主题:脊髓

+ 关注 ≡ 收起全部文章

人工神经连接技术 可让脊髓损伤者手脚动起来

脊髓损伤严重者脑部电信号无法传递到手脚,从而导致手足麻痹瘫痪。一个日美研究小组日前报告说,他们在猴子实验中成功发明一种人工神经连接技术,可以迂回绕开脊髓损伤部位传递大脑电信号,让猴子麻痹的手恢复活动功能。 

  日本自然科学研究机构生理学研究所和美国华盛顿大学的研究人员,以一只脊髓受到损伤的猴子为实验对象,对损伤部位以下的脊髓施加电刺激后,发现肌肉发生了反应。研究人员由此确认损伤部位以下的脊髓残留了原有功能。 

  研究小组向这只猴子的大脑皮层和未受损脊髓内植入像头发一样细的电极,并与外部的芯片相连接,芯片能解读、转换脑部电信号。结果发现,在这种连接状态下,猴子能自由用手操纵杠杆。而切断连接后,猴子的手又回到了麻痹状态。 

  研究人员西村幸男说,将来如果研制出适宜植入体内的芯片,通过这种技术将有望使脊髓损伤患者自主控制手脚活动。 

 

 

日期:2013年4月17日 - 来自[神经科]栏目

嗅鞘细胞移植后脊髓挫伤大鼠几种神经营养因子的表达变化

【摘要】  目的 探讨嗅鞘细胞移植脊髓挫伤大鼠后,在其神经损伤及修复过程中三种神经营养因子(脑源性神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子)的表达变化及意义。方法 体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞。40只健康SD大鼠,雌雄不拘,在移植前一星期使用NYU撞击机,利用10g25 mm的致伤力,制作T10脊髓挫伤模型。40只脊髓挫伤大鼠随机分为OECs移植组和对照组(注射无血清培养液组),又根据取材时间不同分为术后1天、7天、14天、21天组。动物处死前进行BBB评分评估后肢运动功能的变化。取手术部位头端和尾端0.5cm脊髓,采用免疫组织细胞化学染色检测技术检测三种神经营养因子(BDNF、CNTF、NGF)在各组脊髓中的表达变化。结果 行为学评分随着损伤时间的推移呈小幅度增加,但后肢无运动功能恢复;免疫组织化学检测显示,嗅鞘细胞移植能部分改善大鼠脊髓灰质神经细胞的凋亡程度,延缓白质神经纤维的减少,促进髓鞘的修复与再生。与对照组比较,嗅鞘细胞移植治疗后脊髓组织中三种神经营养因子表达明显增加(P<0.05)。结论 嗅鞘移植能够部分改善脊髓损伤后脊髓组织的病理形态,促进脊髓组织中多种神经营养因子的表达。

【关键词】  OECs;移植;神经营养因子

 Abstract:Objective To investigate the expression of three neurotrophic factors(brainderived neurotrophic factor,ciliary neurotrophic factor,nerve growth factor)in rats with spinal cord contusion following olfactory ensheathing cell transplantation.Methods The OECs were dissociated from the olfactory bulbs of the adult GFP rat,primarily cultured.Forty clean adult Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into OECs transplantation group and control group(DMEM transplantation),two groups were subdivided into four groups,with the rats sacrificed 1,7,14 and 21 days after the operations(day of postoperation,DPO),respectively.The spinal cords of all the rats were completely contused at T10 by NYU with 10g~25 mm.The Basso,Beattie and Bresnahan locomotor testing scales(BBB scores)were used to evaluate the locomotor function of hindlimbs of the rats.The expressions of three neurotrophic factors in the spinal cords were detected with immunohistochemistry technique.Results The BBB scores increased gradually with the time after the spinal cord injury.But the hindlimb locomotor function did not improve significantly.Immunohistochemistry result showed that OECs transplantation could partly reduce the number of apoptosis cells in spinal gray matter,delay cells reduction in spinal white matter,and accelerate the medullary sheath repair and regeneration.The expression of three neurotrophic factors(BDNF、CNTF、NGF)in spinal cord tissue after transplantation were obvious increased than that of DMEM/Ham’s F12 group(P<0.01).Conclusion OECs transplantation can partly improve the pathology morphous of injured spinal cord,facilitate the expression of three neurotrophic factors.

  Key words:OECs;transplantation;neurotrophic factors

  嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)位于嗅觉中枢和周围神经系统的过渡区,兼有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统雪旺氏细胞的特点[1,2],在嗅神经轴突生长发育过程中发挥重要作用;同时,因其能够促进多种中枢神经系统神经元存活和轴突生长[35],对中枢神经系统损伤的修复作用日益受到广泛关注。目前认为,嗅鞘细胞促进神经元存活和轴突生长的功能部分源于嗅鞘细胞分泌的多种营养因子和支持因子[6],如神经生长因子(nerve growth factor,NGF),脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophicfactor,BDNF),胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)等。BDNF、CNTF、NGF作为神经系统三种最重要的生物活性因子,它们不仅能促进神经元的生长、发育、分化,而且具有神经保护作用,在神经损伤修复过程中发挥重要作用[7]。本实验经原代培养纯度较高的GFP嗅鞘细胞,然后将其移植入T10挫伤大鼠脊髓;再采用免疫组织细胞化学方法对大鼠脊髓挫伤后不同时间点几种神经营养因子在脊髓中的表达变化进行分析,并观察动物行为学的改变,探讨其在SCI修复过程中的作用,以期为临床治疗用药和治疗时机提供理论依据。

  1 材料和方法

  1.1 实验动物、 主要试剂和仪器

  清洁级成年SD大鼠40 只,雌雄不拘,体质量(290±25)g.我院所实验动物中心提供。SP免疫组化试剂盒( 北京中杉金桥);DAB染色剂(北京中杉金桥);显微镜(日本奥林巴斯)。

  1.2 嗅鞘细胞纯化培养及纯度鉴定

  按照张洁元等[8]的方法进行。无菌条件下取2.5月龄的GFP大鼠嗅球最外两层,经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM /F12培养基中。采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养。在培养第14天行S100 和神经生长因子受体(NGFRp75)的免疫细胞化学染色鉴定,并计算嗅鞘细胞的纯度。

  1.3 大鼠脊髓挫伤模型的建立及嗅鞘细胞移植

  实验大鼠用ketamine/xylazine(90/4mg/kg,i.p.)麻醉后,背部脱毛、消毒,逐层切开皮肤和肌肉,暴露T10椎板,然后予以咬除显示脊髓,彻底止血后使用NYU撞击机,利用10g25 mm的致伤力,制作T10脊髓损伤模型。动物随机分为两组,每组20只。移植组(注射细胞组 ):损伤后在立体定位仪下用微量加样器(Hamilton)连接的玻璃针立即将准备好的细胞悬液注射到挫伤处头、尾两侧1.0 mm、距中线0.5 mm处。注射深度分别为1.75,1.25和 0.75mm,每点在约3060 s内注射1.5μl,另在横断处注射2处,注射深度为1.25 mm,每处1.5μl,共注射7.5μl.对照组(注射无血清培养液组 ):方法同移植组。

  1.4 行为学测试

  采用BBB评分体系[9]。实验动物按照组别在术后 1 d、7 d、14 d、21d 测定。观察前排空膀胱,以免影响大鼠活动,而后将动物置于平坦不滑的实验台上,观察 4 min,对动物的躯体定位及后肢功能进行行为学评分。小于4分为无运动功能恢复,正常运动功能为21 分,评分者为熟悉评分标准的非本组实验人员,3人评分后取平均值。观察时间根据大鼠的活动习性定在20:00 左右。

  1.5 标本处理和免疫组织细胞化学染色检测

  1.5.1 取材

  大鼠麻醉后俯卧固定,切开背部皮肤和脊柱两侧肌肉,咬骨钳咬开椎板,充分暴露脊髓,眼科剪剪取手术部位头端0.5,尾端0.5cm,装入1.5ml EP管,投入液氮中速冻,后转移到70℃冰箱保存。

  1.5.2 运用免疫组织化学法观察各组脊髓组织中几种神经营养因子的表达与分布

  取出冰冻切片,风干。 新鲜0.3%H2O2室温10min 以灭活内源性酶。PBS浸泡3×3 min. Proteinase K 200∶1消化切片30 min.PBS浸泡3×3 min.滴加5%BSA封闭液,室温 20 min.甩去多余液体,不洗。加NGF或 BDNF或CNTF 一抗(稀释度1∶200)置湿盒中,37 ℃,30 min.PBS 浸泡 3×3 min,滴加生物素二抗,置湿盒中,37 ℃,10 min.PBS浸泡3×3 min,滴加SABC,置湿盒中,37℃,20 min.PBS 浸泡3×3 min,DAB显色。苏木精轻度复染,脱水,透明,封固。用 Zeiss荧光显微镜观察照相,每张切片取损伤边缘头侧、 尾侧和对侧 3个视野拍照。10×10放大倍数下每张照片实际面积为1.44 mm2;10 ×20倍数下为0.40 mm2。面积测量借助显微目镜测量尺进行。

  1.6 实验数据分析

  图片采用Image Pro 5.0系统做图像分析,所得各组数据用±s表示;细胞移植组与对照组的数据比较用分组 t检验,统计分析软件采用SPSS13.0,数据导入 origin75作图。P<0.05表示差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 脊髓挫伤后不同时间的行为学测试结果

  各组与正常组评分比较差异显著(P<0.01),说明造模后大鼠的神经功能均受到损害。随着时间的推移,OECs组大鼠的BBB 评分缓慢提高,但评分值提高不大,到第三周(21天)尚未达到运动功能的恢复,但嗅鞘细胞组与模型组、DF12培养液组相比差异显著(P<0.05),说明造模后采取措施有助于神经功能的恢复(见图1)。

  2.2 脊髓挫伤后三种神经营养因子的表达变化

  三种神经营养因子经免疫组化染色后阳性呈棕黄色,神经元阳性染色见于细胞浆或边聚于细胞膜内侧,胶质细胞则分布在细胞核中,神经纤维阳染均匀分布在整个纤维中,成片状。正常组脊髓灰、白质均有极少量神经营养因子表达,散见于整个横截面,以灰质稍多见,阳性染色多分布于纤维上,纤维排列整齐,可见少数几个星型细胞染色。OECs移植后三种神经营养因子表达大量增加,脊髓挫伤处的周边组织均可见三种营养因子表达。移植组三种营养因子的表达都明显高于对照组(P<0.05),且OECs移植后21天三种神经营养因子的表达都还明显高于对照组(见图 2)。正常对照组(BDNF) DMEM移植组21天(BDNF) OECs移植组21天(BDNF)正常对照组(CNTF) DMEM移植组21天(CNTF) OECs移植组21天(CNTF)正常对照组(NGF) DMEM移植组21天(NGF) OECs移植组21天(NGF)图2 各组脊髓组织三种神经营养因子免疫组化(×400)图1 各组脊髓功能CBS 评分

  3 讨论

  脊髓挫伤是研究脊髓损伤修复的重要模型之一,我们所采取的模型制作方法,术后脊髓有明显的血肿,术后8 d行为学测试肢体无功能恢复,挫伤明显,效果可靠。从 BBB 评分的数据上我们可以看出随着时间的推移,评分增加,这一过程中微环境中的各种营养因子可能起到了重要的作用,实验证据也表明给予营养因子的治疗后,大鼠的运动功能会有所改善[10]。未给予治疗的脊髓挫伤大鼠术后两周BBB评分仍然没有达到4分,后肢功能仍未恢复,这说明微环境中既有损伤修复的促进因素也有抑制因素,因此深入研究损伤后各因子的变化和作用有着重要的意义。

  OEC移植入成年大鼠的脊髓损伤处能促进功能的恢复和轴突的再生,形态学观察到它们桥接在损伤导致的空洞处,促进轴突穿过病变区,并且形成髓鞘围绕再生的或脱髓鞘的轴突,来增强轴突的传导性[11],但其作用机制还不清楚,推测嗅鞘细胞能合成某些特殊的细胞外基质和营养因子来支持轴突的黏附和生长。

  很多神经营养因子已被报道在脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后对神经有保护作用。CNTF mRNA在脊髓半横断损伤后 13天增加,然后在 1014天后降低[12]。另外,Lee等[13]发现脊髓半横断后,CNTF在术后 7天达到最大值,然后在14天降低到基线水平。脊髓损伤后,FGF2最早在 6 h内增加,在 7天后还很明显。增加的 FGF2主要局限在损伤的中心部位,7天后仅仅在损伤位置的头侧端可见。这些营养因子的持续表达可能对组织的修复有很重要的作用。但是嗅鞘细胞移植后对脊髓组织的神经营养因子表达影响的研究报道较少。在本实验中,我们观察到嗅鞘细胞移植后,脊髓内这三种因子的表达增强,尤其在移植 21天后表达还明显高于对照组。一方面,移植的嗅鞘细胞在体内表达BDNF、CNTF及NGF;另一方面,OECs移植后,脊髓本身组织表达的这三种营养因子也增强。这三种营养因子在脊髓的表达增强可能对脊髓的神经元、少突胶质细胞以及星型胶质起了重要的保护作用。

【参考文献】
   [1] LopezVales R,Fores J,Navarro X,et al.Olfactory ensheathing glia graft in combination with FK506 administration promote repair after spinal cord injury[J].Neurobiol Dis,2006,24:443454.

