主题:软骨

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组织工程骨和软骨的建造

  0 引言 人类因先天性和获得性疾病引起骨和软骨组织的缺损或畸形,需要选用理想的修复或替代材料完成骨和软骨组织的修复与重建.现今尚无一种修复材料在生物学特性方面能够达到自体组织移植的水平.因此采用组织工程的方法,建造自身细胞来源的自体组织已成为生物医学研究的一项重要课题[1,2].我科由国家自然科学基金和军队医药卫生科研基金资助进行组织工程骨、软骨的研究,现将部分研究成果做以介绍.

  1 材料和方法

  1.1 组织工程骨的研究 实验采用裸鼠和新西兰兔作为实验模型.

  1.1.1 支架材料的制备 取新西兰兔的膝关节,冲洗、漂洗去除骨髓组织,采用脱脂、脱矿、去酸性蛋白等化学处理方法,经冻干处理后,制备成骨松质基质.骨松质基质具有多孔网状结构.

  1.1.2 细胞分离培养 取兔骨髓基质细胞,经体外分化诱导为成骨细胞,经体外培养扩增后与可降解水凝胶混合.

  1.1.3 细胞/支架复合物的形成 将5×106*mL-1的成骨细胞接种于松质骨基质支架上,表面行钙离子固化,体外培养48 h. 然后将细胞/支架复合物植入裸鼠和新西兰兔皮下.以单纯松质骨基质移植作为对照.

  1.2 组织工程软骨的建造

  1.2.1 细胞载体材料的选择 分别选用牛腱胶原、聚氧化乙烯温度固化聚合物、藻酸盐3种水凝胶作为软骨细胞载体材料.

  1.2.2 软骨细胞的分离材料 取兔耳软骨, 用Ⅱ型胶原酶消化分离,按4×107*mL-1将软骨细胞与载体材料混合.

  1.2.3 细胞/载体材料复合物的植入 采用注射方式将细胞/载体材料复合物植入裸鼠及新西兰兔皮下,在体内进行固化.以单纯载体材料植入为对照.

  2 结果

  2.1 组织工程骨的研究 组织学研究显示,移植后2 mo松质骨基质大部分吸收,由成熟的骨组织替代.然而单纯松质骨基质移植骨仅出现少量骨样组织.

  2.2 组织工程软骨的研究 可注射软骨移植后3 mo,3种水凝胶类载体材料均呈现不同程度的吸收,并有大量软骨组织的形成.免疫组织化学检查显示,在所形成软骨中有大量Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的形成.对照组无软骨形成.

  3 讨论 组织工程支架材料的研究和应用是组织工程组织建造的关键问题[1],我们首次采用松质骨基质作为支架建造组织工程骨,并证明了其可行性,为进一步深入研究该支架材料的应用及组织工程骨的血管化问题奠定了基础.可注射性软骨的成功建造具有广泛的临床应用前景[3],同时我们更加关注骨/软骨复合组织的建造,因为该项工作将面临关节结构的形成,是组织工程更具挑战的课题.

  基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770762),军队医药卫生科研基金资助项目(98M104)

  作者简介:杨维东(1961-), 男(汉族),甘肃省武山县人. 副教授, 副主任医师, 硕士. Tel.(029)3376102杨维东(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,陕西西安 710033)

  毛天球(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,陕西 西安710033)

  陈富林(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,陕西 西安710033)

  顾晓明(第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科,陕西 西安710033)

  参考文献

  [1]Lanza rP, Langer R, Chixk W. Principle of tissre engineering: Bone and cartikage reconstruilage reconstuction [M]. Acad Press, 1996:619-652.

  [2]Whang K, Healy KE, Ekenz DR et al. Engineering bone reconstruction with bioabsorble scaffolds with novel microarchiecture [J]. Tissue Engineering,1999;5(1):35-51.

