主题:表达

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大脑完整基因表达图谱和神经元联系图谱绘制完成

    继美国总统奥巴马宣布“推进创新神经技术脑研究计划”(简称BRAIN计划或脑计划)一年后,美国科学家成功给“整个大脑”做了图谱。4月3日出版的英国《自然》杂志发表两项相关研究,介绍了哺乳动物大脑中完整的基因表达图谱和神经元联系图谱。此次的图谱对于研究人类大脑发育和神经回路,从而理解人类的行为和认知过程的健康状态与疾病状态提供了极其重要的资源。
  人类大脑的结构和功能在很大程度上是由胎儿时期基因转录启动的基因表达决定,但是我们对于大脑的发育过程了解甚少。2013年4月2日由奥巴马政府公布的“脑计划”,就旨在探索人类大脑工作机制、绘制脑活动全图,并最终开发出针对大脑疾病的疗法,其重要程度被认为可与人类基因组计划相媲美。
  美国华盛顿州西雅图艾伦脑科学研究所的艾德·雷恩与他的科研团队,此次提供的人类胎儿妊娠中期详细的大脑基因表达图谱,则填补了我们知识中的这一空白。由他们发现的转录标记与不同的解剖特点和发育过程相关。这些数据也识别出了许多和神经或精神障碍相关的基因表达动态。
  而在本期《自然》杂志上发表的另一篇论文中,同是艾伦脑科学研究所的曾红葵与她的研究团队提供了一个小鼠大脑连接图谱,此图谱是第一个哺乳动物全脑神经元连接图谱,也是至今为止最全面的脊椎动物的大脑连接图谱,为了解大脑的不同区域如何沟通与交流提供了新的见解。这篇论文的作者们认为,这一研究结果将有助于探索人类大脑的神经元网络,从而加深我们对于人类大脑连接方式和相关疾病的了解。(中国科技网-科技日报)

日期:2014年4月3日 - 来自[遗传与基因组]栏目
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版纳植物园完成蓖麻基因组bZIP家族鉴定与表达分析

蓖麻是双子叶胚乳型植物的典型代表,是大戟科中重要的油料作物,其种子油被广泛地应用在工业上。bZIP(basic leucine zipper)转录因子广泛分布于真核生物中,在植物中涉及多种生物进程,其中ABF亚族更是ABA信号途径中重要的调控因子。  

中国科学院西双版纳热带植物园分子遗传与育种组研究发现ABA对蓖麻油脂累积具有显著作用,bZIP转录因子可能参与ABA调控蓖麻油脂合成信号途径,为此研究人员在蓖麻全基因组鉴定得到蓖麻bZIP家族所有成员,进一步对蓖麻bZIP家族基因结构、蛋白结构、二聚化特性、进化以及表达谱分析。得到以下结论:蓖麻bZIP家族成员49个,根据保守bZIP结构域特征将bZIP家族分为11个组(Group);对蓖麻bZIP转录因子结构域外的保守基序(Motif)、基因结构、进化关系等生物信息学分析,初步揭示了这两个家族成员在进化和功能上的相关性;对拟南芥和蓖麻中bZIP成员系统发生分析,均表明二者既存在同源性,又在进化中有基因丢失现象;基于DGE高通量表达测序数据以及公开的蓖麻五个组织RNA-Seq数据分别对蓖麻bZIP基因的组织表达模式分析,得到种子特异性表达的或者潜在与油脂相关的基因。  

该研究结果为了解bZIP转录因子的结构和功能提供了重要信息。同时也为揭示蓖麻bZIP基因与蓖麻生长和发育,尤其是在种子储存物质累积中的作用提供了线索。相关研究结果以Genomic surveys and expression analysis of bZIP gene family in castor bean (Ricinus communis L.)为题发表在Planta上。

日期:2014年2月28日 - 来自[技术要闻]栏目

天津工业生物所获得λ-噬菌体基因表达的高分辨率图谱


λ-噬菌体基因表达的高分辨率图谱

λ-噬菌体作为一种被广泛研究的有机体,已经成为研究基因调控的最简单模式菌株。无论是基因表达的集中研究还是现代矩阵杂交技术的应用,都阐明了λ-噬菌体在生长过程中基因功能的复杂性。最近兴起了一种核糖体图谱新技术,通过捕捉细胞内核糖体的瞬间翻译位点来为大家提供更细致和精准的基因表达图谱。 

近日,中科院天津工业生物技术研究所江会锋研究组运用核糖体图谱技术获得了λ-噬菌体基因表达的高分辨率图谱。该研究将核糖体图谱技术应用于λ-噬菌体的溶菌生长过程中,以获得λ-噬菌体蛋白表达图谱,从而来推断翻译的单一位点。 

通过试验,研究组验证了已知的基因表达过程,但是发现还有很多复杂的翻译过程是不可预料的,同时还发现很多核糖体都存在于未知功能的开放阅读框(ORFs)中;此外,核糖体连接在一起后可以改变mRNA翻译其他信息的结构及有效性。研究认为,即便没有功能性多肽产生,功能性ORFs也可能在转录开始时被保留于基因组,因此,可以推断所有这些ORFs的一部分根本没有功能,呈现出的只是转录和翻译系统的基本活性。 

研究成果发表于PNAS期刊上。江会锋为本文的共同第一作者,Jeffrey W. Roberts教授是通讯作者。 

日期:2014年1月14日 - 来自[技术要闻]栏目
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趋化因子受体CXCR4在骨髓间充质干细胞中的表达

【摘要】  目的 体外研究趋化因子受体CXCR4在骨髓间充质干细胞中的表达情况。方法 体外培养大鼠骨髓基质细胞,构建CXCR4腺病毒表达载体,采用Western blotting对骨髓基质细胞的CXCR4受体表达水平进行检测。结果 骨髓间充质干细胞能高表达CXCR4蛋白。结论 CXCR4蛋白在骨髓间充质干细胞高表达,为进一步研究SDF1/CXCR4轴介导BMSCs在肝脏选择性归巢打下基础。

【关键词】  骨髓间充质干细胞;趋化因子受体CXCR4;归巢

 Abstract: Objective To study the expression of CXC chemokine receptor4(CXCR4) in bone mesenchymal stem cells. MethodsBone mesenchymal stromal stem cells (BMSCs) of rats were cultured in vitro, adenovirus vecto of CXCR4 was constructed and the expression level of CXCR4 receptor of BMSCs was tested by western blot. Results BMSCs can express CXCR4 and the positive ratio was high. Conclusion The high ratio of expression laid foundations for the further study in the effect of stromal cellderived factor1/ CXCR4 (SDF1/CXCR4) axis on bone mesenchymal stem cell homing to liver.

  Keywords: bone mesenchymal stem cells (BMSCs); CXC chemokine receptor 4 (CXCR4); homing

  骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是中胚层来源的具有多向分化能力的干细胞,具有分化成各种间叶组织细胞的潜能。利用其在活体内外均可分化为有功能的肝细胞的潜能,用于肝硬化、肝纤维化等的治疗具有重要的临床价值[1],而增加干细胞在肝脏的选择性归巢对治疗效果具有重要的意义。目前研究发现干细胞趋化因子1(SDF1)及其受体CXCR4对干细胞动员、迁移、细胞归巢起到重要作用。CXCR4广泛表达在包括单核细胞、淋巴细胞及所有CD34+细胞表面,与SDF1构成SDF1/CXCR4生物轴,参与细胞间信息传递及细胞迁移,其相互作用对移植的干细胞定位到肝组织起到了关键作用[23]。本实验将通过动物实验通过构建CXCR4腺病毒载体对骨髓基质细胞中CXCR4的表达进行鉴定,为进一步研究SDF1/CXCR4轴介导BMSCs在肝脏选择性归巢打下基础。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  雄性C57BL/6J小鼠,DMEM/F12培养基(GIBCO),胎牛血清(GIBCO),胰蛋白酶(Sigma),质粒抽提试剂盒(天根),连接酶T4 Lignase(TOYOBO),Trizol总RNA提取液(天根),Rever Tre Acea逆转录试剂盒(TOYOBO),PCR System 9700(Applied Biosy Stems),酶标仪(TECAN),倒置显微镜(Olympus),荧光显微镜(Leica),凝胶成象系统(BioRad),超净工作台(Nuair)。CXCR4引物由上海生工合成,上游引物序列:5’AGATCTATGGAACCGATCAGTGTGAGTATATACACTTCTGATAACT 3’,下游引物序列:5’GTCGAC TTAGCTGGAGTGAAAACTGGAGG 3’。