  [2] Franssen EH,De Bree FM,Essing AH,et al.Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing glia and Schwann cells indicates distinct tissue repair characteristics of olfactory ensheathing glia[J].Glia,2008,56:12851298.

  [3] Radtke C,Sasaki M,Lankford KL,et al.Potential of olfactory ensheathing cells for cellbased therapy in spinal cord injury[J].J Rehabil Res Dev,2008,45:141152.

  [4] Wewetzer K,Brandes G.Axonal signalling and the making of olfactory ensheathing cells:a hypothesis[J].Neuron Glia Biol,2006,2:217224.

  [5] Pastrana E,MorenoFlores MT,Avila J,et al.BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons[J].Neurochem Int,2007,50:491498.

  [6] Woodhall E,West AK,Chuah MI.Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor,brainderived neurotrophic factor,glia cell linederived neurotrophic factor and their receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(1/2):203213.

  [7] Cao L,Su Z,Zhou Q,et al.Glial cell linederived neurotrophic factor promotes olfactory ensheathing cells migration[J].Glia,2006,54:536544.

  [8] 张洁元,段朝霞,陈莉华,等.年轻成年GFP大鼠溴鞘细胞的分离培养与形态学特征[J].中华神经医学杂志,2010,9(5):456459.

  [9] Basso DM,Beattle MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurot rauma,1995,12(1):1221.

  [10] Lu P,Jones LL,Tuszynski MH.BDNFexpressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury[J].Exp Neurol,2005,191(2):344360.

  [11] Lu J,Feron F,MackaySim A,et al.Olfactory ensheathing cells promote locomotor recovery after delayed transplantation into transected spinal cord[J].Brain,2002,125:1421.

  [12] Nakamura M,Bregman BS.Differences in neurotrophic factor gene expression profiles between neonate and adult rat spinal cord after injury[J].Exp Neurol,2001,169(2):407415.

  [13] Lee MY,Kim CJ,Shin SL,et al.Increased ciliary neurotrophic factor expression in reactive astrocytes following spinal cord injury in the rat[J].Neurosci Lett,1998,255(2):7982.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第3期]栏目

嗅鞘细胞移植到损伤脊髓存活时间的研究

【摘要】  目的 观察植入损伤脊髓的自发绿色荧光的嗅鞘细胞(green fluorescent proteinolfactory ensheathing cells,GFPOECs),研究移植后嗅鞘细胞的存活时间。方法 用酶消化法分离培养来自2.5月龄的绿色荧光蛋白转基因大鼠嗅球最外层的嗅鞘细胞,培养第10天,用显微外科技术将嗅鞘细胞移植到脊髓挫伤后的T10节段,对照组移植术后未作特殊处理,实验组移植术后腹腔注射环孢菌素A,两组分别在移植术后1、2、4、8周取材,观察细胞植入损伤脊髓后存活情况。结果 对照组在移植术后2周内可见存活的嗅鞘细胞;实验组在移植术后4周仍可见存活的嗅鞘细胞,8周未见存活的嗅鞘细胞。结论 嗅鞘细胞移植后存活时间小于8周。

【关键词】  嗅鞘细胞;GFP;脊髓损伤;存活

 Abstract:Objective To observe the green fluorescent proteinolfactory ensheathing cells(GFPOECs),and study the survival of olfactory ensheathing cells.Methods Outermost olfactory ensheathing cells were isolated from the olfactory bulbs of adult green fluorescent protein transgenic rats,OECs were cultured by enzyme digestion.On the 10th day of culture in the medium,the cells were transplanted into contusion area of the 10th thoracic segment of spinal cord in SD rat with microsurgical technique.After transplantation,cyclosporin was injected intraperitoneally to the rats in the experimental group,and the rats in the control group did not receive any treatment.The GFPOECs in the injured spinal cord were observed with fluorescent light microscopes after 1 week,2 weeks,4 weeks,and 8 weeks.Their survival was observed.Results Strong green fluorescence staining of GFPOECs were observed in the control rats after 2 weeks’ transplantation.In experimental rats,strong green fluorescence staining of GFPOECs were observed even after 4 weeks’ transplantation,but were not observed in 8 weeks’ translantation.Conclusion Transplant OECs cannot survive beyond 8 weeks.

  Key words:olfactory ensheathing cells;green fluorescent protein;spinal cord injury;survival

  嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种特殊的胶质细胞,能促进嗅神经再生,引导无髓鞘嗅神经轴突从外周嗅粘膜上皮出发,穿过筛板,进入嗅球,使嗅神经终身具有再生性[1]。OECs分泌许多神经营养因子[2,3],如神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brainderived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cellderived neurotrophic factor,GDNF),神经营养因4/5(neurotrophin4/5,NT4/5)和神经调节蛋白(neuregulin,NRG)。OECs独特的生物学特性引起了众多学者的兴趣,目前,对OECs移植修复作用的研究颇多,但对其移植后存活的研究报道较少,或者结论不统一。本研究以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因大鼠为供体,观察其嗅球OECs植入挫伤脊髓后的存活情况,从而为其在移植修复中的作用提供细胞学参考。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物

  2.5月龄清洁级GFP转基因大鼠,体重(220±15)g.2.5月龄清洁级普通SD大鼠,体重(220±15)g(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)。所有动物的饲养和处理均按第三军医大学动物管理委员会的规定进行。

  1.1.2 主要仪器设备、试剂

  DMEM/F12培养基(GIBCO,美国);胎牛血清(FCS,GIBCO,美国);Forskolin(INVITROGEN,美国);碱性成纤维生长因子(bFGF,INVITROGEN,美国);多聚左旋赖氨酸(polyllysine,SIGMA,美国);胰蛋白酶(GIBCO,美国);小鼠抗大鼠S100蛋白抗体(S100,武汉博士德);兔抗神经生长因子受体多克隆抗体(NGFR p75,武汉博士德);TRITC标记的山羊抗兔IgG(武汉博士德);FITC标记的山羊抗小鼠IgG(武汉博士德);Hoechst33342(SIGMA,美国)。NYU撞击机(美国);立体定位仪(ST7,日本)。

  1.2 实验方法

  1.2.1 OECs的原代培养

  3%戊巴比妥钠致死剂量(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,断头,消毒后无菌环境下迅速取出GFP转基因大鼠双侧完整嗅球。剪去嗅球尾侧1/3,取头侧2/3置于4℃预冷的DHanks液中(青、链霉素各100 U/L)。用显微外科器械在解剖显微镜下仔细剥除包被嗅球的软脑膜及附着的毛细血管,沿纵轴方向剖开嗅球,剥除嗅球内部的白质层,将分离得到的外部灰质层,即嗅球纤维层和嗅小球层,用眼科弯剪剪碎至1 mm大小组织块,0.125%胰蛋白酶37℃消化20 min.巴氏滴管小心吸取消化后的组织块,移至加有3 ml DFF20(DMEM/F12/20% FCS)全培养液的培养皿中终止消化,5 min后,移至加有3 ml DFF20全培养液的离心管内,用经火焰抛光的巴氏滴管吹打1520次,使组织块分散成单细胞悬液,静置5 min后收集上层细胞悬液。接种于包被多聚左旋赖氨酸(10 μg/ml)的6孔培养板内,置于37℃、5% CO2孵箱中培养。培养3 d后,用添加有Forskolin(100 mg/l)和bFGF(0.01 mg/l)的DFF20全培养液半量换液一次,以后每23天全量换液1次。培养第10天,植入损伤脊髓。

  1.2.2 GFPOECs移植

  制备GFPOECs悬液:用酶消化法将培养10 d的GFPOECs制成单细胞悬液,细胞浓度为3×105个/μl.

  建立脊髓T10挫伤模型:取SD大鼠,3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手术台,备皮,碘伏消毒皮肤,酒精脱碘,铺无菌巾,无菌条件下暴露脊髓T10节段,置于NYU撞击机固定,以10g、25mm致伤力挫伤脊髓。

  移植GFPOECs:将脊髓挫伤后的SD大鼠置于立体定位仪固定,用玻璃微电极吸取细胞悬液,注入损伤部位及其首尾侧各1 mm处,每处注射1 μl,共计3 μl,注射深度1 mm,留针1 min,随后缝合肌肉、皮肤各层,移植术后将动物分为两组:环孢菌素A组,移植术后每天腹腔注射环孢菌素A(cyclosporin,CsA)(10 mg/kg);非环孢菌素A组,术后未注射环孢菌素A.动物术后均与揉压排尿和抗感染护理,两组动物于移植术后1、2、4、8周麻醉后开胸暴露心脏,经主动脉灌注生理盐水200 ml,4%多聚甲醛400 ml,取出移植部位脊髓置相同固定液继续固定2 h,制作15 μm厚冰冻切片,于荧光倒置显微镜下观察GFPOECs.

  2 结果

  2.1 非环孢菌素A组

  此组动物移植术后1、2周取材,制成冰冻切片,于荧光显微镜下损伤的脊髓处可见自发绿色荧光的OECs(图1A、B),移植术后4周,损伤的脊髓处未见绿色的OECs(图1C)。

  2.2 环孢菌素A组

  此组动物移植术后1周、2周、4周取材,制成冰冻切片,于荧光显微镜下损伤的脊髓处可见自发绿色荧光的OECs(图2AC),移植术后8周,损伤的脊髓处未见绿色的OECs(图2D)。

  3 讨论

  GFP作为标记物,被广泛应用于细胞移植的研究领域,GFP转基因动物分离得到的细胞标记稳定,且不影响或很少影响细胞的正常功能,是细胞移植研究最为理想的工具[4]。本实验从GFP转基因动物分离得到自发绿色荧光的嗅鞘细胞,存活的嗅鞘细胞在蓝色荧光下呈肉眼可见的绿色,具有观察简单、避免假阳性等优点。

  移植物存活时间一方面取决于移植物本身,另一方面取决于移植排斥反应的强弱。引起移植排斥反应的抗原称为移植抗原或组织相容性抗原,能引起强烈排斥反应的抗原称为主要组织相容性抗原(MHC抗原),供、受者间MHC型别差异是发生急性排斥反应的主要原因[5]。OECs高表达MHCⅠ分子,中等表达MHCⅡ分子[6],MHC分子与抗原肽形成抗原肽/MHC分子复合物供T细胞识别,活化的T细胞可直接杀伤表达异型抗原的移植物细胞,环孢菌素A是一种不溶性的真菌代谢产物,含有11个氨基酸的环状多肽,能有效地抑制T细胞介导的细胞免疫反应,使T细胞的扩增和分化受阻,环孢菌素A是一种抗有丝分裂和抗炎双重效应的高效免疫抑制剂。急性排斥反应一般在移植术后数天至2周左右出现,本实验未注射环孢菌素A组细胞存活时间只有2周,注射环孢菌素A组细胞移植后4周仍存活,说明OECs移植到脊髓存在排斥反应,而细胞移植后8周,未见绿色荧光的OECs,说明GFPOECs死亡,不能表达绿色荧光蛋白。因此,OECs存活时间大于4周但小于8周,OECs移植后不能长期存活,避免给机体带来不良后果,比如“异位”占位,肿瘤等。图1 非环孢菌素A组嗅鞘细胞移植后图2 环孢菌素A组嗅鞘细胞移植后

【参考文献】
   [1] RamónCueto A,Avila J.Olfactory ensheathing glia:properties and function[J].Brain Res Bull,1998,46(3):175187.

