主题:胶体金

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HBsAg胶体金诊断试剂漏检原因分析

    目前,为避免血液浪费,保证血液质量,越来越多的血站采用胶体金试纸条进行献血员HBsAg筛查,该方法简单快捷,不需要特殊仪器,特异性高,但在工作中笔者发现该方法存在漏检,对漏检原因进行分析,现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  街头无偿献血者血样共计13937份。

    1.2  材料  HBsAg胶体金诊断试剂由艾康生物技术有限公司生产,初复检HBsAg诊断试剂盒(酶联免疫法)分别由英科新创(厦门)科技有限公司和北京万泰生物药业有限公司生产。

    2  结果

    13937名献血者经HBsAg胶体金诊断试剂筛查为阴性,经初、复检两遍ELISA试验检出强阳性36例,弱阳性15例。

    3  讨论

    造成阳性标本漏检的原因如下。

    3.1  采血深度不够  为取得足够量的血样用力挤压,组织液混入血液,造成抗原浓度降低,弱阳性标本漏检,因此采血深度要适度,约2~3mm,防止用力挤压。

    3.2  操作不规范  标本血液黏稠不能渗析时,可加入1滴缓冲液加速血液渗析,若在加入血液前提前在试条上加入缓冲液,会造成阳性标本的漏检。

    3.3  观察时间不够  强阳性标本2min可检出,5ng标准品5min可检出,1ng标准品15min可检出。观察时间过短会造成HBsAg弱阳性标本的漏检。当街头献血者较多时,为缩短献血者等待时间,观察时间短,造成弱阳性漏检。

    3.4  试验条件不良  试验温度应保持在10℃以上,避免风吹,在高温高度潮湿的环境中应尽快使用。在街头无偿献血,有时试验条件难以保证,这就要求检验人员严格按照试剂盒要求进行试验,并可根据外界温度变化适当延长反应时间,以免漏检。

    3.5  加样量控制不佳  加样量不足或过多,都会影响检验结果。加样量不足,会造成阳性漏检,加样量过多,检测试纸条滤膜无法有效阻挡血细胞,血细胞和血清一起向检测线移动,造成检测区模糊,影响结果判读[1]。

    3.6  试剂灵敏度差异  HBsAg胶体金试纸条灵敏度比ELISA试验低,胶体金试纸条可检出≥1ng/ml的HBsAg,对<1ng/ml的标本存在漏检。

    [参考文献]

    1  刘福昌.HBsAg全血金标检测试纸条漏检原因分析.中国输血杂志,2002,15(3):188.

    作者单位: 266071 山东青岛,青岛市中心血站

    (编辑:林剑雷)

日期:2006年12月19日 - 来自[2006年第4卷第14期]栏目
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胶体金试纸条检测HBsAg的应用体会

  目前HBeAg的检测方法国内有很多种,如酶免疫法、固相放射免疫法、免疫荧光法和金标法。胶体金试纸条法是一种膜载体的免疫检测法,具有快速简便的特点,一些基层医院和个体诊所一般使用此法。我们对1120例门诊病人和体检者用胶体金试纸条法和酶免疫法(ELISA法)同时检测血清标本HBsAg,现将检测结果及使用体会报告如下。

  1  资料与方法

  1.1  一般资料 

  1120份标本来自本院2006年1月1日~9月30日我院门诊病人和体检者。平均年龄41.3岁。静脉采血3 ml注入普通试管中,分离血清备用。

  1.2  试剂与仪器 

  (1)试剂:胶体金试纸条为北京万泰生物药业有限公司生产,ELISA试剂盒为上海华泰生物工程实业有限公司生产,均在有效期内。(2)仪器:上海科华实验系统有限公司产KHB ST-360酶标仪与洗板机。

  1.3  方法 

  1120份血清标本以胶体金试纸条和ELISA试剂盒平行检测HBsAg,操作严格按说明书进行。

  1.4  判定标准 

  ELISA法待测标本A值S/CO≥1.05者为HBsAg阳性。胶体金试纸条靠近加样端包被有胶体金吸附的抗-HBsAg线,为检测线;另一端包被有胶体金吸附的羊抗鼠IgG,为对照线。两条线同时出现紫红色为阳性,只出现对照线为阴性,若两条线都不出现表明试纸条失效。

  2  结果

    1120份标本胶体金试纸条法和ELISA法检测结果,见表1。表1  1120份标本胶体金试纸条法和ELISA法检测结果(略)


