引起颅内出血的病变时,应该考虑到脊髓动静脉畸形引起的蛛网膜下腔出血,然后做病因治疗。诊疗中,关注常见病因,不忽略少见病因才能尽可能减少误诊漏诊。

【参考文献】
   1 史玉泉. 实用神经病学. 上海:上海科学技术出版社,1994:334-336.

  2 王维治.应该重视SAH的临床误诊问题.国外医学·脑血管病分册,2008,8(4):195

  3 孙红斌,王学峰. 神经系统疾病的理论与实践. 成都:四川科学技术出版社,1997:145-147.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2010年第8卷第11期]栏目

Wnt-3a信号蛋白促进大鼠脊髓损伤修复作用的实验研究

【摘要】  目的 研究外源性Wnt-3a信号蛋白对脊髓损伤的修复作用,并探讨其作用机制。方法 取40只成年雌性SD大鼠在T10节段制备适度脊髓挫伤模型。随机从中取20只为损伤对照组(Group 1),另外20只为损伤治疗组(Group 2)。脊髓损伤3天后用Wnt-3a蛋白治疗。这些大鼠的功能恢复通过Basso、Beattie、Bresnahan (BBB)开放视野运动评分来观察。这些大鼠分批在损伤后14天或28天被处死,取出损伤节段脊髓用来组织病理学检查,同时用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经细胞标记物进行免疫组化染色。结果 两组大鼠在伤后一周运动功能有明显的恢复。不过,到损伤后28天,我们观察发现,损伤治疗组中的大鼠BBB评分比损伤对照组中的评分高出7.0分左右(Group 2∶16.94±1.18,Group 1∶9.89±1.29;P<0.05),光镜和电镜检查发现Wnt-3a蛋白对髓鞘形成和轴突再生有一定的修复效果。免疫组织化学发现,在损伤后2周,Wnt-3a蛋白治疗组诱导分化的神经元数目明显多于损伤对照组。结论 大鼠脊髓损伤施加外源性的Wnt-3a蛋白可以一定程度上促进轴突传导和功能恢复,并且可以促进神经元数目的增加,通过双标染色提示这些神经元来源于内源性神经干细胞。

【关键词】  分化;神经干细胞;大鼠;脊髓损伤;Wnt-3a蛋白

Repair effect of Wnt-3a protein on contused adult rat spinal cord

  ZU Bo,YIN Zong-sheng,ZHANG Hui.Anqing Hospital,Anhui Medical University,Anqing 246003,China

  [Abstract] Objective To evaluate the functional recovery of acute spinal cord injuried rats treated with exogenous Wnt-3a signal protein administration and to explore its mechanism.Methods Moderate spinal cord contusion injury was made in 40 adult Sprague Dawley (SD) rats at T10.Twenty rats served as contusion controls(group 1).Twenty rats were treated with Wnt-3a for three days after injury (group 2).The functional recovery of the rats was observed through Basso,Beattie,Bresnahan (BBB) open field locomotor score.Rats were killed at 14 or 28 days after injury,then spinal cords were removed for histopathological examinations,and the expression of the bromodeoxyuridine (BrdU) plus neural cell markers was stained with immunohistochemical method.Results Rats of two groups receiving a contusive injury recovered substantial function within 1 week.By 28 days,rats in groups 2 scored 7.0 points better on the BBB scores than rats in group 1 (group 2=16.94,after 28 days vs. group 1=9.89 points;P<0.05).Light and electron microscopic studies showed that the Wnt-3a treated group had moderate repair effect of myelin and axons.Immunohistochemical analysis showed significant increases in the number of the inducing differentiated neurons in Wnt-3a-treated rats compared with control rats two weeks after injury.Conclusion Exogenous Wnt-3a administration can improve axonal conduction and increase of spinal cord function in the injured spinal cord,and the administration of Wnt-3a result in the populations of neurons,suggesting that these cells may be derived from endogenous neural stem cells.