  [2] Woodhall E,West AK,Chuah MI.Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor,brainderived neurotrophic factor,glia cell linederived neurotrophic factor and their receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(12):203213.

  [3] Lipson AC,Widenfalk J,Lindqvist E,et al.Neurotrophic properties of olfactory ensheathing glia[J].Exp Neurol,2003,180(2):167171.

  [4] Mothe AJ,Kulbatski I,van Bendegem RL,et al.Analysis of green fluorescent protein expression in transgenic rats for tracking transplanted neural stem/progenitor cells[J].J Histochem Cytochem,2005,53(10):12151226.

  [5] 龚非力.医学免疫学[M].第2版.北京:科学出版社,2004.

  [6] 梅爱农,朱鹏立,杨津,等.大鼠嗅鞘细胞免疫抗原分子检测[J].神经病与精神病学,2010,5(1):3538.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第3期]栏目

无骨折脱位颈脊髓损伤的手术治疗

【摘要】  目的 探讨无骨折脱位型颈脊髓损伤的手术策略及治疗效果。方法 根据影像学表现的不同,对26例无骨折脱位型颈脊髓损伤患者分别采用前路减压植骨融合内固定或后路单开门椎管扩大成形术,术前、术后采用Frankel分级和JOA17分法评价临床疗效。结果 术后Frankel分级较术前明显改善。术前JOA评分为(5.3±2.5)分,术后随访末次JOA评分为( 12.2±3.7)分,改善率为59 %,有统计学意义( P<0. 01)。结论 对无骨折脱位型颈脊髓损伤, 根据患者的不同特点, 有针对性地选择手术方式, 可以获得较好的临床结果。

【关键词】  颈椎; 无骨折脱位; 脊髓损伤; 手术

   Surgical Treatment of Cervical Spinal Cord Injury without Fracture and Dislocation

    ZHAO Bing, CUI Yikun, CHEN Lijiang, YIN Zhenyu

    (Department of Spine Surgery,Mianyang Center Hospital,Sichuan Mianyang 621000,China)

    【Abstract】  Objective To evaluate the surgical treatment and its clinical outcomes of cervical spinal cord injury without fracture and dislocation. Methods Twentysix cervical spinal cord injury patients without fracture and dislocation were performed posterior unilateral opendoor laminoplasty or anterior spinal decompression and reconstruction individually . The selection of the surgical procedure was based on the appearance of radiography. Neurological function (Frankel grade and JOA scoring system) were evaluated before and after operation. Results No severe vascuneurological complication occurred. The Frankel grade was improved significantly after operation compared with that of before operation. The preopevative and postoperative JOA score were 5.3±2.5 and 12.2±3.7 respectively. The improvement rate was 59 %. Conclusion Cervical spinal stenosis and cervical vertebra degenerative are the main pathological basis to cervical spinal cord injury without fracture and dislocation. Surgical treatment could achive an efficient outcome as long as the surgical procedure is selected correctly.

    【Key words】  cervical vertebra;  no fracture dislocation;  spinal cord injury;  operation

    随着人口老龄化的到来及交通事故等意外伤害的增加,无骨折脱位颈脊髓损伤在临床并不少见。随着对该类损伤研究的深入,大多数作者主张手术治疗。2001年7月~2008年4月我院共收治无骨折脱位型颈脊髓损患者 26 例,根据受伤机制及影像学表现的不同,分别选用了后路单开门椎管扩大成形术或前路减压植骨融合内固定术,效果满意,现总结如下。

    1  临床资料

    1.1  一般资料

    本组男性19例,女性7例,年龄38~72岁,平均 57.5岁,年龄小于50岁者2例,其余均在50岁以上。致伤原因:走路跌伤9例,骑自行车摔伤3例,车祸伤7例,坠落伤5例,重物砸伤1例,前额碰壁致伤1例。按受伤机制划分:颈部过伸性伤19例,屈曲性伤5例,受伤机制不明确2例。术前予以颈部制动、激素、脱水等治疗,手术时间在伤后3~37 d,平均7.5 d.

    本组患者中11例(42.3 %)伤前有轻微的颈肩痛或四肢麻木等不适,伤后均有不同程度的脊髓损伤,表现为四肢及躯干不同程度的疼痛、麻木、四肢肌力减退、病理征阳性等上运动神经元损伤体征。其中 19 例患者表现为中央型脊髓损伤,3 例表现为脊髓半截综合证,4 例患者合并单侧上肢及沿神经根性分布的感觉障碍及肌力与反射减弱等下运动神经元损伤表现。

    1.2  影像学资料

    入院后 26 例患者均常规行颈椎正侧位 X 线、CT 及 MRI 检查,未发现有骨折脱位征象。X 线测量发现存在发育性椎管狭窄 8例(椎管/椎体比值<75 %),节段性不稳 5 例[1];颈椎 MRI 示短节段颈椎间盘退变突出使脊髓腹侧受压 4 例,其中单节段 1 例,两个节段者 3 例;颈椎多节段椎间盘突出使脊髓腹背侧受压,蛛网膜下腔狭窄或消失 13 例;脊髓有不同程度的水肿。CT 发现多节段后纵韧带骨化 1 例。

    1.3  手术方法

    术式的选择主要依据影像学显示有无颈椎管狭窄、脊髓受压的节段和部位来决定。对颈椎 1~2 个节段颈椎间盘退变突出使脊髓局限性腹侧受压的 4 例患者,行前路减压植骨融合内固定。对 22 例发育性颈椎管狭窄、多节段退变性颈椎管狭窄、颈椎后纵韧带骨化等造成脊髓腹背侧受压者选择后路单开门椎管扩大成形术,若存在节段性不稳定则行相应节段的门轴部位植骨或结合侧块钢板内固定。

    1.4  术后处理

    颈椎手术围手术期常规治疗与护理, 如激素、脱水、抗炎等。引流管 1~3 d 后拔出, 高压氧治疗 1~2 周,同时应用神经营养药物。引流管拔出后下肢功能恢复者在外固定支架保护下鼓励早日下地活动,术后6个月复查X线片确认骨融合后方可允许患者参加稍剧烈的体育活动或体力劳动。

    2  结果

    2. 1  术后一般情况

    本组 26 例病例随访 10~52 月,平均 27 月。2 例术后出现脑脊液漏,经俯卧、局部压迫或严密缝合等方法治愈;1例在术后24 h发生C5神经根麻痹,肌力II级,采用脱水、激素及神经营养药物治疗恢复到V级;未出现术中脊髓损伤和切口感染的病例。手术患者随访见固定节段均获得骨性融合,内置物无松动或断裂;后路手术患者术后X线正位片显示无再关门现象。

    2. 2  神经功能评价

    伤后脊髓损伤程度按修改后Frankel分级标准,术前分级:A级1例,B级9例,C级12例,D级4例。采用 JOA 17分法对患者进行手术前及手术后随访时的神经功能评价。本组病例术前JOA评分为(5.3±2.5)分,约 90 % 的患者在术后 3 d 内即可观察到神经功能恢复,术后随访末次JOA评分为( 12.2±3.7)分,术后与术前数据差异有统计学意义(P<0. 01)。术后改善率的计算依以下公式:

    改善率=(术后JOA评分术前JOA评分)/(17术前JOA评分)×100 %

    结果显示,术后改善率为 59.0 %.

    3  讨论

    3.1  无骨折脱位颈脊髓损伤的特点及受伤机制

    无骨折脱位型颈脊髓损伤是一种特殊类型的颈脊髓损伤,多见于 50 岁以上的中老年人,本组 26 例中,50 岁以上的有 24例(92.3 %),占了绝大多数。这类损伤的一个共同特点是受伤时头颈部受到外力较小,多数病例为过伸性损伤,如跌伤、摔伤、撞伤等轻微外伤,共19例(73.1 %),与文献报道类似[2,3]。11例病人受伤前有轻微的颈肩痛或四肢麻木不适等症状。此类损伤常为不全性脊髓损伤,Frankel分级 A 级仅1例,其他的均为不全性脊髓损伤。

    病人的影像学检查虽无骨折脱位的征象,但常有颈椎管狭窄及颈椎间盘退行性变,是构成这类损伤的重要病理解剖学基础[4]。本组病例中,存在发育性椎管狭窄 8 例,节段性不稳 5 例,单节段或多节段椎间盘突出 17 例,后纵韧带骨化 1 例。颈椎退变引起的椎间盘突出、椎体后缘骨赘形成、黄韧带肥厚、骨与关节增生、椎间不稳以及颈椎OPLL等因素,可导致颈椎管狭窄。在退变性或发育性颈椎管狭窄的人群中,颈椎椎管储备间隙明显减少,脊髓与椎管前、后壁较接近,脊髓在椎管内无退让余地,MRI表现为脊髓及硬膜囊受压,蛛网膜下腔狭窄或消失。

    颈椎在正常的后伸活动时,由于椎间盘的隆起,黄韧带短缩增厚及皱摺,同时脊髓的缩短、变粗可使椎管矢状径减少 2~3 mm [5]。因此正常颈部后伸就有可能使脊髓在狭窄的椎管内遭受压迫而引起损伤。当颈椎受到外力作用,可使颈椎节段间产生更大的位移,使椎管产生明显变形而冲击或挤压损伤脊髓。Kafadar等[6]研究指出脊髓伤后由于出血、水肿使髓内压升高,最大的压力点是在包围软脊膜区域的中央。随着伤力的增加,脊髓损伤范围由中央管向周边相应扩展,无论伤力来自脊髓何方,中央管受到压力最大,造成的原始和继发性损伤最重,临床上常表现为脊髓中央管周围综合征[7]。

    3.2  手术方式的选择

    无骨折脱位型颈脊髓损伤在过去多采用保守治疗。文献报道[8]保守治疗虽然可以使脊髓功能得到部分恢复,但效果有限,治疗过程中还可能再次加重。

    随着对无骨折脱位型颈脊髓损伤的机制及病理等基础研究的不断深入,多数作者倾向于早期手术治疗。通过手术减压,可以降低脊髓内部压力,改善脊髓的血液循环,避免或减轻脊髓的继发损害,为脊髓功能的恢复创造良好的条件。病程越长,术前再加重比例越高,远期疗效越差,当脊髓功能恢复达“平台期”后,就应当手术治疗。孙宇等[9]研究认为,到达“平台期”的时间平均为 1.8 月,手术时机宜在伤后 2 个月内,最迟不能晚于伤后 1 年,否则将明显影响脊髓功能的远期恢复。

    手术方式分为前路减压植骨融合内固定和后路椎管扩大成形术,具体手术方式的选择主要依据影像学显示脊髓受压的节段和部位、有无颈椎管狭窄等因素决定。本组病例中,对 4 例 1~2 个节段的退变性椎管狭窄、孤立型后纵韧带骨化等造成局限性脊髓腹侧受压者行前路减压植骨融合内固定;对 22 例发育性颈椎管狭窄、多节段退变性颈椎管狭窄、颈椎后纵韧带骨化等造成脊髓腹背侧受压者选择后路单开门椎管扩大成形术。

    颈椎前路减压可以直接解除脊髓前方的压迫,改善脊髓的血液循环,有利于脊髓功能的恢复,植骨融合和钛板固定可获得颈椎即刻和长期的稳定。研究表明[10,11],随着融合节段的增多,骨不连和相邻节段退变的发生率显著增高。因此,尽管前路减压有较好的疗效,但应以短节段为主要适应证。

    后路单开门椎管扩大成形术可有效扩大椎管,根据“弓弦原理”,脊髓向后退让,脊髓前方得到间接减压。Sodeyama等[12]通过CT脊髓造影发现,椎管扩大术后在C5或C6水平脊髓平均后移3 mm,从而有效地间接解除脊髓前方的压迫。通常的减压范围为C3~C7,这样可使脊髓充分后移,避免减压节段过短所致的在减压节段上、下端形成新的甚至更严重的卡压[13]。单开门椎管扩大成形术可有效地保留颈椎的运动节段,对脊柱的稳定性破坏较少,避免前路长节段植骨融合所致的运动丧失和邻近节段退变等方面的并发症[14,15]。本组病例入院后在对症治疗的同时,积极完成围手术期的准备,伤后平均7.5 d接受手术治疗。本组病例无论是前路减压还是后路单开门椎管扩大成形,通过随访发现,术前Frankel分级D级及以上的有4例(15.4 %),术后达 13 例(53.8 %),病人JOA评分由术前的 5.3 增加到 12.2,改善率达 59 %,说明只要手术及时,方式选择得当,对无骨折脱位型颈脊髓损伤手术减压可获得良好的治疗效果。

【参考文献】
  [1] 藏磊,刘忠军,党耕町,等.无骨折脱位型颈脊髓损伤的类型与治疗研究[J].中华创伤骨科杂志,2004, 6(7):781784.

