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新方法在不改变细胞基因组的前提下帮助激活基因的表达

    当前干细胞研究中最热门的话题就是开发出可以调节细胞分化的方法,细胞的分化过程基于细胞中的基因是否处于激活或失活的状态,因此研究人员正在寻找多种方法来控制基因的表达,他们梦想有一天可以开发出新型方法,在特定时间段内精确调节基因的激活表达和失活。
    最近,发表于国际杂志Stem Cell Reports上,来自芬兰赫尔辛基大学的研究者开发了一种新方法,其可以在不改变细胞基因组的前提下帮助激活基因的表达,而这一方法的应用就包括直接进行干细胞的分化研究。
    研究者Otonkoski表示,我们可以通过专门的细胞产生未分化的细胞,称之为诱导多能干细胞(iPS),同时还可以通过提供合适类型的生长环境来调节这些细胞的分化;然而研究者并不能够充足有把握地控制细胞的分化过程以确保该过程顺利进行,而且分化最后单一的基因或许在必要的时间不会激活表达,而且细胞也会维持未成熟的状态。
    在细菌和古菌中广泛存在的成簇的规律间隔的短回文重复序列,即CRISPR系统就可以通过在特定位点对DNA进行切割来编辑基因,CRISPR系统通常被用于从细胞中移除错误的基因或引入可以进行特殊意愿表达的移植基因。文章中研究者就开发了一种新方法,该方法可以在不改变细胞基因组的情况下来调节单一基因的行为,该方法利用CRISPR系统,而该系统自身的调节可以被额外的化学物来控制。
    因此研究者就可以通过将少量RNA引入到细胞,使得RNA同基因调节区域中的活性蛋白进行结合,进而使得所需的基因可以接纳特殊药物,而当调节活性蛋白的化学物被提供给细胞时,所需基因就会按照意愿的方式进行激活。本文研究中研究者利用了两种常见的抗生素—多西环素和甲氧苄啶,这两种抗生素可以帮助精确且高效调节许多基因的表达,而且研究者指出,该方法可以在多种被检测的细胞中发挥作用,包括干细胞等。
    最后研究者强调说,当前该方法仅用于实验模型中,距离临床应用还差一段距离,研究者认为这种新型方法可以作为一种重要的研究工具,来在实验室帮助调节干细胞的分化,从而为后期开发新型潜在的疾病治疗手段提供帮助。

日期:2015年9月15日 - 来自[遗传与基因组]栏目
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Stem Cell Rep:新技术可控基因表达 调节干细胞


最近,来自芬兰赫尔辛基大学的研究者开发了一种新方法,其可以在不改变细胞基因组的前提下帮助激活基因的表达,而这一方法的应用就包括直接进行干细胞的分化研究,相关研究发表于国际杂志Stem Cell Reports上。

当前干细胞研究中最热门的话题就是开发出可以调节细胞分化的方法,细胞的分化过程基于细胞中的基因是否处于激活或失活的状态,因此研究人员正在寻找多种方法来控制基因的表达,他们梦想有一天可以开发出新型方法,在特定时间段内精确调节基因的激活表达和失活。

研究者Otonkoski表示,我们可以通过专门的细胞产生未分化的细胞,称之为诱导多能干细胞(iPS),同时还可以通过提供合适类型的生长环境来调节这些细胞的分化;然而研究者并不能够充足有把握地控制细胞的分化过程以确保该过程顺利进行,而且分化最后单一的基因或许在必要的时间不会激活表达,而且细胞也会维持未成熟的状态。

在细菌和古菌中广泛存在的成簇的规律间隔的短回文重复序列,即CRISPR系统就可以通过在特定位点对DNA进行切割来编辑基因,CRISPR系统通常被用于从细胞中移除错误的基因或引入可以进行特殊意愿表达的移植基因。文章中研究者就开发了一种新方法,该方法可以在不改变细胞基因组的情况下来调节单一基因的行为,该方法利用CRISPR系统,而该系统自身的调节可以被额外的化学物来控制。

因此研究者就可以通过将少量RNA引入到细胞,使得RNA同基因调节区域中的活性蛋白进行结合,进而使得所需的基因可以接纳特殊药物,而当调节活性蛋白的化学物被提供给细胞时,所需基因就会按照意愿的方式进行激活。本文研究中研究者利用了两种常见的抗生素—多西环素和甲氧苄啶,这两种抗生素可以帮助精确且高效调节许多基因的表达,而且研究者指出,该方法可以在多种被检测的细胞中发挥作用,包括干细胞等。