  [Key words] differentiation;neural stem cells;rat;spinal cord injury;Wnt-3a protein

  脊髓损伤患者的治疗仍缺乏有效的手段,近年来,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)治疗脊髓损伤已成为一大热点。然而,最近的研究发现,外源性的神经干细胞移植到损伤区域主要分化为星形胶质细胞[1],参与胶质瘢痕的形成,抑制轴突的再生。 内源性神经干细胞的发现为治疗脊髓损伤提供一条新的途径。这些内源性神经干细胞可以由于损伤或生长因子治疗得到刺激,并能被诱导分化为神经元代替损伤的透射神经元[2]。同时,近年来有关Wnt信号途径对神经干细胞的作用逐渐引人注意,因其启动信号为Wnt蛋白而得名。Wnt-3a是Wnt基因家族中重要成员,最近的一些研究发现, Wnt-3a信号蛋白对神经干细胞的定向分化的调控作用表现的十分明显。 笔者将外源性Wnt-3a信号蛋白施加到挫伤性脊髓损伤区域,而后观察实验动物脊髓功能恢复情况,旨在探索出一条脊髓损伤治疗新的有效途径。

  1 材料和方法

  1.1 实验及动物分组 成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,体重200~250 g,由安徽医科大学动物实验中心提供。成年雌性Sprague-Dawley大鼠按体重从小到大编号,将这些动物分为两组:对照组(Group 1,n=20)和实验组(Group 2,n=20)。

  1.2 急性脊髓挫伤型模型的制备 所有大鼠用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后,后路显露 T10脊髓。用 Allen 法制成脊髓背侧损伤动物模型,损伤力度为(10 g×2.5 cm)25势能克厘米力(gram-cm force,gcf)。损伤治疗组及损伤对照组大鼠3天后经历二次手术,再次暴露脊髓。脊髓治疗组用微电极推进器在原脊髓损伤区域缓慢注入6 μl Wnt-3a重组蛋白(浓度 50 ng/ml),深度约1 mm,留针5 min。损伤对照组在同样部位给予同等剂量生理盐水。

  1.3 行为学评分 为了评价脊髓损伤后的运动功能变化,实验动物分别在术前,术后1、7、14、21、28天进行运动功能评分(basso beattie bresnahan,BBB)[3]。BBB评分是观察动物的臀﹑膝﹑踝关节行走,躯干运动及其协调情况。

  1.4 组织学观察 分别在脊髓损伤后14天、28天处死等量动物(n=4)。腹腔麻醉后,自左心室通过静脉导管用冷的4%多聚甲醛固定液灌注后,取出损伤节段和相邻节段长约0.8 cm的脊髓组织。一部分脊髓组织移入4%多聚甲醛固定6 h,依次移入20%和30%的蔗糖溶液中直至沉底,然后脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,水平面连续切片,片厚5 μm,行HE染色,观察光镜下的结构变化。另一部分脊髓组织分成1 mm3大小组织块先后固定于2.5%的戊二醛、1%的锇酸中,随后在梯度乙醇中脱水,用环氧树脂将组织包埋后,进行超薄切片,片厚70 nm,入枸橼酸铅染液后,在透射电镜下观察脊髓组织超微结构的变化。

  1.5 免疫组织化学检测 同样在脊髓损伤后14天、28天处死等量动物(n=4),按上述方法灌注固定后,常规冰冻切片机切片,片厚15 μm,行免疫荧光组织化学检测,同时进行细胞计数。为分析损伤区域的增值反应,在灌注前48 h每12 h腹腔注射0.1 mg/g BrdU(浓度10 mg/ml)。BrdU标记增殖的神经干细胞; MAP-2标记神经元; GFAP标记星形胶质细胞;按照试剂盒步骤操作,一抗分别用BrdU、 MAP-2、GFAP,4 ℃过夜,后加入对应的FITC或TRITC标记的荧光二抗,室温下避光2 h,PBS漂洗后,缓冲甘油封片。阴性对照采用磷酸缓冲液(PBS)代替一抗。于荧光显微镜观察实验结果。

  1.6 统计学处理 实验数据用(x±s)表示,采用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析,两组间BBB评分及双标阳性细胞数采用两样本的t检验。对于双标阳性细胞计数, 随机计数8个400倍镜下视野, 取平均值获取实验结果。P<0.05差异具备显著性。