[2] 邓幼文,吕国华,王冰,等.无骨折脱位型颈脊髓损伤的手术策略[J].中国脊柱脊髓杂志,2006, 16(6):413416.

[3] 洪毅, 张庆民, 李想, 等.颈椎管扩大成形术在治疗无骨折脱位型颈脊髓损伤中的作用[J]. 中国脊柱脊髓杂志,2005, 15(2):8386.

[4] Koyanagi I, Iwasaki Y, Hida K, et al. Acute Cervical Cord Injury without Fracture or Dislocation of the Spine Column [J]. J Neurosurg , 2000, 93 (1): 1522.

[5] 王少波,蔡钦林,党耕町,等.无骨折脱位颈椎外伤合并颈脊髓损伤的MRI 表现及其临床意义[J].中国矫形外科杂志,2000, 14 (6) : 531533.

[6] Kafadar A, Gencosmanoglu BE, Hanci M. A Great Misfortune: Second Traumatic Spinal Cord Injury [J]. Spinal Cord, 2002, 40(1): 3739.

[7] Dare AO, Dias MS, Li V. Magnetic Resonance Imaging Correlation in Pediatric Spinal Cord Injury without Radiographic Abnormality[J]. J Neurosurg,2002,97(1 Suppl):3339.

[8] 孙宇,蔡钦林,王少波,等.无骨折脱位型颈脊髓损伤的外科治疗[J].中国脊柱脊髓杂志, 2001, 11(3):139141.

[9] 孙宇,蔡钦林,王立舜,等.无骨折脱位型颈脊髓损伤外科治疗随诊观察[J].中国脊柱脊髓杂志,2002,12(2):9092.

[10] 刘晓岚,刘社庭,罗为民,等.无骨折脱位型颈脊髓损伤的病因与手术疗效观察[J].脊柱外科杂志,2004, 2(5): 272275.

[11] Okada T, Ikata T, Yamada H, et al. Magnetic Resonance Imagine Study on the Results of Surgery of Cervical Compression Myelipathy [J] . Spine,1993,18:2 024 2 029.

[12] Sodeyama T, Goto S, Mochizuki M, et al. Effect of Decompression Enlargement Laminoplasty for Posterior Shifting of the Spinal Cord[J]. Spine, 1999, 24(15) : 1 5271 531.

[13] 沈惠良,曹立,张庆明.单开门椎管扩大成形术治疗脊髓型颈椎病疗效分析[J]. 骨与关节损伤杂志, 2004 , 19 (5) : 289291.

[14] Tsuzuki N, Abe R, Saiki K, et al. Tensionband Laminoplasty of Cervical Spine[J]. Int Orthop,1996,20(5):275284.

[15] 孙宇,潘胜发,陈景春,等.单开门颈椎管扩大椎板成形术对颈椎运动的影响[J]. 中国脊柱脊髓杂志, 2003, 13(4):212215.

日期:2013年2月27日 - 来自[2009年第4卷第2期]栏目

细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

【摘要】    细胞移植治疗脊髓损伤是近年来脊髓损伤修复研究的热点之一。本文综述了采用细胞移植治疗脊髓损伤的研究现状,并提出了笔者的一些见解。本文着重综述了嗅鞘细胞、雪旺细胞和骨髓基质干细胞移植应用于脊髓损伤修复的实验研究,评价了三种细胞移植各自的优缺点,期望为脊髓损伤及其修复的相关研究提供较全面的综合参考资料。

【关键词】  细胞移植;脊髓损伤;嗅鞘细胞;雪旺细胞;骨髓基质干细胞

  The Reseach Progress of Cell Transplantation to Injunied Spinal Cord

    XU Fan1,CHEN jian-min2,ZGANG Xiao2

    (Chengdu medical college,1.Grade 2003 in department of pharmacy;2.Experiment center,Chengdu  610083,China)

    Abstract: Cell transplantation is a new hot focus in the field of spinal cord injury research.In this review,we summarized experimental results that researchers had been acquired on cell transplantation for spinal cord injury.In addition,several comments were made according to our view of points.In general,various cells were mentioned in this review.They are olfactory ensheating cells,Schwann cells and bone marrow stromal stem cells,which were applied to treat spinal cord injury.Their excellences and weaknesses were to provide comprehensive references to relevant researches.

    Key words:cell transplant,spinal cord injury,olfactory ensheathing cells,Schwann cells,bone marrow stromal stem cells

    美国电影<超人>的扮演者Reeve在2004年10月份永远离开了我们。他不幸在9年前的一场马术比赛中,摔伤颈椎,导致高位截瘫。从那时起,他积极地在美国推进干细胞的研究,希望能通过干细胞移植让更多由于脊髓损伤而导致瘫痪的病人重新站立起来。近年来,全世界的科学家都在积极地探索采用细胞移植治疗脊髓损伤的新方法,这使利用细胞移植治疗脊髓损伤取得了长足的进步。本文综述了嗅鞘细胞、雪旺细胞和骨髓基质干细胞等三种应用前景较好的种子细胞在细胞移植治疗脊髓损伤中的研究现状。

    1  嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤

    1.1  嗅鞘细胞的分布和生物学功能

    嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells)直接起源于嗅基板,包裹嗅觉神经束进入嗅球,分布在嗅上皮、嗅神经和嗅球的第一、二层。OECs是一种具有星形胶质细胞和雪旺(Schwann)细胞双重特性的成鞘细胞,其生物学功能极为广泛。

    在体内,嗅鞘细胞具有引导嗅觉系统轴突延长、控制突触的特定靶向的作用[1]。这与嗅鞘细胞的促生长作用密切相关。嗅鞘细胞膜上表达各种与细胞黏合和轴突生长相关的分子,如FNL、tenacisn、laminin及NCM[2,3]等 。此外,嗅鞘细胞还能分泌多种促神经元发育、生长、分化、存活的营养因子,如NGF、NT及BDNF等[2-9]。

    1.2  嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的优越性

    OECs移植到受损脊髓组织后,能引导损伤神经轴突再生和发生髓鞘化作用,还能促进神经轴突穿越脊髓损伤后所形成的胶质瘢痕区。1997年,Li等在Science杂志上发表了“嗅鞘细胞移植诱导成年大鼠皮质脊髓束再生”的研究报告。这是嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的最早报道。此后,许多学者进行了这方面的研究并取得了良好的实验效果。

    Ramon-Cueto等[1]采用脊髓完全横断的方法造成急性脊髓损伤的动物模型,在损伤节段两端分别注入OECs,术后3~7个月观察到,动物的运动功能和感觉反射都有所恢复。动物后肢有自主性运动,能支撑身体重量,后肢轻触觉和本体感觉有恢复。2002年,Li等[10]报道, 通过切断大鼠的单侧上位颈髓造成脊髓损伤,术后立即将培养的OECs悬液移植到损伤脊髓部位。移植后2~7周连续观察动物的运动功能,发现大鼠前后肢的爬行功能明显恢复。移植后2个月,用电生理方法检测膈神经的动作电位变化,发现电位节律是中枢源的。他们的研究表明,OECs移植到受损脊髓后,可以同时恢复前后肢的爬行功能和呼吸功能。Verdu等[11]在大鼠的第8胸髓水平行椎板切除,下位脊髓用玫瑰红浸泡,并用卤素灯照射,造成脊髓损伤模型,然后移植OECs。采用脊髓运动功能评分(BBB评分)比较,发现OECs移植组大鼠的运动功能、躯体感觉比对照组强。抗GFAP的免疫组化染色观察发现,OECs移植组大鼠受保护的脊髓体积明显大于对照组。Keyvan-Fouladi等[12]切断大鼠的单侧第1颈髓,术后8周植入OECs,移植后1~3周内,移植物连接到损伤部位并逐渐恢复前爪的取物功能。再生的皮质脊髓束向尾端延伸10 mm,在灰质中形成树枝状末端。

    OECs不但能直接参与神经轴突髓鞘的形成,而且还具有分泌促进神经生长的因子及抑制有害因子的作用,从而改善脊髓损伤部位的内环境,诱导损伤的脊髓神经元再生,达到脊髓再生和功能恢复的目的。一方面,OECs能改变脊髓损伤局部的抑制性内环境。在体外培养和体内研究OECs中发现,能分泌大量不同种类的神经营养因子,如神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)和神经营养素-4(NT-4),以及血小板衍化生长因子(PDGF)、神经肽Y,S-100[13]等,这些物质是神经元生长、发育、分化、成熟的必需因子。且OECs细胞膜上具有参与细胞黏附和轴突生长的蛋白分子,如Ll样细胞黏附分子(CAM-L1)、层黏连素(1aminin)、含唾液酸的分子(PSA-N-CAM)和神经细胞黏附分子(N-CAM)[14]。另一方面,OECs能促进受损神经元轴突的再生、形成髓鞘和穿越胶质瘢痕区。Perez-Bouza等[15]通过实验证实,OECs具有很强的控制轴突再生方向的能力,OECs形成的“神经胶质桥”可穿过瘢痕等阻碍,沿着轴突纵轴方向延伸生长。

    因此,OECs被认为是治疗脊髓损伤最有潜力的移植细胞之一。

    2  雪旺细胞移植治疗脊髓损伤

    2.1  雪旺细胞的分布和生物学功能

    雪旺细胞是周围神经系统的神经胶质细胞,包绕神经纤维轴突形成髓鞘和神经膜。现已证明周围神经的再生能力主要归因于雪旺细胞。

    雪旺细胞具有多方面的生理功能,在神经纤维的再生修复中具有诱导、营养以及促进轴突生长和成熟的作用。首先,雪旺细胞能产生多种细胞因子,①分泌神经营养因子,包括神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)等[16];②产生促突起生长因子(neurite-promoting factor,NPF),包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞黏附分子(cellular adhesion molecules,CAM)[17];③释放轴突诱导因子。这些物质具有营养和保护受损神经元、促进轴突再生和出芽等作用。其次,雪旺细胞可以作为再生轴突的机械性导管样引导物,支持和引导轴突再生。再次,雪旺细胞可以抑制胶质瘢痕形成,改善损伤脊髓局部微环境,从而减少脊髓再生障碍。

    2.2  雪旺细胞治疗脊髓损伤的实验研究

    许多实验证明,经培养纯化的雪旺细胞,无论在体内或体外均能支持和促进脊髓神经突起的生长。David等[18]将含有雪旺细胞和基质胶(matrigel)的导管植入T8处横切的大鼠脊髓内,证实雪旺细胞移植组的再生轴突对电刺激会产生反应,而Matrigel移植组的大鼠则无同样的反应性。Takami等[19]采用NYU法制作Fischer大鼠T9脊髓损伤模型,分别将嗅鞘细胞、雪旺细胞以及二者混合移植入损伤部位,l2周后行脊髓病理切片、免疫组化染色,结果发现3组脊髓空洞体积均较空白对照组明显减小,细胞向损伤部位两端扩散远达5 mm以上者分别占总数的43%、51%、44%;单纯雪旺细胞移植组轴突再髓鞘化程度明显高于其他3组,大鼠运动功能的恢复也最好。从而认为雪旺细胞移植在脊髓损伤修复中的作用不可替代[20]。