  [3]Wakitani S, Goto T, Young RG et al. Repair of large full-thickness articular cartilage defects with allografts articular chondrocytes embedded in a collagen Gel [J]. Tissue Engineering, 1998;4(4):429-434.

日期:2004年9月23日 - 来自[生物医学工程]栏目
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利用组织工程技术再生软骨组织的实验研究

  【摘要】 目的 在有免疫力的动物体兔体内探索组织工程化软骨生成的影响因素。 方法 经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架与软骨细胞体外培养,观察基质产生情况,并将细胞支架复合物体内回植,观察软骨的生成,并进行组织学及超微结构评价。 结果 以卵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养,结果基质产生旺盛,体内回植后软骨生成良好。 结论 细胞支架复合物体外培养期间有基质产生,是组织工程化软骨生成的前提条件;以卵磷脂、多聚赖氨酸及聚乳酸共同修饰的聚羟基乙酸支架与软骨细胞复合培养后回植到有免疫力的动物体内可生成组织工程化软骨。


  The experimental study of morphogenesis of cartilage tissues by means of tissue engineering techniques LIU Yanchun,WANG Wei,CAO Yilin,et al. Department of Plastic Surgery,Shanghai Ninth Peoples Hospital,Affiliated to Shanghai Second Medical University,Shanghai,200011


  【Abstract】 Objective To find the factors affecting the morphogenesis of tissue-engineered cartilage in animals who have inherent immunity. Methods To culture chondrocytes seeded onto polyglycolic acid(PGA) scaffolds coating with different materials,observe the production of matrices secreted by chondrocytes and implant the constructs of chondrocytes and scaffolds into subcutaneous of rabbits.The formation of cartilage were evaluated using histology and electron microscope. Results The chondrocytes produced more matrices when seeded onto PGA scaffolds coating with PLA,LEC and PLYS.The formation of cartilage was excellent when the constructs above were implanted into the subcutaneous of rabbits. Conclusion The more production of matrices,the better formation of tissue-engineered cartiolage;The constructs of chondrocytes seeded onto PGA coating with PLA,LEC and PLYS can form tissue-engineerd cartilage in animals who have inherited immunity.


  【Key Words】 Cells Cartilage Regeneration Tissue-engineered


  目前有关组织工程化软骨的研究大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行[1]。在有免疫力的动物体内形成组织工程化软骨的研究报道较少,而且目前所用固体细胞培养支架主要是以聚乳酸修饰的聚羟基乙酸,存在着亲水性差,对细胞吸附力弱等缺点[2]。本课题通过不同物质修饰的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养后回植,探讨在有免疫力的动物兔体内组织工程化软骨形成的影响因素,为软骨组织工程技术过渡到临床应用提供理论依据。


   材料与方法


  一、聚羟基乙酸支架的表面修饰


  将直径15 μm纤维间隔150~200 μm厚度100μm的聚羟基乙酸 (Polyglycolic acid,简写PGA)无纺网(DAVIS-GECK公司提供)以2%的聚乳酸(Polyglycolic acid,简写PLA)二氯甲烷溶液包埋固定再分别以1%的卵磷脂(Lecithin,简写LEC)无水乙醇溶液及10%多聚赖氨酸(Poly-1-lysine,简写PLYS)包埋,得到四种经不同物质修饰的聚羟基乙酸支架;(1)PGA加PLA;(2)PGA加PLA加LEC;(3)PGA加PLA加PLYS;(4)PGA加PLA加LEC加PLYS。支架消毒采用75%酒精浸泡及紫外线照射。


  二、软骨细胞悬液制备[3]


  取新西兰大白兔一侧耳廓软骨(兔体重2.0~2.5 kg,雌雄不限)。所取软骨剥去软骨膜,剪成0.1 cm×0.1 cm大小的碎片,以磷酸盐缓冲液(PBS,含青霉素200 U/ml,链霉素200 μg/ml)冲洗两遍,以去除残余血迹。然后加入两倍于软骨体积的Ⅱ型胶原酶(Sigma 公司,3 mg/ml)在37℃恒温振荡器内消化。4~5小时收获细胞1次,2~3次后软骨碎片完全溶解细胞从基质中释放出来。经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液,浓度为5×107个/ml。