  1.2 方法

  1.2.1 BMSCs的分离培养

  引颈脱臼处死小鼠,75%酒精浸泡5 min,无菌条件下取股骨、胫骨,暴露骨髓腔,DMEM/F12基础培养液冲洗骨髓腔直至发白,收集冲洗液。反复吹打收集的冲洗液,制成单细胞悬液,置水平离心机中离心。以4×105/cm2 的密度接种于DMEM/F12完全培养液(含有青霉素100 IU/mL,链霉素100 μg/mL,胎牛血清10%)的25 cm2培养瓶中,置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃细胞培养箱中培养。48~72 h后全量换液,去除未贴壁细胞,以后每3 d换液。倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。当细胞铺满皿底达80%~90%融合(原代7~10 d,传代后5~7 d),倾弃旧培养液,PBS洗涤2次,加入0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA(1∶1体积比)于37 ℃孵育3~5 min。待细胞消化充分时,以血清终止胰蛋白酶作用。吸管吹打后收集细胞悬液离心。用10%FBS的DMEM/F12完全培养基(10%FBSDMEM/F12)重悬,调整细胞密度至1×103/cm2接种25 cm2培养瓶中,按1∶2比例进行传代培养代培养。免疫组织化学方法对BMSCs进行鉴定。

  1.2.2 CXCR4基因克隆与腺病毒包装

  采用Trizol试剂提取肝脏组织中总RNA,进行RNA质量检测(图1),制备cDNA,PCR扩增目的条带(图2),参照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行胶回收,目的条带连接PTA2(T载体)。将连接产物进行转化培养,参照质粒抽提试剂盒说明书收集菌液沉淀抽提质粒,进行双酶切鉴定(图3)。质粒抽提后双酶切鉴定正确后送上海生工测序。测序结果:扩增序列与GENEBANK中做发表的序列完全一致。目的条带连接腺病毒穿梭载体PadTrack。连接产物转化,提质粒。pme I线性化后转化至BJ5183同源重组菌中。挑取重组子,Pac I酶切鉴定正确后进行病毒包装(图4)。病毒至第五代并大量扩增病毒(图5)。1、2:均为所提RNA图1 RNA质量检测M:markerD2000,从上至小分别代表的条带大小分别是2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp;1:PCR扩增片段图2 PCR扩增条带电泳M:markerD2000;1、2、3:载体自连;4:正确的阳性克隆图3 双切酶鉴定M:从上至小代表的大小分别是15 000 bp、10 000 bp、7 500 bp、5 000 bp、2 500 bp、1 000 bp、500bp;1、2:重组载体  图4 重组载体电泳图5 腺病毒荧光照片

  1.2.3 鉴定间充质干细胞对CXCR4的表达

  CXCR4转染间充质干细胞,取第三代BMSCs,病毒原液用PBS稀释10倍,均匀转染细胞,制成单细胞悬液。采用Western Blotting鉴定间充质干细胞的CXCR4表达水平,分析结果。

  2 结果

  2.1 BMSCs分离及传代培养的观察结果

  采用贴壁法成功地分离培养出了BMSCs。原代培养骨髓基质细胞约24~48 h贴壁,贴壁细胞初呈不规则近圆形。4 d后细胞迅速增殖, 出现细胞集落。原代培养约7~10 d达到80%~85%细胞融合,呈漩涡状生长。传代细胞12~24 h贴壁,以梭形细胞为主。5~7 d细胞达80%融合。种植后4~24 h贴壁,5 d有80%~90%以上的融和,形态为成纤维样和梭形细胞为主。细胞排列成漩涡状或放射样分布。免疫组织化学方法对BMSCs进行鉴定,显示CD34、CD45表达阴性,CD44、CD54表达阳性。

  2.2 CXCR4的表达

  采用Western Blotting鉴定间充质干细胞的CXCR4表达水平,实验结果显示:间充质干细胞能高表达CXCR4蛋白(图6)。

  3 讨论

  本实验成功地构建了CXCR4腺病毒载体并对BMSCs中CXCR4的表达进行鉴定,结果说明表达是成功的。有研究用Western blotting分析,数据表明有CXCR4受体表达,但可能是以糖基化形式存在[4]。有研究发现BMSCs表达CXCR4也是随着传代数增加而减少,可能和细胞活性降低有关,提示临床应用骨髓基质干细胞治疗应选用近代细胞为佳[5]。1:CXCR4;2:阴性对照图6 间充质干细胞的CXCR4表达

  临床研究发现BMSCs对肝脏的修复至少应包括两方面的作用,即对受损肝脏功能的恢复以及促进受损肝脏的再生。Fürst[6]证实自体BMSCs移植可促进受损肝脏再生。临床上也有报道BMSCs移植可促进受损肝脏的功能恢复[7]。SDF1的受体CXCR4是一个G蛋白偶联受体,SDF1/CXCR4轴在BMSCs归巢中有重要作用,是干细胞迁移的关键因素,因此SDF1/CXCR4对干细胞的增殖和迁移的重要性越来越受到重视[8]。如能提高CXCR4在骨髓基质干细胞中的表达,将为干细胞移植治疗肝硬化肝纤维化的临床应用提供广阔的前景。

【参考文献】
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日期:2013年9月26日 - 来自[2010年第19卷第6期]栏目

环氧化酶2在胃癌发生发展中的作用研究进展

【关键词】  胃癌;环氧化酶2;幽门螺旋杆菌

胃癌是严重危害人类生命健康的恶性肿瘤,传统的治疗方法不足以降低其致死率。探索胃癌新的防治措施及其发生发展的分子机制一直为人们所关注。环氧化酶2(cyclooxygenase2,COX2)是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素(PG)过程中重要的诱生型限速酶。近年来的研究发现,COX2在胃癌中的表达明显增高,而抑制COX2表达有可能预防和逆转胃癌的发生,表明COX2在胃癌的发生发展过程中起重要作用,COX2有望成为胃癌防治的一个新靶点,所以研究COX2与胃癌的关系具有重要意义[1]。本文结合国内外文献,就COX2参与胃肠肿瘤发生发展的分子机制研究进展综述如下。

  1 COX2在胃癌中的表达及其临床意义

  大量的临床病理研究显示,胃癌组织中COX2的表达增加,而正常胃粘膜组织中未见表达。不表达COX2的胃癌细胞,与其GPG岛的甲基化有关,脱甲基化可恢复COX2的表达。除了胃癌组织,癌前病变中也发现COX2高表达。并且,在胃癌癌前病变恶变为胃癌的过程中,COX2的表达是逐渐增加的,提示COX2参与了胃癌的发病过程[2]。有学者发现在不同组织类型的癌细胞内COX2的胞内定位略有不同。COX2在胃癌组织中的高表达状态与与胃癌的微血管密度(micro vessel density,MVD)、血管侵袭、低凋亡率及淋巴结的转移都有着一定的相关性。为了验证COX2的表达与胃癌临床病理特征、血管生成及患者存活率的关系,Lazar等[3]检测了61例手术切除的胃癌标本中COX2的表达。结果表明COX2的表达与肿瘤的侵袭程度、淋巴结转移及TNM分期明显相关,但是与患者预后无明显关联。COX2在胃癌的形成过程中起重要作用,也许是胃癌发生的早期事件,COX2的表达和胃癌的侵润深度相关[3]。用RTPCR法测定33例胃癌手术标本中COX1和COX2的表达量,对标本中COX2抗体同时行免疫组化染色和常规组织学测定,发现胃癌中COX2表达指数明显高于正常粘膜(P<0.05),COX2指数随着胃癌组织的浸润深度而升高。免疫组化显示COX2蛋白弥散于肿瘤细胞的胞浆中,而不存在于细胞间质或非癌性筋膜中。用斑点杂交测定了104例胃癌手术标本中的COX2蛋白表达情况,同样证实COX2在胃癌组织中的表达上调。COX2的表达情况可能与胃癌的组织来源有关,用免疫组化法测定67例胃癌标本中肠型胃癌(高分化)的COX2阳性率为58%,而在弥散型胃癌(低分化)中的阳性率低仅为6%。总之,COX2在胃癌组织中高表达,且这种高表达状态与胃癌的发生、侵袭和转移、病理分期有明显关联。COX2有可能成为胃癌诊断和治疗的分子标志。