    目前,雪旺细胞作为移植细胞治疗脊髓损伤的最大局限性是植入细胞的存活期较短和迁移距离有限。这是将雪旺细胞移植应用于脊髓损伤临床治疗的急需解决的问题。另一方面,雪旺细胞分离、纯化和培养技术日益成熟,基因修饰后在体内具有良好的生长性且免疫原性小,所以雪旺细胞作为外源基因的载体应用于脊髓损伤的基因治疗具有巨大的前景,是今后研究的一大热点方向。

    3  骨髓基质干细胞移植治疗脊髓损伤

    骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓支持结构的一种具有多向分化潜能的多能干细胞,又称为骨髓间质干细胞。这种细胞除具备干细胞的基本特点外,还具有细胞的可塑性或“克隆性”,表现为骨髓基质干细胞在特定信号的诱导下,依靠某类组织,并分化成该组织细胞,其细胞分化类型受其所处的组织微环境的影响[21,22]。在体内和体外,骨髓基质干细胞可转化为神经元样细胞。脊髓损伤局部的微环境增加了骨髓基质干细胞向神经元方向的诱导分化作用。

    根据BMSCs的这种特性,Keating[23]等认为BMSCs可作为自体体内移植进行基因治疗的载体,并且已在进行Ⅰ期临床试验。最近研究显示移植入脊髓半切的大鼠脊髓内的人BMSCs无需进行免疫抑制即可存活数月而没有炎症或免疫排斥反应的迹象,而且可见轴突在移植物中生长[24]。这些特性使BMSCs成为脊髓损伤临床基因治疗的备选载体细胞之一。步星耀[25]等将BMSCs脊髓内移植定向诱导分化与BMSCs定向分化诱导椎管内移植相结合,移植途径有①直接受损脊髓多靶点注射;②腰穿椎管内植入,将扩增的BMSCs移植于蛛网膜下腔,使之随脑脊液到达病变部位;③静脉移植,开放血脑屏障,将扩增的BMSCs静脉输入,使之通过血脑屏障到达病变部位。实验结果显示,术后动物的运动和感觉功能均有不同程度恢复。

    骨髓基质干细胞取材方便,可自体移植以避免免疫排斥反应,又能进行基因修饰,是脊髓损伤基因治疗的良好载体细胞。目前,由于骨髓基质干细胞分化的定向诱导技术尚未成熟,单纯骨髓基质干细胞移植治疗脊髓损伤还有待进一步研究。

    4  存在的问题

    多种来源和种类的细胞移植治疗脊髓损伤已经在小鼠、大鼠模型移植实验中取得明显疗效[1,10-24,26,27]。遗憾的是,还有一些问题阻碍了细胞移植向临床推进,这些问题集中在以下方面,第一,骨髓来源的干细胞,尽管能向神经细胞分化,但几乎没有实验能够证明这些具有神经细胞抗原标记的跨胚层分化细胞,的确是有特定功能的神经细胞[26,27];第二,以往所进行的移植实验,甚至临床实验,所观察到的疗效没有提供令人信服的理论依据;第三,干细胞存在致瘤性是国际共识和研究焦点,北京大学干细胞中心则证实,成熟度相对高的神经干细胞移植后同样具有较高的致瘤性;还有研究表明,胚胎干细胞分化出的细胞移植后,在发挥疗效的同时,具有较强的致瘤性[28]。从理论上讲,只要具有分裂增生能力的细胞被植入动物体,就具有形成肿瘤的可能。

    在神经生物学基础研究[29]中,对各种神经细胞的研究集中在细胞的分离、植入细胞的存活、分化的条件、调控因子以及移植后形态学改变等方面。在实验中,研究者实现了细胞移植后部分存活并形成突触或促进突触的形成,但是仍未解决移植后的神经功能恢复。主要面临以下问题,第一,形态和功能属于不同的问题,突触的建立并不等于神经冲动能有效传递。神经发育学表明,竞争的作用是保持功能的重要机制。事实上,在发育过程中有相当一部分突触会退化或处于休眠状态(突触精减),只有少数(甚至一个)突触连接会发育并形成有效的活化突触,从而保证功能的恢复;第二,突触的连接是精确且有序的。特定的神经元轴突只会向特定的靶组织或特定的靶细胞生长并建立突触连接,而且即使在最佳实验室条件下,每天的生长速度也不会超过1mm。也就是说,需要很长的时间,才有可能形成神经元和靶细胞的连接;第三,神经元即使与靶细胞连接成功,也必须经过“易化”(facilitation)才能逐步产生功能性作用。因此,必须加大感觉信息的输入,才有可能获得运动信号的输出。而刺激在时间和空间上的积累是必不可少的。可见,要使成年动物或人产生一种新的“功能”,或恢复已经丧失的功能,绝不仅是实现细胞移植成活并建立形态上的突触联系就可以解决的。总之,在细胞移植后,应当考虑如何使再生的神经元及其突触真正产生功能作用,这才是实现脊髓损伤修复的本质问题。

【参考文献】
  [1]Ramon—Cueto A. Cordero MI,Santos-Benito FF,et al.Functional Recovery of Paraplegic Rats and Motor Axon Regeneration in Their Spinal Cords by Olfactory Ensheathing Glia[J].Neuron,2000,25:425-435.

[2]Van Eldik LJ, Christie-pope B. Neurotrophic Activity of S-100 Beta in Cultures of Dorsal Root Ganglia from Embryonic Chick and Fetal Rat[J].Brain Res,1991,542(2):280.

[3]Toisay KT,Key. B The Extracellular Matrix Modulates Olfactory Neurote Outgrowth on Ensheathing cells[J].J Neurosci,1999,19(22):9 890.

[4]Sonigra RJ,Brighton PC,jacoby J,et al. Adult l Olfactory Nerve Ensheathing Cells are Efective Promoters or Adult Central Nerves System Neurite Outgrowth in Coculture[J].Glia,1999,25(30):256.

[5]Li Y,Field PM, Raisman G. Repair of Adult Rats Corticospinal Tract Transplants of Olfacory Ensheathing Cells[J].Science,1997,277(5334):2000.

[6]Rtamon-Cueto A,Plant GW,Avila J,et al. Long-distance Axonal Regeneration in the Transected Adult Rat Spinal Cord in Promoted by Olfactory Ensheathing Glia Transplant[J].J Neurosci,1998,18(1):3 803.

[7]Kott JN,Westrum,LE,Raines EW,et al. Olfactory Ensheathing G1ia and Platelet-derived Growth Factor B-chain Reactivity in the Transplanted Rat Olfactory Bulb[J].Int J Dev Neurosi,1994,12(4):315.

[8]Woodhall E,West A K,Chuah M I. Cultured Olfactory Ensheathing Cells Express Nerve Growth Factor,Brain-derived Neurotrophic Factor,Glia Cell Line-derived Neurotrophic Factor and Their Receptors[J].Brain Res Mol Brain Res. 2001,88:203-213.

[9]Miragall F.Kadmon G,Husmann M,et al. Expression of Cell Adhesion Molecules in the Olfactory System of the Adult Mouse:Presence of the Embryonic form of N—CAM[J].Dec Biol,1988,129(2):516.

[10]Li Y,Decherchi P,Raisman G. Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells into Spinal Cord Lesions Restores Breathing and Climbing[J].J Neurosci,2003,23:727-731.

[11]Verdu E,Garcia-Alias G,Fores J,et al. Olfactory Ensheathing Cells Transplanted in Lesioned Spinal Cord Prevent Loss of Spinal Cord Parenchyma and Promote Functional Recovery[J].Glia,2003,42:275-286.

[12]Keyvan-Fouladi N,Raisman G,Li Y. Functional Repair of the Corticospinal Tract by Delayed Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells in Adult Rats[J].J Neurosci,2003,23:9 428-9 434.

[13]程赛宇,阮怀珍,吴喜贵,等.大鼠坐骨神经损伤后嗅球成鞘细胞对脊髓神经元的保护作用[J].中华创伤杂志,2002,18:607-6l0.

[14]Lipson AC,Widenfalk J,Lindqvist E,et al. Neurotrophic Properties of Olfactory Ensheathing Glia[J].Exp Neurol,2003,180:167 -171.

[15]Perez-Bouza A,Wigley CB,Nacimiento W,et al. Spontaneous Orientation of Transplanted Olfactory Glia Influences Axonal Regeneration[J].Neuroreport,1998,9:2 971-2 975.

[16]Azanchi R,Bernal G,Gupta R,et al. Combined Demyelination Plus Schwann Cell Transplantation Therapy Increases Spread of Cells and Axonal Regeneration Following Contusion Injury[J].Neurotrauma,2004,2l:775-788.

[17]Takeda Y,Asou H,Murakami Y,et al. A Nonneuronal Isoform of Cell Adhesion Molecule LI:Tissue-specific Expression and Func-tional Analysis[J].Neurochem,1996,66:2 338-2 349.

[18]David S,Lacroix S. Molecular Approaches to Spinal Cord Repair[J].Annu Rev Neurosci,2003,26:411-440.

[19]Takami T,Oudega M,Bates ML,et al. Schwann Cell but Not Olfactory Ensheathing Glia Transplants Improve Hindlimb Locomotor Performance in the Moderately Contused Adult Rat Thoracic Spinal Cord[J].Neurosci,2002,22:6 670-6 681.

[20]Friedman JA,Windebank AJ,Moore MJ,et al. Biodegradable Polymer Grafts for Surgical Repair of the Injured Spinal Cord[J].Neurosurgery,2002,51:742-751.

[21]Mezey E,Chandross KJ,Harta G,et al. Turning Blood into Brain:Cells Bearing Neuronal Antigens Generated in Vivo from Bone Marrow[J].Science,2000,290(5497):l 779-1 782.

[22]Prockop DJ. Marrow Stromal Cells as Stem Cells for Nonhematopoietic Tissues[J].Science,1997 ,276(5309):7l-74.

[23]Cao Qi-lin,Zhang Yping,Russell M,et al. Pluripotent Stem Cells Engrafted into the Normal or Lesioned Adult Rat Spinal Cord Are Rest Ricted to Glial Lineage Exp Neurol[J].2001,167:48-58.

[24]Hofstetter CP,Schwarz EJ,Hess D,et al. Marrow Stromal Cells form Guiding Strands in the Injured Spinal Cord and Promote Recovery[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99:2 l99-2 204.

[25]步星耀,张永福.骨髓问充质干细胞移植治疗脊髓损伤[J].实用诊断与治疗杂志,2004,18(14):259-260.

[26]Bianco P,Gehron Robey P. Marrow Stroma1 Stem Cells[J].C1in Invest,2000,105(12):1 663.

[27]Pittengen MF,Mackay AM,Beck SC,et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenehymal Stem Cells[J].Science,1999,284(541):l43-147.

[28]Fricker-Gates RA,Winkler C,kirik D,et al. EGF Infusion Stimulates the Proliferation and Migration of Embryonic Progenitor Cells Transplanted in the Adult Rat Striatum[J].Exp neurol,2000,165(2):237-247.

[29]吕国蔚.医学神经生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:166-200.

日期:2013年2月27日 - 来自[2006年第1卷第1期]栏目

脊髓损伤动物模型的制备与评价

【摘要】    脊髓损伤(SCI)的修复是医学界面临的一大难题,虽然现在还没有理想的治疗方法,但是世界各地的许多学者已对脊髓损伤的病理机制和再生修复进行了深入的研究。脊髓损伤动物模型的制备和评价方法对脊髓损伤相关研究具有很重要的意义,本文将回顾目前常用的脊髓损伤模型制备和评价的方法。

【关键词】  脊髓损伤;动物模型;评价

  Establishment and evaluation of animal models of spinal cord injury

    Xu Fan2,Chen-Jianmin1,Zhang Xiao1

    (Chengdu medical college,chengdu,China 610083)

    【Abstract】Objective restore the neural function after spinal cord injury is a hard work.Though there are no promising therapies,the scientists all over the world have made great effort in studying the pathological meschasim ofspinal cord injury and spinal cord regenerate.The establishment of animal model and evaluating methods are playing an important role in these researches.This article will review applications about how to make and evluate animal models of spinal cord injury.