  三、培养液用F-12培养基加入10%的小牛血清及青霉素100 U/ml,链霉素100 μg/ml。


  四、细胞支架复合物体外培养


  将上述支架分别裁剪成1.5 cm×2.0 cm大小,每个支架中加入细胞悬液250 μl,然后将4种细胞支架复合物分别置入60 mm培养皿中,放入37℃ 5%CO2培养箱中,4小时后加入培养液5 ml,抗坏血酸50 μg/ml,人转化生长因子-bl(TGF-bl,MegaGene公司)10 ng/ml,人碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF,MegeGene公司)2 ng/ml。培养液每3天更换1次。定期在倒置显微镜下观察细胞与支架的吸附、生长繁殖及基质产生情况。


  五、细胞支架复合物体内回植


  新西兰大白兔12只,于每只兔背部不同部位皮下种植单纯四种支架及四种自体细胞支架复合物,3个月后取材进行大体、组织学及透射电镜检测观察有无软骨组织生成,并与原耳廓软骨进行比较。


  结果


  一、细胞支架复合物体外培养期间观察


  培养期间倒置显微镜观察及扫描电镜检测见支架1细胞复合物无基质产生;支架2细胞复合物有少量基质产生;支架3细胞复合物于支架纤维间有呈蜘蛛网样分布的基质产生;支架4细胞复合物于支架纤维之间或支架纤维表面有较多呈蜘蛛网样分布的基质产生。


  二、软骨生成情况观察


  3个月后对12只兔背部不同部位皮下埋置物进行大体观察及组织学、透射电镜检测,结果如下:单纯支架种植均无软骨生成;支架1细胞复合物回植12个标本中2个有软骨生成,但生成的软骨体积远远小于植入的细胞支架复合物体积;支架3、4细胞复全物回植12个标本均有软骨生成,且生成的软骨体积基本等于支架复合物体积,组织学及电镜检测与原兔耳廓软骨相同。

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  讨论


  一、细胞支架复合物体外培养期间基质产生情况是评价软骨细胞功能的指标之一。3、4支架细胞复合物体外培养期间基质产生旺盛,说明软骨细胞较好地发挥了功能,主要由于多聚赖氨酸对支架的修饰不仅增强了支架对细胞的吸附性,而且具有促进细胞发挥功能的作用[4];1、2支架未经多聚赖氨酸包埋,则无或较少有基质产生。


  二、软骨生成与否及生成量的多少与细胞支架复合物体外培养期间基质产生情况密切相关。支架1细胞复合物体外培养期间无基质产生,故回植后无软骨生成;支架2细胞复合物体外培养期间基质产生较少,故12个标本中2个有软骨生成,且生成软骨体积远远小于细胞支架复合物体积;支架3、4细胞复合物体外培养期间基质产生旺盛,故回植后12个标本均有软骨生成,且生成软骨体积基本等于细胞支架复合物体积,其组织学及电镜检测与原耳廓软骨基本相同。


  三、以往组织工程化软骨的研究大部分是在无免疫力的裸鼠体内进行,而在有免疫力的动物体内研究报道较少。本实验证明在有免疫力的动物兔体内可形成组织工程化软骨组织,为软骨组织工程技术过渡到临床应用提供了理论依据。


  本课题为上海市领先学科资助课题


   参考文献


  1 Vacanti CA,Upton J.Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices.Clin Plas Surg,1994,21:445-448.


  2 刘彦春,王炜.软骨工程技术及其应用.中国修复重建外科杂志,1997,11:300-303.


  3 Klagsbrum M.Large-scale preparation of chondrocytes.Method Enzymol,1979,58:560-566.


  4 刘彦春,王炜,曹谊林,等.包埋后的聚羟基乙酸与软骨细胞体外培养的实验研究.中华显微外科杂志,1998,21:36-38.