  2 COX2与幽门螺旋杆菌感染的关系

  幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是胃癌发病的Ⅰ类致癌原,从Hp感染到胃癌的发生大致过程为:Hp感染→单纯性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生(以大肠型上皮化生更易癌变)→不典型增生→胃癌。在这个过程中,COX2的表达有逐渐增加的趋势,并与Hp感染有着正相关关系[4]。王海滨等[5]用Hp喂养小鼠可见胃粘膜COX2显著增多,而抗Hp治疗后,COX2表达则明显降低,与Hp共孵育的胃癌细胞内的COX2的表达也明显增多[6]。检测发现COX2在胃癌组织中的表达明显升高,并且在Hp相关性胃癌中表达75.76%,较非Hp阳性的胃癌中表达增高,Hp感染可增强COX2的表达。目前,Hp感染诱导COX2表达上调的机制尚未明确。Hp亚群Hp99通过活化AP1的活性,诱导AGS细胞cfos、cjun的表达,从而诱导COX2和iNOS的表达。Hp感染可以诱发胃炎症反应,产生许多炎性细胞因子可以使COX2的表达上调。有作者为了在体内验证COX2的下游基因,Hp感染后加入COX2抑制剂(NS389),Hp感染影响了385个基因的表达[7]。与COX2有关的基因有160个,包括影响胃生理特征的基因(胃泌素,Galr1)、上皮屏障功能基因(Tjp1,connexin45,Aqp5)、炎症相关基因(Icam1)、凋亡相关基因(Clu)和增生相关基因(Gdf3,Igf2)。单独用NS389治疗后导致140个基因的改变,这些基因的改变都是在COX2不同表达的基础上发生的。这些结果表明COX2与胃的炎症发生、上皮细胞修复及完整性方面有关。COX2过表达在Hp相关性胃癌中起着重要作用。在MKN45细胞中COX2蛋白、mRNA及其启动子活性均显著增加。并且Hp刺激了p38MAPK及其下游因子ATF2的磷酸化。COX2的表达被p38MAPK的抑制剂抑制。这些结果表明Hp诱导p38MAPK/ATF2信号传导途径是COX2表达的重要机制。Hp感染可使胃泌素的表达增加,后者可以促使COX2的表达,使COX2的mRNA的半衰期延长[8]。用胃泌素释放肽(gastrinreleasing peptide,GRP)抑制剂可以降低癌组织的COX2的表达。Hp感染还可以作为其他诱导因子(如高盐饮食)诱导COX2表达的基础。

  3 COX2促进胃癌血管生成和淋巴结转移

  肿瘤浸润和转移与血管和淋巴管的增生有密切联系,多种细胞因子如VEGF、成维细胞生长因子(FGF)、活化蛋白1(active protein1)等都可以促进血管和淋巴管增生,促进肿瘤转移。VEGF是决定胃癌患者不良预后的一个相对独立因素[9]。COX2的催化产物PGE2通过EP(Eprostanoid)受体激活Her2/neu酪氨酸激酶信号通路及活化剂蛋白(activator protein1)和转录激活因子(ATF4)促进VEGF表达[10]。在EP3基因敲除小鼠Lewis肺癌模型的肿瘤血管生成受到明显抑制,也证明COX2是通过PGE途径促进血管增生,VEGF反过来又能促进COX2的表达,其相互作用被某些因素(如炎症)激发后,即可加速恶性肿瘤的发生与发展。FGF2促血管生成作用同样依赖COX2,用COX2抑制剂celecoxib可阻断血管增生,抑制肿瘤的生长。FGF又可通过Akt信号通路促进COX2的表达,二者对血管增生有协同作用[1112]。COX2基因敲除或添加COX2抑制剂可抑制胃癌的发生。COX2抑制剂可以诱导细胞凋亡、减少血管生成,阻碍钾离子通道,COX2可以调控Notch1信号传导途径在胃癌的侵袭和转移过程中的作用[13]。

  4 COX2促进胃癌细胞增生抑制细胞凋亡

  有研究表明,COX2可以抑制胃癌细胞的凋亡,促进细胞增生[11]。这可能是由于COX2对许多凋亡基因或抗凋亡基因的调控作用,从而打破凋亡基因与抗凋亡基因之间的平衡。bcl2基因是一个重要的抗凋亡基因。有作者认为COX2可能是bcl基因的上游调节者,COX2是通过PI3K信号途径来上调凋亡抑制蛋白Bcl2家族成员中的MCL1表达,使癌细胞凋亡受抑[14]。使用COX2抑制剂后发现死亡受体和凋亡信号通路的关键酶胱冬酶(Caspases)的表达增加,表明COX2可能有抑制死亡受体表达的作用。COX2的过表达可以使转化生长因子的抗细胞增殖活性减弱。COX2还可以减弱抑癌基因Fas介导的细胞凋亡信号[1516]。有作者检测了COX2抑制剂celecoxib对BGC823细胞凋亡、增生及细胞周期的影响,结果发现celecoxib可抑制BGC823细胞的生长,增强细胞在G1期的比例,减少细胞在S期的比例,增强细胞的凋亡率,并且增强P21和Fas的表达。COX2抑制剂可以增强胃癌细胞凋亡率,抑制血管生成[1718]。COX2抑制剂抗肿瘤效应可能与下调AktGSK3beta、FKHR,上调caspase9的活性。通过RNA干扰抑制COX在SGC7901中的表达,可以抑制细胞的增生,诱导细胞凋亡,但是对细胞周期无明显影响,RNAi是胃癌基因治疗的有效手段之一。

【参考文献】
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日期:2013年9月26日 - 来自[2010年第19卷第6期]栏目
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Survivin基因在大肠癌中的表达

【摘要】    目的 探讨Survivin基因在大肠癌中的表达。 方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测20例大肠癌及其癌旁组织survivin mRNA表达情况。结果 65%大肠癌组织表达survivin mRNA,而癌旁组织25%表达。 Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移及分化程度无明显关系。结论 Survivin基因在大肠癌发生发展中可能起作用,Survivin表达上调和端粒酶激活可能通过各自不同的信号途径在大肠癌变中发挥协同作用。

【关键词】  Survivin基因;大肠癌;表达

  Expression of Survivin gene in larger intestinal cancer patients.

  CAO Bi-hong, LIU Ji-hong, ZENG Hong, et al.

  Huizhou Municipal Central People’s Hospital, Huizhou 516001, Guangdong, P.R. China

    Abstract:Objective  To investigate the expression of survivin in colorectal cancer (CRC) patients.  Methods  The expression of survivin mRNA in 20 colorectal cancer patients and adjacent tissues was detected by RT-PCR.  Results  The expression of survivin  mRNA was detected in a 65% of the samples of CRC patients, significantly higher than that of the adjacent tissues (25%).  There no significant correlation of survivin gene expression with the tumor size, invasivesdepth, lymphonode metstsis and extent of differentiation were observed.  Conclusion  The up-regulation expression of survivin gene in CRC patients shows that survivin may play a role in the pathway of carcinogenesis. The up-regulation expression of survivin and the activtion of telomerase may have a cooperative effect in the carconogenesis through their respective signal pathway.

    Key words:Survivin gene; Colorectal cancer; Experssion

    生存素(Survivin)是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一员,其抗凋亡作用的机制可通过Caspase途径和非Caspase途径实现[1],属于一种结构独特的哺乳类凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员,survivin同时具有肿瘤组织特异性高表达的特,研究已证实多种常见肿瘤如胃癌、大肠癌、乳癌、肺癌、肝癌等均存在Survivin异常表达[2],但在正常成人组织不表达或呈低表达。本文采用 RT-PCR法检测大肠癌及癌旁组织中survivin mRNA表达情况,并探讨了生存素的表达与大肠癌临床病理的关系。

  1  材料与方法

  1.1  标本采集 

  选取2002年8月~2005年6月经病理组织学诊断为大肠腺癌手术切除标本20例(男11例,女9例),平均55.8岁(35~76岁)。其中结肠癌14例,直肠癌6例;组织学类型分为:腺癌10例,粘液腺癌6例,印戒细胞癌4例;对肿瘤病理组织做出细胞学分级的诊断(Dukes.分期)为A期5例,B期6例,C期6例,D期3例。术前未经化疗、放疗或免疫治疗。在手术中采集癌组织及癌旁组织标本(距肿瘤边缘5cm处)一部分立即置于液氮罐中,后转移至-80℃低温冰箱中保存用于实验,另一部分用10%甲醛固定,用于病理诊断。