    本资料显示在1120份标本中,胶体金试纸条法的阳性检出率为8.75%,ELISA法的阳性检出率为9.20%。ELISA法HBsAg的阳性检出率高于胶体金试纸条法,说明用胶体金试纸条法检测HBsAg时存在一定的漏检率(4.86%),二者的符合率为95.14%,低于试纸条说明书的报道(99.1%),但高于焦玉东的报道[1]。可能是由于胶体金试纸条本身的质量以及不同的生产厂家、不同的批号,以及本身的灵敏度不同所致。

  3  讨论

    胶体金试纸条和ELISA法均属于免疫学检测范畴,方法特异,敏感性好。ELISA法测定灵敏、特异,易于自动化且无放射性污染等优点,是目前应用最广而且发展最快的一种免疫测定技术。胶体金试纸条法虽然具有操作简便、快速、可以单人份操作,具有高度特异性且不需要特殊设备等优点,但一般只适用于基层医院以及对HBsAg的快速检测。从以上结果可以看出,与ELISA法相比,存在一定的漏检率,不能完全代替ELISA法,ELISA法仍是临床免疫学诊断的主要依据[2]。造成胶体金试纸条法漏检的原因主要有原理及方法学上的差异、试剂本身的灵敏度较ELISA法低、个别标本可能存在HBsAg亚型以及温度、观测结果的时间短等[1]。笔者建议在使用胶体金试纸条检测HBsAg观察结果时,若阴性,应适当延长反应时间再观察结果,以60 min为宜,以免造成HBsAg弱阳性的漏检。综合性医院一般不宜使用胶体金试纸条法检测患者的HBsAg,对于胶体金试纸条法筛查阴性的临床标本,建议用ELISA复检,以防漏检造成人为差错而延误诊断甚至引起医患矛盾或医疗纠纷。

  [参考文献]

  1  焦玉东.胶体金试纸条检测7628份献血者HBsAg假阴性分析.临床检验杂志,2004,22(6):468.

  2  魏来,陶其敏.努力规范肝脏疾病的免疫学诊断.中华检验医学杂志,2003,26(2):69.

  作者单位: 213341 江苏溧阳,溧阳市第五人民医院

 

日期:2006年12月19日 - 来自[2006年第4卷第9期]栏目

高浓度尿致胶体金法早早孕检测假阴性1例

    患者,女,24岁,农民。因停经40天,右下腹痛伴阴道流血8h入院。查体:T 37.2℃,P 84次/min,R 21次/min,BP 80/40mmHg。急性痛苦病容,轻度贫血貌。心肺正常,肝脾无肿大。右下腹腹肌紧,压痛明显,反跳痛不明显,移动性浊音(+)。妇科检查:阴道畅通,宫口有鲜血流出。宫颈举痛,后穹隆饱满,子宫大小正常。右侧附件可触及约4cm×4cm包块。B超提示:子宫大小正常;右侧附件探及5.5cm×4.4cm混合性包块;双侧髂窝及膀胱直肠后分别探及3.8cm和2.3cm积液。血常规:WBC 11×109/L,CRA 75%,Hb 9.9g/L,PLT 152×109/L。HCG检测:阳性反应。综合病史、体征及辅助检查确诊为宫外孕破裂。经急诊手术,痊愈出院。

    讨论:人绒毛膜促性腺液素(HCG)是孕妇体内产生的一种粒蛋白激素,可通过血液循环排泄到尿中,并可通过胶乳凝集、血凝抑制、放射免疫、酶联免疫、单克隆、抗体胶体金等试验进行检测。其中单克隆、抗体胶体金法因期简便、快捷、准确,是目前最为理想及普遍应用的检测方法。其结果对早期妊娠,病理性妊娠及胎盘滋养层疾病的诊断,鉴别诊断,治疗及追踪观察均有重要意义。

    该例患者首次HCG检测呈阴性反应,因与患者病史、体征等不相吻合,查其原因是否为尿液浓度过高(尿液粘稠,见是血浆样)所致,用同次尿液稀释10倍后用同样方法再次检测,HCG呈现阳性反应。尿液浓度影响HCG检查,有关杂志未见报道。早早孕试纸应用说明中也未提到。本科遇到的这一例尚属首例,其影响机制不清,尚须在今后的工作实践中不断观察总结

     作者单位: 374600 云南维西,维西县人民医院检验科

    (编辑:邓  锋)

日期:2006年8月20日 - 来自[2006年第6卷第11期]栏目
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幽门螺杆菌IgG抗体胶体金免疫层析快速诊断试纸条的研制

