主题:胶体金

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胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原

关键词: 乙型肝炎病毒表面抗原;胶体金免疫层析法Gold-immunochromatography

  【摘要】 目的建立一种简易快速、自测式胶体金免疫层析法(GICA)用于检测血清中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒、标记乙型肝炎病毒表面抗体(抗HBs),制成免疫层析检测试条。血清中HBsAg与测试条上金标记抗体结合后沿着硝酸纤维素膜移动,与膜上的固相抗体结合形成肉眼可见的红色线条。结果 gICA试条只与HBsAg有特异性反应,与乙型肝炎病毒核心抗原、e抗原等无交叉反应。检测中国药品生物制品检定所HBsAg标准品,灵敏度可达1 ng/ml。用GICA与酶免疫法比较检测了395份不同血清标本中HBsAg,两法符合率为99.0%。结论 GICA检测血清中的HBsAg特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。

  assay

  for hepatitis B virus surface antigen Zhou Jiwen, Rong Guangya, Yang shouchen, et al. 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039

  【AbstractObjective A sensitive, rapid, simple and selfperforming gold immunochromatography assay (GICA) was developed for hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) in sera.MethodsColloidal golds were coupled with monoclonal anti-HBs to prepare an GICA apparatus. The gold-anti-HBs conjugate reacts with HBsAg in serum and migrates up the nitrocellose strip on which anti-HBs was immobilized,thus producing the detection reaction.Results 395 sera of patients and healthy people were detected for HBsAg by GICA and EIA.The corresponding rate of both tests was 99.0%. The sensitivity of GICA was 1 ng/ml by detecting HBsAg panel from the National Institute for the Control of pharmaceutical and Biological Products.

  Conclusion GICA is a sensitive, specific, simple and rapid assay for detecting HBsAg.

  【Key wordsHepatitis b virus surface antigen Colloidal gold Immunochromatography免疫层析技术是90年代初在免疫渗滤技术[1,2]的基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术,由Beggs等[3]最先用于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的测定,后来由胶体金代替胶体硒用于乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)等检测。我们用胶体金标记单克隆乙肝病毒表面抗体(抗HBs),制成检测HBsAg的胶体金免疫层析法(GICA)检测试条。用该法检测HBsAg,其灵敏度与酶免疫法(EIA)相近,并具有简便快速、特异性好、不需要仪器设备等优点。

材料与方法

  一、材料

  1.氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O):北京化学试剂厂产品。

  2.抗HBs:单克隆抗HBs及羊抗HBs均为本实验室制备。

  3.HBsAg灵敏度标准参比品:中国药品生物制品检定所产品。

  4.HBsAg酶免疫诊断试剂盒:北京科卫临床诊断试剂厂产品。

  5.血清标本:315份肝炎患者血清采自本院住院患者。其中乙型肝炎患者血清220份,甲型肝炎、戊型肝炎患者血清各30份,丙型肝炎患者血清35份。肝炎分型诊断依据1995年北京第5次传染病和寄生虫病学术会议修定的诊断标准;80份健康人血清为健康供血者待筛检血清。

  二、方法

  1.胶体金-抗HBs结合物的制备:参照文献[4,5]并稍加改进。其步骤为:超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01%。煮沸后每100 ml加入1%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml,继续煮沸15分钟。待冷却后用0.2 mol/L K2CO3调至pH 8.2。快速搅拌下加入纯化的抗HBs igG 2 mg,并继续搅拌15分钟。加入牛血清白蛋白240 mg,再搅拌5分钟,最后加入10% naCl水溶液使含NaCl浓度为1%,混匀。以2 000 r/min离心10分钟,弃沉淀,上清液以10000 r/min离心60分钟。小心吸去上清液,沉淀物即为初步纯化的金-抗HBs结合物。溶于贮存液中(0.02 mol/L,pH 7.4 Tris-HCl,含40 mg/100 ml分子量20 000的聚乙二醇,50%甘油,0.02% NaN3),-20℃保存。