最后研究者强调说,当前该方法仅用于实验模型中,距离临床应用还差一段距离,研究者认为这种新型方法可以作为一种重要的研究工具,来在实验室帮助调节干细胞的分化,从而为后期开发新型潜在的疾病治疗手段提供帮助。

日期:2015年9月15日 - 来自[技术要闻]栏目

玉米虫害间接防御基因表达调控机制


近日,从中国农业科学院生物技术研究所获悉,该所玉米功能基因组创新团队与中国农科院植物保护研究所合作,在揭示玉米虫害间接防御基因—萜类合成酶基因TPS10表达调控机制上取得新进展。该研究成果在线发表于最新一期的国际著名刊物《植物学杂志(The Plant Journal)》上。

据悉,植物中天然存在着复杂的防御体系,当植物受到害虫咬噬后,其释放的萜类化合物可以吸引害虫天敌来启动间接防御系统。玉米作为我国的第一大作物,虫害是制约玉米产量的关键因素之一。因此研究玉米萜类合成酶基因的表达调控机制,对于解析玉米防御体系的分子调控网络及培育抗虫玉米品种具有重要意义。

玉米萜类合成酶TPS10是催化玉米倍半萜类物质产生的关键酶,该研究团队利用模式植物“拟南芥”分析玉米TPS10基因的启动子序列,得到启动子-300至-200区段为基因诱导表达所必须的功能序列,通过酵母单杂交、生物信息学分析、凝胶阻滞、原生质体瞬时表达分析及转基因玉米验证,最终确定玉米EREB58基因是调控玉米TPS10基因表达的关键基因。EREB58基因编码一个ERF(植物转录因子)家族的转录因子,通过与TPS10启动子中的顺式作用原件GCC-box结合,激活TPS10基因的表达并诱导玉米产生法尼烯和(E)-α-香柑油烯,达到间接防御的目的。该研究工作揭示了ERF家族中的EREB58基因通过调控TPS10基因的表达参与玉米的间接防御,为解析玉米及其他植物防御体系的分子调控网络提供新的研究思路。

该研究得到了国家自然科学基金的资助。李圣彦、汪海为文章的共同第一作者,郎志宏、黄大昉为通讯作者。

研究成果在线发表链接:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.12994/abstract

日期:2015年9月11日 - 来自[技术要闻]栏目
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我国揭示玉米虫害间接防御基因表达调控机制


近日,从中国农业科学院生物技术研究所获悉,该所玉米功能基因组创新团队与中国农科院植物保护研究所合作,在揭示玉米虫害间接防御基因—萜类合成酶基因TPS10表达调控机制上取得新进展。该研究成果在线发表于最新一期的国际著名刊物《植物学杂志(The Plant Journal)》上。

据悉,植物中天然存在着复杂的防御体系,当植物受到害虫咬噬后,其释放的萜类化合物可以吸引害虫天敌来启动间接防御系统。玉米作为我国的第一大作物,虫害是制约玉米产量的关键因素之一。因此研究玉米萜类合成酶基因的表达调控机制,对于解析玉米防御体系的分子调控网络及培育抗虫玉米品种具有重要意义。

玉米萜类合成酶TPS10是催化玉米倍半萜类物质产生的关键酶,该研究团队利用模式植物“拟南芥”分析玉米TPS10基因的启动子序列,得到启动子-300至-200区段为基因诱导表达所必须的功能序列,通过酵母单杂交、生物信息学分析、凝胶阻滞、原生质体瞬时表达分析及转基因玉米验证,最终确定玉米EREB58基因是调控玉米TPS10基因表达的关键基因。EREB58基因编码一个ERF(植物转录因子)家族的转录因子,通过与TPS10启动子中的顺式作用原件GCC-box结合,激活TPS10基因的表达并诱导玉米产生法尼烯和(E)-α-香柑油烯,达到间接防御的目的。该研究工作揭示了ERF家族中的EREB58基因通过调控TPS10基因的表达参与玉米的间接防御,为解析玉米及其他植物防御体系的分子调控网络提供新的研究思路。

该研究得到了国家自然科学基金的资助。李圣彦、汪海为文章的共同第一作者,郎志宏、黄大昉为通讯作者。

研究成果在线发表链接:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.12994/abstract

日期:2015年9月11日 - 来自[技术要闻]栏目

Nature Communications:关键基因过表达会加重慢性肾脏疾病

近期,一个由美国纽约西奈山伊坎医学院John C. He领导的课题组在《Nature Communications》上发文称,他们发现了一个关键蛋白质水平会影响肾脏健康。这个课题组发现了一个生物标记蛋白RTN1,可能可以促进慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)病情更加严重。针对这个蛋白质,研究人员认为今后可以通过调控这个蛋白表达量,影响肾脏疾病病情的发展。