    【摘要】  目的  建立一种快速检测抗H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条,并优化制备中各关键步骤的实验条件。方法  以柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金溶液,葡萄球菌A蛋白(SPA),制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。结果  用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记SPA的最低稳定浓度5μg/ml,最适稳定量为6μg/ ml。SPA标记的最适pH为6.0。以此试纸条检测临床血清标本与进口ELISA试剂盒比较,组间阳性率比较差异无显著性。结论  胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关,而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。

    【关键词】  幽门螺杆菌;胶体金;免疫层析检测
  
  Research on development of gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG

  ZHANG Bao-yuan,WANG Xiao-wei,CUI Xiao-dai,et al.Capital Institute of Pediatrics,Beijing 100020,China

  【Abstract】  Objective  Developing gold immunochromatographic test kit for serum H.pylori antibody IgG and optimize the key experiment conditions.Methods  Preparing the colloid gold particles of 20 nm which were coupled with Streptococcus protein A (SPA),set up the gold immunochromatography test kit for serum H.pylori antibody IgG.Results  The spheroidal colloid gold particles of 20nm is shown in color of bright red.The minimal stable concentration (MSC) of gold- SPA is 5μg/ml,and the suitable stable concentration ( SSC) is 6μg/ml.The pH 6.0 is appropriate. 53 sera samples were tested by GICA and ELISA,there is on significant difference between two methods.Conclusion  The quality of gold immunochromatography test kit is associated with the factors,such as the quality and quantity of antigen or antibody, colloid gold particles,buffers,etc.

  【Key words】  helicobacter pylori;colloid gold;gold immunochromatographic assay

    在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的诊断中,细菌培养、组织病理学检查、尿素酶试验、呼气试验等方法或因为给患者造成的侵入性痛苦,或需要一定的条件和技术,或因为需要特殊仪器,或因为费用昂贵等,其临床推广及多次重复追踪复查受到限制。而血清学检测因其非侵入性、快速、准确,可同时处理大量标本,检测不同类型的抗体,在临床检验、基础研究中倍受青睐。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测(gold immunochromagraphy assay,GICA),操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和特殊设备,特别适于基层卫生单位使用。本研究预采用H.pylori超声全菌体抗原、葡萄球菌A蛋白(SPA)抗原,尝试研制一种根据双抗原夹心法检测原理检测血清、唾液中抗H.pylori的IgG抗体的胶体金免疫层析检测试剂,优化胶体金免疫层析快速诊断试纸条研制各关键步骤的实验条件,为进一步研制和开发奠定实验基础。

  1  材料与方法

  1.1  材料 

  幽门螺杆菌菌种SS1为军事医学科学院微生物与流行病研究所保存;TSB肉汤(Tryptic soy broth)为DIFCO 公司产品;氯金酸(HAuCl4.H2O),上海化学试剂公司产品;柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H2O),北京北化精细化学品有限公司产品;葡萄球菌A蛋白(SPA)、牛血清白蛋白(BSA),均为Sigma公司产品;聚乙二醇(PEG 20000),FLUKA公司产品;以上试剂均为分析纯。厌氧培养罐AnaeroPack Rectangular Jar为三菱化学公司产品。

  1.2  方法

  1.2.1  玻璃器皿的清洁 

  制备胶体金的所用容器均应反复清洗,并硅化处理玻璃容器的内表面,最后用MQ超纯水冲洗晾干备用。

  1.2.2  胶体金颗粒的制备

  取1%氯金酸溶液1ml,加99ml超纯水成终浓度0.01% 的氯金酸溶液,加热沸腾后,取1%柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中,继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色,颜色稳定后继续加热5min,室温冷却,补充失水至原体积。

  1.2.3  免疫胶体金复合物的制备

  1.2.3.1  胶体金标记蛋白最低稳定浓度与最适稳定量的确定 

  目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例:用0.1mol/L的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH至5.9~6.2,取11支洁净试管分装胶体金溶液(1ml/管)。将待标记蛋白质SPA逐级稀释后(由2~10μg另设对照管),各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中,混匀;5min后,在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml,混匀,室温静置。依表1顺序进行。表1  胶体金标记SPA的最低稳定浓度实验(略)

    (1)室温静置2h以上观察结果;(2)未加SPA的11号管为对照管;1号管既不加SPA也不加氯化钠溶液同样设为对照;(3)未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管,即呈现由红变蓝的聚沉现象,而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量,即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量,也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。