  2 结果

  2.1 行为学检测结果 具体的BBB评分结果见表1。脊髓损伤后28天,Wnt-3a蛋白治疗组BBB评分明显高于损伤对照组(Group 2=16.94,after 28 days vs Group 1=9.89 points;P<0.05)。值得注意的是,在损伤对照组,其BBB评分在损伤后14天基本达到最高值,而Wnt-3a蛋白治疗组直到损伤后28天BBB评分仍继续增加。表1 实验组、对照组各阶段BBB运动功能评分

  2.2 组织学观察结果

  2.2.1 光镜观察 损伤对照组在脊髓损伤后14天,神经纤维排列稀疏、断裂,胶质细胞增生,瘢痕形成(图1A)。在损伤治疗组,HE染色组织学形态稍好于损伤对照组(图1B)。在脊髓损伤后28天,灰质神经元和白质神经纤维逐渐恢复,损伤对照组中间质可见大量胶质细胞形成(图1C),损伤治疗组组织形态学明显好于损伤对照组,基本接近正常脊髓组织(图1D)。

  2.2.2 电镜观察 损伤对照组在脊髓损伤后14天,髓鞘扭曲﹑分层和崩解,轴浆肿胀,轴突内线粒体嵴突消失,空泡样变性(图2A),但在损伤治疗组白质轴索变性程度明显好于损伤对照组(图2B)。到脊髓损伤后28天,损伤治疗组超微结构明显好转,只可见少量轴索变性,轴浆内线粒体肿胀情形明显减轻,绝大部分可见嵴突(图2C)。而在损伤对照组,虽然超微结构较损伤后14天有所好转,但轴浆和线粒体仍较肿胀,微管、微丝稀松,髓鞘壁变薄,部分线粒体可见嵴突(图2D)。

  2.3 免疫组织化学结果 我们在脊髓损伤区域发现BrdU和MAP-2双标阳性的细胞,特别在蛋白移植的灰质区域及附近。通过数据统计,损伤治疗组每个400倍下视野可见20.5±5.2 BrdU+/MAP-2+双标阳性新生神经元,而在损伤对照组可见12.5±4.3,BrdU+/MAP-2+双标阳性新生神经元(n=8,P<0.05) (图 3)。然而,到损伤后28天,两组之间双标阳性新生神经元数没有明显统计学意义(Group 2:9.8±4.5,Group 1:7.8±3.6;P>0.05)。此外,通过双标免疫荧光,我们发现在脊髓损伤后14天,损伤治疗组每个400倍下视野可见5.6±1.7 BrdU+/GFAP+双标阳性新生星形胶质细胞,而在损伤对照组可见16.9±5.9 BrdU+/GFAP+双标阳性新生星形胶质细胞(n=8,P<0.05)(图4)。同样地,这种治疗效果不能维持很长时间,在损伤后28天两组之间未见明显的区别(Group 2:6.1±2.7,Group 1:5.1±1.9;P>0.05)。

  3 讨论

  脊髓组织容易因为各种原因导致损伤。损伤的结果导致神经回路的中断,同时大量神经元坏死导致功能丧失。干细胞生物特性研究的进展, 为恢复脊髓损伤后丧失的神经生理功能提供一种合适的方法。这种在损失区域诱导再生的策略具体的可以划分为两种方法:(1)细胞移植治疗;(2)内源性神经干细胞的激活[4,5]。

  不过,最近的研究显示神经干细胞的移植主要分化为星形胶质细胞, 从而抑制轴突的再生。 此外, 在干细胞移植过程中, 伦理道德因素、机体免疫排斥反应、肿瘤形成及功能问题仍未能解决, 这些都影响外源性神经干细胞的移植治疗[6]。 相比 而言, 内源性神经干细胞有着显而易见的优势: 无伦理学问题;无免疫源性,不需抗排斥治疗;同样具备自我更新和多向分化的能力;无生物安全性问题; 操作简便等[7]。

  人们已经研究发现,哺乳动物的成体神经前体细胞或神经干细胞在中枢神经系统损伤或疾病情形下有增殖反应[8]。由此可以设想,内源性神经干细胞的调控将是神经变性疾病和中枢神经系统损伤一种可以选择的治疗方法。也是干细胞移植治疗的补充。不过,理解神经干细胞在中枢神经系统损伤情形下分化机制是利用这种策略进行治疗的关键。神经干细胞分化方向是由外在的信号因素和内在的遗传机制复杂的相互作用所决定。Yamamoto等[9]提出两种方法:(1)在损伤的部位注入生长因子, 刺激内源性神经干细胞增殖, 并利用其神经保护作用促进神经元分化;(2)抑制微环境中的负性信号促进内源性神经干细胞向神经元分化。