慢性肾脏病(CKD)在美国成年人群中非常普遍,据估计,有10%的美国成年人患有慢性肾脏病,而且在世界范围内,这个病的患病率一直在增长。现在没有很好的针对慢性肾脏病的治疗方法,而且最多只能有些方法提供很有限的保护,可以延缓病情严重化。这个慢性肾脏病最终会导致患者不得不依赖透析,或者进行肾脏移植。在患有慢性肾脏病的小鼠和人体中,研究者们首次检出了RTN1蛋白的一个变体RTN1A存在很高的表达量。但是,相反地,在患有糖尿病肾病( diabetic nephropathy)小鼠和人体内,这个蛋白的表达量很低。这说明RTN1蛋白的表达水平与肾脏疾病可能存在着一定关联。

进一步的实验发现,在体外培养的肾脏细胞中,过表达RTN1蛋白可以导致内质网存在很大应激压力和细胞凋亡。同时,通过基因敲除降低RTN1的表达量,则可以导致衣霉素诱导、高血糖诱导的内质网应激压力减小和细胞凋亡的减少。RTN1A可以用自己的N端、C端的结构域与PERK相互作用,这样会导致内质网的应激压力增加。针对RTN1A与PERK蛋白结合位点的突变,发现内质网的应激压力降低了。在小鼠内的实验发现,基因敲除RTN1A对应基因的小鼠,肾脏细胞内质网应激减少,单侧输尿管梗阻的小鼠肾脏细胞纤维化趋势也有所减少,与此同时,在糖尿病小鼠体内,内质网应激压力也减少了,蛋白尿、肾小球肥大、系膜扩展等症状都有缓解。

这项研究首次发现了慢性肾脏病相关的一个标记蛋白RTN1,人类中这个蛋白的一种变体RTN1A的过量表达与慢性肾脏病的严重化正相关,其影响肾脏细胞健康的机制可能是,这种蛋白会给细胞带来内质网应激压力和细胞凋亡增加。今后,如果能够针对这种蛋白开发出一种抑制剂,减少这种蛋白的表达或者减少其生理活性,或许科研为慢性肾脏病的防治带来新的途径。

日期:2015年8月4日 - 来自[肾脏相关]栏目
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版纳植物园筛选出美藤果基因表达分析的内参基因

美藤果是大戟科、多年生木质藤本植物,其种子含油率高达40%,且从美藤果种子中榨取的植物油富含多元不饱和脂肪酸,尤其是富含类似于深海鱼油的ω-3脂肪酸,可用于食品、保健、制药、化妆品等方面,对调整血脂、预防心血管疾病、保养肌肤等具有显著的作用。据最新的研究表明,美藤果油也可用于加工生物柴油。因此,美藤果是一种具有很大发展潜力的保健植物和能源植物。近年来,有关美藤果的研究越来越深入,但迄今为止,还没有针对美藤果基因表达分析筛选出合适的内参基因。随着RT-qPCR实验技术的广泛应用,在分析基因的表达量时选择合适的内参基因作为参考标准显得尤为重要。

  

中国科学院西双版纳热带植物园热带植物资源可持续利用重点实验室能源植物分子育种组与中国科学技术大学联合培养的博士研究生牛龙见等在导师徐增富的指导下,采用RT-qPCR技术并结合ΔCt、geNorm、BestKeeper和NormFinder 四种运算方法,首先获得不同算法下得出的最适内参基因,然后通过RefFinder软件综合四种算法的结果,最终从12个常用的候选内参基因中筛选出5个实验样品集(共16个样品)的内参基因组合。结果表明:UCE、ACT、PLA在美藤果幼苗中最稳定;在成年美藤果植株中RPS13、CYC、EF1a表达最稳定;在花发育过程中,PLA、ACT、UCE最适合用作内参基因;在种子发育过程中,UCE、RPS13、RPII是最稳定表达的内参基因;在所有的组织样品中,UCE、ACT、EF1a是最佳选择的内参基因。该研究结果为利用RT-qPCR技术准确地分析美藤果基因在不同生长发育阶段的表达奠定了重要的基础。

  

相关研究结果以Selection of reliable reference genes for gene expression studies of a promising oilseed crop, Plukenetia volubilis, by real-time quantitative PCR 为题发表于国际专业期刊International Journal of Molecular Sciences(2015, 16, 12513-12530)。