  1.2.3.2  最适标记pH的确定 

  调节胶体金溶液pH依次为4、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,配合上述最低稳定量实验,确定标记蛋白的最佳标记pH。

  1.2.3.3  SPA标记胶体金 

  当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下:按最低稳定量的120%计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下,将蛋白质溶液加入胶体金溶液中(pH已调至5.9~6.2),加入蛋白质时应逐滴加入,1mg的蛋白质大约5min加完。分别取1ml胶体金-SPA结合物液(实验组)和1ml胶体金原液(对照组)于试管中加10%氯化钠溶液0.1ml,室温静置1h,观察结果:如果对照组试管溶液由红色转为蓝色,甚至可以看到聚合物沉淀,而实验组溶液仍保持红色,无沉淀,方可继续下一步实验,否则需补加标记用蛋白SPA。最后加入终浓度为0.2%的聚乙二醇(PEG MW20000),继续搅拌30min。

  1.2.4  胶体金标记SPA复合物的纯化 

  超速离心法纯化免疫胶体金复合物。先以3500rpm离心20min(4℃),弃沉淀将上清以13500rpm离心35min(4℃),弃上清,用保存液悬起较疏松的红色沉积物;再以11000rpm离心35min(4℃),小心移弃上清后,用保存液悬起较疏松的红色沉积物至原体积1/10,即为初步纯化的免疫胶体金复合物。

  1.2.5  胶体金标记蛋白质的检定 

  定量测定:以保存液作对照测530nm处OD值,4℃避光保存。质量鉴定:用有Formvar 膜的镍网沾取金标蛋白溶液,空气中干燥后醋酸铀负染,在Tecnai10透射电镜下观察。

  1.2.6  金标垫的制备

  1.2.6.1  免疫胶体金复合物稀释度的确定 

  纯化的胶体金标记SPA作不同程度稀释后,均匀等量浸于同样大小的玻璃纤维素膜制成金标垫。组装试纸条,在其他条件不变的情况下,根据反应结果,确定达到试纸条敏感度要求的最适胶体金标记SPA的稀释度,或称为工作浓度。

  1.2.6.2  金标垫的制备 

  保存液稀释胶体金标记SPA复合物原液至工作浓度,按比例均匀浸于玻璃纤维素膜,-20℃冻存,冷冻真空干燥后,密封保存。

  1.2.7  H.pylori全菌超声粉碎抗原的制备[1] 

  幽门螺杆菌SS1采用TSB固体斜面培养基微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2)37℃培养,72h后转种TSB液体培养基,37℃振荡培养60h后收集菌体。H.pylori菌体用小体积生理盐水悬浮,冰浴条件下超声粉碎有效时间5min(150W),超声粉碎置显微镜下观察呈均匀细颗粒状;4℃,12000r/min离心20min,收集上清;细菌沉渣再重复超声5min,重复离心过程取上清;合并2次上清,于0.01mol/L的PB缓冲液(pH 7.2)中透析24h,中间换液3次,最后12000 r/min离心20min,上清测蛋白浓度后分装,于-20℃保存。

  1.2.8  H.pylori配体固相硝酸纤维素膜的制备 

  H.pylor抗原室温融化后,12000r/min离心10min,取上清2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液(pH 7.2)以250μg/ml间隔,经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区,定义为检测带(T),距离检测带5mm远的质控带(C)用dispenser线形包被正常兔IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h,4℃密封保存。

  1.2.9  样品垫的处理 

  选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜,室温干燥备用。

  1.2.10  试纸条组装 

  根据功能不同可将试纸条分为四个部分:上段(A区)为手持部位(吸水滤纸:吸收检测样品中多余液体),中段(B区)为实验反应区(硝酸纤维素膜:包括判读结果的检测带T和指示试纸条质量的质控带C),下段(D区)为样品区(玻璃纤维素膜:接触待检测样品),在中下段之间(C区)放置浸有胶体金标记SPA复合物的金标垫;而整个试纸条贴附于双面胶白色塑料背板(见图1)。

  1.3  临床血清标本H.pylor抗体IgG检测
 
  取1998年3月~2001年9月期间在我院消化门诊就诊,临床诊断为幽门螺杆菌胃炎患儿血清53份。加入80μl 于试纸条样品区,2~5min开始观察结果,20min观察终止。出现1条红色(对照)沉淀线,为血清学诊断阴性;出现2条红色(样品和对照)沉淀线,为血清学诊断阳性。同时采用华美生物工程公司ELISA试剂盒对血清标本进行对照检测。组间阳性率采用U检验分析。