  1.2  方法

  1.2.1  主要试剂

  RNA提取及RT-PCR检测试剂盒购自华美生物工程公司,端粒酶定量检测试剂盒(BoehringerMannheim)购自Roche公司。

  1.2.2  RT-PCR检测 

  Survivin基因表达(1)组织RNA提取:取组织50~100mg切成薄片,用冷PBS缓冲液洗涤后,加TrizolTM溶液在玻璃匀浆器中充分匀浆,参照试剂盒说明书行一步法提取总RNA。紫外分光光度计于260nm和280nm测吸光度值,且A260/A280≥1.8。(2)RT-PCR反应:反应体系加入4μg RNA,0.5μg Oligo(dT),20U RNasin,200U M-MLV逆转录酶缓冲液,反应终体积为25μl。反应混合液在42℃保温1h,最后95℃ 5min灭活 M-MLV逆转录酶活性,冰上冷却后完成cDNA合成。为保证mRNA提取和逆转录效应的可信性,以3磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)表达作为内参照,其PCR条件与下述所描述的条件一致。Survivin基因引物序列:正向引物 5’-GGAC-CACCGCATCTCTACAT-3’(位于外显子-1的2855-2984);反向引物5’-GCACTTTGCCAGTTTCC-3,(位于外显子-4的11990-12009),扩增产物为338bp。G3PDH基因引物序列上游序列5'-CCA CCCATG-GCA AA TTCCATGGCA-3,(212-236),下游序列5'-TCTAGACGGCAGGTCAGG TCAGGTCCACC-3'(787~811)。在25μl反应体系中,含上下游引物各20p mol,cD-NA 2μg,Taq DNA聚合酶1U,4种dNTP各0.2mmol/L及PCR缓冲液。PCR参数为95℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 1min,共31个循环。(3)电泳:PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭(EB)显色,紫外线灯下观察 338bp survivin特异扩增条带及599bp G3PDH内参照扩增片断,只出现599 bp片断为阴性。

  1.3  统计学处理计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验。

  2 结果

  2.1 Survivin在大肠癌和癌旁组织的表达 

  20例大肠癌和癌旁组织 Survivin mRNA表达的阳性率分别为65.0%(13/20)和25.0%(2/20),两者差别有统计学意义(χ2=6.664,P<0.01)。

  2.2 Survivin表达和端粒酶相对活性(RTA)与大肠癌临床病理学特征的关系大肠癌组织中Survivin基因表达与肿瘤大小、侵袭深度、分化程度及是否有淋巴结转移无关(P>0.05),见表2。表2  Survivin表达与大肠癌临床病理学特征的关系项目水平例数Survivin(略)

  3 讨论

    生存素是1997年Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体 21(EPR21)cDNA从人类基因组库中杂交筛选克隆出来的,基因全长15kb,位于17q25,含有4个外显子和3个内含子,基因编码产生一含142个氨基酸的蛋白,是目前人类IAPs家族中研究最多的一个基因。生存素结构独特,不同于其它IAP家族成员,仅含有一个杆状病毒LAP重复序列(BIR),没有环指结构。生存素在胚胎和胸腺组织中丰富表达,在人类大多数肿瘤亦存在高表达(美国国立癌症研究所用于抗癌药物筛选的60株肿瘤细胞中均存在生存素高表达)。Survivin的主要生理功参与增殖细胞的生长、分化,促进胚胎细胞的分和增殖,大多数研究均认为生存素除了在胚胎发育过程中和绝大多数肿瘤组织中表达外,在正常组织中不表达,近年研究检测结果发现,除了睾丸、甲状腺、胎盘外,survivin尚在成人正常的子宫内膜、肾上腺髓质和大肠黏膜中有部分表达或低表达。相反,在多种恶性肿瘤中 Survivin前检测组织中survivin表达的方法有RT-PCR法、原位杂交法、免疫组化法及Western blot法,但由于报道较少还未能作出方法学的确切评价。 RT-PCR方法灵敏性和特异性好,因为方法中涉及到PCR扩增和特异引物的使用,少量细胞甚至单个细胞即可完成实验。本文采用RT-PCR法观察了大肠癌及其癌旁组织survivin mRNA的表达与其临床病理学的关系,研究发现survivin表达与肿瘤大小、侵袭深度、分化程度及淋巴结转移无明显关系(P>0.05)。本研究采用较为敏感的RT-PCR方法检测大肠癌及癌旁正常组织中生存素mRNA的表达,结果大肠癌组织中阳性表达率(65.0%)明显高于癌旁正常组织(25.0%),这与Sarela等[3]的研究结果一致,表明生存素是一个较为特异的肿瘤标志物。生存素mRNA的表达与大肠癌临床病理参数,这与徐晓的研究一致[4],而一些研究在大肠癌肝转移患者中发现生存素mRNA的表达明显低于无转移者[5];在子宫内膜癌的研究中,有学者认为[6],生存素蛋白的表达与子宫内膜癌的临床分期,组织分化及浸润深度有关。Kawasaki等[7]提出survivin表达上调预示着生命期缩短和预后不良,生存素mRNA的表达与肿瘤患者的预后相关,这已在非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌、肝癌中得到证实。在大肠癌的研究中,Serela等的研究表明在Ⅱ期大肠癌中生存素mR-NA阴性表达组患者的5年生存率(94.4%)远高于阳性表达组(44.8%),提示Ⅱ期大肠癌术后检测生存素mRNA或生存素蛋白可作为评价大肠癌预后的客观指标。近来,一些体内、外试验研究表明[8],在生存素阳性表达的细胞株或患者中,对化疗或放疗抵抗现象 (Chemo-radioresistance)普遍,而封闭生存素的表达则会增加肿瘤对放、化疗的敏感性。因此,从临床角度讲,生存素阳性表达的肿瘤患者其治疗效果可能不佳,化疗耐药现象可能和一些凋亡抑制基因如生存素有关,针对靶基因生存素的基因治疗可望改善临床治疗效果。

【参考文献】
    [1]Kawasaki H, Toyoda M, Shinohara H, et al. Expression of survivin correlates with apoptosis, proliferation, and angiogenes is during human colorectal tumorigenesis[J].Cancer, 2001,91 (11):2026~2032.

  [2]Chakravarti A, Noll E, Black PM, et al. Ouantitatively determined survivm expression level are prognostic value in human gliomas[J]. Clin Oncol,2002,20(4):1063~1068.

  [3]Sarela AI, Macadam RC,Farmery SM,et al.Expression of the antiapoptosis gene, survivn,predicts death from recurrent colorectal carcinoma[J].Gut,2000,46(15):645~650.

  [4]徐晓,陈卫昌,刘强,等.生存素在大肠癌中的表达及其与血管生成的关系[J].江苏医药,2005,31 (6):439~442.

  [5]Sarels Al, Verbeke CS, Ramsdale J,et al. Expression of survivin, a novel inhibitor or apoptosis and cell cycle regulatory protein in pancreatic adenocarcmoma[J].Br J Cancer, 2002,86(6):886~892.

  [6]Tanaka K, lwamoto S,Gon G,et al. Expression of survivm and its relationship to loss of apoptosis in breast careinomas[J].Clin Cancer Res,2000,6(2):127~134.

  [7]Kawasaki H, Altieri DC, Lu CD,et al. Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer[J].Cancer Res, 1998, 58(22):5071~5074.

  [8]Asanuma K,Moriai R, Yajima T, et al. Survivin as a radioresistance factor in pancreatic cancer[J]. Cancer Res,2002,91(12):1204~1209.

日期:2013年9月26日 - 来自[2008年第8卷第3期]栏目

人PRL-3基因真核表达载体构建及相关蛋白生物信息学分析

【摘要】    目的 克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体,并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法 运用RT-PCR技术,从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3 cDNA,经T-A克隆,构建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3,通过双酶切鉴定及测序确认,并利用生物信息学方法预测分析其相互作用蛋白。 结果 成功扩增出人PRL-3全长cDNA,构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体,测序结果表明PRL-3全长cDNA与GeneBank中PRL-3序列完全一致。利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP,利用基于保守的蛋白相互作用分析方法,预测认为肌动蛋白家族成员ARP6和功能尚不清楚的小G蛋白家族ARL-3可能是PRL-3的相互作用蛋白,提示PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁,参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径。结论 成功克隆PRL-3基因全长cDNA并构建其真核表达载体,并利用生物信息学方法,初步预测PRL-3的相互作用蛋白,为进一步深入研究PRL-3在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。

【关键词】  PRL-3;蛋白相互作用; 生物信息学

  Construction of PRL-3 gene eukaryotic expression vector and bioinformatic analysis of PRL-3-interacting proteins.