  2.免疫层析测试条的制备:测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分点金-抗HBs结合物;硝酸纤维素膜上用0.02 mol/L,pH7.4 PBS稀释成100μg/ml的羊抗HBs(检测线)和羊抗鼠IgG(对照线)包被成两条约1 mm宽的线条,晾干后用含10%新生牛血清的PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片(支持物)上,切成0.8 cm×8 cm的条,加干燥剂密封保存。

  3.HBsAg检测:以新鲜血清为好。试管中加入0.1~0.2 ml血清,将测试条点有金标记抗体端插入血清内即可。结果判定:以测试条纤维素膜上出现两条红色线为HBsAg阳性;仅出现一条红色线(靠近吸水滤纸端,对照线)为阴性。如果无红色线条出现则视为试剂失效。结果确定时间:强阳性标本在2分钟内即可在检测线见到红色胶体金颗粒聚集;弱阳性标本(1~2 ng/ml)约需要20分钟确定结果。

结果

  1. GICA检测HBsAg的特异性:将试条分别与HBsAg、HBcAg和HBeAg反应,结果只与HBsAg有特异性反应,其余均呈阴性反应。

  2. 灵敏度:用GICA试条检测检定所2 ng/ml、1 ng/ml的HBsAg灵敏度参比品,其灵敏度可达1 ng/ml。

  3. 稳定性:将GICA试条于37℃温箱放置4天,做热稳定性试验,与放置4℃的试条对照检测HBsAg强阳性、弱阳性及阴性血清,结果无明显差别。

  4. 395份血清HBsAg检测结果:用GICA试条检测了315份各型肝炎患者血清和80份健康人血清中HBsAg,结果见表1。220份乙型肝炎患者血清中HBsAg阳性率为77.7%。丙型肝炎患者血清有8.6%、戊型肝炎患者血清中有3.3%检出HBsAg,可能为合并感染。30份甲型肝炎患者血清中无HBsAg阳性。这395份血清同时用EIA检测其HBsAg,比较两法检测HBsAg的一致性,结果有4份血清两法检测结果不符(表2),符合率为99.0%。4份两法结果不符的血清中,有2份(乙肝组与健康人各1份)GICA呈弱阳性,而EIA阴性,但这2份血清EIA吸光度值均接近临界值。另2份(均为乙肝组血清)GICA阴性,EIA为HBsAg弱阳性。

  表1 315份各型病毒性肝炎患者与80份健康人血清HBsAg检测结果

组别 份数

GICA

EIA

    阳性数 阳性率(%) 阳性数 阳性率(%)
乙型肝炎 220 171 77.7 172 78.2
甲型肝炎 30 0 0 0 0
丙型肝炎 35 3 8.6 3 8.6
戊型肝炎 30 1 3.3 1 3.3
健康人 80 6 7.5 5 6.3
合 计 395 181 45.8 181 45.8

表2 GICA与EIA法检测395份血清HBsAg结果比较

GICA EIA 合计
  + -  
+ 179 2 181
- 2 212 214
合计 181 214 395

讨论

  目前检测HBsAg多采用EIA,由于其操作程序较为复杂,延时长,给实验室检测带来不便,为适应实验室检测工作需要而推出的EIA一步法,虽然简化了操作程序,缩短了检测时间,但却带来了个别强阳性标本出现假阴性的问题[6]

  胶体金免疫层析法检测HBs,用胶体金代替酶标记抗HBs,样品中HBsAg与金-抗HBs结合物结合后沿硝酸纤维素膜迁移,在包被有抗HBs处形成“抗HBs-HBsAg-金标抗体”夹心物而出现红色线。此法集免疫反应与色谱层析之特点,使待测样品的HBsAg与吸水纤维上的金标抗HBs不断结合,形成HBsAg-金标抗体复合物,再由层析作用持续通过硝酸纤维素膜,与膜上固相抗HBs结合。由于是所有样品均经过较窄的纤维素膜的持续性反应,实际上对被测的物质起到了浓缩作用。从而使免疫层析法比原理相近的免疫渗滤法更为敏感。此法无须洗涤,大大减少了污染机会,不需要仪器设备,易于操作,整个检测过程在20分钟内即可完成。

  我们用胶体金免疫层析法检测了395份不同血清中HBsAg,并与EIA进行比较。两种方法检测HBsAg的符合率为99.0%。GICA的灵敏度与EIA相近。可达1 ng/ml。试验结果表明,GICA检测血清标本中HBsAg具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、简易快速、无须仪器设备等优点,有广泛应用价值。

参考文献

  1 Valkirs GE, Barton R. Immuno concentration--a new format for solid-phase immunoassays.

  clin Chem, 1985, 31:1427-1431.