  2  实验结果

  2.1  胶体金颗粒制备 

  我们实验所用柠檬酸还原法制备的20nm胶体金溶液呈亮红色,用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸胶体金后在透射电镜下观察,可见金颗粒大小基本一致,分布均匀,圆形(图2)。测量100个胶体金颗粒直径,计算平均直径约20nm。

  2.2  胶体金标记SPA的最低稳定浓度、最适稳定量及最适pH 

  加入不同浓度SPA的胶体金溶液在加入氯化钠后呈现不同颜色(由蓝色伴聚合物沉淀逐渐过渡到亮红色),使胶体金溶液红色不变而蛋白质含量最低的试管中加入5μg SPA,因此确定本次制备的20nm胶体金标记SPA的最低稳定量是每毫升胶体金溶液5μg SPA,最适稳定量为每毫升胶体金溶液6μg SPA。胶体金与蛋白质的结合成功与否,取决于pH值,一般只有在蛋白质等电点(PI)略偏碱的条件下二者才能牢固地结合,实验证实SPA标记的最适pH为6.0,符合理论预测。

  2.3  胶体金标记SPA复合物的制备与纯化 

  将胶体金溶液pH值调至6.0,30ml胶体金溶液在磁力搅拌下缓缓加入180μl SPA溶液(1mg/ml),加入PEG20000增加胶体金溶液的稳定性,超速离心纯化后在Tecnai10透射电镜下观察,可见金颗粒外围有明显的低电子密度晕圈,表明金颗粒表面吸附有蛋白(图3)。

  2.4  临床血清标本H.pylor抗体IgG检测结果 

  53份受检血清中抗Hp血清抗体IgG胶体金法阳性21份,疑似7份,阴性25份;ELISA法阳性19份,疑似6份,阴性28份。组间阳性率比较差异无显著性(U检验,P>0.05)。表3  两种方法检测临床血清标本H.pylor抗体IgG结果比较(略)

  3  讨论

  胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术,现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。胶体金的制备并不难,但要制备高质量的胶体金却并非易事,通过反复实验我们总结出如下经验:(1)所用化学试剂应为分析纯试剂,试剂质量直接影响胶体金制备的成功与否;(2)配制溶液用水应为双蒸水或MQ超纯水,而且必须注意到不同来源的水其pH和离子强度有很大差异;(3)玻璃器皿的清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成,形成的颗粒大小不一,颜色微红、无色或混浊不透明。合格胶体金溶液应清亮透明,若混浊或液体表面有漂浮物,提示此次制备胶体金有较多凝集颗粒。胶体金粒子大小不同,颜色亦不同[2]:5~20nm之间,呈葡萄酒红色;20~40nm之间液体为深红色;60nm金溶液呈紫红色,日光下仔细观察比较胶体金的颜色,可以粗略估计制得金颗粒大小。不同大小的胶体金粒子具有不同的光散射作用,据此可用可见光光谱法评价胶体金的粒径及分布[3]。

  鉴定胶体金最有说服力的是在透射电镜下观察,理想的金颗粒是大小基本相等,均匀一致,无椭圆形及多角形的金颗粒存在。拍片放大后测量金颗粒直径,符合制备要求。小颗粒胶体金基本是圆球形,30~80nm金颗粒则多为偏心圆形[2]。如果金颗粒大小不等或有椭圆形、三角形金颗粒存在应重新制备,造成这种情况的主要原因一般与在加还原剂时没有迅速一次性加入以及搅拌不均匀有关;此外制备量的多少、容器的大小、加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备好的胶体金可因电解质、温度、金溶液的浓度变化而有不稳定和聚沉。因此,制备后最好在20天以内进行标记,室温或4℃保存,避免低温冻存。实验中我们选择添加牛血清白蛋白作为稳定剂以维持胶体金的稳定性,使之便于长期保存,并防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。牛血清白蛋白、PEG20000是最为常用的高分子稳定剂[4]。

  胶体金颗粒与蛋白质的结合一般通过静电感应、蛋白质疏水作用吸附于金颗粒表面,或通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合[5]。无论其作用机制为何,环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,一般只有在蛋白质等电点略偏碱的条件下二者才能牢固地结合,因此,标记之前须用0.1mol/L碳酸钾溶液或0.1N 盐酸将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质等电点略偏碱。由于胶体金会阻塞pH计电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,用精密的pH试纸测定其pH即可。