日期:2015年6月16日 - 来自[技术要闻]栏目

The Scientist:从芯片到RNA-seq的转型之路


自二十世纪九十年代中期以来,芯片就一直是基因组表达分析的中坚力量。在这一技术最辉煌的时期,准备研究基因表达模式的人都会想到使用芯片。不过随着测序成本的直线下降,RNA测序(RNA-seq)成为了越来越受欢迎的转录组分析方法。

DNA芯片上排列着大量的核酸探针,可以代表生物的整个基因组或部分基因组,比如外显子、miRNA、单核苷酸多态性SNP等等。用芯片分析基因表达需要抽提RNA,将其反转录为cDNA,然后进行荧光标记。芯片上各点的信号强弱,代表了该探针目的基因的表达量。

RNA-seq主要是将RNA转化为cDNA文库,然后进行直接测序。虽然处理原始数据比较麻烦,但RNA-seq能够做得到芯片做不到的事。RNA-seq可以揭示未知的转录本、基因融合和遗传多态性,而芯片只能检出明确的已知目标。在测序深度足够的情况下,RNA-seq在高丰度和低丰度转录本检测中都比芯片有效。

不过由于芯片可以快速分析大量样本,该技术在这方面还将继续占据统治地位,FDA国家毒理学研究中心的Weida Tong指出。不过,科学研究最终将完全转向RNA-seq,Tong说。在此之前,芯片和RNA-seq数据应当更加兼容,RNA-seq数据的分析和储存必须进一步简化。“这就像是临产前的阵痛期,”Tong说。“一旦完成这个痛苦的过程,大家就能真正享受到技术带来的福利。”

The Scientist杂志与多位专家共同探讨了从芯片到RNA-seq的过渡,希望帮助研究者们顺利度过这段艰难的转型期,最终实现华丽转身。

通向全新世界

芯片分析依赖于已知的基因组信息,这也是该技术的最大局限。显然,在探索性研究和非模式生物研究中,RNA-seq才是真正的大赢家。RNA-seq的转录组分析是无偏好的,可以揭示新剪接点、小RNA以及芯片漏掉的新基因。

“与芯片探针不同,RNA测序不需要预先知道序列信息,”安捷伦科技公司的Kevin Poon说,“因此它是一个理想的研发平台,能够获得转录本序列并在此基础上发现突变和融合转录本。”

改用RNA-seq的研究者们往往是“看到了芯片无法检出的生物学信息,”赛默飞世尔公司的Anup Parikh指出。举例来说,南佛罗里达大学(USF)Christina Richards实验室的研究生Mariano Alvarez正在研究2010墨西哥湾漏油事件对当地植物的影响。他们最初是用芯片在评估基因表达,但现在他们已经引入了RNA测序数据,以获得更为丰富的信息。

没有底线的检测

芯片检测的动态范围比较窄,在转录本丰度很低的情况下,RNA-seq才是你正确的选择。Tong及其同事去年用Illumina RNA-seq平台和Affymetrix芯片,评估了大鼠肝脏在药物处理下的基因表达改变。他们发现,在检测丰度较高的基因时,RNA-seq和芯片的结果基本一致。但在检测表达水平低的基因时,RNA-seq更加准确。这一结论也得到了其他一些研究的支持。

造成这种差异的主要原因是,当基因低水平表达时,芯片中结合探针的cDNA发出较弱的荧光,难以压倒背景荧光。对于RNA-seq而言,覆盖度越高能检测的转录本水平就越低,没有绝对的下限。当然,RNA-seq也没有绝对的检测上限。而芯片在检测表达量很高的基因时,可能会出现饱和。

生命力依然顽强

尽管RNA-seq有许多优势,但许多研究者还是在继续使用芯片,尤其是样本量比较大的研究。芯片在临床研究中也很吃香,因为它的数据处理又快又简单。“芯片能提供高度一致的数据,分析软件也相当成熟,”Poon说。“通过分析成百上千的样本,基因和miRNA的表达特征已经被赋予了临床上的诊断价值。”

“我会一直使用芯片,”MitoGenetics公司的Kirk Mantione说。“我知道要做些什么,结果也更容易解读。”

Mantione使用芯片对自己开发的药物进行评估,在细胞系和动物中分析这些药物对基因表达的影响。芯片可以快速给出结果,展示药物对特定基因的作用。不过Mantione也希望用RNA-seq研究那些还不成熟的生物模型,或者寻找之前没有发现的转录本多态性。