日期:2004年9月23日 - 来自[生物医学工程]栏目

髌骨软骨软化症的手法治疗

【关键词】  髌骨软骨软化症  推拿疗法

1  临床资料
1.1  一般资料  本组64例,其中男性31例,女性43例;年龄最小的42岁、最大67岁,42~50岁15例、51~67岁49岁;病程最短7个月,最长9年。所有病例均经X线摄片或CT检查确诊。
1.2  诊断要点  ①症状:膝关节内隐痛、酸胀、乏力,逐渐加重至膝内疼痛,活动及半蹲位时尤甚,下楼时表现艰难痛苦,关节有弹响及摩擦感,行走呈小步,有骨四头肌萎缩现象,还可伴有关节积液。②检查:髌骨两侧偏后外处压痛,膝半蹲及下蹲困难,挺髌试验阳性,骨四头肌张力差,髌骨边缘有触痛感。③X线征象:髌骨边缘骨质增生,软骨表面有囊状吸收区,骨硬化改变及粗糙不平,髌骨关节间隙狭窄,关节中可见“关节鼠”,髌骨位置外移。
1.3  治疗方法  ①推压法:患者俯卧位,由于膝关节的神经血管及承力与腰椎有关,因此医者先用双手大拇指指腹对L2、3、4横突处作上下反复的推压,力量稍大到患者能承受,时间5 min,以患者自觉局部或臀部有温热感为好。②按推法:患者仰卧位,使患肢伸直。医者用大拇指指腹在膝关节周围的足三里、阳棱泉、阴棱泉、三阴交等穴,按压后加力推,最好不移动拇指,可反复施行5 min。③扌衮法:患者俯卧位,医者用握空拳手的本节在膝腘窝内、大小腿之间、股下1/3及腓上1/3处作着力扌衮动,上下反复10次。④推理法:患者仰卧,患肢半屈位。医者用一手的大拇指指腹在髌骨周围作重点的推动,既要求指力深透有力,又不使髌骨滑动,慢慢的在双膝眼、髌腱、股四头肌肌腱及髌骨周围推动。时间10 min,使患者膝髌处有灼热感为宜。手法治疗1次/ d,10次为一疗程,2~3个疗程效果明显。
2  疗效观察
2.1  疗效标准  临床治愈:症状消失,关节活动正常;显效:症状基本消失,关节活动正常;好转:症状减轻,跨大步或下蹲时稍感酸楚;无效:症状及活动功能与治疗前比较无明显变化。
2.2  治疗结果  临床痊愈30例(47.0%),显效24例(37.5%),好转6例(9.3%),无效4例(6.2%),总有效率为93.8%。
3  讨 论
    髌骨软骨软化症与腰膝部位的长期劳累、过度的活动、潮凉的环境有着密切的关系,由于髌软骨的长期损伤性变,膝关节压力分布不均,使软骨周围的微循环发生障碍,加上损伤后自身修复变化多发生在表面,,初期造成软骨面破碎、水肿、渗出、增粗、钙化、脱落、凹凸不平及髌骨的移位,继而出现裂痕加深、破碎坏死脱落,逐步使损伤面扩展,直至软骨下骨质显露,在软骨面被破坏的同时,还有组织自身修复所造成的增生等病理变化。
    髌骨软骨软化症是临床上常见的一种多发病,好发于中老年人,由于中老年人肝肾气衰、筋骨失养,加之气血不足伤及骨质,骨伤则气血不畅而闭塞,气血闭塞不通则筋骨、肌肉、关节疼痛,久之则关节伸屈不利、终日麻木痛楚。应用推拿手法治疗的原则主要是改变膝髌部周围软组织的血液循环,逐步清除髌下沉积物。推压法可行气逐瘀、活血通络,按推法可温通经脉、开通闭塞,扌衮法可舒筋活络、调和营卫,推理法可祛瘀生新、分离粘连。综合此法可以行气活血,加快血液回流,增强股四头肌及髌腱的张力,加速膝关节内容物的吸收与修复。达到稳定髌骨功能、防止新的创伤产生、恢复膝关节的力量的目的。