  ZHOU Jun, LI Jian-ming, YANG Fa-da, et al.

  Department of Pathology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, P. R. China

    Abstract:Objective  To clone entirely coding human PRL-3 gene and construct its recombinant eukaryotic expression vector so as to explore its function and roles in metastasis of the human colorectal carcinoma.  Methods  With total RNA extracted from the human colorectal carcinoma cell sw480 as template, PRL-3 gene was amplified by RT-PCR with the designed primers based on the public sequence of GeneBank, and then inserted into pGEM-T Easy vector by TA cloning. Recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-PRL-3 was then constructed by subcloning technique and confirmed by restriction enzyme digestion analysis and sequencing. Bioinformatical methods were used to predict and analyze PRL-3-interacting proteins, and gene expression patterns of the candidate proteins in human tissues or organs were analyzed by Digital northern blot in NCBI online database.  Results  The entirely coding human PRL-3 gene was cloned. Recombinant pcDNA3-PRL-3 was successfully constructed. Bioinformatics analyses indicated that PRL-3 was found as an important bridge between ARL-3 protein and ARP6 protein. Gene expression patterns of PRL-3 and its related proteins in human tissues or organs were found similar by use of digital northern blot in online NCBI database.  Conclusion  Human PRL-3 gene has been successfully cloned and ARL-3 protein and ARP6 protein are predicted to be PRL-3-interacting proteins, which will be useful for further research on its function as well as its implications in the occurrence and progress of colorectal carcinoma.

    Key words:PRL-3 Gene; Protein interaction; Bioinformatics

    蛋白酪氨酸磷酸酶-3(Phosphatase of regenerating liver-3  PRL-3) 是一种分子量只有20KD的蛋白磷酸酶,属于PRL家族,该家族只有三个成员PRL-1、PRL-2、及PRL-3[1]。新近的一些研究表明PRL-3与肿瘤转移有非常密切的关系。作为一个潜在新的肿瘤治疗靶点已成为一个新的研究热点,但就目前而言,对于PRL-3仍有两大难题急需解决,首先,PRL-3活性的生理性靶标或底物不明。其次,PRL-3参与哪些细胞信号通路仍不清楚,这些问题的解答将有利于揭示PRL-3的功能特性,而寻找PRL-3的相互作用蛋白则可能为这些问题的解决提供线索。因此,本研究中我们首先克隆人PRL-3基因,构建其真核表达载体,通过PCR、限制性酶切分析以及测序鉴定,然后应用生物信息学方法对PRL-3相互作用蛋白进行初步预测,寻找PRL-3相互作用蛋白,为进一步研究了解PRL-3蛋白在结直肠癌转移中的作用机制以及相关的信号通路奠定基础。

  1  材料与方法

  1.1  材料 

  Trizol试剂和RT-PCR 试剂盒为Invitrogen公司产品;克隆载体pGEM-T Easy Vector、AMV逆转录酶为Promiga公司产品;PrimeSTAR HS DNA高保真酶、限制性内切酶、T4连接酶、标准分子量DNA Marker、质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA片段纯化试剂盒均购自Takara公司;pGEX-4T-1、sw480人大肠癌细胞、大肠杆菌DH5、BL21(DE3) 菌株均由为本室保存。

  1.2  方法

  1.2.1  引物的设计与合成 

  根据已报道的PRL-3基因序列(GeneBank Accession Number: NM_032611) ,依据PCR引物设计原则和PrimeSTAR HS DNA高保真酶的特性,利用在线引物设计工具(http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web- primer)设计能特异性扩增人PRL-3 cDNA全长的引物序列,同时分别在上游引物P1和下游引物P2的5′端引入BamH 1和Xho l两酶切位点,引物由上海英骏生物技术有限公司合成, 序列如下:

    P1:5’-GGATCCATGGCTCGGATGAACCGC-3’
   
  P2:5’-CTCGAGCTACATAACGCAGCACCGGGT-3’

  1.2.2  RT-PCR 

  取适量培养的大肠癌细胞株sw480,加入1ml TRIzol试剂,提取总RNA,以2μg总RNA为模板,按照试剂盒说明书进行反转录获得cDNA,以cDNA产物为模板, P1和P2为引物, PCR扩增约522bp的片段, 总反应体积为50μl, 循环参数为:94℃ 2min;94℃ 20s, 56℃ 20s, 72℃ 40s, 30个循环,72℃延伸5min。取5μl PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

  1.2.3  PRL-3基因序列测定 

  PRL-3扩增产物使用Agarose Gel DNA Purification Kit回收DNA,经加A尾处理后,插入克隆载体pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-T-PRL-3, 然后转化DH5a感受态,涂LB板(Amp+)后,次日随机挑取5个克隆, 37℃振荡培养12h,小量提取质粒pGEM-T-PRL-3,经PCR及BamH 1和Xho Ⅰ双酶切鉴定,鉴定正确的质粒交由上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。

  1.2.4  pcDNA3-PRL-3真核表达载体的构建 

  pcDNA3和pGEM-T-PRL-3分别用BamH Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切后, 琼脂糖电泳回收载体大片段和目的片段;连接上述目的基因和载体片段,构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体,转化DH5α感受态细胞,用含Amp+的LB平板筛选阳性克隆,小量抽提质粒,经PCR及BamH Ⅰ 和Xho Ⅰ双酶切鉴定并进行测序分析。

  1.2.5 不同种属PRLs家族成员进化树分析 

  利用NCBI在线数据库,对PRL-3进行Blast分析,寻找其直系及旁系同源蛋白,进一步我们对不同种属包括酵母、线虫、果蝇、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猕猴以及人等PRLs家族成员应用在线分析软件Clustal W进行进化树分析(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/#)。

  1.2.6 利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库,寻找果蝇中PRL相互作用蛋白 

  利用在线的模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP (http://dip.doe-mbi.ucla.edu/),分析果蝇PRL(dPRL-1)相互作用网络,寻找果蝇中PRLs相互作用蛋白。

  1.2.7 人类PRL-3相互作用蛋白的预测 

  利用在线数据库寻找果蝇中PRL相互作用蛋白的人类的同源蛋白 (http://www.ensembl.org/index.html, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),对人类PRL-3的相互作用蛋白进行初步分析预测,对其可能的功能进行初步分析。

  1.2.8 虚拟Northern杂交分析PRL-3及预测的相互作用蛋白的表达 

  利用CGAP中的SAGE和cDNA数据库(http://cgap.nci.nih.gov/Genes)对PRL-3及预测的相互作用蛋白基因在正常组织和各种肿瘤细胞中的表达情况进行虚拟Northern杂交分析。

  2 结果

  2.1 人PRL-3cDNA基因的扩增、克隆及序列测定 

  PCR成功扩增出人PRL-3基因片段,PRL-3基因PCR产物的电泳结果可见大小为522bp左右的特异性条带(图1)。电泳回收片段插入pGEM-T Easy克隆载体中,形成pGEM-T-PRL-3, BamH 1和Xho Ⅰ双酶切鉴定得到正确克隆,克隆测序结果与GeneBank里的人PRL-3基因序列相一致(图2)。

  2.2 真核表达载体pcDNA3-PRL-3的构建及鉴定 

  构建的质粒用BamH 1和Xho l双酶切鉴定,得到约5.4kb和522bp左右的片段,与预期结果一致(图3)。

  2.3  PRL-3相互作用蛋白的生物信息学研究

  2.3.1 不同种属PRLs家族成员进化树分析 

  利用NCBI在线数据库我们寻找到包括酵母、线虫、果蝇、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猕猴以及人等不同种属的PRL-3蛋白的直系及旁系同源蛋白。应用在线分析软件ClustalW,对不同种属的PRLs家族成员进行进化树分析,结果见图4。我们观察到人PRL-3(hPRL-3)与果蝇PRL(dPRL-1)接近,实际上在果蝇中PRL只有一个成员即dPRL-1,这提示PRL-3在进化上的保守性。