  标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。根据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同,选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的。如有需要可将上述初步纯化免疫胶体金用10%~30%蔗糖或甘油溶液做密度梯度离心或用凝胶过滤法进一步纯化。

  胶体金免疫层析试纸条的研制不仅在抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等方面至关重要,而且缓冲系统的优化尤其是各种辅助添加剂的选择,优化组合也必不可少。为确保试剂盒的稳定性,试纸条的组装须在洁净干燥的环境下进行,空气湿度<20%为宜。本试验制备的检测H.pylori IgG抗体的胶体金免疫层析试纸条经临床血清标本检测,初步结果与国产ELISA试剂盒比较差异无显著性,说明两种方法在特异性、敏感性和稳定性有较好的一致性。

  本研究旨在探索优化胶体金免疫层析诊断试纸条的研制技术,建立胶体金快速诊断层析试纸条研制的技术平台,从而为研究和开发系列胶体金免疫层析快速诊断试纸条提供有重要价值的实验依据和经验参考。(本文图片见附页1)

  【参考文献】

  1  陈敏章,胡伏莲,周殿元,等.幽门螺杆菌感染的基础与临床.北京:中国科学技术出版社,1997,322.

  2  Bassab C,Syamal R.Manufacturing high-quality gold sol.IVD Technology,2001,8:46-54.

  3  彭剑淳,刘晓达,丁晓萍,等.可见光光谱法评价胶体金粒径及分布.军事医学科学院院刊,2000,24(3):75-77.

  4  Hayat MA.Colloidal gold-principles,methods and applications.San Diego:Academic Press,1989,2-10.

  5  Hermanson GT.Bioconjugate techniques.Academic Press,1996,593-602.

  作者单位:1 100020 北京,首都儿科研究所

       2 100071 北京,军事医学科学院微生物与流行病学研究所

  (编辑:文静)

日期:2006年8月19日 - 来自[2006年第6卷第2期]栏目

第十九章金免疫技术--第一节免疫胶体金的制备

第十九章 金免疫技术

  金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创,最初用于免疫电镜技术。迄今为止,金标记仍主要用于免疫组织化学中。在免疫测定中,金标记常与膜载体配合,形成特定的测定模式,典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等,已是目前应用广泛的简便、快速检验方法。

第一节 免疫胶体金的制备

  一、胶体金的特性和制备

  (一)胶体金的结构

  胶体金(colloidalgold)也称金溶胶(goldsol),是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成,紧连在金核表面的是内层负离子(AuC12),外层离子层H+则分散在胶体间溶液中,以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。

  胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核,较小的胶体金颗粒基本是圆球形的,较大的胶体金颗粒(一般指大于30nm以上的)多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。

  (二)胶体金的特性

  1.胶体性质胶体金颗粒大小多在1~100nm,微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中,成为胶体金溶液。胶体金因而具有胶体的多种特性,特别是对电解质的敏感性。电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层,从而打破胶体的稳定状态,使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒,而从液体中沉淀下来。某些蛋白质等大分子物质有保护胶体金、加强其稳定性的作用。

  2.呈色性微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体金(2~5nm)是橙黄色的,中等大小的胶体金(10~20nm)是酒红色的,较大颗粒的胶体金(30~80nm)则是紫红色的。根据这一特点,用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。

  3.光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的波长(λmax)在510~550nm范围内,随胶体金颗粒大小而变化,大颗粒胶体金的λmax偏向长波长,反之,小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长,表19-1所列为部分胶体金的λmax。

  (三)胶体金的制备

  1.制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸(HauC14)是主要还原材料,常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用的强弱,可以制备0.8nm~150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下:

  (1)将HauC14先配制成0.01%水溶液,取100ml加热至沸。

  (2)搅动下准确加入一定量的1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液。

  (3)继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色,续而转成黑色,随后逐渐稳定成红色。全过程约2~3min。

  (4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

  用此法可制备16~147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。

表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性

胶体金粒径(nm) 1%柠檬酸三钠加入量(ml)* 胶体金特性
呈色 λmax
16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙红 522nm
41 1.00 红色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm

  *还原100ml0.01%HauC14所需量

  2.注意事项

  (1)氯金酸易潮解,应干燥、避光保存。

  (2)氯金酸对金属有强烈的腐蚀性,因此在配制氯金酸水溶液时,不应使用金属药匙称量氯金酸。

  (3)用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水,或者是高质量的去离子水。

  (4)是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的,用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的,硅化方法可用5%二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟,用蒸馏水冲净后干燥备用。

