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人肿瘤浸润γδ Τ细胞的抗肿瘤活性研究

人肿瘤浸润γδ Τ细胞的抗肿瘤活性研究

免疫学杂志 2000年第3期第16卷 基础免疫学

作者:陈娟 何维 巴德年

单位:陈娟(中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院免疫室,北京 100005);何维(中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院免疫室,北京 100005);巴德年(中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院免疫室,北京 100005)

关键词:肿瘤;肿瘤浸润淋巴细胞;γδT细胞;细胞毒;细胞因子

  [摘 要]目的 研究人直肠癌和结肠癌的肿瘤浸润γδT淋巴细胞(γδTILs)体外抗肿瘤活性。方法 用固相抗体法体外扩增获得γδTILs,并用MTT法和3H-TdR掺入实验体外观察γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞的细胞毒及增殖反应。结果 所获得γδTILs对所测定的肿瘤细胞显示出明显的细胞毒活性。该杀伤效应可为IL-2,IL-4,IL-12,IL-15,TNF-α和IFN-γ所增强,而不受IL-10,GM-CSF和TGF-β所影响。某些去增殖活性的肿瘤细胞可诱导静息化的γδTILs产生显著的增殖反应。结论 γδTILs可通过其强烈的肿瘤细胞毒参与机体的抗肿瘤免疫应答。

  [中图分类号]R739.8  [文献标志码]A

  [文章编号]1000-8861(2000)03-0175-04

Study on antitumor activity of expanded human infiltrating gamma-delta T lymphocytes

CHEN Juan,HE Wei,BA De-nian

  (Department of Immunology,Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences amd School of Basic Medicine,Peking Union Medical College,Beijing 100005,China)

  [Abstract]Objective To investigate the antitumor activity of selectively expanded human colorectal γδ tumor-infiltrating T lymphocytes(TILs)in vitro.Methods γδTILs were expanded by solid phase-antibody method,whose cytolytic and proliferative activities were detected by MTT method and 3H-TdR incorporation.Results  Expanded γδTILs demonstrated marked cytotoxicites to allogeneic and isogeneic tumor cell lines.Cytokines including IL-2,IL-4,IL-12,IL-15,TNF-α and INF-γ could promote the cytotoxicities of γδTILs,while IL-10,GM-CSF and TGF-β had no effect on such killing activities.Rested γδTILs could proliferate in response to some mitomycin C-treated tumor cells.Conclusions γδTILs could play an important role in antitumor response via their cytotoxicity to tumor cells.

  [Key words]tumor;tumor infiltrating lymphocytes;γδT cells;cytotoxicity;cytokine

  T细胞可依据表面抗原受体(TCR)的不同表达而分成两类T细胞:TCRαβT细胞和TCRγδT细胞。在外周血、脾和淋巴结T淋巴细胞中,γδT细胞所占比例较小,而在表皮及粘膜等上皮组织相对富集,据推测它们可能参与构成机体免疫监视系统的第一道防线[1]。有研究结果显示,在上皮性肿瘤组织中局部浸润淋巴细胞也发现有一定比例的γδT细胞的存在[2,3]。因此,澄清肿瘤浸润γδT淋巴细胞(γδTILs)的性质与功能特点将有助于最终阐释γδT细胞的生物学意义并深化抗肿瘤免疫机制的研究。我们先前进行了肠道γδTILs的体外扩增建系、表型分析和初步的功能研究[4,5]。本文着重研究肠道γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞的杀伤活性,分析细胞因子对其影响作用;同时观察这些肿瘤细胞对肠道γδTILs的增殖诱导作用,以期为阐明γδTILs的功能特性提供资料和为日后可能的临床应用奠定实验基础。

  1 材料和方法

  1.1 试剂及标本

  1.1.1 人肿瘤组织标本:结肠癌和直肠癌标本取自中国医学科学院肿瘤医院病理科及北京协和医院外科,均为术后新鲜标本。病人术前未经放、化疗治疗。

  1.1.2 细胞株:人直肠腺癌细胞系HR8348购自中国医学科学院肿瘤研究所,人Burkitt's淋巴瘤细胞系Daudi及小鼠胸腺瘤细胞系EL-4(H-2Kd)为本室自存。

  1.1.3 主要试剂:人类基因工程重组细胞因子IL-4,IL-12,IL-15,IL-10和TGF-β购自英国PeproTech公司,TNF-α,INF-γ和IL-2购自邦定公司。丝裂霉素C(MMC),四甲基偶氮唑蓝(MTT,配成5mg/ml溶液)购自Sigma公司。氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)购自中科院原子能研究所,比放射活性3700kBq/ml。含10%脐带血清的RPMI1640的完全培养基(RPMI1640干粉系GIBC0—BRL公司产品,脐带血取自北京市妇产医院,0.22μm滤膜过滤除菌)。抗TCRγδ单克隆抗体和荧光标记的单克隆抗体:抗TCR-αβ-PE(IgG2b,clone BMA031),抗TCR-γδ-FITC(IgGl,clone IMMU510)为法国IMMUNOTECH公司产品。

  1.2 方法

  1.2.1 固相抗体活化和扩增肿瘤浸润γδTILs及αβTILs和其纯度鉴定:参见文献[4]。

  1.2.2 细胞毒活性测定:MTT法检测扩增的γδTILs对肿瘤细胞系HR8348,Daudi和EL-4的杀伤活性。效应细胞分别为αβTILs或γδTILs。效靶比分别为1∶5,1∶1和5∶1。具体实验步骤参见文献[5]。

  1.2.3 细胞因子对γδTILs肿瘤细胞毒活性影响测定:γδTILs的静息化处理:取培养中的γδTILs用RPMI1640培养基离心(500×g)洗涤3次,用完全培养基重悬并置于37°C、5%CO2孵箱中静息24h。将细胞因子IL-2(10ng/ml),IL-4(10ng/ml),IL-10(10ng/ml),IL-12(10ng/ml),IL-15(10ng/ml),TGF-β(0.5ng/ml),TNF-α(200ng/ml),GM-CSF(0.5ng/ml)和INF-γ(200ng/ml)分别与静息化的γδTILs孵育过夜。次日检测其对三种靶细胞的细胞毒活性。

  1.2.4 γδTILs增殖活性测定:静息化的γδTILs作为效应细胞,加入96孔圆底培养板中(1×105细胞/孔)。剌激细胞为经不同浓度MMC(50μg/ml,25μg/ml,120μg/ml)分别处理(37°C,30min)去增殖活性的HR8348,Daudi和EL-4肿瘤细胞(1×106细胞/ml),按剌激细胞与效应细胞之比为1∶2,1∶5,1∶10加入培养板中。总体积为200μl/孔。在37°C、5%CO2孵箱中培养24h后,每孔加入3H-TdR 10μl,继续培养8h。收集细胞,用β液闪仪测定掺入量,以每分钟脉冲数(cpm)表示。

  1.2.5 统计学处理:采用t检验增殖反应的显著性;采用χ2检验细胞杀伤百分率的显著性。

  2 结果

  2.1 扩增所得γδΤILs的纯度鉴定 体外固相抗体扩增法培养的细胞在1~2周内开始增殖,4~6周达到对数生长期,其中γδTILs的比例随时间逐渐上升,在3周时达到80%以上(见图1)。每份肿瘤标本可获得108以上的γδTILs。用抗CD3单抗固相扩增可得到αβTILs占绝大比例(>90%)的总T细胞。

图1体外扩增所得γδTILs的纯度的代表性分析

  Fig 1Representative analysis for purification of expanded γδTILs in vitro

  γδ or αβ TILs derived from same case of patient with colon carcinoma were stained with anti-TCR-αβ-PE and anti-TCR-γδ-FITC McAbs respectively.This figure is shown as a re-presentative of similar independent tests from 10 cases.