有时候,人们继续使用芯片只是因为想要对新数据和旧数据进行比较,如果所有的数据都是以同样的方式获得的,比较起来自然更为容易。

Affymetrix公司建议大家先用芯片快速筛查大量样本,然后用这些结果指导RNA-seq。此外,芯片也可以用来验证RNA-seq的数据。

日期:2015年6月12日 - 来自[技术要闻]栏目
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军事医学科学院:差异表达蛋白统计研究方法比较

随着质谱技术的快速发展, 蛋白质组学已成为继基因组学、转录组学之后的又一研究热点, 寻找可靠的差异表达蛋白对于生物标记物的发现至关重要. 因此, 如何准确、灵敏地筛选出差异蛋白已成为基于质谱的定量蛋白质组学的主要研究内容之一. 目前, 针对该问题的研究方法众多, 但这些方法策略的适用范围不尽相同. 近期来自军事医学科学院,大连海事大学的研究人员发表了评述,介绍了几种基于质谱技术筛选差异蛋白的统计学策略,并比较它们各自的优缺点。

蛋白质组学是后基因组时代兴起的一个重要的研究方向, 意在从整体水平上对组织或细胞内表达的全部蛋白进行定性和定量分析. 蛋白定性分析起步较早, 随着质谱技术的不断发展, 已日渐成熟, 单一样本可以实现8000 以上蛋白的鉴定规模. 长久以来, 临床生物标记物的发现是蛋白质组学研究的热点, 对探索疾病机理和药物制备具有特别重要的意义, 而蛋白定量分析对这一研究的开展具有促进作用. 在定量研究方面, 围绕质谱数据进行差异蛋白筛选, 进一步实现生物标志物的发现与生物学特性的分析, 已成为定量蛋白质组学研究的一个重要方向.

 

基于质谱技术进行蛋白鉴定、定量及差异蛋白筛选的基本流程可以分为实验和数据分析2 部分.

(ⅰ) 实验部分. 包括从生物样本的制备, 蛋白混合物的预处理, 到酶解肽段的质谱分析等一系列过程;

(ⅱ) 数据分析部分. 包括质谱仪器获取原始数据后的所有数据处理的过程, 从蛋白鉴定、定量到差异蛋白筛选, 并且每一过程均涉及相应的质量控制和统计学分析. 基于质谱的定量研究可计算肽段的丰度信息, 原则上, 可由肽段表达量推断出蛋白的表达量, 但此过程需要解决2个困难, 即肽段计算过程中信号峰缺失及共享肽段的问题. 对于前者, 可选择使用估计值填充缺失的数据, 以完善实验数据, 或者是在统计检验前, 利用肽段的天然同位素分布过滤噪声信号, 以选择最佳的肽段数据集进行实验; 对于后者, 可选择使用合理分配的准则处理共享肽段. 

肽段/蛋白表达水平值的准确定量对深入研究蛋白质组学意义匪浅, 它的一个主要目的是筛选差异表达蛋白. 差异表达蛋白指在不同实验条件下或不同的处理组中, 蛋白表达水平的检测值在排除系统随机噪声后达到一定的差异, 具有统计学意义, 同时也具有生物学意义, 差异蛋白筛选过程, 即是对定量结果做合理的统计推断. 因此, 利用统计学基本原理对差异表达蛋白进行显著性分析就显得十分重要.

总体来说, 定量蛋白质组学的数据分析存在3大主要问题: 数据的缺失值较多、实验的重复次数较少和结果的质量/可靠性参差不齐, 这对差异蛋白的筛选带来巨大挑战. 

针对前2个问题, 研究人员已提出若干方法和工具, 这些方法各有利弊, 但很少能同时考虑2方面. 根据所属的统计学派别不同, 具体可以将它们分为3大类: 基于经典统计学派的策略、基于贝叶斯学派的统计检验策略和其他策略. 

这篇文章主要分析总结这些方法及工具的优缺点及应用范围. 针对第3个问题, 为了得到可靠的候选生物标记物, 可对统计检验筛选的结果进行质量控制, 这就需要在实验设计时利用基于内参的方法保证定量结果的可靠性, 或者是在多重假设检验中控制假阳性率. 而这篇文章主要倾向于对后一种方法的介绍, 探讨了对筛选过程产生假阳性的控制方法, 最后还对目前研究中存在的问题以及未来的发展方向进行了讨论和展望. 

日期:2015年5月22日 - 来自[技术要闻]栏目
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