  2.3.2  模式生物果蝇中PRLs相互作用蛋白的确定 

  利用在线的模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP,分析果蝇PRL(dPRL-1)相互作用蛋白的网络,寻找果蝇中PRLs相互作用蛋白,结果见图5。结果发现这一网络非常独特,dPRL-1是联系果蝇蛋白CG11678-1A和CG17819-PA两者间的重要桥梁。

  2.3.3 人类PRL-3相互作用蛋白的预测 

  根据确定的模式生物果蝇中PRL(dPRL-1)相互作用蛋白序列,利用在线数据库,寻找果蝇中PRL(dPRL-1)相互作用蛋白的人类的同源蛋白,结果发现,人类中与CG11678-1A同源的蛋白是ARP6(actin-related protein 6 homolog),而与CG17819同源的蛋白是ADP-ribosylation factor-like protein家族成员ARL-3,这些同源蛋白之间都具有较高的同源性,而且具有较为一致的作用域。

  2.3.4 数字Northern杂交分析PRL-3及预测的相互作用蛋白的表达 

  利用CGAP中的SAGE和cDNA数据库(http://cgap.nci.nih.gov/Genes)对PRL-3及预测的相互作用蛋白基因在正常组织和各种肿瘤细胞中的表达情况进行数字Northern杂交分析(表1及图6)。结果发现ARP6、ARL-3与PRL-3的基因表达谱非常接近,与PRL-1及PRL-2的基因表达谱则差别明显,而且也注意到PRL-3在正常结直肠粘膜组织中未有表达,而在结直肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116以及COLO205中都有较高的表达。表1  PRL-3 相关蛋白在正常组织中的表达情况(略)

  3 讨论

    我们通过克隆构建PRL-3真核表达载体,并利用生物信息学技术对其相互作用蛋白进行了初步预测,为进一步研究其功能和在结直肠癌转移中的作用创造条件。本实验采用分子克隆技术构建PRL-3的真核表达载体,以期采用基因转染和表达方法,探讨其在肿瘤中的作用。

    随着计算机科学的发展,生物信息学目前已成为研究蛋白质相互作用方法中除了传统的基于分子生物学方法之外的重要补充。生物信息学是一门数学、统计、计算机与生物医学交叉结合的新兴学科,已广泛地渗透到医学的各个研究领域中,是现代生物医学发展不可缺少的重要工具,在人类疾病与功能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究以及对蛋白质的相互作用的预测分析等方面都发挥着关键的作用。生物信息学预测蛋白相互作用的方法依据不同的原理可分为多种,如系统发育谱(Phylogenetic profile),基因邻接(Gene neighborhood),镜像树 (Mirrotree),突变关联(Correlated mutation),保守的蛋白间相互作用(Interologs)等方法,其中保守的蛋白间相互作用方法依据的原理是相互作用的蛋白质在物种演化过程中具有保守性。因此,通过在一个物种中建立的蛋白质相互作用网络,可以预测其它物种相应同源蛋白质间的相互作用[2,3]。
   
  PRL-3蛋白与结直肠癌转移的关系已经确定[4],但目前我们仍不了解PRL-3活性的生理性靶标或底物,也没有掌握促进细胞迁移和侵袭的具体机制。PRL-3本身只是一个小分子蛋白质,结构相对简单,除了酶活性结构域和异戊烯化位点外,无其它的活性区。根据PRL-3的分子结构分析,结合其它特异性的磷酸酶功能特性,其功能特征可能取决于它结合的蛋白质结构和功能[5],寻找确定PRL-3的相互作用蛋白将可以为这些问题的解决提供线索和提示。
   
  鉴于模式生物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的蛋白相互作用数据库已经建立[6],我们采用基于保守的蛋白间相互作用的生物信息学预测方法,通过分析确定果蝇中CG11678-1A和CG17819-PA两蛋白为dPRL-1的相互作用蛋白,再通过在线数据库寻找确定人类与此二者同源的蛋白为ARP6(Actin-related protein 6 homolog)和ADP-ribosylation factor-like protein家族成员ARL-3,这些同源蛋白之间都具有较高的同源性,而且具有较为一致的保守结构域。同时根据CGAP的SAGE和cDNA数据库,我们对PRL-3、ARP6及ARL-3基因在正常组织和各种肿瘤细胞系中的表达情况进行了虚拟Northern杂交分析,结果发现ARP6、ARL-3与PRL-3的基因表达谱非常接近,与PRL-1及PRL-2的基因表达谱则差别明显,而且也注意到PRL-3在正常结直肠粘膜组织中未有表达,而在结直肠癌细胞系HT29、SW620、HCT116以及COLO205中都有较高的表达。根据这些结果,我们推测ARP6和ARL-3蛋白很可能与其在酵母中的同源蛋白相似,与人类PRL-3存在相互作用。
   
  ARP6是肌动蛋白家族成员,其家族成员主要参与细胞骨架调节,目前对其研究相关报道还不多见,有研究表明其家族成员ARP2的高表达与结直肠癌的肝转移发生关系密切[7,8],而ARP2与WAVE2 (Wiskott-Aldrich syndrome family verproline-homologous protein 2)的高表达也可以促进乳腺癌及肺癌转移发生[9,10]。ARL-3则属于功能尚不清楚的小G蛋白家族,目前对于它的研究也少见报道,有研究表明ARL-3的缺乏与上皮细胞不正常的增殖有关[11],而另有报道认为其家族另一成员ARL-2与细胞周期、微管蛋白变形和微小管的动力学有关[12]。这些研究结论在某种程度上对解释PRL-3在肿瘤转移中的机制提供了有益的提示。

    通过上述预测分析,我们推测,PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁,参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径,但这仅是基于生物信息学预测结果的一种推测,还需后续的实验去证实,而寻找确定PRL-3相互作用蛋白,将为证实这一推测乃至最终阐明PRL-3功能特性起到至关重要的作用。

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日期:2013年9月26日 - 来自[2008年第8卷第3期]栏目
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氧化型脂蛋白(a)对大鼠GMCs增生及ICAM -1表达的影响

【摘要】    目的 探讨氧化型脂蛋白(a)[Ox-Lp(a)]对大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)增生及细胞间粘附因子-1(ICAM-1)表达的影响。方法 分离Lp(a) 并氧化修饰,培养GMCs,分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L 的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L 的ox-Lp (a) 作用12h、24h、48h、60h。采用MTT法测定GMCs增生率,免疫组化法检测GMCs的增生细胞核抗原(PCNA)阳性表达率,酶联免疫法检测培养液上清的ICAM-1浓度。并与加入终浓度5nmol/L的天然Lp(a)[n-Lp(a)]作用12h的Lp(a)组及不加任何刺激因素的空白对照组比较。结果 与对照组比较,Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。与Lp(a)比较,Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,且Ox-Lp(a)2.5nmol/L 作用高于终浓度5nmol/L的Lp(a)组(P<0.01)。随着Ox-Lp(a)浓度的增加,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化,Ox-Lp(a)5nmol/L时达高峰,在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降,20nmol/L明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。随着处理时间的延长,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势,48h达到高峰,60h出现下降(P<0.01)。GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关(P<0.01)。结论 Lp(a)、Ox-Lp(a)能明显影响GMCs的增生,Ox-Lp(a)生物学作用强于Lp(a)。Ox-Lp(a)对GMCs的作用呈剂量依赖性和时间依赖性,小剂量时刺激GMCs的增生,大剂量则表现为细胞毒作用。Ox-Lp(a)明显影响大鼠GMCs 的ICAM-1表达,GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。提示Ox-Lp(a)对肾小球系膜细胞的作用可能与ICAM-1有关。

【关键词】  脂蛋白(a);脂蛋白氧化;系膜细胞;增生细胞

  Regulation of intercellular adhesion molecule-1 expression on murine glomerular mesangial cells by Oxidized lipoprotein(a).

  XIANG Wei, HE Xiao-jie, XIE Hui-neng, et al.