  Wnt信号蛋白是近几年来逐渐被人们认识的一类信号分子。在哺乳动物中,Wnt细胞信号蛋白家族至少由19种成员组成,在细胞生长和发育过程中发挥重要作用[10]。最近,Wnt这类脂质蛋白被发现可以在神经干细胞培养液中促进神经干细胞的神经元的分化[11]。然而, Wnt信号途径对体内脊髓损伤是否有修复作用尚不清楚。

  通过实验结果,我们发现Wnt-3a蛋白治疗组在脊髓损伤后4周BBB运动评分明显高于损伤对照组(P<0.05),并且组织学观察提示在实验明显好于对照组。同时,Wnt-3a蛋白治疗组在损伤后14天BrdU+ /MAP-2+阳性的新生神经元数目明显多于对照组数目(P<0.05)。但是,在对照组中,BrdU+/GFAP+阳性新生星形胶质细胞数目明显少于在实验组中的数目。这些说明Wnt信号途径能促进内源性神经干细胞分化为神经元,同时抑制星形胶质细胞的分化。由此可以看出, Wnt信号途径不论在体内或是体外对神经干细胞都发挥新颖的作用和效果。 通过实验, 我们发现脊髓损伤区域施加Wnt-3a信号蛋白可以促进脊髓损伤一定程度的恢复。

  不过,在脊髓损伤后的28天,Wnt-3a蛋白的作用明显减弱。BrdU+/GFAP+双标阳性细胞数或BrdU+/MAP-2+双标阳性细胞数在Wnt-3a蛋白治疗组和损伤对照组之间未见明显的区别(P>0.05)。这些结果表明,这种治疗方法不能获得长期、局部、高浓度的生长因子治疗作用。为了获得这种治疗作用,可以采用体内基因治疗方法。体内基因治疗包括从宿主组织中分离细胞、体外基因修饰及表达产物的活性鉴定,随后将基因修饰的细胞移植到宿主中[12]。我们下一步研究将打算移植Wnt-3a基因转染的神经干细胞,观察其治疗脊髓损伤的效果。

【参考文献】
   1 Cao QL,Zhang YP,Howard RM,et al.Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a gilal lineage.Exp Neurol,2001,167(1):48-58.

  2 Magavi SS,Leavitt BR,Macklis JD.Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice.Nature,2000,405:951-955.

  3 Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight drop device versus transsection.Exp Neurol,1996,139(2):244-256.

  4 Okano H.Adult neural stem cells and central nervous system repair.Ernst Schering Res Found Workshop,2006,60:215-228.

  5 Okano H,Okada S,Nakamura M,et al.Neural stem cells and regeneration of injured spinal cord.Kidney Int,2005,68(5):1927-1931.

  6 Cao Q,Benton RL,Whitemore SR.Stem cell repair of central nervous system.J Neurosci Res,2002,68(5):501-510.

  7 Abrahams JM,Gokhan S,Flamm ES ,et al.De novo neurogensis and acute atroke: Are exogenous stem cells really necessary?Neurosurgery,2004,54:150-156.

  8 Azari MF,Profyris C,Zang DW,et al.Induction of endogenous neural precursors in mouse models of spinal cord injury and disease.Eur J Neurol,2005,12(8):638-648.

  9 Chernoff EA,Sato K,Corn A,et al.Spinal cord regeneration : intrinsic properties and emerging mechanisms.Semin Cell Dev Biol,2002,13:361-368.

  10 Nelson WJ,Nusse R.Convergence of Wnt,beta-catenin,and cadherin pathways.Science,2004,303:1483-1487.

  11 Muroyama Y,Kondoh H,Takada S.Wnt proteins promote neuronal differentiation in neural stem cell culture.Biochem Biophys Res Commun,2004,313:915-921.

  12 Jones LL,Oudega M,Bunge MB,et al.Neurotrophic factors,cellular bridges and gene therapy for spinal cord injury.Physiology, 2001,533(Pt 1):83-89.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2009年第7卷第11期]栏目
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