  2.2 γδTILs对同种异体和异种肿瘤细胞系的细胞毒作用 我们比较了同一标本来源的γδTILs和αβTILs的杀伤能力。如图2所示,γδTILs对异种小鼠胸腺瘤EL-4细胞的杀伤活性明显高于αβTILs(在E∶T范围为1∶1~1∶5之间时,P<0.05);对于同种异体肿瘤细胞HR8348,αβTILs杀伤活性强于γδTILs(P<0.05);而对于Daudi细胞,两者无明显差异(P>0.05)。γδTILs的肿瘤杀伤强度由高到低依次为Daudi,EL-4和HR8348。

图2 γδTILs和αβTILs对同种异体/异种肿瘤细胞的体外杀伤活性

  Fig 2 Cytotoxicity of γδTILs and αβTILs to allogeneic/xenogeneic tumor cell lines in vitro Killing activities of TILs to murine thymoma EL-4(A),human colon adenocarnoma HR8348(B)and human lymphoma Daudi(C)tumor cell lines were measured at E∶T ratio of 1∶5,1∶1 or 5∶1,respectively.Data are expressed as

  2.3 各种细胞因子对γδTILs肿瘤杀伤活性的影响 如图3所示,在效靶比为5∶1的情况下,IL-2,IL-4,IL-12,IL-15,TNF-α和IFN-γ能增强γδTILs对三种靶细胞的杀伤能力,而IL-10,GM-CSF和TGF-β对其则无明显影响作用。

图3 细胞因子对γδTILs杀伤EL-4,HR8348和Daudi肿瘤细胞的影响(效靶比为5∶1)

  Fig 3Effects of varied cytokines on cytotoxicity of γδTILs to EL-4,HR8348和Daudi tumor cells at E∶T ratio of 5∶1 Control means control test without adding to any cytokine

  2.4 γδTILs对去增殖活性肿瘤细胞的增殖反应性 如图4所示,在剌激细胞与效应细胞比例在5∶1~2∶1范围内,去增殖活性的肿瘤Daudi和EL-4细胞系可诱导γδΤΙLs产生明显的细胞增殖反应(与对照比,P<0.05),其中HR8348则没有剌激γδΤΙLs增殖的能力。在效应细胞数量不变的情况下,随着剌激细胞数量不断升高,γδTILs增殖活性有增强的趋势。

图4MMC处理的去增殖活性的肿瘤细胞诱导γδTILs产生增殖

  Fig 4MMC-treated tumor cells induced γδTILs to proliferate The ratios of stimulator cells including Daudi,HR8348 and EL-4 tumor cells to effector cells were 10∶1,5∶1 and 2∶1,respectively.Data are expressed as cpm

  3 讨论

  本文发现,γδTILs显示了高于αβTILs的对异种肿瘤细胞的杀伤活性,而对于同种异体的实体肿瘤HR8348细胞,其细胞毒作用则不及αβTILs。对于另一种γδΤ细胞敏感的靶细胞—Daudi细胞,两种TILs的杀伤作用相仿。由于αβTILs对同种异体靶细胞的杀伤是基于对MHCI类分子的识别,故αβTILs的肿瘤细胞毒实质是同种排斥的体外反应。鉴于一般同种反应性αβΤ细胞克隆在总T细胞群体中有高达2%的存在频率,因此不难理解αβTILs对同种异体和异种肿瘤细胞所表现的强烈杀伤。然而,γδT细胞在杀伤同种异体(可能也包括异种)肿瘤细胞时并不识别其MHCI类抗原[5],我们推测可能与识别某些共同配体有关。研究发现应激条件下细胞表面表达的热休克蛋白是γδT细胞的配体[6]。我们在实验中也发现EL-4和Daudi细胞膜表面均表达高水平的hsp70分子,同时γδT细胞对其杀伤可为抗hsp70抗体所部分抑制(另文发表),这可能为本研究中γδTILs对EL-4和Daudi细胞较强细胞毒活性提供了一种识别机制的解释。最近研究还发现,γδT细胞可无需抗原处理与呈递直接识别表达于多种上皮性肿瘤表面的MHCI类基因相关分子A和B(MICA,MICB)[7]。因此,本文观察到的γδT细胞肿瘤细胞毒效应也许与上述抗原分子有关,至少与热休克蛋白(hsp)70分子有关。γδTILs对异种肿瘤细胞的强烈杀伤的识别分子基础还有待于进一步澄清。

  γδT细胞的杀伤活性可为某些细胞因子所上调,本研究发现IL-2,IL-4,IL-12,IL-15,TNF-α和IFN-γ均有此作用。该结果与某些文献报道相似[8,9]。尽管有文献报道TGF-β和IL-10有抑制γδT细胞活性的作用趋势[8],但在本研究中并没有发现此种表现,这也许与细胞因子作用的时间和浓度有关。系统、深入地了解细胞因子对γδT细胞肿瘤细胞毒的影响可为日后γδT细胞的过继治疗肿瘤应用提供重要的依据,本文工作为此方面提供了一定的资料。

  最后,我们还发现去增殖活性的肿瘤细胞对γδTILs细胞增殖活性的诱导程度与其被杀伤水平存在着平行关系,如Daudi和EL-4肿瘤细胞可诱导γδTILs产生显著的增殖反应,而它们又是本实验体系中γδTILs的敏感靶细胞。这种实验上的印证将促使我们进一步寻找肿瘤细胞活化γδT细胞的分子识别基础。综上所述,γδTILs对同种异体或异种肿瘤细胞有明显的细胞毒作用,在细胞毒作用增强型细胞因子的作用下,其抗肿瘤活性能得以最大程度的体现。本文结果为γδTILs过继治疗肿瘤提供了一定的理论依据和实验基础。

  [基金项目]国家重点基础研究发展规划(G1998051200)中子课题(G1998051214)和国家自然科学基金(39670373)资助项目

  [作者简介]陈娟(1973-),女,辽宁沈阳市人,博士研究生,主要从事肿瘤免疫学研究。

  [参考文献]

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  [4]于松涛,张芳,何维.抗体固相法体外扩增人肿瘤浸润γδT淋巴细胞[J].免疫学杂志,1997,13:260~262.

  [5]SONGTAO YU,WEI HE,JUAN CHEN,et al.Expansion and immunological study of human tumor infiltrating gamma/delta T lymphocytes in vitro[J].Int Arch Allergy Immunol,1999,119:31~37.

  [6]SAITO K,KATSURAGI H,MIKAMI M,et al.Increase of heat-shock protein and induction of γδT cells in peritoneal exudate of mice after injection of live Fusobacterium nucleatum[J].Immunology,1997,90:229~235.

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[收稿日期]2000-03-13;[修回日期]2000-03-28


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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发疹型药疹皮损内浸润淋巴细胞类型和亚类的检测

发疹型药疹皮损内浸润淋巴细胞类型和亚类的检测

  中华皮肤科杂志2000年第33卷第5期

段昕所 陆洁 张春雷 李世荫

  关键词:药疹;淋巴细胞

  发疹型药疹的皮损组织病理表现为真皮浅层、中层血管扩张充血,周围有淋巴细胞浸润,为了进一步探讨本病皮损浸润淋巴细胞中以那些细胞类型及亚类为主,我们对本病患者皮损进行了淋巴细胞类型及亚类的免疫组化研究。

  一、病例选择

  发疹型药疹患者34例,男14例,女20例;年龄(35.55±11.59)岁。为本院门诊及住院患者,临床确诊为发疹型药疹。原发病为阑尾炎、感冒、肺炎或咽峡炎,其致敏药物为氨苄西林、青霉素、头孢菌素、利福平、卡马西平及感冒清等药物,诊断依据文献[1],特异性淋巴细胞转化试验阳性、皮内试验阳性或激发试验阳性。本文中,34例患者有14例特异性淋巴细胞转化试验阳性[2],19例是皮损消退2周后皮内试验阳性(6~24h皮试部位有斑丘疹发生,同时设生理盐水阴性对照),有1例皮损消退4周后再次口服感冒清后激发试验阳性。同时,除外感染性发疹性疾病,用环钻在局麻下取患者腹部、背部或四肢红色斑丘疹皮损,一分为二,一份用中性甲醛固定,石蜡包埋切片,另一份OCT包埋,立即液氮冷冻,恒冷切片机切片。对照8例,男2例,女6例;年龄(35.65±13.20)岁,为我院外科手术患者,皮肤无任何发疹,在手术过程中取其正常皮肤,与发疹型药疹患者皮损处理相同。

  二、试剂及方法

  CD20单克隆抗体,CD45RO、OPD4单克隆抗体,该3种抗体1∶100稀释;CD8单克隆抗体(邦定生物工程公司,1∶100稀释),免疫组化试剂盒(Histostain-SP-kit)为Zymed公司产品。每一病例切片均常规HE染色。免疫组化采用LSAB法,AEC显色;苏木素复染,甘油明胶封片。石蜡组织切片做B淋巴细胞(CD20)、T淋巴细胞(CD45RO)、Th细胞(OPD4)染色。冰冻组织切片做CD8染色。