(审稿:杨志强  编校:张  鹏)

日期:2004年6月29日 - 来自[经验交流]栏目
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鼻尖美容术

  俗话讲的鼻头,医学上称为鼻尖。外鼻的整形美容术,统称为鼻成形术。对于一个鼻尖形态不算好的低鼻者,隆鼻术后的感觉往往难以达到完美的地步,此时若能行鼻尖美容术,犹如画龙最后一笔的“点睛”。

  鼻尖的好看与否,是由支撑鼻尖的支架结构决定的,起主要作用的是鼻冀软骨内、外侧脚和穹窿部;其次是鼻侧软骨,鼻中隔软骨部。理想的鼻尖具备适宜的突度、角度和一些精致的点、面。

  常用的鼻尖美容术。

  低鼻尖矫正术

  软骨移植法 在鼻孔内做鼻缘切口,或做软骨内切口,切除鼻翼软骨的头侧部分或鼻侧软骨的尾侧部分,切取下来的软骨,切削成形后,缝在穹窿的顶部以抬高鼻尖,也可切取耳甲软骨移植。

  双侧鼻翼软骨内脚靠拢法 做双侧鼻小柱侧面切口,切除两内侧脚之间的软组织,然后在其近上、下端处各做褥式缝合一针,即将双内侧脚靠拢。此法可抬高鼻尖2-3mm。

  鼻翼基底楔形切除法 如鼻尖形态较好,仅是略低时,在双侧鼻翼基底切除一块楔形的全厚组织,使鼻孔内收、穹窿部上突,即抬高了鼻尖。

  超高鼻尖矫正术 适宜突度的鼻尖,是指由鼻背向鼻尖过渡,是平直抬高的过程。如有较大的弧度抬高,则称超高鼻尖。手术矫正效果良好。将穹窿部的最突出部分适当全层切除一段,接头两侧软骨间断浅层划开,目的是使其减弱,形成的鼻尖峭而不锐。切除的部分也可位于鼻翼软骨内侧脚的基底,但其效果不如在穹窿部切除。

  钝平鼻尖矫正术 仰视观察时,美学上的标准鼻尖呈锥体状,有悖于此的钝平鼻尖显然不美。有些人找到美容外科医生说:“请把我的‘猪鼻子’改一改”。此言道出此类鼻子到了非做手术不可的地步。手术采取鼻孔内鼻翼缘切口,在双侧鼻翼软骨的穹窿部其表面做切口3-6条,将鼻翼软骨内侧脚间的软组织切除,褥式缝合拉拢两内侧脚。如鼻尖较低,可移植软骨抬高之。

  肥厚鼻尖矫正术 人们俗称这类鼻子为“蒜头鼻子”。原因是皮肤较厚,皮下组织量多,软骨支架肥厚且有向外膨隆之势。肥厚鼻尖矫正术被称为缩鼻术,治疗这类鼻尖的手术最具挑战性,手术采取缘切口或软骨间切口,均匀鼻翼软骨与鼻侧软骨剪除各个部位的纤维脂肪组织。切除鼻翼软骨头侧的1/2—2/3,向内侧和头侧旋转外侧脚,此时可见鼻翼内收。在鼻翼软骨穹窿部间断划开软骨,不可切断。加固鼻孔或横鼻孔;如鼻尖欠高,可将切下的软骨垫在穹窿表面,以抬高鼻尖。

  鼻尖美容术与鼻成形术一样 :复杂多样,隐蔽精致,要求美容外科医生对鼻的美学有较深刻的理解。

日期:2004年4月10日 - 来自[整形美容]栏目
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