    Key words:spinal cord injury,animal model,evaluation

   1  脊髓损伤动物模型的制备

    1.1  脊髓撞击损伤模型

    Allen[1]建立了重物坠落致脊髓损伤的方法。即用一定重量的重锤沿一套管垂直落下、精确打击特定脊髓节段而致伤。这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律,对研究脊髓损伤后神经元、神经胶质细胞的病理变化、再生规律和相互作用,探索神经保护策略有很大帮助。

    1.2  脊髓压迫损伤模型

    包括腹侧和背侧脊髓压迫模型,根据压迫方式和持续时间区别分为许多种类。Tralov[2]于1953年首先报道了脊髓压迫损伤的动物模型,用一小气囊连接导气管置于椎管内,然后向气囊内充气造成脊髓压迫损伤。后来还有人采用水囊压迫制备脊髓损伤模型。由于气囊或水囊在椎管内滚动,这两种方法对动物脊髓造成的压迫程度不均匀。Von-Buler等用动脉瘤夹夹持脊髓,以夹持力和钳夹时间区别脊髓损伤轻重。夹持压迫的特点在于可以模拟脊柱移位造成的脊髓损伤,且能保持硬脊膜结构完整,揭示神经功能损伤与压迫时间的关系,寻求最佳的解压迫时机,通过控制夹持力的大小和持续时间可得到不同损伤程度的模型。但此模型的制作要求夹持及解除夹持脊髓要迅速,而且对夹持力的判定不如重物坠落法直接。

    1.3  脊髓缺血及再灌注损伤模型

    该模型对研究脊髓的缺血及再灌注有重要的意义。具体的模型制作方法有血管结扎、灼闭、夹闭、栓塞等不同的方式。兔脊髓血管呈明显节段性分布,侧枝循环较差,易致缺血,且缺血后病理变化较一致,重复性好,并发症较少。Chavlco[3]在兔肾动脉上方夹闭腹主动脉造成脊髓缺血及再灌注损伤,观察结果显示运动障碍以前角运动神经元损伤为主。有学者应用明胶海绵或碘油栓塞双侧供应胸椎的肋间动脉,造成了神经变性、坏死、液化,但此模型一致性较差。Bungle[4]利用孟加拉玫瑰红激光束直接照射脊髓,造成脊髓缺血损伤,光镜和电镜观察显示组织细胞病变与缺血病变有较好的相关性。此外,还有人直接灼闭脊髓动脉,造成局部缺血。

    1.4  切割和吸除型脊髓损伤模型

  切割型脊髓损伤模型[5,6],即使用虹膜刀片或显微剪横断或半横断脊髓。吸除型脊髓损伤模型,是直接切除一段脊髓、或切开后用玻璃针吸出已损毁的脊髓组织,或负压吸除部分脊髓,造成脊髓完全或非完全的横断性缺损。该法操作方便、出血少、继发反应轻,适用于放置移植物或药物等进行再生性实验研究,国内学者多采用此法。但此法所获得的模型与临床相关性差,重复性低,难以保证模型动物的一致性,由于硬脊膜的破裂,大量外来成分进入脊髓损伤部位,破坏了该部位的微环境,且动物护理较难,死亡率非常高,得到整批数据较难。

    1.5  静压型脊髓损伤模型

    静压型脊髓损伤模型[7,8]是利用压迫物造成脊髓组织变形及脊髓结构改变。慢性压迫脊髓以模拟出血、水肿或肿瘤等占位性病变。最早进行慢性脊髓压迫损伤模型研究的是Tralov[2]。他将一个可膨胀的气球放入椎骨与硬脊膜之间,以不同速率向气球内充气使其膨胀,导致脊髓损伤。20世纪70年代以来,多采用袖带压迫法产生慢性脊髓损伤,但此法不能量化受压脊髓所承受的压强,而且与临床实际相差较远。另外,人们陆续发展了静物、螺钉和移植肿瘤造成压迫损伤。将重物直接放在脊髓背面,亦可造成慢性分级压迫,或逐渐旋紧固定在椎骨上的螺钉压迫脊髓组织。Ushio等将肿瘤细胞W256种植到大鼠椎体前,肿瘤细胞通过椎间孔扩散,进入硬膜外腔,生长压迫脊髓,肿瘤细胞种植后,平均16 d后大鼠双后肢产生瘫痪。结果表明,此法制作的模型[13]:模拟了脊髓慢性压迫损伤的临床与病理表现。

    1.6  光化学诱导型脊髓损伤模型

    静脉注射光增敏剂二碘曙红(孟加拉玫红)或四碘荧光素二钠(藻红B),然后分别以氩离子灯或氙弧灯产生的514.5nm激光或560nm绿光照射拟损伤的脊髓部位,光即与光增敏剂发生反应,使局部自由基大量堆积,损伤脊髓血管内皮细胞,进而引发血栓,导致缺血性损伤和水肿,由此而制得光化学诱导型脊髓损伤(photo—chemically induced,PCI)模型[9,10]。该法能保持硬脊膜的完整性,甚至不必切开皮肤,因为激光足以穿透脊背表面,但应注意防止光的热效能对脊髓的直接灼伤。

    1.7  牵拉性脊髓损伤模型

    牵拉性脊髓损伤模型[11], 即将双侧椎板切除显露大鼠脊髓,用牵开器由侧方牵拉脊髓,实现水平方向上的脊髓牵拉损伤;选用不同的牵拉比率可制备不同程度的牵拉性脊髓损伤。该方法所制备模型动物的神经电生理的改变与行为学功能的改变有相关性。目前临床上牵拉性脊髓损伤的增多与医源性原因有关[12],此模型模拟了临床治疗中脊髓损伤的致伤条件和受伤机制,模型制作的关键是控制牵拉比率的精确性。

    2  脊髓损伤动物模型的评价

    动物脊髓损伤后的神经功能评定主要有神经电生理评价、运动功能评价和组织形态学评价,应把三者结合起来确定脊髓损伤程度,观察恢复情况及评价疗效。

    2.1  神经电生理评价

    这种评定方法比较客观可靠[14],尤其适用于动物SCI后运动和感觉反射不易直接观察的情况。常用的神经点电生理评价指标有体感诱发电位(SEP) 、脊髓诱发电位(SCSEP)和 运动诱发电位(MEP)。

    体感诱发电位(SEP)的变化可反应出脊髓传导功能受损的程度。一般认为脊髓诱发电位(SCSEP)或皮层诱发电位(CSEP)的出现取决于脊髓后索或后外侧索的完整性,反映脊髓的感觉通道功能,不反映脊髓的运动功能。运动诱发电位(MEP)信号沿脊髓前外侧索传送,对实验性脊髓损伤较SEP敏感且与运动功能一致。MEP的恢复先于动物运动功能的恢复。MEP的存在与否可推断运动通路是否存在,从而达到判断脊髓损伤及预后的目的[15]。MEP可准确地反映运动功能,与SEP结合运用可客观全面地反映脊髓的功能。

    2.2  运动功能观察评价

    由于神经点生理检测的动物应答具有局限性,所以多年来研究人员常采用运动功能评分法评价脊髓损伤程度。常见的运动功能评分法有以下几种:

    ①BBB评分法[17]:此法几乎包括了SCI后大鼠后肢恢复过程中所有行为变化,且与SCI的程度高度相符,又无需特殊设备,但标准较复杂,需对观察人员进行一定的训练,以减少主观因素的影响,目前此法应用最广;②Tarlov评分法[16]:根据脊髓损伤后动物后肢有无活动、活动是否频繁、有力,能否负重等情况把脊髓功能分为5个等级。此方法对灵长类是准确的,但对分类种属较低等的动物(如啮齿类动物),尤其在损伤程度较轻时,缺乏准确性,有些指标难以观察。近年来发展了多种改良的Tarlov法。③斜板实验法:Rivlm和Tator于1977年首次报道了利用斜板法检测大鼠SCI后功能恢复程度。现在应用的为改良的斜板实验法[2],即将大鼠身体长轴与斜板纵轴呈垂直位放置,斜板每次升高5°,以大鼠能够停留5s的最大角为其功能值。损伤程度越重,利用该法的评分结果之间的差异越显著。该法基本可以区分不同损伤程度对神经功能的影响,但不能揭示大鼠神经功能的细微恢复,如爪的位置、尾的下垂或上翘等,而这些功能对于大鼠整体功能具有重要的作用。④联合行为评分法(CBS):Gale等[16]于1985年建立了一套包括运动、感觉和反射功能等的综合评价标准。该法弥补了单一运动功能评价的不足,且敏感性大为提高。但其标准值范围跨度大,记分呈跳跃性分布,不精确,所需设备复杂,人为因素较多。⑤ 爬网格实验法:正常大鼠经过一段时间的铁丝网训练后,其后爪总能踩到构成网格的铁丝上,而脊髓损伤的大鼠的后爪却常踏空到网格内,因而可以大鼠的爬行速度和后爪踏空次数对运动功能进行评分。此法简单可行,但对运动功能评价较单一。⑥Treadmill法:也叫踏旋器法,让不完全脊髓损伤的大鼠以后肢和臀部坐在一装有传感器的平台上,通过检测后肢与臀部对平台的切应力可测出大鼠的平衡功能[18]。

    2.3  组织结构的形态学评价

    早期SCI实验中,研究者主要采用传统的神经解剖学研究方法,如组织化学、镀银或其他染色法观察溃变的神经元胞体和末梢。20世纪70年代后,人们发展了用辣根过氧化物酶(HRP)技术和放射自显影术追踪神经束行径的方法。Grant曾采用神经节注射HRP的方法研究感觉神经从脊髓至脑的走行方向。近年来,大多数脊髓损伤实验均采用用免疫组化方法研究脊髓损伤后的病理改变及修复情况,但单纯使用免疫组化染色不易在连续切片上追踪实验结果。因此,现在多采用免疫组化技术与HRP、荧光物和放射自显影技术等相结合的逆行或顺行标记法,以及与乙酰胆碱能和单胺能荧光物相结合的多种染色等方法。应用电子显微镜可观察超微结构的变化,但较局限,应与能观察脊髓损伤部位组织结构全貌的光镜相结合。

    3  脊髓损伤实验研究存在的问题与展望

    理想的脊髓损伤模型应具备以下三方面的条件:①临床相似性,即制作的脊髓损伤模型与临床相近,尽量接近人类的情况。从理论上讲,使脊柱受钝性暴力的作用后致伤,即所谓“闭合性脊髓损伤”,可以模拟脊髓在外力作用下受损和其后的病理改变过程,与人类脊髓损伤的情形相似。但实际研究中发现,动物模型与临床脊髓损伤仍有很大区别,这种闭合伤所造成的功能障碍并不稳定, 难以制备可重复的分级损伤模型;其次,动物模型是切开背部皮肤后对开放的脊髓后部直接损伤造成的,而人类脊髓损伤则多是因撞击所致挫伤或椎体移位导致脊髓前部与侧方受压造成。②可调控性,即可根据实际需要调整损伤强度,复制出不同损伤程度的脊髓损伤模型。③可操作性与可重复性,即对脊髓损伤模型制作的各关键步骤客观化、定量化,使其可信度高,可实施性强,能反映客观问题。不同脊髓损伤模型,导致不同类型的解剖结构损伤与神经功能变化。目前,脊髓损伤动物模型的各种制备方法均存在一定的局限性。所以,建立理想的脊髓损伤动物模型是进行脊髓损伤及修复研究的首要问题。

【参考文献】
  [1]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocaion of spinal colum[J].JAMA,1911,57:878-880.

[2]Tralov IM,Kinger H.Spinal cord compression studies[J].Arch Neuro psychiatry,1954,70:813-819.

[3]Chavlco M,Kalincakave K.Blood flow and electrocytes in spinal cord ischermia[J].Exp Neurol,1991,112:299-303.

[4]Bunge MB,Holets VR.Charaterization of pgotochemically induced spinal cord injury in the rat by light and electron microscope[J].Exp neurol,1994,127(1):76-93.

[5]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan jc.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight—drop device versus transection[J].Exp Neurol,1996,l39:244-256.