  对每张组织切片,采用单盲法,任取有细胞浸润的5个高倍视野,进行染色阳性细胞和单一核细胞计数,计算染色阳性细胞占单一核细胞的百分比。并且统计各类阳性细胞在不同组织中的计数。

  三、结果

  HE染色:在34例发疹型药疹患者皮损中均表现为真皮浅层毛细血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞及少量嗜酸粒细胞浸润。而正常对照组织无该炎症反应。

  浸润淋巴细胞类型:用免疫组化LSAB法对34例患者皮损石蜡切片中浸润淋巴细胞进行CD20、CD45RO、CD4+单染及冰冻组织片CD8+单染,同时CD20与CD45RO在石蜡切片上进行了单酶双染,T细胞DAB显色(呈棕黄色),B细胞4-氯-1萘酚显色(呈蓝色)。结果T淋巴细胞占多数,其中以CD4+T细胞浸润为主,并且在表皮的基底层也见有少许CD4+细胞浸润。CD8+T细胞较少。同时也发现有B淋巴细胞浸润,以靠近血管周围分布较多。对各例患者各类型或亚类淋巴细胞所占百分比按计量资料进行统计,结果,T淋巴细胞为(55.77±5.35)%,CD4T淋巴细胞为(44.86±5.96)%,CD8T淋巴细胞为(10.65±3.12)%,B淋巴细胞为(42.67±9.53)%。

  另外,各类及亚类淋巴细胞在皮损的不同部位其浸润程度也不同。患者皮损表皮中有少许CD4细胞浸润,少数患者皮损表皮有CD8细胞浸润,无B淋巴细胞浸润。大部分患者真皮浅层有较多的CD4细胞和少许CD8细胞浸润,血管周围B淋巴细胞较多。少部分病例皮下组织中也见有少许各类淋巴细胞浸润。

  四、讨论

  通过对34例发疹型药疹患者皮损组织的免疫组化研究发现,浸润的淋巴细胞以T淋巴细胞为主。在浸润的T淋巴细胞中,CD4+T淋巴细胞为最多,CD8+T淋巴细胞较少,在皮损组织中CD4+/CD8+约为(3~4)/1。Carr等[3]报道的HIV感染者所发生的发疹型药疹,其皮损组织中浸润的淋巴细胞是以CD8+T淋巴细胞为主,与我们的研究结果不同,这可能与HIV的感染密切相关,因为在他研究的患者中,外周血中CD4+/CD8+比值倒置,大约0.9∶1,所以,其组织中以CD8+细胞浸润为主。

  作者单位:段昕所(067000河北省承德医学院附属医院皮肤科)

  陆洁(067000河北省承德医学院附属医院皮肤科)

  张春雷(北京大学第三医院皮肤科)

  李世荫(北京大学第三医院皮肤科)

  参考文献

  [1]阎伯龄,段昕所.药疹与发疹性疾病的鉴别诊断.第1版.北京:北京出版社,1991.5-6.

  [2]段昕所,陆洁,王晶,等.特异性淋巴细胞转化试验对发疹型药疹诊断价值的观察.中华皮肤科杂志,1996,29:269-270.

  [3] Carr RR, Vasak E , Munro C, et al. Immunohistological assessment of cutaneous drug hypersensitivity in patients with HIV infection. Clin Exp immunol, 1994, 97:260- 265.


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

手术切除肺鳞癌标本中DC浸润对预后的意义

手术切除肺鳞癌标本中DC浸润对预后的意义

中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 临床免疫学

作者:龚选举 阎玉虎 吴建平

单位:湖北省肿瘤医院,武汉 430070

  关键词: 肺鳞癌;DC浸润;预后

  摘 要 目的:研究肺鳞癌组织中DC的浸润程度及对预后的影响。方法:将S-10 0蛋白作 为DC的特异性标记物,应用SABC免疫学方法检测肺鳞癌组织中DC的分布。结果:50例肺鳞癌 中,DC显著浸润的20例,5年生存率为59%。轻度浸润的30例,5年生存率为19.1%。50 例 鳞癌中,低分化鳞癌27例,DC显著浸润的11例,5年生存率为55%。轻度浸润的16例,5年生 存率为12.8%。高分化鳞癌23例,DC显著浸润的11例,5年生存率为66.8%。轻度浸润的12 例 ,5年生存率为27.2%。经Log-rank检验,在显著浸润和轻度浸润组二者之间有显著差异。结论: 肺鳞癌组织中DC显著浸润的预后明显好于轻度浸润的病例。

  中国图书分类号 R734.2

The significance to survival of DC infiltrated in lung squamous cell carcinoma excised by operation

GONG Xuan-Ju,YAN Yu-Hu,WU Jian-Ping.

  (Hubei Cance r Hospital,Wuhan 430070)

  Abstract Objective: To study the infiltration degree of TIDC in lung cancer and the effect of it on prognosis.Methods: Use S-100 protein as the specific la bel marker of DC,adopt immunohistochemistry SABC method to detect the distributi on of DC in lung cancer.Results:Among 50 lung squamous cell carcinomas, 20 ar e infiltrated with DC markedly,five-year survival rate is 59%.30 showed slight d egree infiltrated,five-year survival rate is 19.1%.Among 50 squamous cell car cin oma,27 are low differentiate squamous cell carcinoma,and 11 are DC infiltrated m arkedly,five-year survival rate is 55%,while 16 are slight degree infiltrated,f i ve-year survival rate is 12.8%;23 are high differentiate squamous cell carcino ma ,and 11 are DC infiltrated markedly, five-year survival rate is 66.8%,while 12 a re slight degree infiltrated, five-year survival rate is 27.2%.These data wer e e xamined with Log-rank test,there is significant difference between markedly inf iltrated group and slightly degree infiltrated group.Conclusion: The prognosis of lung squamous cell carcinoma cancers which have DC markedly infiltrated is su perior to those of slightly degree infiltrated patients.

  Key words Lung squamous cell carcinoma DC infiltrated Progno sis

  应用免疫组织化学的方法研究肿瘤组织中树突状细胞(Dendritic cell,DC)的浸润, 自90年代以来成为免疫学界一直关注的热点,国内某些实验室也开始转入这方面的研究 [1-3]。研究手术切除的实体瘤内的DC浸润情况,国外时有报道,国内则研究甚 少。我 们研究了手术切除肺鳞癌组织中DC的浸润情况,报道如下。

  1 材料与方法

  材料来源于1978年至1994年间湖北省肿瘤医院手术切除的肺鳞癌病例共50例。为了便于 分析 比较,选择的病例在治疗方式及临床分期上都一致(T2N0M0)。所有病例都获得随 访及生存时间的统计。全部病例的组织切片均为原发肺鳞癌病理切片。肿瘤组织中DC的标记,采用免疫组织化 学即S-100蛋白阳性方法进行研究。由于DC内也存 在 S-100蛋白,因此,将S-100蛋白作为TIDC的特异性标记物[4]。免疫组化方法采 用SABC法 。所有试剂采用武汉博士德生物公司提供的即用型试剂盒,操作步骤按试剂盒说明进行。S -100蛋白阳性标记的树突状细胞在肿瘤组织中的浸润程度是依据Furukawa等提出的分级标 准:0~20个阳性细胞为无至轻度浸润;20个以上为显著浸润。生存曲线是通过Kaplan-Mei er方法获得。预后的因素通过Log-rank检验分析[5]

  2 结果

  2.1 DC的分布 S-100蛋白阳性标记的DC主要散在分布于肿瘤组织内和癌 性间质中,很少见于周围肺 组织。这种细胞同肿瘤细胞紧密接触,呈褐黑色,其形态学上有一个不规则的核,胞浆呈分 枝状突起, 形似树突状,因此而得名树突状细胞,见图1。

  2.2 DC的浸润 50例鳞癌中,DC显著浸润的20例,占40%。DC无至轻度浸润 的30例,占60%。50例鳞癌中 ,高分化鳞癌23例,其中显著浸润的11例,占47.8%;无至轻度浸润的12例,占52.2%。 低分化鳞癌27例,其中显著浸润的11例,占40.7%,无至轻度浸润的16例,占59.3%。