  1. Department of Peadiatrics, Hainan Provincial People's Hospital, Haikou 570311, Hainan, P.R. China
   
  Abstract:Objective  To investigate the effects of oxidized lipoprotein(a) [Ox-Lp(a)] on proliferation of glomerular mesangial cells (GMCs) and the experssion of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in rat model induced by lipopolysaccharide, and explore the possible mechanism of Ox-Lp(a) on the proliferation of rat GMCs.  Methods  The effect of Ox-Lp(a) with different doses of  2.5, 5, 10, and 20nmol/L on the proliferation of GMCs was observed. The rats of were divided into three groups: control group, Lp(a) group, Ox-Lp(a) group. After culture (at the end of 12h, 24h, 48h and 60h), the cultured GMCs and suspension were collected for observation of the proliferative rate of GMCs (MTT), the positive rate of proliferationg cell nuclear antigen (PCNA)(immuno-histo-chemisty), and  ICAM-1 activity was determined with ELISA.  Results  At the end of experiment, compared with control and Lp(a) group , MTT, positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were more significantly higher in Ox-Lp(a) group; as for dosage-response, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were increased as Ox-Lp(a) doses increased, a maximal effect was seen for Ox-Lp(a) 5nmol/L group. Alon with the continuous increase[Ox-Lp(a) 10nmol/L], MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity of GMCs were decreased in Ox-Lp(a) group; As for time-response, MTT, the positive rate of PCNA and ICAM-1 activity were increased as Ox-Lp(a) dosage increased, a maximal effect was seen for Ox-Lp(a) cultured GMCs 48h. ICAM-1 activity showed positive correlation with MTT and the positive rate of PCNA.  Conclusion  Ox-Lp(a) can significantly affect the rate of GMCs proliferation, this effect is dosage-dependent and time-dependent. Small dosage can stimulate proliferation of GMCs, bigger dosage inhibit the proliferation of GMCs. Ox-Lp(a) can significantly affect ICAM-1 activity, too. ICAM-1 activity is positively correlated  with MTT and the positive rate of PCNA .This suggests that the effect of Ox-Lp(a) on GMCs might be associated with ICAM-1.
   
  Key words:Lipoprotein(a); Oxidative modificaton of lipoprotein ; Intercellular adhesion molecule-1; MTT ;  Proliferationg cell nuclear antigen; Rat; Glomerular mesangial cells

    已知多数肾脏疾病伴随脂代谢紊乱,且脂质异常能引起或加重肾损伤,是肾小球病变进展的重要危险因素之一[1]。脂蛋白(a)[Lipoprotein(a),Lp(a)]是一种特殊类型的脂蛋白,是冠心病、动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的独立危险因素。研究表明Lp(a)发生氧化后可转变为氧化型Lp(a)[Ox-Lp(a)],其生物学特性可发生明显变化[2]。我们既往研究发现难治性肾病综合征患儿存在血脂代谢紊乱及载脂蛋白E基因多态性的异常,且与Lp(a)相关联[3,4]。已有研究发现Lp(a)在血管内膜下易被氧化[5]。但Ox-Lp(a)对与肾脏疾病进展密切相关的肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMCs)的作用及可能机制尚未见报道。

  1  材料和方法

  1.1  材料

  1.1.1  大鼠GMCs培养[6] 

  从液氮罐内取出大鼠GMCs系,37℃水浴后离心,吸出细胞液,移入细胞培养瓶静置培养,培养液由20%胎牛血清、0.3U/ml胰岛素、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素、2.5mg/L二性霉素及D-缬氨酸改良的伊格尔培养基(Minimum Essential Medium,MEM)组成。培养瓶置于5% CO2、18%O2孵箱内。当系膜细胞长至贴壁时,用0.25%胰蛋白酶与0.04%乙二胺四乙酸二钠等量混合,消化细胞,传代。笫3代时,用RPMI 1640代替D-缬氨酸改良的MEM,其他成分相同。

  1.1.2  天然Lp(a)[n-Lp(a)]分离及Ox-Lp(a)制备[7] 
  通过采用肝素体外LDL沉淀法定期进行LDL血浆置换患者的富含Lp(a)再生液,行超速离心(密度1.065~1.120mg/ml),再予密度梯度离心法分离。获取的 Lp(a) 经150mmolNaCl、1mmol/L EDTA(pH 7.4)于4℃透析48h后,微孔过滤膜除菌,Sephader G 25M 凝胶层析和赖氨酸-seppharose 4B层析纯化,采用0.6%琼脂糖凝胶电泳和4%的SDS-PAGE鉴定并分析纯度。储存备用。加入终浓度为10μmol/ L的CuSO4 37℃温育24h使Lp(a)氧化。在0.01mol/LPBS溶液中透析24h后测定丙二醛浓度作为硫代巴比妥酸反应物质(TBARS) 的浓度。

  1.2  方法

  1.2.1  MTT法测定大鼠GMCs增生率 

  将GMCs种入96孔板中,2×104个细胞/孔,分对照组、Lp(a)组、Ox-Lp(a)组共3组,Ox-Lp(a)组分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48 h、60h。Lp(a)组加入n-Lp(a)(5nmol/L,作用12h),不加任何刺激因素作为空白对照组。实验末分别测定GMCs增生率。细胞增生率=(LPS组吸光度-实验组吸光度)/LPS组吸光度。

  1.2.2  GMCs中增生细胞核抗原(Proliferationg cell nuclear antigen,PCNA)表达的测定 

  GMCs分瓶培养,实验末,收集培养细胞,涂片,丙酮固定,免疫组化法测定PCNA表达。实验结果在显微镜下观察,分别计数每张涂片中的5个视野内(200个/每视野)GMCs的免疫染色阳性细胞数,计算其阳性率。

  1.2.3  细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的测定

  采用ELISA法(试剂盒购自南京建成生物工程有限公司)。

  1.3 统计学分析 

  所有计量资料均采用均数±标准差表示,组间比较采用t检验或方差分析,并行相关分析。以P<0.05为有统计意义。

  2 结果

  2.1  Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的时间效应 

  见表1,在对照组、Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组[终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48h、60h],GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量均有明显变化,经F检验,差异有显著性(P<0.01)。表1  Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的时间效应(略)
   
  与Lp(a)组比较,Ox-Lp(a)12h组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,两两之间的q检验,差异有显著性(P<0.01)。
   
  在Ox-Lp(a)各亚组,随着处理时间的延长,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势,Ox-Lp(a)24h组高于12h组,Ox-Lp(a)36h组高于24h组,Ox-Lp(a)48h组高于36h组,Ox-Lp(a)48h达到高峰,Ox-Lp(a)60h组出现下降,低于Ox-Lp(a)48h组,经两两之间的q检验,除Ox-Lp(a)48h与36h组的MTT,Ox-Lp(a)48h与60h组的培养上清ICAM-1含量无统计学差异外,余差异均有显著性(P<0.01)。

  2.2  Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的剂量效应 

  见表2,在对照组、Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组[终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h],GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量均有明显变化,经F检验,差异有显著性(P<0.01)。表2  Ox-Lp(a)对GMCs增生及ICAM表达影响的剂量效应(略)
   
  与Lp(a)组[终浓度5nmol/L的n-Lp(a),作用12h]比较,Ox-Lp(a)2.5nmol/L作用12h,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,差异有显著性(P<0.01)。
  
  在Ox-Lp(a)各亚组,随着Ox-Lp(a)浓度的增加,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化,Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降,低于5nmol/L组,20nmol/L低于10nmol/L组,经两两之间的q检验,差异均有显著性(P<0.01)。

  2.3 相关性分析 

  从剂量效应来看,n-Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组[终浓度2.5、5、10、20nmol/L的ox-Lp(a)作用12h]PCNA阳性率及培养上清ICAM-1浓度与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关[相关系数从0.68~0.92,P均<0.01]。
   
  从时间效应来看,n-Lp(a)组及Ox-Lp(a)各亚组[终浓度5nmol/L的ox-Lp(a)作用12h、24h、48h、60h]PCNA阳性率及培养上清ICAM-1浓度与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关[相关系数从0.74~0.86,P均<0.01]。

    ICAM-1与PCNA阳性率相关性分析:从剂量效应来看,培养上清ICAM-1浓度与PCNA阳性率呈正相关[相关系数从0.78~0.94,P均<0.01]。从时间效应来看,培养上清ICAM-1含量与PCNA阳性率呈正相关[相关系数从0.81~0.96,P均<0.01]。

  3 讨论

    随着肾替代治疗的进展,肾脏疾病患者长期生存率的提高,终末期肾病(ESRD)发病率逐渐增高,从而引起人们对慢性肾功能不全的病理生理和治疗的关注。近年来研究表明肾小球硬化与AS在组织形态上的改变及发病机制上存在相似性。GMCs增殖在肾小球硬化中扮演了极其重要的作用[1,8]。系膜细胞增殖和细胞外基质分泌增多是肾小球硬化最重要的前期表现之一。系膜细胞增殖的机制尚不十分清楚,可能与多种因素有关,脂质代谢紊乱也与其密切相关[1,8,9]。动物实验已证实低密度脂蛋白能直接刺激GMCs增殖和基质增多致肾小球硬化形成[9]。
   