[6]Bavetta S Hamlyn PJ,Bumstock G,et a1.The effects of FK506 on dorsal column axons following spinal cord injury in adult rats:neuroprotection and local regeneration[J].Exp Neurol,1999,1585:382-393.

[7]Von—Euler M,Seiger A,Sundstrom E.Clip compression injury in the spinal cord[J].Exp Neurol,1997,145:502-510.

[8]Balfour R,Achanha K,Kaufman J,et a1.Synergistic effect of basic fibroblast growth factor and methylpridnisolone on neurological function alter experimental spinal cord injury[J].J Neurosurg, 1995, 83: 105-ll0.

[9]Watson BD,Prado R,Dietrich WD,et a1.Photochemically induced spinal cord injury in the rat[J].Brain Res,1986,367:296-312.

[10]Cameron T,Prado R,Watson BD,et a1.Photochemicallv induced cystic lesion in the rat spinal cord.Behavioral and morphotological analysis[J].Exp Neurol,1990,109:214-223.

[11]周子强,李佛保,陈裕光.脊髓牵拉性损伤动物模型的建立[J].中国脊柱脊髓杂志,2000,10:269-273.

[12]Adamson J,Zappulla RA,Fraser A,et a1.Efects of selective spinal cord lesions on the spinal motor evoked potential(MEP)inthe rat[J].Electroencephalog and Clin Neurophysio1,1989,74:469-480.

[13]Ushioy,Posner U,Posner JB,et a1.Experimental spinal cord compression by epidural neoplasma[J].Neurology,1997,5:422-429.

[14]Dawson GD.A summation technique for detecting small singals in a large background [J].J Physio1,1951,115:2.

[15]Stewart M,Quick GJ,Amassian VE.Corticospinal reSponses to electrical stimulation of motor Cortex in the rat[J].Brain Res,1990,508:344.

[16]Gale K Kerasidis H.Spinal cord contusion in the rat:Behavial of functional neurological impairment[J].Exp Neurol,1985,88(1):123-131.

[17]Basso DM.Beattie MS, Bbesnahan JC.A sensitive and rellable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].JNeurotrauma,1995,12(1):1-12.[18]Mulligail SJ,Knapp E,et al.A method for assessing balance control in rodents [J] Biomed Sci Instrum ,2002,38:77-82.

日期:2013年2月27日 - 来自[2006年第1卷第1期]栏目

脊髓栓系综合征的磁共振成像诊断价值

【摘要】  目的 探讨脊髓栓系综合征(TCS)磁共振的成像特点及诊断价值。方法 对经手术证实的26例TCS患者的资料进行回顾分析。结果 26例中,椎管内脂肪瘤5例,畸胎瘤3例,脊髓胎分出5例,皮毛窦3例,脊髓纵裂4例,隐性脊柱裂6例。结论 MRI对TCS患者确诊具有重要价值,能明显显示脊髓圆椎的位置形态及伴发的畸形,可以为手术治疗提供可靠的依据,所以应作为脊髓栓系和脊柱闭合不全术前常规检查。

【关键词】  脊髓栓系综合征;磁共振成像;诊断价值

Diagnostic value of magnetic resonance imaging in tethered cord syndrome

  LIAN Li-xin,LI Qiu-mei,YANG Yan-ling.MRI Room,Mengzhou City People’s Hospital,Mengzhou 454750,China

  [Abstract] Objective To investigate the tethered cord syndrome(TCS)magnetic resonance imaging features and diagnostic value.Methods The confirmed by surgery in patients with TCS of the 26 cases were retrospectively analyzed.Results 26 cases,the intraspinal lipoma were five cases,three cases were teratoma,5 cases were the separation of fetal spinal cord,three cases were superficial sinus,4 cases were diastematomyelia.Conclusion MRI diagnosis of TCS in patients with an important value,is clearly shown in the spinal cord to the location of cone morphology and associated with the deformity,the treatment for the hands to provide reliable basis,it should be used as tethered spinal cord and spinal dysraphism preoperative routine examination.

  [Key words] tethered cord syndrome;magnetic resonance imaging; diagnostic value

  脊髓栓系综合征(tethered cord syndrome,TCS)是由于各种先天和后天原因牵拉圆锥,使圆锥位置下移,并被“栓系”在椎管内,但常合并其他畸形,从而产生脊髓感觉或运动神经功能障碍。由于临床医生对TCS认识不足,实际工作中遇到仅手术处理脊膜膨出而忽略TCS的病例,为提高对TCS的认识和评估,MRI对TCS的诊断价值。现将我院手术证实的26例TCS报告如下。

  1 资料与方法

  1.1 一般资料 本组26例TCS均为我院1998年10月至2009年1月手术证实的病例。其中男17例,女9例,年龄最大50岁,最小2个月。临床表现:有排尿困难并大小便失禁10例,下肢疼痛伴跛行,足部畸形5例,内翻足5例,皮毛窦3例,肌肉萎缩无力3例。

  1.2 方法 MRI设备及扫描技术,扫描采用德国西门子永磁0.35TMRI成像系统和脊柱表面线圈,常规采用矢状面冠状面及轴位20 ms T2加权像(TR/TE=2 000/90 ms)横轴位T1加权像。矢状位4 mm横轴位5~8 mm成像。矩阵256×256均为腰骶段脊柱扫描。

  2 结果

  26例患者中,椎管内脂肪瘤5例,畸胎瘤3例,椎管内皮样囊肿5例,脊髓终丝2例,脊膜膨出4例,皮毛窦3例,脊髓纵裂4例。26例TCS脊髓圆锥末端均低于L2椎体下缘。其中9例栓系于S1~3椎管内,MRI脊髓正常,圆锥形态消失而呈“鼠尾状”。6例因脊髓圆锥纤细与马尾神经束在矢状面上难以区分,但横轴位成像完全可以分辨脊髓或马尾神经,上述结果MRI发现与手术中所见相同。

  3 讨论

  TCS的发生机制和诊断标准:脊髓栓系综合征在临床与放射学上有不同的概念。以往将脊髓圆锥位于L2椎体水平,终丝直径>2 mm定义为脊髓栓系[9],近年来,部分学者认为脊髓栓系为脊膜膨出、脂肪瘤、脊髓纵裂等引起的继发性改变[6]。脊髓栓系的发生与脊髓发育过程异常有关。正常胚胎发育早期,脊柱与脊髓的长度大致相等,随后脊柱生长速度快于脊髓,造成脊髓的位置逐渐上升,至出生3个月后,脊髓至成人水平,即圆锥位于L1~2水平,如果在这个过程中脊髓与周围组织黏连或因其他原因造成脊髓上升受限时,脊髓被牵拉而绷紧引起血管功能不全及继发性缺血、变性而出现症状[3],成人脊髓圆锥末端在T12和L1椎体水平,脊髓圆锥的位置可随脊髓弯曲在一定范围内上下移位。马尾及终丝则不和硬脊膜黏连[1]。当胚胎期神经管发育过程障碍,常可导致中枢神经系统形态异常或移位及周围结构不闭合,发生脊髓纵裂、圆锥低位、半锥体、棘突交叉、皮毛窦等异常改变。按照传统诊断方法,我们应以使用脊末端低于L2椎体下缘作为诊断TCS的标准。

  TCS的分型,周国昌等[8]根据MRI表现,手术所见及脊髓栓系的发生机制将TCS分为5种类型:(1)终丝粗大型;(2)脂肪瘤型;(3)脂肪瘤切除术后瘢痕黏连型;(4)椎管内肿瘤致脊髓栓系;(5)混合型。笔者根据TCS的不同病因,手术所见和MRI表现将其如下分型:①终丝粗短紧张型:终丝粗短,其直径在2 mm以上,脊髓变细且圆锥部下降并粘在硬膜囊后壁,背侧蛛网膜下腔消失。MRI轴位像可见椎管内有高信号圆点状终丝影像。终丝表面可附有薄层脂肪组织亦可合并脊髓中央管轴度扩张。临床表现可有步行困难、尿失禁和下肢无力等;②脊髓脊膜膨出型,MRI轴位及矢状位可见椎板部分或完全缺如,临床上常有双下肢活动力差及泌尿系膀胱功能障碍等症状;③椎管内肿瘤致脊髓栓系型,各种腰骶段椎管内胚胎肿瘤如皮样肿瘤、表皮样囊肿、畸胎瘤和脂肪瘤等,均可导致TCS。MRI依其信号不同多可做出正确判断,并可很好地显示脊髓末端与肿瘤的关系;④混合型:椎管内肿瘤合并终丝粗大;术后瘢痕组织黏连合并终丝增粗;椎管内脂肪堆积合并终丝增粗。

  MRI对TCS的诊断价值:TCS患者最好的诊断手段是MRI已为众学者认可,MRI以其多序列、多方位、成像和高软组织分辨力等优点,从本组资料结果可知,MRI不仅可良好地显示脊髓栓系,并且还可以良好地显示TCS的合并症及其他异常,在临床上如行腰椎手术或联合腰麻、硬膜外麻醉患者,应在手术前或麻醉前详细询问病情仔细检查患者,及早发现神经管闭合不全的相关体征,MRI是目前TCS的最佳影像学检查手段,因此应作为TCS和脊髓栓闭合不全术前的常规检查。

【参考文献】
   1 Warder DE,Oakes WJ.Tethered cord syndrome:thelow-lying and normally positioned conus.Neurosurgery,1994,34:597.

  2 Hendrick EB,Hoftman H,Hamphreys RP.The tethered spinal cord.Clin Neurosurgery,1983,30:457.

  3 Warder DE,Oakes WJ.Tethered cord syndrome and the conus in normal position.Neurosurgery,1993,33:374.

  4 Barson AJ.The vertebral level of termination of the spinal cord during normal and abnormal development.J Anat,1970,106:489.

  5 陈辉.脊髓栓系综合征病和病理研究进展.中华小儿外科杂志,1995,12:364.

  6 Brophy JD,Sutton LN,Zimmeman RA,et al.Magnetic.resonance Imaging of lipomyelomeningoele and tethered cord.Neurosurgery,1989,25:236.

  7 Yamada S,Mandybur GT,Thompson JR.Dorsal midline prooscis associated with diastematomyelia and tethered cord syndrone:case report.J Neurosurgery,1996,85:709.

  8 周国昌,徐建民,周天健,等.脊髓栓系综合征MRI图与手术所见的关系.中国脊髓脊柱杂志,1994,4:145.

  9 高培毅,林燕,戴建平.脊髓闭合不全的MRI影像诊断(二)隐性脊柱闭合不全.中华放射学杂志,1994,28:530.

  

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第7卷第1期]栏目

脊髓血管母细胞瘤的MRI诊断与鉴别诊断

【摘要】  目的探讨脊髓血管母细胞瘤的MRI特征性表现,提高诊断和鉴别诊断能力。方法回顾性分析18例经手术病理证实的脊髓血管母细胞瘤的MRI表现。所有病例均行MRI平扫及增强扫描。结果11例单发(61.1%),7例多发(38.9%)。MRI表现多与肿瘤大小相关。≤1 cm的肿瘤呈点状或结节状,为均匀等T1、等或稍长T2信号,强化均匀;>1 cm的肿瘤多呈香肠状、葫芦形或不规则形,多以等T1、稍长T2为主的混杂信号,不均匀强化。肿瘤常继发囊肿或大范围脊髓空洞(94.4%)以及水肿。>1 cm的肿瘤内部及周围常见流空血管影(100%)。结论脊髓血管母细胞瘤的MRI影像学表现具有特征性,MRI对其诊断和鉴别诊断具有重要价值。

【关键词】  血管母细胞瘤;脊髓肿瘤;磁共振成像

            MRI diagnosis and differentiation of spinal cord hemangioblastomasZHANG Jing,SHAN Jun,YU Jia-yun,et al. Department of MR Room,the People's Hospital of Huaibei City,Huaibei 235000,China[Abstract]ObjectiveTo discuss the characteristic performance of MRI of the spinal cord hemangioblastomas,to improve the ability of diagnosis and differentiation.MethodsA retrospective analysis of 18 cases confirmed by surgery and pathology for spinal cord hemangioblastomas were done on the MRI manifestations.All cases underwent plain and contrast enhanced MRI scan.ResultsThe lesions were single in 11 cases (61.1%) and multiple in 7 cases.MRI shew more associated with tumor size.Tumors were point-like or nodular,they were isointense on T1WI or longer T2WI.They were enhanced uniformity;(>1 cm) tumors were sausage-like,gourd-shaped or irregular shape,and many other T1,slightly longer T2-based mixed-signal,non-uniform strengthened.Tumors are often mixed with cysts or a wide range of syringes (94.4%);(>1 cm)tumors within and around shew vascular flow void shadow (100%).ConclusionThe imaging performance of MRI in hemangioblastomas of the spinal cord is characteristic,the method of MRI is very valuable to its diagnosis and differentiation.