  2 Spielberg F, Kabeya CM, Ryder RW, et al. Field testing and comparative evaluation of rapid,

  visually read screening assays for antibody to human immunodeficiency virus. lancet, 1989, 1:580-584.

  3 Beggs M, Novotny M, Sampedro S, et al. A selfperforming chromatographic immunoassay

  for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophin (HCG) in urine and serum. Clin

  chem, 1990, 36:1084-1085.

  4 Mey JD. The preparation and use of gold probes. In: Polak JM, Noorden SV, ed. immunocytochemistry

  modern methods and applications. Bristol : John Writht, 1986. 115-145.

  5 李成文著.现代免疫化学技术.上海:上海科学技术出版社,1992.165-181.

  6 杨守纯.提高病毒性肝炎感染标志检验水平的趋向.中华医学检验杂志,1995,18:5-

  本研究为全军“九五”指令性课题基金资助(基金编号96L049)


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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免疫胶体金的制备及其在医学检验中的应用

摘要免疫胶体金技术是四大免疫标记技术之一,问世二十多年来发展十分迅速,在生物医学各研究领域特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。本文从胶体金技术的基本原理、制备方法、标记技术和实际应用等几个方面对胶体金技术作了较系统介绍。
  1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(D ot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg 、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。 
  免疫胶体金技术的基本原理   
  氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
  免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。
  胶体金的制备方法     
  胶体金的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。下面介绍最常用的制备方法及注意事项。
  1、玻璃容器的清洁:玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成,一切玻璃容器应绝对清洁,用前经过酸洗、硅化。硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1分钟,室温干燥后蒸馏水冲洗,再干燥备用。专用的清洁器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面,弃去后以双蒸馏水淋洗,可代替硅化处理。
  2、试剂、水质和环境:氯金酸极易吸潮,对金属有强烈的腐蚀性,不能使用金属药匙,避免接触天平称盘。其1%水溶液在4℃可稳定数月不变。实验用水一般用双蒸馏水。实验室中的尘粒要尽量减少,否则实验的结果将缺乏重复性。
  金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用pH电极测定金溶液的pH值。为了使溶液pH值不发生改变,应选用缓冲容量足够大的缓冲系统,一般采用柠檬酸磷酸盐(pH3~5.8) 、Tris-HCL (pH5.8~8.3)和硼酸氢氧化钠(pH8.5~10.3)等缓冲系统。但应注意不应使缓冲液浓度过高而使金溶胶自凝。
  3、柠檬酸三钠还原法制备金溶胶:
  取0.01%氯金酸水溶液100ml 加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液 0.7ml,金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色,继续煮沸15分钟,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在 535nm,A1cm/535=1.12。 金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关,一旦颗粒大小发生变化,光散射也随之发生变异,产生肉眼可见的显著的颜色变化,这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。
  金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径的金溶胶,见附表。 附表 100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响1%柠檬酸三钠ml 0.30 0.45 0.70 1.00 1.50 2.00金溶胶颜色蓝灰、紫灰、紫红、红、橙红、橙吸收峰(nm) 220 240 535 525 522 518径粒(nm) 147 97.5 71.5 41 24.5 15 
  4、柠檬酸三钠-鞣酸混合还原剂:用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶,操作方法如下:取 4ml1%柠檬酸三钠 (Na3C6H5O7.2H2O),加入0~5ml1%鞣酸,0~5ml 25mmo/L K2CO2(体积与鞣酸加入量相等),以双蒸馏水补至溶液最终体积为20ml,加热至60℃取1ml1%的 HAuCl4,加于79ml双蒸馏水中,水浴加热至60℃,然后迅速将上述柠檬酸-鞣酸溶液加入,于此温度下保持一定时间,待溶液颜色变成深红色(约需0.5~1小时)后,将溶液加热至沸腾,保持沸腾5分钟即可。改变鞣酸的加入量,制得的胶体颗粒大小不同。
  5、白磷还原法:在120ml双蒸馏水中加入1.5ml1%氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3,然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液,混匀后室温放置15分钟,在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm,并有很好的均匀度,但白磷和乙醚均易燃易爆,一般实验室不宜采用。
  要得到大小更均匀的胶体金颗粒,可采用甘油或蔗糖密度梯度离心,经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数(CV)可小于15%。
  免疫胶体金制备
  1、蛋白质的处理:由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。
  一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。
  2、蛋白质最适用量的选择:将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1ml(含蛋白质5~40ug)加到 1ml胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5分钟后加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2小时,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。
  3、标记:在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。
  下述标记步骤最为常见:
  ①用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。  ②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2~3ml),搅拌2~3分钟。  ③加入5ml1%PEG20000溶液。  ④于10000~100000g离心30~60分钟(根据粒径大小选择不同离心条件),小心吸去上清液(切忌倾倒)。  ⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2~0.5mg/ml PEG20000的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以 A1cm/540nm=1.5左右为宜,以 0.5mg/ml叠氮钠防腐,置4℃保存。  ⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200柱进行凝胶层析分离纯化,以含 0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。  以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心或微孔滤膜预处理。
  胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存