  Lp(a)是1963年由Berg利用免疫方法发现的一种新的脂蛋白,其密度在低密度脂蛋白和高密度脂蛋白之间,为1.050~1.100g/ml。Lp(a)与低密度脂蛋白相比,在化学结构上十分相似,含有类似的脂质核心和载脂蛋白B,但比低密度脂蛋白多含一个载脂蛋白(a),二者之间以二硫键结合,此在其他任何脂蛋白中都不存在。Lp(a)的密度比低密度脂蛋白大(1.065g/ml),颗粒也稍大(25.0nm),Lp(a)与低密度脂蛋白不一样,不是由中间密度脂蛋白在肝脏内转化而来,也不能转化为其他的脂蛋白,系一类独立的脂蛋白[10]。Lp(a)已被认为是心脑血管AS及动脉再狭窄的独立危险因素,Lp(a)和纯化的载脂蛋白(a)可促进平滑肌细胞生长,而此为AS病灶产生的重要事件之一。并且Lp(a)对血液纤维蛋白的溶解有一定影响,Lp(a)可明显增加α-抗纤维蛋白溶解酶的抑制作用,而间接影响纤维蛋白溶解酶原的活性,有促血栓形成的作用,估计也参与了AS的形成。血浆Lp(a)水平升高是肾脏疾病和终末期肾病的共同特征,并加速肾功能的丧失,提示Lp(a)可能与肾脏疾病的发生发展密切相关[8]。本研究发现与对照组比较,Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,差异有统计学意义,提示Lp(a)能明显影响肾脏系膜细胞的增生。

    脂蛋白氧化修饰是近年来的研究热点,已观察到体外Lp(a)可发生氧化修饰,初步研究提示Ox-Lp(a)的生物学作用明显大于未氧化修饰的Lp(a)。Lp(a)在体内被氧化修饰后,易被巨噬细胞-清道夫受体识别和摄取,导致细胞内胆固醇酯的蓄积及泡沫细胞的形成,损伤组织细胞,参与AS的病理过程。有研究发现Ox-Lp(a)能诱导内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白1α表达增强,而n-Lp(a)表达不明显[7]。本研究发现与Lp(a)比较,Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,且Ox-Lp(a) 2.5nmol/L作用高于终浓度5nmol/L的n-Lp(a)。提示Lp(a)发生氧化修饰后,其生物学作用可发生明显变化。

    MTT是目前检测细胞增生程度的一种常用方法,代表与实验前相比细胞增生了多少。PCNA是一种细胞周期调控蛋白,是细胞增殖时所需要的DNA聚合酶辅助蛋白,通常用来作为判断肾脏疾病细胞增生的标志物,也是反映细胞增生的一种指标,与MTT结合能更准确的反映细胞增生程度。我们研究发现随着Ox-Lp(a)浓度的增加,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率呈明显变化,Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降,低于5nmol/L组,20nmol/L低于10nmol/L组,差异有统计学意义。随着处理时间的延长,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率呈上升趋势,Ox-Lp(a)24h组高于12h组,Ox-Lp(a)36h组高于24h组,Ox-Lp(a)48h组高于36h组,Ox-Lp(a)48h达到高峰,Ox-Lp(a)60h组出现下降,低于Ox-Lp(a)48h组。相关性分析发现从时间效应来看,PCNA阳性率与反映系膜细胞增生指标的MTT呈正相关,从剂量效应来看,PCNA阳性率与MTT也呈正相关。以上结果说明Ox-Lp(a)能明显影响肾脏系膜细胞的增生,作用呈剂量依赖性及时间依赖性,小剂量时刺激系膜细胞的增生,大剂量则表现为细胞毒作用。
   
  细胞粘附分子是一类能介导细胞间以及细胞与细胞外基质粘附的糖蛋白,粘附分子在AS发病中起着一定的作用。Anne  H等人发现在高胆固醇血症和高甘油三酯血症患者血可溶性ICAM-1水平明显升高。研究发现粘附分子及其粘附机理可能是介导肾炎时细胞浸润和增殖、细胞外基质扩张乃至肾小球硬化的分子基础[11,12]。肾小球MC表面有低表达的ICAM-1[11,12]。

    我们研究发现随着Ox-Lp(a)浓度的增加,GMCs培养上清ICAM-1含量呈明显变化,Ox-Lp(a)5nmol/L组高于2.5nmol/L组,在10nmol/L组出现下降,低于5nmol/L组,20 nmol/ L低于10nmol/L组。随着处理时间的延长,GMCs培养上清ICAM-1含量呈上升趋势,Ox-Lp(a)48h达到高峰,Ox-Lp(a)60h组出现下降。且Ox-Lp(a)组GMCs培养上清ICAM-1含量明显高于Lp(a)组。从时间和剂量效应来看,ICAM-1浓度均与反映系膜细胞增生指标的MTT和PCNA阳性率呈正相关。说明Ox-Lp(a)可能通过ICAM-1而影响系膜细胞增生,此值得进一步研究。
   
  小儿原发性肾小球疾病是临床上常见疾病之一,如其肾小球病变不断加重,最终可导致肾小球硬化、肾功能丧失。现在儿童慢性肾脏疾病/ESRD发病率及病死率不仅与慢性肾损害和肾替代治疗有关,而且与心血管疾病危险因素长期暴露导致心血管疾病的发生有关。心血管疾病现在是成人ESRD死亡的主要原因,也占儿童ESRD死亡的1/4,在儿科ESRD患者,已发现AS的亚临床证据,在动脉内膜出现斑块,在肾移植患儿,髂动脉活组织检查发现AS病变[13]。我们研究发现肾脏疾病常伴随脂代谢紊乱, Lp(a)、Ox-Lp(a)均明显影响肾小球系膜细胞增殖,Ox-Lp(a)生物学活性明显强于Lp(a),此可能与ICAM-1相关联。最终导致肾小球内皮细胞损伤、系膜细胞增殖、肾脏疾病进展乃至肾小球硬化。因此积极处理肾脏疾病伴发的脂质代谢紊乱,阻断ICAM-1的作用,有效控制系膜细胞异常增生,即能延缓肾脏病的慢性进展。

【参考文献】
    目的 探讨氧化型脂蛋白(a)[Ox-Lp(a)]对大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)增生及细胞间粘附因子-1(ICAM-1)表达的影响。方法 分离Lp(a) 并氧化修饰,培养GMCs,分别加入终浓度2.5、5、10、20nmol/L 的ox-Lp(a)作用12h, 终浓度5nmol/L 的ox-Lp (a) 作用12h、24h、48h、60h。采用MTT法测定GMCs增生率,免疫组化法检测GMCs的增生细胞核抗原(PCNA)阳性表达率,酶联免疫法检测培养液上清的ICAM-1浓度。并与加入终浓度5nmol/L的天然Lp(a)[n-Lp(a)]作用12h的Lp(a)组及不加任何刺激因素的空白对照组比较。结果 与对照组比较,Lp(a)组GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。与Lp(a)比较,Ox-Lp(a)刺激后的GMCs MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量明显增高,且Ox-Lp(a)2.5nmol/L 作用高于终浓度5nmol/L的Lp(a)组(P<0.01)。随着Ox-Lp(a)浓度的增加,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈明显变化,Ox-Lp(a)5nmol/L时达高峰,在Ox-Lp(a)10nmol/L组出现下降,20nmol/L明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。随着处理时间的延长,GMCs的MTT增生率、PCNA阳性率、培养上清ICAM-1含量呈上升趋势,48h达到高峰,60h出现下降(P<0.01)。GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关(P<0.01)。结论 Lp(a)、Ox-Lp(a)能明显影响GMCs的增生,Ox-Lp(a)生物学作用强于Lp(a)。Ox-Lp(a)对GMCs的作用呈剂量依赖性和时间依赖性,小剂量时刺激GMCs的增生,大剂量则表现为细胞毒作用。Ox-Lp(a)明显影响大鼠GMCs 的ICAM-1表达,GMCs上清的ICAM-1浓度与MTT和PCNA阳性表达率呈正相关。提示Ox-Lp(a)对肾小球系膜细胞的作用可能与ICAM-1有关。

日期:2013年9月26日 - 来自[2008年第8卷第3期]栏目
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