  2.3 DC浸润与生存的关系 依据DC浸润的程度分为2组,即DC在瘤组织内 显著浸润和DC在瘤组织内无至轻度浸润 。50例肺鳞癌中,DC显著浸润的20例,存活最长的9年,最短的1.6年,平均4.7年,5年生 存 率为59%。DC无至轻度浸润的30例,存活最长的6年,最短的1年,平均存活2.7年,5年生 存 率为19.1%(X2=6.50,P=0.01,P<0.05)。50例中高分化鳞癌23例, 其中DC显著浸润的11例, 5年生存率为66.8%。无至轻度浸润的12例,5年生存率为27.2%(X2=2.95,P=0 .07,P>0.05)。 低分化鳞癌27例,其中显著浸润的11例,5年生存率为55%。无至轻度浸润16例,5年生存率 为12.8%(X2=4.71,P=0.04,P<0.05,见图2,3,4)。

  3 讨论

  能够手术切除的肺癌病人,尽管其病理 类型及 临床期别一样,但术后病人的生存时间却 明显不同,这提示机体内部的免疫功能对肿瘤的发生、发展及限制有一定的作用,这一作用 随着免疫学研究的不断深入而进一步得到证实。DC是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。自 从Steinman 70年代首次报道以来,DC的研究一直受到关注[3]。90年代以后,由于 DC的体外 大量扩增获得成功,从而使DC的研究逐步成为肿瘤实验研究中的一个不断升温的热点。近来 的研究发现,大部分外科切除的实体瘤内DC浸润程度与患者的预后有关。浸润DC数量多,则 患者的预后好,反之亦然,因此也称肿瘤浸润树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cells,TIDC),提示瘤内DC与肿瘤的发生、发展有密切的关系。Tsujitani等研究了210 例手术切除的胃鳞癌患者,结果表明DC即S-100阳性显著浸润的82例患者5年生存率为60 .4 %,而轻度浸润的128例患者5年生存率为18.8%[6]。类似的结果也见于对结、直肠 腺癌及食管 癌的研究[4]。Furukawa等研究了40例手术切除的肺鳞癌组织内DC的浸润情况,结 果显示, 显著浸润的22例患者中,其5年生存率为86.4%,而无至轻度浸润的18例患者5年生存率为38 . 9%[5]。本文研究了手术切除的50例肺鳞癌组织内DC的浸润情况,其结果显示,50 例中DC显 著浸润的20例,DC无至轻度浸润的30例。经Log-rank检验,二者有显著性差异。50例鳞癌 中 ,低分化鳞癌27例,其中显著浸润的11例,无至轻度浸润的16例,经Log-rank检验二者有显 著差异。高分化鳞癌23例,其中显著浸润的11例,无至轻度浸润的12例,经Log-rank检验 , 二者无显著性差异。本研究还对手术切除肺鳞癌患者清扫的区域淋巴结进行了研究。结果显 示区域淋巴结内DC反应的情况,无论在高分化鳞癌或低分化鳞癌中对病人的生存均无明显影 响(P>0.05),因此,从本组研究的结果看,在肺鳞癌组织中DC显著浸润的病例,其生存和 预后明显好于无至轻度浸润的病例,这点与Furukawa等报道的相一致[5]。同时,DC 在不同 分化的肺鳞癌组织内浸润的程度对生存及预后有影响。DC在低分化鳞癌中浸润的程度对预后 有影响,而对高分化鳞癌则影响不大。 关于DC参与肿瘤免疫的机理,据目前研究的材料提示,它不能直接杀伤肿瘤细胞,但其最大 特点是能够显著刺激初始型T细胞(Native T cells)增殖。在机体的细胞免疫和体液免疫中 起重要的调控作用[3]。 虽然一个任意选择的免疫学因素与癌症的临床预后的相关性仅处于分析阶段而不足以反应整 个复杂机制。但本文可提示浸润于肿瘤中的DC可能在宿主对抗肿瘤的防卫机制中起着重要的 作用而影响病人的预后。影响肿瘤病人的预后有诸多因素,但DC的浸润及其对肿瘤的影响, 从目前的研究资料来看不得不认为是一个重要的因素。当然对DC的研究还处于实验阶段,进 一步的研究将揭示其真正面目。

图1 肺鳞癌组织中S-100蛋白标记阳性DC(SABC法 ,×200)

  Fig.1 S-100 protein labeled positive DC in lung squamous cell carcino ma(SABC method,×200)

图2 肺鳞癌中DC浸润对生存率的影响

  Fig.2 Effect of DC infiltrated to the survival rate of lung squamous cel l carcinoma

图3 肺高分化鳞癌中DC浸润对生存率的影响

  Fig.3 Effection of DC infiltrated to survival rate of lung high-differe ntiated squamous cell carcinoma

图4 肺低分化鳞癌中DC浸润对生存率的影响

  Fig.4 Effection of DC infiltrated to survival rate of lung poorly-diffe rentiated squamous cell carcinoma

  作者简介:龚选举,男,46岁,主任医师,主要从事肺癌和乳腺肿瘤的研究

  参考文献

  1,Schuler G,Steinman R M.Dendritic cells as adjuvants for immune mediat ed resistance to tumor.J Exp Med,1997;186:1183

  2,Adema G J,Hartgers F,Verstraten R et al. A dendritic-cell-derived C-C chemokine that preferentially attracts native T cell.Nature,1997;387:713

  3,曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展.中国免疫学杂志,1998;14(3):161

  4,Lu L,Qian S,Hershberger P A et al. Fas ligand(CD95L) and B7 expressoin on dendritic cells provide counter-regulatory signals for T cell survival and pro liferation.J Immunol,1997;158:5676

  5,Furukawa T,Watanabe S,Kodama T et al. T-zone histocytes in adenocarcino ma of the lung in relation to postoperative prognosis.Cancer,1985;56:2651

  6,Tsujitani S,Kakeji Y,Watanabe A et al. Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion and lymph node metastasis in human gastric cancer.Ca ncer,1990;66:2012

[收稿1999-12-15 修回2000-05-17]


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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卵巢癌浸润淋巴细胞的生物学特性研究

卵巢癌浸润淋巴细胞的生物学特性研究

中国免疫学杂志 2000年第3期第16卷 肿瘤免疫学

作者:童善庆 王建华 李彪如 丁健青 胡宝瑜 朱佑明 陆德源 华祖德 陆静

单位:童善庆(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025);王建华(上海第二医科大学分子生物实验室,99级博士生,上海200025);李彪如(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025);丁健青(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025);胡宝瑜(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025)

关键词:肿瘤浸润淋巴细胞;细胞因子;卵巢癌;细胞表型

  摘 要 目的: 研究卵巢癌浸润淋巴细胞(TIL)在体外扩增后生物学特性,评估TIL用于晚期卵巢癌治疗的前景。方法: 利用流式细胞仪分析TIL的细胞表型,使用分子生物学和免疫学方法研究TIL分泌细胞因子的能力和杀伤肿瘤细胞的活性。结果: TIL细胞表型的差异可能与肿瘤的种类、性质、取材部位有关,结缔组织、基质中来源的TIL以CD3CD4为主,肿瘤组织和小血管周围以CD3CD8为主,体外IL-2的浓度对TIL的免疫学特性有很大的影响。经rIL-2扩增后,TIL分泌产生IL-2、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子能力及杀伤肿瘤细胞的活性均有明显提高。再加入抗CD3单抗或PHA( 合适浓度),TIL细胞因子表达可进一步增强。TIL联合磷酰胺或IL-2治疗晚期卵巢癌患者,可显著改善患者外周血细胞表型,具有一定的疗效。结论: TIL在体外经rIL-2扩增后,免疫活性有明显提高。体内肿瘤细胞的消退可能主要并不是通过输入的TIL直接杀伤肿瘤细胞,而是在很大程度上依靠其分泌多种细胞因子增强了机体细胞免疫活性和免疫调节能力。TIL辅助其它疗法可成为晚期卵巢癌患者的一种有效治疗手段。

  中国图书分类号 R737.31

Study on biological character of tumor-infiltrating lymphocytes in ovarian carcinoma

TONG Shan-Qing WANG Jian-Hua LI Biao-Ru et al

  (Department of Microbiology, Shanghai Second Medical University ,Shanghai 200025)