  [Key words]hemangioblastomas;spinal cord tumors;magnetic resonance imaging

  血管母细胞瘤又名血管网状细胞瘤、血管内皮细胞瘤,脊髓血管母细胞瘤是一种少见的良性肿瘤,术前常难以准确诊断。笔者收集18例经手术和病理证实的脊髓血管母细胞瘤患者的临床和MRI资料,探讨其MRI特征性表现及MRI对其诊断与鉴别诊断的价值,旨在提高对该肿瘤的术前正确诊断率。

  1资料和方法

  1.1一般资料18例患者均在我院行MRI检查,男12例,女6例,发病年龄15~52岁,平均33.2岁。其中11例单发;7例多发与Von Hippel-Lindau(VHL)综合征相关,多发者中2例有家族史,1例并有小脑血管母细胞瘤。主要临床表现:18例均有上肢或下肢麻木无力,6例肢体感觉减退,5例节段性疼痛,4例肌肉萎缩,1例肌束颤动,1例表现为头晕、头痛、步态不稳,5例病理征阳性。

  1.2检查方法使用GE1.5T超导型磁共振成像系统,相控阵脊柱线圈。18例均行平扫及增强扫描。平扫矢状面及冠状面FSE T1WI:TR 450 ms,TE 15 ms;FRFSE T2WI:TR 3000 ms,TE 115 ms,层厚3 mm,间隔1mm,采集次数(NEX)2;颈髓、胸髓及腰髓FOV分别为24 cm×24 cm、34 cm×34 cm、34 cm×34 cm,矩阵分别为320×224、384×224和384×224。轴面T2WI:TR 3 140 ms,TE 104 ms,FOV 24 cm×24 cm,矩阵为320×224,采集次数(NEX)2。增强扫描静脉注射钆喷替酸葡甲胺(Gd-DTPA)15~20 ml,0.1 mmol/kg。包括矢状面、冠状面及轴面T1WI,TR 350~500 ms,TE 8.9~11.9 ms。

  2结果

  2.1肿瘤的位置、大小及形态11例单发中,位于颈髓4例(36.4%),胸髓7例(63.6%)。7例多发者中,位于颈髓8个(34.8%)病灶,胸髓14个(60.9%),腰段1个(4.3%)。肿瘤呈偏心性生长,大多数位于脊髓背侧,少数位于腹侧。11例非VHL综合征,4个肿瘤上下径<1 cm,7个肿瘤上下径均>1 cm,最大者上下径约5.7 cm。7例VHL综合征的23个肿瘤中,15个肿瘤上下径≤1 cm,其余8个肿瘤上下径>1 cm,最大者约4.3 cm。≤1 cm的肿瘤表现为点状或结节状;>1 cm的肿瘤表现为香肠状、葫芦形或不规则形。

  2.2肿瘤的MRI表现平扫:≤1 cm的肿瘤多表现为均匀等T1(图1)、等或稍长T2信号(图2);>1 cm的肿瘤多表现为以等T1、稍长T2为主的混杂信号,其内常见长T1、长T2信号的囊变区或流空血管影(图4,5)。增强扫描:34个肿瘤均明显强化、边界清楚,≤1 cm的肿瘤多均匀强化(图3),>1 cm的肿瘤多不均匀强化,其内部及周围可见点状或迂曲的流空血管影(图6,7),<1 cm的肿瘤,未发现流空血管影。6个肿瘤邻近的背侧软脊膜可见“尾征”,即迂曲线样明显强化影(图8)。17例继发脊髓囊肿或大范围脊髓空洞(图1~6),范围由1个椎体阶段至全脊髓不等。12例肿瘤邻近脊髓内见水肿信号(图2)。

  3讨论

  3.1临床特点脊髓血管母细胞瘤是由中胚叶形成的血管细胞发生的真性肿瘤。它是一种少见的良性肿瘤,占脊髓肿瘤的1.0%~7.2%[1],发病无性别差异,好发年龄为20~40岁。绝大多数脊髓血管母细胞瘤是单发,多发病变则见于VHL综合征患者。Baker等[2]统计有1/3患者合并VHL综合征,为罕见的常染色体显性遗传性疾病,是一组多发、多器官的良恶性肿瘤症候群,以视网膜血管瘤、中枢神经系统血管母细胞瘤、腹部实质脏器内的囊肿和肿瘤为特征;其余2/3为散发肿瘤。本组18例中,以中青年患者多见,男女发病人数之比为2∶1。临床表现多与肿瘤的位置有关。11例单发(61.1%),7例多发合并VHL综合征(38.9%),1例合并颅内血管母细胞瘤,与文献报道大体一致。本病较常见于胸髓,其次为颈髓,大部分脊髓血管母细胞瘤为髓内病变。本组21个肿瘤位于胸髓,12个肿瘤位于颈髓,1个肿瘤位于腰段。34个肿瘤中有31个位于髓内,3例占据硬膜下间隙,与文献报道相符[1]。

  3.2MRI表现与特点脊髓血管母细胞瘤的MRI表现多与肿瘤的大小相关。Chu等[3]报道小的脊髓血管母细胞瘤(≤10 cm)绝大多数在T1WI上呈等信号,T2WI上呈高信号,增强后均匀一致强化。较大者在T1WI上呈低信号和等、低混杂信号,T2WI上呈混杂信号,增强后不均匀强化。本组中≤1 cm的肿瘤呈点状或结节状,为均匀等T1、等或稍长T2信号;>1 cm的肿瘤由于沿脊髓纵轴生长常呈香肠状、葫芦形或不规则形,内部常有囊变区及流空血管影,以等T1、稍长T2为主的混杂信号。MRI增强后,肿瘤强化均非常明显,边界清楚。≤1 cm的肿瘤多均匀强化,>1 cm的肿瘤多不均匀强化,其内可见斑片状、点状或条形无强化区,为囊变区或流空血管影,这与参考文献[3]研究基本相符。Chu等[3]还研究表明,VHL综合征患者脊髓血管母细胞瘤的病灶数目多且小病灶所占比例较高。本组7例VHL综合征患者有脊髓血管母细胞瘤23个,15个肿瘤上下径≤1 cm,8个肿瘤上下径均>1 cm,而11例非VHL综合征有4个肿瘤上下径<1 cm,7个肿瘤上下径均>1 cm,与之相符。
   
  脊髓血管母细胞瘤常继发脊髓囊变或大范围脊髓空洞以及水肿,从影像上难以区分肿瘤分泌形成的囊肿和脊髓空洞,Lonser等[4]报道脊髓空洞和水肿的发生率为89%,本组出现率为94.4%。Chu等[3]认为肿瘤血管高渗透性及肿瘤细胞的高分泌性是囊变形成的主要原因。脊髓水肿常发生于肿瘤或囊变两极,水肿范围内的脊髓呈肿胀表现。血供丰富的肿瘤常发生动静脉瘘,肿瘤邻近的脊髓组织则相对缺血,导致水肿的发生。
   
  流空血管影是脊髓血管母细胞瘤的重要特征性表现。本组15例>1 cm的肿瘤内部及周围均见流空血管影,发生率为100%,手术证实为肿瘤的供血动脉及引流静脉;而≤1 cm的肿瘤,MRI检查几乎未发现流空血管影。

  3.3鉴别诊断单发的脊髓血管母细胞瘤需与下述病变鉴别:(1)室管膜瘤:为成人最好发的髓内肿瘤,好发于颈髓或脊髓圆锥,肿瘤位于脊髓中央,瘤内常合并囊变、出血,含铁血黄素带在MRI上表现为肿瘤两端低信号的“帽”征[5],可继发脊髓空洞症,但发生几率及范围较血管母细胞瘤小,无流空血管影。(2)星形细胞瘤:发病年龄较小,男性多见,病灶多位于胸段,呈膨胀性或浸润性生长方式。肿瘤边界不清,呈中等度强化或不强化,可继发囊变、出血、空洞。(3)血管畸形(其中海绵状血管瘤常见):受累脊髓无肿胀,常继发出血,信号混杂,病变周围可见低信号环,可见流空血管影及范围较小的脊髓空洞症,邻近脊髓萎缩、水肿。(4)脊膜瘤:该肿瘤平扫多为等T1等T2信号,增强扫描多为明显均匀强化,但脊膜瘤为髓外肿瘤,常导致其临近脊髓受压变形移位,一般无脊髓空洞。

  图1~3患者女,15岁。图1~2为矢状位平扫T1WI、T2WI:C2平面脊髓内腹侧见小结节状等T1、稍长T2信号,伴脊髓囊变。C6以下平面见脊髓空洞。邻近脊髓伴有水肿。图3矢状位增强扫描:C2平面脊髓腹侧及T6~7椎间盘平面脊髓背侧见结节状强化灶,病灶均<1 cm,信号均匀图4~8患者男,20岁。图4、5分别为矢状位平扫T1WI 、T2WI:示T7~8平面脊髓内见上下径约3.4 cm香肠状以等T1、稍长T2为主的混杂信号,邻近脊髓背侧见流空血管影,并伴大范围脊髓空洞。图6~8为矢状位、轴位增强扫描:病灶呈明显不均匀强化,边界清楚,其内见低信号流空血管影,邻近背侧软脊膜线样强化呈“尾征”(略)

    多发的脊髓血管母细胞瘤需要与脊髓转移瘤相鉴别,转移瘤患者年龄通常较大,病情进展较快,多沿脊髓蛛网膜下腔播散生长,脊髓空洞及流空血管影少见。
   
  总之,脊髓血管母细胞瘤的MRI影像学表现具有特征性,肿瘤多位于髓内,可单发或多发,背侧多见,增强扫描强化明显,常继发大范围的脊髓空洞或囊变,大的肿瘤内部及周围常见迂曲的流空血管影,这些征象多提示血管母细胞瘤的诊断[6]。

【参考文献】
  1张晓丹,金征宇,张燕,等.脊髓血管母细胞瘤的MRI表现.临床放射学杂志,2005,24(6):475-477.

  2Baker KB,Moranl CJ,Wippold FJ,et al.MR imaging of spinal hemangioblastoma.AJR,2000,174(2):377.

  3Chu BC,Terae S,Hida K,et al.MR findings in spinal hemangioblastoma;correlation with symptoms and with angiographic and surgical findings.AJNR,2001,22(1):206-217.

  4Lonser RR,Weil RJ,Wanebo JE,et al.Surgical management of spinal cord hemangioblastomasin patients with von Hippel-Lindau disease.J Neurosurgery,2003,98:106.

  5李瑞春,惠旭辉,刘毅,等.脊髓髓内血管母细胞瘤的MRI特征.临床放射学杂志,2007,26(12):1189.

  6Bloomer CW,Ackerman A,Bhatia RG.Imaging for spine tumors and new applications.TMRI,2006,17(2):69.

日期:2013年2月27日 - 来自[2009年第6卷第12期]栏目
共 81 页,当前第 6 页 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 :


关闭

网站地图 | RSS订阅 | 图文 | 版权说明 | 友情链接
Copyright © 2008 39kf.com All rights reserved. 医源世界 版权所有
医源世界所刊载之内容一般仅用于教育目的。您从医源世界获取的信息不得直接用于诊断、治疗疾病或应对您的健康问题。如果您怀疑自己有健康问题,请直接咨询您的保健医生。医源世界、作者、编辑都将不负任何责任和义务。
本站内容来源于网络,转载仅为传播信息促进医药行业发展,如果我们的行为侵犯了您的权益,请及时与我们联系我们将在收到通知后妥善处理该部分内容