  胶体金具有很高的动力学稳定性,在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢,可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。
  金溶胶必须有少量电解质作稳定剂,但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚,但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性,如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。
  当金溶胶吸附蛋白质后,溶胶的稳定性随溶液pH而变化,而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点,如ConA,过氧化物酶等,当pH较低时保持稳定,提高pH则显得不稳定,接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2~0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4~10℃贮存数月有效,不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚,可离心除去。
  免疫胶体金的应用  
  1、胶体金在电镜水平的应用
  胶体金应用电镜水平的研究最早,发展最快,应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3~15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3~15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测,而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。
  胶体金用于电镜水平的研究,主要包括:①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。
  金标记在电镜水平的应用,主要方法包括:包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。
  实验证明,该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高,既可用于抗原检测,也可用于抗体检测,因此,可同时适用于科研和诊断。
  2、胶体金在光镜水平的应用
  胶体金同样可用做光镜水平的标记物,取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于:①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原,③组织中或亚薄切片中抗原的检测。  胶体金用于光镜水平的研究,可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。
  3、胶体金在流式细胞仪中的应用:  应用荧光素标记的抗体,通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原,是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠,区分不同的标记困难,因此必须寻找一种非荧光素标记物,用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。该标记物必须能够改变散射角,胶体金可以明显地改变红激光散射角,因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。
  4、凝集试验:单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液,其颜色随溶胶颗粒大小而变化,当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚,溶胶颗粒极度增大,光散射随之发生变化,颗粒也会沉降,溶液的颜色变淡甚至变成无色,这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。
  5、免疫印迹技术(immunoblotting):免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离,得到的区带转移至硝酸纤维素膜,然后用酶免疫法(或免疫荧光、RIA)进行定量。
  免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后,再与经葡萄球菌A蛋白致敏的胶体金温育,彻底洗去多余的胶体金,根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。  利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理,采用银显影剂增强金颗粒的可见性,更可大大提高测定灵敏度,检测下限可低至 0.1ng,这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。  由于胶体金免疫印迹技术简便、快速,且有相当的高的灵敏度,在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。
  6、胶体金在肉眼水平的应用  胶体金取代传统三大标记物,用于肉眼水平的免疫检测中。除了胶体金本身具有的特点外,还有以下优点:①试剂和样本用量极小,样本量可低至1~2ul;②不需γ-计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器,更适于现场应用;③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与;④实验结果可以长期保存;⑤时间大大缩短,提高了检测速度。 
  金标过程中,无共价键形成,是一定离子浓度下的物理吸附。因此几乎所有的大分子物质都可被金标记,标记后大分子物质活性不发生改变。实验结果表明,胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。而结合银染色时,检测的敏感性更大大提高。   
  胶体金在免疫层析快速诊断技术中的应用
  免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现特异性的免疫诊断。  
   早孕诊断用的免疫层析试纸条(通常又叫尿妊纸条)的装配结构见图一。
装配方法:在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α-HCG玻璃纤维、已固定有抗β-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配,配件与塑料底板的结合可用双面胶或其它粘性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切,裁成宽度为4mm的条状,即为尿妊用纸条。
  本法检测速度快,一般一两分钟可出结果;灵敏度高,可达50IU/L;好的试纸条结果也是准确可靠的,这是其所以能在尿妊诊断中得到广泛应用的主要原因。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性,但与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关,准确性取决于抗β-HC G的特异性。
  金标尿妊纸条虽然好用,但在使用中也必须注意以下几个方面:一是温度,试纸条虽然可在室温保存,但大批暂时不用的试纸条还是应该放在4℃保存,以免抗体失效,从冰箱刚取出的试纸条则应待其恢复至室温,然后才打开密封,可避免反应线模糊不清。二是正确操作,一般的操作方法是在试纸条的吸尿玻璃端滴入2滴(约100微升)尿液,或将吸尿端直接插入标本中,深度约10~15毫米20秒,取出后平放,这种方法比较麻烦且容易造成污染。我们的方法是取尿标本约0.5ml 加入小试管中,然后插入试纸条,待1~2分钟反应带清晰后观察结果。
   胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用
  ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用,特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ELISA法由于操作程序复杂,时间较长,给实验室带来不便。因此出现一步法快速检测试剂盒,虽可提高检测速度,但有出现假阴性结果的弊端。ELISA法需时较长的主要原因,是由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应不适当地缩短反应时间,将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要,近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法,快速斑点渗滤法即为其中一种,其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法(Dot-immunogold filt ration assay),又称滴金免疫法。
  快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体:固定于膜上的特异性抗原+标本中的相应抗体+金标记的抗抗体或SPA显色。夹心法测抗原:固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色。
  结果判断:快速斑点免疫金渗滤法在操作完成后即可直接观察结果。根据测定模式的不同可有以下不同的判定结果。
日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