  Abstract:Objective:To study biological character of tumor-infiltrating lymphocytes on post in vitro expansion in ovarian carcinoma , and evaluate prospects of using TIL treatment of advanced stage of ovarian carcinoma .Methods:Cellular phenotype changes in TIL were analyzed by flow cytometry . By means of molecular biology and immunologic methods, ability of secrete cytokines and activities of anti-tumor in TIL were studied.Results:Difference of cellular phenotype in TIL is probably related to type,feature,and resource of tumor. CD3CD4+ is dominant in TIL from connective tissue and parenchyma.CD3CD8+ is dominant in TIL from tumor tissue and around microvessels . Concentration of rIL-2 in vitro plays a significant role in immunologic character of TIL. By means of rIL-2 expansion in vitro ,TIL has apparently been improved in competence of secreting some cytokines ,such as IL-2、TNF-α、IFN-γ,and anti-tumor activities.TIL was more stimulated by adding anti-CD3 or PHA (suitable concentration), which significantly increased its ability to secreting cytokines. Treatment with TIL+CTX or TIL+ rIL-2, could apparently improve phenotype in peripheral blood cell patients , with somewhat effects.Conclusion:Immunologic activity of TIL in vitro are apparently improved by rIL-2 expansion. Tumor regression , by means of infusion TIL, is not largely attributed to direct cytotoxicity to tumor cell , but indirectly and partly augmenting cellular activities and abilities of immunomodulation in patients with ovarian carcinoma ,through secreting multiply cytokines.

  Key words:Tumor-infiltrating lymphocytes Cytokine Ovarian carcinoma Cellular phenotype

  肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是直接从患者肿瘤组织中分离,在体外经IL-2激活与扩增后,再回输至患者体内治疗肿瘤,具有杀瘤效应明显,副作用相对较小,而对其它肿瘤细胞或正常细胞无杀伤作用,从而使得TIL的治疗成为晚期肿瘤治疗的一种有效的方法[1,2]。但近年来一些研究已发现TIL的治疗效果并不十分明显,差异较显著,这在一定程度上与人们对TIL的生物学、分子生物学等特性了解不够全面有很大关系。本文研究了卵巢癌TIL在体外经IL-2扩增后的生物学活性、细胞表型,细胞因子基因表达与分泌,评估TIL用于晚期卵巢癌治疗的疗效,以期较全面地了解卵巢癌患者的免疫效应细胞的功能状态,探讨TIL在体内杀伤肿瘤细胞的机制,旨在进一步发挥TIL抗肿瘤潜能及寻求更加有效的TIL 过继免疫治疗晚期卵巢癌新途径。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 标本来源 上海瑞金医院、仁济医院、第九人民医院妇产科提供的15例卵巢癌活检标本,其中11例为原发上皮性,2例为继发性,2例为浆液性,病理诊断明确。标准 Raji 、L929 、CTLL2细胞株,本室保存,按常规方法培养。

  1.1.2 主要试剂  CD3、CD4、CD8单克隆抗体,异硫氰酸胍, 随机引物,Taq DNA聚合酶,均为华美公司。dNTP、DEPC水、PHA、CTX和胶原酶为SIGMA公司产品。 M-MLVL逆转酶:BRL公司产品。 RNA酶抑制剂为Boehringer公司产品。3H-dTR为中科院植生所产品。96孔细胞培养板为Costar公司产品。 rIL-2 标准品为 中科院上海生化所产品。 TNF标准品为 二军大微生物教研室赠。 IFN-γ标准品,IL-6标准品,rIL-2为二军大分子遗传所产品。1640 完全培养基(CM)为Gibco 公司产品。

  1.1.3 PCR引物 β-act、β-act1 、IL-2、IL-2R(p55)、IL-2R(P75)、TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6的扩增片段分别为660、310、458、 310、371、701、468、371、408 bp ,均为上海SANGER公司产品,引物序列,详见参考文献[2]。

  1.2 方法

  1.2.1 TIL 细胞分离培养 见参考文献[1,2] 。

  1.2.2 TIL 细胞表型分析 取对数生长期,存活率为95%TIL细胞,在CM中静置过夜(37%,5%CO2),使表面成分重新显露,培养的细胞每周收集1次,标记过程详见文献[3]。24 h后流式细胞仪检测。

  1.2.3 TIL细胞毒效应检测 MTT方法,详细过程见参考文献[4]。放射线强度确定由β-计数仪计数,特异杀伤活性由下列公式决定:

  1.2.4 TIL培养液中IL-2活性的检测 用IL-2依赖株CTLL增殖反应[4]

  1.2.5 细胞病变抑制法测TIL培养液中IFN-γ的活性 见文献[4]。

  1.2.6 L929 细胞法检测TIL培养液中TNF的活性 见文献[5]。

  1.2.7 TIL细胞因子基因表达的检测 半定量RT-PCR方法,见文献[2,6]。

  1.2.8 TIL治疗设计 治疗计划采用化学敏感性测试筛选高活性TIL和高敏感性抗肿瘤药物。具体过程见参考文献[1,7,8]。

  1.2.9 TIL治疗计划 第1天使用高敏感抗肿瘤药物。第2天观察抗肿瘤药物负作用。第3天到15天:点滴或局部注射TIL>1×109 和rIL-2 5×104 U/天。第16天到25天:注射rIL-2 5×104 U/d。第25d:再次使用高敏感抗肿瘤药物。

  1.2.10  统计学处理 采用χ2精确法检验。

  2 结果

  2.1 卵巢癌TIL不同扩增时间细胞表型分析 15例TIL标本在扩增后的第10,20,30天,分别检测其细胞表型,发现随着培养时间延长,TIL中CD3,CD4,CD8,HLA-DR所占比例逐步升高,说明TIL细胞免疫活性被逐步激活,结果见图1。

图1 卵巢癌TIL细胞表型标志的动态变化

  Fig.1 Trending changes of cellular phenotypes of TIL in ovarian carcinoma

  2.2 不同取材部位TIL细胞表型分析(经IL-2诱导扩增后20 d) 用于过继免疫治疗的TIL并不是均一群体,而是由混合淋巴细胞亚群组成。应用流式细胞仪,分析TIL的细胞表型特征发现来自不同部位TIL均以T细胞为主,主要有二种亚型CD3CD8和CD3CD4,其差异可能与肿瘤种类性质,取材部位有关,结缔组织和基质中来源的TIL以CD3CD4为主,肿瘤组织和小血管周围及腹水中来源TIL以CD3CD8为主。

  2.3 卵巢癌 TIL的杀伤力 7例以CD4为主的TIL和8例以CD8为主的TIL对自体肿瘤细胞具有较强杀伤活性:分别为98.89%和90.21%(LU50/107细胞,E:T=25:1),对异体肿瘤细胞和K562细胞也具有一定的杀伤活性。TIL在培养的不同时间内杀伤力存在差异,在培养10~20 d内杀伤活性逐步增强,在20~40 d内TIL杀伤活性达到增高,在40~56 d内TIL仍可维持较高的杀伤活性。

  2.4 TIL细胞培养上清液中扩增前后IL-2、IFN-γ和TNF-α活性测定 5例上清标本中在扩增前检测不到有IL-2、IFN-γ的分泌,扩增后分泌IL-2、IFN-γ的平均活性单位有明显的升高;TNF-α在扩增后其平均活性单位明显高于扩增前。

  2.5  体外rIL-2对TIL细胞因子mRNA表达的影响 体外经IL-2扩增的TIL细胞表达β-actin、IL-2R(p55)、IL-2R(p75)、TNF-α、IFN-γ mRNA,但rIL-2去除后3 d,TIL无任何细胞因子mRNA的表达。体外用高浓度rIL-2(1 000~2 000 U/ml)扩增TIL细胞表达β-actin、IL-2R(p55)、IL-2R(p75)、TNF-α、IFN-γ,体外用低浓度rIL-2(100 U/ml)扩增,TIL细胞只表达β-actin、IL- 2R(p75) mRNA。结果见表1 。

表1 体外rIL-2对TIL某些细胞因子mRNA表达的影响

  Tab.1 Influence of expression of mRNA of some cytokines of TIL with rIL-2 in vitro