  (5)胶体金的鉴定和保存:胶体金的制备并不难,但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定,主要检查指标有颗粒大小,粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

  肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法,但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色,可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结制备的胶体金最好作电镜观察,并选一些代表性的作显微摄影,可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。

  胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存,加入少许防腐剂(如0.02%NaN3)可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记,使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

  二、免疫金的特性和制备

  (一)免疫金的特性

  胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold)。

  胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。

  (二)免疫金的制备

  1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。

  在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再胶体金的pH值。

  2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2~5min。

  由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。

  3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。

  4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm金颗粒用15000r/min离心30min。

  5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。

  6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。

  多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

日期:2006年1月16日 - 来自[免疫学和免疫学检验]栏目
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第四节胶体金的质量鉴定

第四节 胶体金的质量鉴定

  胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能应用。

  一、胶体金颗粒直径测定

  用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内,取现放在空气中干燥或37℃烤箱烤干。然后在透射电镜下观察,主要观察金颗粒的大小,符合不符合所需要的颗粒直径,金颗粒是否均匀一致,有无椭圆形及多角形金颗粒存在。理想的金颗粒是大小基本相等,均匀一致,无椭圆形及多角形的金颗粒存在,还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小。

  二、胶体金金颗粒均匀度测定

  一般需测量100个以上的胶体金颗粒,然后用统计学处理,计算胶体金颗粒的平均直径及标准差,前者反映颗粒的大小,后者说明颗粒是否均匀一致。

  三、影响胶体金颗粒大小的因素

  如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形,三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入,而是多次加入。再者搅拌不均匀,速度太慢没有搅拌起来,造成了颗粒大小不等。制备量的多少,容器的大小,加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备了合格的胶体金以后,放在室温或4℃保存。避免低温冻存,因为冻存可导致胶体金凝集,破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右。根据胶体金的性质,有不稳定和聚沉的可能性,因此,制备完毕后最好在20天以内进行标记。

日期:2006年1月13日 - 来自[实用免疫细胞与核酸]栏目

第三节胶体金的制备方法

第三节 胶体金的制备方法

  胶体金溶液的制备有许多种方法,其中最常用的是化学还原法,基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有:白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等,下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

  一、制备胶体金的准备

  (一)玻璃器皿的清洁

  制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成,形成的颗粒大小不一,颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净,加入清洁液(重铬酸钾1000g,加入浓硫酸2500ml,加蒸馏水至10000ml)浸泡24h,自来水洗净清洁液,然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3~4次,自来水冲洗掉洗洁剂,用蒸馏水洗3~4次,再用双蒸水把每个器皿洗3~4次,烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理,而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液,用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面,然后弃去,再用双蒸水洗净,即可使用,这样效果更好,因为减少了金颗粒的吸附作用。

  (二)试剂的配制要求

  (1)所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净,配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。

  (2)氯化金(HauCl4水溶液的配制:将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右,仍保持稳定。

  (3)白磷或黄磷乙醚溶液的配制:白磷在空气中易燃烧,要格外小心操作。把白磷在双蒸水中切成小块,放在滤纸上吸于水份后,迅速放入已准备好的乙醚中去,轻轻摇动,等完全溶解后即得饱和溶液。储藏于棕色密闭瓶内,放在阴凉处保存。

  二、制备胶体金的方法和步骤

  (一)白磷还原法

  1.白磷还原法(z Sigmondy 1905年)

  (1)取1%的HAuCl4水溶液1ml,加双蒸水99ml配成0.01%的HAuCl4水溶液。

  (2)用0.2mol/l K2CO3调pH至7.2。

  (3)加热煮沸腾,迅速加入0.5ml 20%白磷的饱和乙醚溶液,振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成。胶体金的颗粒直径为3nm左右,大小较均匀。

  2.白磷还原法(z Sigmondy 1905及z Sigmondy Thiessen 1925)

  (1)取0.6%的HAuCl4水溶液2.5ml,加双蒸水120ml 。

  (2)用0.2mol/l K2CO3,调pH至中性。

  (3)加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml(1份白磷4份乙醚),在室温振荡约15min ,溶液呈红褐色,再加热至典型的葡萄酒红色,加热可使乙醚蒸发,胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化,此方法获得胶体金颗粒的直径在5~12nm之间。

  3.白磷还原法的改良法(Henegouwen 1986)