胶体金[198Au]

药物名称   胶体金[198Au]
药物别名   胶体金[198Au]
英文名称   Gold[198Au] Colloidal
说  明   
功用作用   
用法用量   
注意事项   
日期:2009年1月18日 - 来自[放射性同位素药]栏目
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胶体金早早孕试验在血清β-HCG定量检测中的运用

【摘要】    目的 探讨胶体金早早孕试验在血清β-HCG定量检测中的运用价值。方法 分别用胶体金早早孕试验和发光免疫分析法检测血清β-HCG。结果 两种方法有很高符合率,分别为强阳性100.00%,阳性99.15%,弱阳性96.46%,阴性100.00%。结论 胶体金早早孕试验是进行定量检测β-HCG的较好预筛方法。

【关键词】  胶体金早早孕试验 发光免疫分析法 β-HCG

  人绒毛膜促性腺激素(HCG)是一种唾液酸糖蛋白,分子量大约为46,000道尔顿。 HCG开始时是在受精卵进入子宫壁进行培育后不久由胎盘绒毛滋养层合体细胞合成并分泌的。它与胎盘激素、促黄体生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)以及人甲状腺刺激激素(hTSH)相类似,都是由两个非共价结合相异亚基所组成的糖蛋白,分别标明为α和β,具有各自的碳水化合物侧链。这些糖蛋白的α亚基都非常相似,但其生物和免疫化学特异性是由β亚基决定的。人绒毛膜促性腺激素与促黄体生成激素的β亚基在氨基酸含量上相当一致。人绒毛膜促性腺激素的β亚基所特有的氨基酸残余物为其提供免疫化学特异性。故临床上采用β-HCG检测来反映机体HCG水平。目前,用于检测血清β-HCG的放射免疫法逐渐被灵敏度高、稳定性好的化学发光免疫法替代。发光免疫分析仪在各实验室较为普及。本文介绍一种用胶体金早早孕试纸筛选后再上机检测,操作简单,费时少,且准确性高。