  IL-2R TNF-α IFN-γ IL-2
P55 P75
rIL-2 stimulation 0.976 1.185 1.213 0.374 0
rIL-2 post-remove 1) 0 0 0 0 0
rIL-2(1 000 U/ml) 0.925 0.951 0.931 0.892 0
rIL-2(100 U/ml)  2) 0 0.643 0 0 0

  note :compared with rIL-2 pro-and post-remove 1)P<0.01; compared with rIL-2 low and high concentration 2)P<0.012.6  加入抗-CD3单抗、PHA对TIL细胞因子mRNA表达的影响 和单纯rIL-2扩增TIL相比,抗-CD3和PHA+rIL-2扩增TIL后,分泌产生IL-2R、TNF-α、IFN-γ明显增强,而且分泌产生了IL-6、IL-2、IL-4。结果见图2。

图2 rIL-2+抗-CD3对TIL某些细胞因子mRNA表达的影响

  Fig.2 Influence on expression of mRNA of some cytokines of TIL cultured with rIL-2+anti-CD3

  Note:Lane 1, 4, 7, 10, 13, 16 : product of rIL-2 ;Lane 2, 5, 8, 11, 14, 17 : product of PBMC;Lane 3, 6, 9, 12, 15, 18 : product of rIL-2+anti-CD3

  2.7 卵巢癌TIL临床治疗前后外周血T细胞表型分析 应用本研究TIL治疗计划,流式细胞仪检测治疗前后患者外周血T细胞表型,发现治疗后患者外周血T细胞亚型中CD3、CD4、CD8及NK、LAK细胞比例明显增高,T细胞免疫功能被增强,结果见表2。

表2 患者治疗前后外周血T细胞表型分析(n=8)

  Tab.2 Analysis of T cell phenotypes of peripheral blood of from pro-and post-treatment(n=8)

Groups CD3 CD4 CD8 NK LAK
Pre-treatment 52.5±2.1 27.5±1.9 30.8±2.5 11.5±3.5 16.12±2
Post-treatment 60.8±2.5 33.1±3.5 31.5±1.5 17.3±3.2 19.65±3

  note:compared with pre- and post-treatment, P<0.05

  3 讨论

  TIL是继LAK细胞之后过继免疫治疗的第二代抗肿瘤效应细胞。近年来,TIL已被广泛用于临床治疗晚期肿瘤患者取得了一定的临床效果,但随着研究的深入,已发现TIL生物学治疗效果差异明显,出现了许多问题。因而,进一步加强对TIL生物学,分子生物学等特性的了解显得十分有意义。

  研究发现:刚分离TIL在未扩增前,免疫活性低下,这可能与卵巢癌细胞分泌表达IL-10,TGF-β等抑制性细胞因子有关[9]。扩增后第10、20、30天后激活的T细胞标志HLA-DR被进一步表达,TIL细胞并非是均一的细胞群体,而是由多种亚型构成,不同部位取材、肿瘤性质的差异对TIL群体中主要亚型有较大影响,这在一定程度上与各种TIL治疗疗效差异有关。

  扩增后TIL对自体肿瘤细胞有较高的杀伤活性,特异性也较强。一般来说,TIL在扩增后第2、3周杀伤活性最高,此阶段为过继免疫治疗最佳时间,测定TIL上清液中细胞因子活性发现扩增后有高活性的TNF-α、IFN-γ、IL-2的分泌,经RT-PCR方法在转录水平方面进一步 证实有这些细胞因子基因的表达,但TNF-α mRNA可持续表达相当长时间,IL-2 mRNA表达只是一过性,IFN-γ mRNA表达有时缺乏。IL-2、IFN-γ都是迟发型超敏反应中重要的免疫调节因子,TNF-α是一种具有明显抗肿瘤效应的细胞因子,因而体内肿瘤细胞的消退可能并不是由于输入TIL发挥直接杀伤效应,而是在很大程度上其分泌的细胞因子增强了机体内细胞免疫活性和免疫调节能力。

  研究也发现:激活的TIL在去除rIL-2后3~5 d,已无任何细胞因子的分泌,说明TIL的体内外激活对IL-2有很大的依赖性 。为此,我们选用不同的rIL-2浓度,来研究二者的关系,发现高浓度rIL-2(1 000~2 000 U/ml)可使TIL明显地扩增,但TIL对自身肿瘤的杀伤特异性下降,表现为非抗原特异、非MHC约束的细胞毒性。低浓度rIL-2(100 U/ml)扩增TIL,发现TIL的生长停滞,细胞因子表达极不活跃,在TIL中再加入抗-CD3和PHA(合适的浓度),发现TIL分泌产生IL-2R、TNF-α、IFN-γ明显增强,而且分泌产生了IL-6、IL-2、IL-4,说明加入抗CD3单抗或PHA等在一定程度上可以克服低浓度rIL-2培养中TIL特异性杀伤和有效增殖的不足。

  TIL过继免疫治疗晚期卵巢癌患者在整个疗程(一般3个月)后,发现患者的外周血T细胞免疫功能有明显改善,说明TIL治疗有一定的效果,辅助其它疗法可作为晚期卵巢癌患者一种有效的治疗手段,有关TIL治疗疗效评估,我们正在深入研究。

  基金项目:本课题系国家自然科学基金(39370706)资助

  作者简介:童善庆,男,62岁,博士生导师,主要从事医学微生物学和免疫学的研究

  作者单位:朱佑明(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025)

  陆德源(上海第二医科大学微生物学教研室,上海 200025)

  华祖德(上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科,上海 200025)

  陆静(上海第二医科大学附属瑞金医院妇产科,上海 200025)

  参考文献:

  [1]李彪如,沈鼎鸿.肿瘤浸润淋巴细胞生物学性状初步研究. 中华微生物和免疫学杂志, 1994;14(2):399

  [2]王建华,童善庆,蒋 玖 et al .卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞某些细胞因子基因表达的研究.中国肿瘤生物治疗杂志,1999;6(1):39

  [3]Heo D S ,Thresal,Jonas T et al. Long-term IL-2 dependent cytotoxic activity of TIL from human squamous cell carcinoma of the head and neck .Cancer Res,1987;47(23):6353

  [4]杨廷彬,尹学念主编.实用免疫学. 长春: 长春出版社,1994:591~599

  [5]胡宝瑜,张炳舟,朱佑明 et al.全血诱发TNF 检测法.上海免疫学杂志, 1991;11(1):3

  [6]J.萨母布鲁克著;金冬雁,黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京:北京科学出版社,1992:880~915

  [7]Hirokazu I,Kazuyuki F U ,Koucichi T K et al. Immunomodulation in patients with epithelial ovarian cancer after adoptive transfer of tumor-infiltration lymphocytes.Cancer Research,1994;54(1):190

  [8]Freedman R S,Tomasovic B,Templin S et al. Large scale expansion in interleukin -2 of tumor-infiltrating-lymphocytes from patients with ovarian carcinoma for adoptive immunothrapy. J Immunol Methods, 1994;167(1~2):145

  [9]王建华,童善庆,丁健青 et al .卵巢癌肿瘤细胞多种细胞因子基因表达的研究.上海免疫学杂志,1998;18(6):334

收稿日期:1999-03-28

  修改日期:1999-06-07


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨①

人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨①

中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 肿瘤免疫学

作者:王正昕 曹雪涛 张明徽 李 楠 王元和

单位:王正昕 王元和第二军医大学附属长征医院普外科,上海 200003;曹雪涛 张明徽 李 楠 第二军医大学基础医学部免疫学教研室,上海200433

关键词:树突状细胞;肿瘤浸润;MHC-II类分子;IL-10;VEGF;TGF-β1;免疫抑制

  中国图书分类号 R73-3

  摘 要 目的:树突状细胞作为抗原提呈细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中起重要作用,对肿瘤浸润性树突状细胞的研究有助于揭示肿瘤免疫逃逸机制。方法:采用酶消化、细胞分离、流式细胞仪分析等方法研究了14例胃肠道肿瘤患者肿瘤浸润性树突状细胞的表型,并用RT-PCR检测了IL-10、VEGF和TGF-β13种免疫抑制因子在14例肿瘤细胞中的表达。结果: 肿瘤浸润性单核细胞中有CD1a的树突状细胞存在,该类细胞的表面分子如MHC-II类分子、CD80及CD54等共刺激分子和粘附分子有低表达或不表达,14例肿瘤细胞中IL-10、VEGF及TGF-β1的表达率均较高。结论:肿瘤浸润性树突状细胞可能是一种无功能或功能低下的树突状细胞,肿瘤细胞在肿瘤局部分泌的免疫抑制因子可能是导致肿瘤浸润性树突状细胞功能低下的原因之一。