  (1)取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml,加双蒸水60ml 。

  (2)用1%的HAuCl4水溶液0.75ml,加0.1mol/l K2CO30.6ml, 振荡变成棕红色。

  (3)加热煮沸,至溶液变成透明红色。

  使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大,二者之间的关系见表5-1。

表5-1 胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系

还原次数 颗粒直径(nm) 正负误差
1 5.6 0.9
2 6.7 0.9
3 7.9 0.9
4 9.8 1.3
5 12 1.0

  此方法主要优点是简化了制备不同大小的颗粒胶体金的手续和其它试剂的配制,经济、操作简单。另外,在多次还原过程中氯化金不再形成新的金颗粒,只是在原先金粒子基础上使它的直径变大。第一次金颗粒起着“晶核”的作用。由于这一特点,制备的金颗粒相对均匀一致。

  (二)抗体血酸还原法(Stathis and Fabrikanos 1958)

  (1)将在4预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/l K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。

  (2)在搅拌下加入1ml 0.7%抗坏血酸水溶液,立即呈现紫红色。

  (3)加双蒸水至100ml,加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8~13nm。

  (三)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)

  此方法是由Frens在1973年创立的,制备程序很简单,胶体金的颗粒大小较一致,广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾,迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液,开始有些蓝色,然后浅蓝、蓝色,再加热出现红色,煮沸7~10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表5-2。

表5-2 柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系

0.01%的HAuCl4(ml) 1%柠檬酸三钠(ml) 直径(ml)
100 5.0 10.0
100 4.0 15.0
100 1.5 25.0
100 1.0 50.0
100 0.75 60.0
100 0.60 70.0
100 0.42 98.0
100 0.32 147.0
100 0.25 160

  按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数,基本的规律是柠檬酸三钠用量多,胶体金颗粒直径小,柠檬酸三钠用量越少,腔体金颗粒直径越大。

  (四)鞣酸—柠檬酸三钠还原法(Slot与Gueeze1985年)

  该法是以1982年Muhlpfordt法为基础,1985年Slot与Geuze对该法进行了改良,特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金,而且颗粒的直径均匀一致,很适合于双标及多标研究。制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表5-3。

表5-3 鞣酸—柠檬酸三钠还原法

A 液 B 液
直径(nm) 1%柠檬酸钠(ml) 0.1mol/L K2CO3ml 1%鞣酸(ml) H2O(ml) 1%HAuCl4(ml) H2O(ml)
3.3 4 0.2 4 11.8 1 79
5 4 0.2 0.7 15.1 1 79
10 4 0.025 0.1 15.875 1 79
15 4 0.0025 0.01 15.987 1 79

  操作步骤:

  (1)根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。

  (2)将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃,并通过控温装置使温度保持稳定。

  (3)在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液,继续加热直至胶体金变成葡萄酒色,时间大约7~10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色,大约1~3min就变成红色。

  用鞣酸—柠檬酸三钠还原法,柠檬酸三钠主要为还原剂,而鞣酸则有双重作用,一是还原作用,二是保护作用,控制“晶核”的形成过程,也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成,因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小,达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。

  (五)乙醇超声波还原法(Baigent and Muller 1980)

  (1)1%HAuCl4水溶浓0.2ml加入100ml双蒸水。

  (2)用0.2molK2CO3调pH至中性,再加入1ml乙醇。

  (3)用20KC、125w超声波探头浸入溶液内进行超声振荡,由此法制得的胶体金颗粒为6~10nm。

  (六)硼氢化钠还原法(Tschopp et al 1982)

  (1)将预冷在4的40ml双蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4

  (2)再加入0.2molK2CO3,0.2ml。

  (3)在搅拌下,迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液(0.5mg/ml)0.4ml,一般重复加入3~5次,直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min,获得的金颗粒直径在2~5nm之间。

  (七)放射性胶体金的制备方法(Kent and Allen 1981)

  (1)取0.01%HAuCl4 上水溶液100ml,加热至沸腾。

  (2)加入40μl195Au。

  (3)迅速加入4ml1%柠檬酸三钠水溶液,5~7min出现透明的橙红色。

  (4)其含量为I×106脉冲数/min。

  (八)微波制备液体金方法。

日期:2006年1月13日 - 来自[实用免疫细胞与核酸]栏目
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胶体金[198Au]注射液

【适应症】
1.肝脏扫描。 2.肝血流量测定。 3.腔内治疗。
日期:2005年11月24日 - 来自[药品说明书]栏目
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