The phenotypes of human tumor infiltrating dendritic cells

  in gastrointestinal cancers

WANG Zheng-Xin,CAO Xue-Tao,ZHANG Ming-Hui et al

  (Department of Immunology of Second Military Medical Uiniversity,Shanghai 200433)

  Abstract Objective: As antigen-presenting cells,dendritic cells(DCs) p?ay important roles in antitumor immune response.Analysis of tumor infiltrating dendritic cells(TIDCs)would contribute to investigate the mechanisms by which tumors escape immune recognition.MethodsPhenotypes of TIDCs were examined by methods including digestion with enzyme,cell separation and FACS.Reverse transcript-polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect IL-10、VEGF and TGF-β1 mRNA expression in the freshly isolated tumor cells of 14 patients.ResultsThe expression of some molecules such as MHC class II and costimulating factors(CD80),adhesion molecules(CD54)on the surface of TIDCs were downregulated or negative .Levels of IL-10、VEGF and TGF-β1 mRNA expression in tumor cells of 14 patients were very high.ConclusionThe results suggested that TIDC was a kind of dysfunctional DC and immunosuppressive factors from tumor cells could inhibit DC's function .

  Key words Dendritic cells Tumor infiltration MHC class II IL-10 VEGF TGF-β1 Immunosuppression

  树突状细胞(Dendritic cell,DC)是目前已知机体内功能最强的抗原提呈细胞,能在体内外直接激活静息期T细胞,促进T辅助细胞和CTL的生成。近年来关于DC在肿瘤免疫治疗中的作用研究引人注目,取得了一系列进展[1]。但是对肿瘤微环境中浸润性DC的功能状态的研究很少,而对这部分DC的研究有助于揭示肿瘤免疫逃逸的机制。本文通过对5例胃癌、9例结直肠癌肿瘤组织中浸润性细胞的研究,证实了肿瘤浸润性树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cell ,TIDC)的存在,并通过流式细胞仪检测TIDC的表型,且用RT-PCR的方法检测IL-10、VEGF及TGF-β1在14例肿瘤细胞中的表达。本结果提示肿瘤细胞局部产生的免疫抑制因子IL-10、VEGF及TGF-β1可能是导致TIDC无功能或功能低下的原因之一。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 标本来源 胃癌标本5例,大肠癌标本9例,病理证实均为腺癌,其中直肠癌5例,结肠癌4例,标本均取自上海长征医院普外科。获瘤体重量4.40~8.10g,平均6.03g。患者年龄45~71岁,平均57.5岁,男8例,女6例。

  1.1.2 主要试剂 胶原酶IV型,DNA酶I型,透明质酸酶V型,均为Sigma公司产品;淋巴细胞分离液(Histopaque,1.077g/ml)购自Sigma公司;FITC标记的抗人CD1a、抗人HLA-DR单克隆抗体、PE标记的抗人CD86、抗人CD80单克隆抗体、抗人CD54、抗人CD14单克隆抗体、同亚型对照抗体及FITC标记兔抗鼠IgG荧光二抗均购自PharMingen公司。完全培养基包括:RPMI1640,10%小牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,0.01mmol/L丙酮酸钠,0.05 mmol/L 2-巯基乙醇,20mmol/L Hepes,1 000U/ml青霉素,链霉素1 000μg/ml,甲硝唑5μg/ml。

  1.2 方法

  1.2.1 取材 标本切下后,纵向打开肠腔,0.05%洗必泰反复冲洗,切取1/3~1/2肿瘤组织,置于培养皿中称量。然后肿瘤组织块浸于含青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640中30min。

  1.2.2 单细胞悬液的制备 将瘤体剪成1 mm3大小,置于含0.05%胶原酶、0.02%DNA酶、0.01%透明质酸酶、10%小牛血清的RPMI1640培养基中,4℃磁力搅拌过夜消化,再经200目钢网过滤,收集所有单细胞悬液,经Hank液洗2遍,调整细胞浓度至1×106 ml-1左右。

  1.2.3  细胞分离及流式细胞仪分析 向离心管中依次加入比重为1.077 g/ml和1.055 g/ml的淋巴细胞分离液各2 ml,再在上面加入2~3 ml单细胞悬液,400 g离心20 min,收集处于上层界面的肿瘤细胞,Hank液洗,-70℃冻存;收集2层淋巴细胞分离液界面上的细胞悬液,Hank液洗,置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中,5%CO2 37℃过夜培养。收集悬浮细胞,用FACS标记液PBA(PBS+1%BSA+0.02%叠氮钠)调整细胞浓度为5×106 ml-1,加入离心管,100 μl/管,分别按直接标记法或间接标记法进行标记,流式细胞仪(FACS calibur,B.D.公司)检测细胞表面表型。

  1.2.4 肿瘤细胞表达免疫抑制因子的RT-PCR检测 取分离冻存的肿瘤细胞,以TRIZOL提总RNA,用AMV作反转录,引物为oligo-dT15,反转录产物作为PCR的模板分别检测VEGF、IL-10及TGF-β1的表达。引物序列分别为IL-10:上游5'ACAGCTCAGCACTGCTCTG,下游5'AGTTCACATGCGCCTTG;VEGF:上游5'TTGCTGCTCACCTCCAC,下游5'AATGCTTCTCCGCTCTG;TGF-β1:上游5'CCCTGGACACCAACTATTG,下游5'GTTGGCATGGTAGCCCT。PCR反应条件均为95℃,15 s;55℃,30 s;72℃,30 s;35个循环。同法作正常胃、结肠、直肠粘膜组织中免疫抑制因子的表达。

  2 结果

  2.1  TIDC的表型分析 对5例胃癌、4例结肠癌、5例直肠癌肿瘤组织中所分离的浸润性淋巴细胞群的FACS分析结果表明,10例有CD1a+、CD86表达的细胞存在(见表1),占分离的淋巴细胞数的4.62%±2.89%,细胞活力>80%,且该群细胞除有4例低表达HLA-DR外均不表达HLA-DR,CD54和CD80的表达率也很低,且都不表达CD14(见表1)。

  2.2 肿瘤细胞表达免疫抑制因子的检测 通过RT-PCR检测了上述14例新鲜分离的肿瘤细胞表达免疫抑制因子的情况,发现IL-10 mRNA的表达率为92.8%,VEGF mRNA的表达率为71.4%,TGF-β1 mRNA的表达率为64.3% (见表2、图1),而正常粘膜组织中除直肠粘膜有VEGF mRNA和IL-10 mRNA的弱表达外,结肠和胃粘膜中均无表达,且3种粘膜组织中均未检测到TGF-β1 mRNA的表达(未列入)。

表1 14例肿瘤患者TIDC的表型特征

  Tab.1  The phenotypes of tumor infiltrating dendritic cells of 14 patients

Tumor Classification CD1a CD86 CD80 HLA-DR CD54
Colon Duckes'B + + + - +
Rectal Duckes'C - - - - -
Rectal Duckes'A + + - - -
Colon Duckes'A + + - - -
Rectal Duckes'C + + - - -
Gastric IV - - - - -
Gastric III + + - + -
Gastric IV - - - - -
Colon Duckes'C + + - + -
Gastric IV - - - - -
Rectal Duckes'A + + + - +
Rectal Duckes'A + + - + -
Rectal Duckes'A + + - - -
Gastric I + + - + -

表2 IL-10、VEGF及TGF-β1在14例人肿瘤细胞中的表达率

  Tab.2 Positive rates of IL-10,VEGF and TGF-β1 mRNA expression in tumor cells of 14 patients

  Total patients Patients of positive expression Positive rates
IL-10 14 13 92.8%
VEGF 14 10 71.4%
TGF-β1 14 9 64.3%

图1 IL-10、VEGF及TGF-β1 mRNA在人肿瘤细胞中的表达

  Fig.1 The expression of IL-10,VEGF and TGF-β1 mRNA in human tumor cells

  Note:1. gastric cancer ;2. rectal cancer ;3. colon cancer

  3 讨论

  DC是目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞。我们通过细胞分离的方法对胃肠道TIDC的表面分子的表达进行了分析,实验结果表明,14例病例中有10例肿瘤组织分离的浸润细胞中有CD1a、CD86表达的细胞存在,该群细胞数量很少,约占分离得到的淋巴细胞数的4.62%±2.89%。该群细胞除4例低表达HLA-DR外,其余均不表达HLA-DR,且CD54和CD80的表达率也很低。4例无CD1a、CD86TIDC浸润的患者,肿瘤的病理分期皆为III、IV期的患者,说明TIDC的浸润与病变的恶性程度关系密切,这与以往用免疫组化的方法对TIDC的研究结果相一致[2,3]。TIDC的表面分子HLA-DR 、CD54和CD80的不表达或低表达具有重要意义。MHC-II类分子与外源性抗原的提呈关系密切,MHC-II类分子的不表达或低表达说明DC提呈外源性抗原的能力低下,而且DC对抗原多肽的提呈还需要其表面表达的共刺激分子、粘附分子的参与,TIDC表面的CD80、CD54的低表达或不表达同样可以导致DC的抗原提呈能力低下,这可能是TIDC无法有效诱导抗原特异性CTL反应的原因之一。因此我们认为TIDC是一种无功能或功能低下的DC,即使有大量的肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating cells,TIL)存在,也无法有效地识别和杀伤肿瘤细胞。至于造成TIDC功能障碍的原因,目前多数学者认为是肿瘤细胞释放的免疫抑制因子作用于DC所致,导致其表面分子的表达和功能发生变化[4]

  IL-10、VEGF及TGF-β1均为免疫抑制因子,能够抑制抗原提呈细胞的免疫功能。Allavena等研究表明IL-10能降低DC的表面分子如MHC-II、CD80及CD86等的表达率,抑制DC的分化成熟,抑制DC的抗原提呈能力[5]。而IL-10的分泌又受TGF-β的影响,TGF-β的存在可显著促进IL-10的分泌,应用抗体阻断法证实TGF-β对抗原提呈细胞功能的影响是通过IL-10实现的,而且TGF-β1可下调MHC-II类分子的表达[6]。VEGF是一种34~42 kD的蛋白,可在DC成熟过程的早期影响造血前体细胞分化为功能成熟的DC[7]。我们的实验结果表明IL-10、VEGF及TGF-β1mRNA在肿瘤细胞中都有很高的表达水平,而在正常胃肠道粘膜组织中的表达水平很低或无表达,说明肿瘤局部有大量的肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子存在,这些免疫抑制因子单独或相互作用可能是造成TIDC表面的MHC-II类分子、共刺激分子(CD80)及免疫粘附分子(CD54)低表达或不表达的原因之一,致使TIDC的功能障碍,从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。

  综上所述,我们的实验结果提示TIDC是一种无功能或功能低下的DC,肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子IL-10、VEGF及TGF-β可能是导致其某些表面分子低表达或不表达的原因之一,从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸,进一步研究肿瘤微环境中TIDC表型及功能状态变化的原因,有助于深入认识肿瘤免疫逃逸机制。

  ①本课题受国家自然科学基金重点项目(39730420)和国家杰出青年科学基金(39835123)资助

  作者简介:王正昕,男,31岁,普外科博士生;

  曹雪涛,男,36岁,教授,博士生导师,教研室主任,《中国免疫学杂志》编委,《中国肿瘤生物治疗杂志》常务副主编,主要从事肿瘤免疫学研究

  4 参考文献

  1 曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究进展.中国免疫学杂志,1998; 14(3): 161

  2 Ambe K,Mori M,Enjoji M.S-100 protein-pensitive dendritic cells in colorectal adenocarcinomas. Cancer, 1989; 63: 496

  3 Tsujitani S , Kakeji Y, Watanabe A et al. Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion and lymph node metastasis in human gastric cancer . Cancer , 1990; 66: 2012

  4 王正昕,曹雪涛.肿瘤浸润性树突状细胞的研究进展.国外医学*免疫学分册,1998;21(6):326

  5 Allavena P, Piemonti L, Longoni D et al. IL-10 prevents the differen-tiation of monocytes to dendritic cells but promotes their maturation to macrophages. Eur J Immunol,1998;28:359

  6 D'Orazio T J,Niederkorn J Y. A novel role for TGF-β and IL-10 in the induction of immune privilege. J Immunol,1998;160:2089

  7 Oyama T, Ran S, Ishida T et al. Vascular endothelial growth factor affects dendritic cell maturation through the inhibition of nuclear factor-kB activation in hemopoietic progenitor cells. J Immunol,1998;160:1224

收稿1999-04-20 修回1999-08-20


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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有肌层浸润的膀胱癌患者接受手术前化疗后拒绝膀胱切除术的结果

【关键词】  手术前化疗

Harry W, Herr. Eur Urol, 2008, 54:126132.
   
  本研究作者为了确定有肌层浸润的膀胱癌患者接受手术前化疗后拒绝膀胱切除术的结果。从1995年至2001年,对63例因为完成了一套基于顺铂的手术前化疗方案而拒绝进行原计划的膀胱切除术的患者进行评估。对患者、肿瘤和治疗要点进行预先评估,并通过一元和多元分析与总体生存状况进行关联分析。中位随访时间是86月,所有患者随访时间均超过5年。结果显示40例患者(64%)存活,其中54%患者膀胱功能正常。浸润性肿瘤的数目和大小与所有生存者(状况)有很强相关性。为获得较好的生存状况,最重要的治疗方法是在开始化疗前通过重新分期经尿道膀胱肿瘤切除术彻底切除浸润性肿瘤。23例患者(36%)后来死于疾病,19例(30%)浸润癌出现膀胱内复发。存活患者中,超过90%的单发、小的、低分级浸润性肿瘤被彻底切除,且83%膀胱内无肿瘤复发。由此可得出结论:伴有肌层浸润的膀胱癌患者通过手术前化疗和经尿道膀胱肿瘤切除术治疗后可以存活,肿瘤的特点有助于识别哪些患者对彻底化疗有反应而不需要膀胱切除术就可以存活。


作者单位:

日期:2008年12月27日 - 来自[2008年第12卷第4期]栏目

水贮存后树脂浸润牙本质硬度的变化

2008年09月02日 J Dent Res. 2008 Jul;87(7):655-60. 医学空间(MEDcyber.com)9月2日消息-聚合物吸水发生增塑作用后其力学性能可能降低,这可通过其组成树脂的极性来进行预测。泰国诗纳卡宁威洛大学口腔医学院的Chiaraputt S及其同事在最近的研究中对以下假设进行了检验,即当使用粘合树脂来制作树脂浸润牙本质时,水贮存后其弯曲模量的下降应减少,并与其亲水特性成比例。
研究人员使用三种亲水性逐渐升高的树脂混合物来制作树脂浸润牙本质的聚合物梁和大型混合层模型,利用小型三点屈曲装置于水贮存前和贮存后1-4周进行检测。
结果显示,大型混合层中弯曲模量的下降与相应聚合物梁的下降相关,而且前者的下降更为广泛。亲水性更高的大型混合层中弯曲模量的下降百分比更高,其下降率与大型混合层中整体分子间引力和极性力的Hoy溶解度参数成比例。
日期:2008年9月2日 - 来自[口腔科]栏目
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乳腺原位癌伴微小浸润的临床及病理学分析

2008年07月28日 《中华普通外科杂志》-2007年22卷12期 -909-911页 医学空间(MEDcyber.com)7月28日消息,该项研究目的是总结和分析乳腺导管原位癌伴微小浸润(T.mic)的临床和组织病理特征,探讨合理的治疗方法。方法采用总结自1996年1月至2006年6月底共31名患者32例乳腺导管原位癌伴微小浸润的临床特征,组织病理特征,治疗方法及随访资料。结果经病理诊断的32例乳腺导管原位癌伴微小浸润患者中,最大浸润灶均≤1mm,其中有27例(84%)临床上可触及肿块,有30例(93.8%)钼靶上有异常表现,病理可见粉刺样结构的病例为19例(59.4%),可见坏死的为加例(62.5%)。25例行腋窝淋巴结清扫术的患者没有一例有腋窝淋巴结转移。经过中位时间为28个月的随访无一例发生复发和转移。由此得出结论乳腺导管原位癌伴微小浸润是一个少见的乳腺癌亚型,其预后很好。治疗上应该根据其原位癌成分的病理特点及临床特征进行治疗。
日期:2008年7月28日 - 来自[肿瘤相关]栏目
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