    1  资料与方法

    1.1  资料来源  2006年1~12月临床送检有停经史,年龄20~35岁的门诊病人和住院病人的血液,共2200份标本。

    1.2  试剂和方法

    1.2.1  胶体金早早孕试验  空腹抽取3ml血液,离心后取血清。将测试条有箭头一端插入血清中,5s后取出平放,5min之内观察结果,判断方法按操作说明。分强阳性、阳性、弱阳性和阴性。早早孕试纸由浙江艾康生物技术有限公司提供。

    1.2.2  发光免疫分析法测定  原理为微粒酶免疫检测(MEIA)技术,按仪器说明书操作。血清早早孕试验阴性或弱阳性标本按仪器未稀释法(0:0)上机测定,早早孕阳性标本按仪器稀释法(1:10)上机测定,早早孕试验强阳性标本按仪器稀释法(1:200)上机测定。仪器型号Abbott AXSYM SYSTEM,试剂为原装试剂。正常的参考范围:< 5mIU/ml。用前述两种方法同时对2200份标本测定。

    2  结果

    胶体金早早孕和化学发光免疫法结果有着较好的一致性。强阳性、阳性、弱阳性和阴性的符合率分别为100.00%、99.15%、96.46%和100.00%,结果见表1。 表1  化学发光免疫分析法和胶体金早早孕试验测定β-HCG结果

    3  讨论

    由于血清β-HCG在正常人体中含量较低,而在妊娠及滋养细胞性疾病时又异常升高,因受仪器测定的线性范围所限制,在未知浓度时直接上机检测,高值标本无法读数,要选择稀释法重新检测,如果每天标本量大,在时间和成本上都是不允许的,因胶体金早早孕试验是定性试验,敏感度和特异性相对较低,从上面结果显示:有22例假弱阳性标本,这可能由于高浓度LH等激素引起阴性标本假弱阳性,以及恶性葡萄胎病人标本由于高浓度β-HCG导致抗原过剩,结果造成阳性标本假弱阳性。有3例假阳性标本,这可能由于高浓度LH等激素引起阴性标本假阳性。如果把两种方法结合起来即可节约试剂成本,又可更快速、更准确的报告检验结果,增加可信度和准确性,更好服务临床。所以, 胶体金早早孕试验不失为一种省时又省力的筛选方法。

    (编辑:李  木)


作者单位:850007 西藏拉萨,西藏军区总医院检验科

日期:2008年7月4日 - 来自[2007年第8卷第12期]栏目

乙型两对半测试卡胶体金法检出HBsAg阳性600例结果分析

【摘要】  目的 了解乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg阳性结果特异性,研究提高特异性的方法。方法 用乙型两对半测试卡胶体金法检出HBsAg阳性224例,对HBsAg阳性224例,分别用HBsAg胶体金和ELISA进行复查。结果 HBsAg检出阳性212例,阴性12例,ELISA检出阳性212例,阴性12例,两者阳性符合率100%,乙型两对半测试卡胶体金法阳性符合率为94.6%。结论 乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg存在一定的假阳性。用HBsAg胶体金法或ELISA对乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg阳性结果复查,可以提高HBsAg阳性结果的特异性。

【关键词】  胶体金;HBsAg; 乙型两对半

      乙型两对半测试卡胶体金法优点简单快速,观察结果直观,不需仪器,适合基层医院使用。我们发现乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg存在一定的假阳性。对于幼儿入学及成人就业体检人群,必须保证乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg有较好的特异性。为了不影响幼儿入学及成人就业,有必要对乙型两对半测试卡胶体金法检出的HBsAg阳性结果复查。本文用HBsAg和ELISA分别进行复查。介绍如下。

    1  材料与方法

    1.1  对象  收集我院体检中心样本共2612例。标本均无溶血,无脂血现象,待标本充分凝固后才离心分离出血清检测。

    1.2  方法  用乙型两对半测试卡胶体金法检出HBsAg阳性224例,对HBsAg阳性224例,分别用HBsAg胶体金和ELISA进行复查。

    1.3  试剂  乙型两对半测试卡胶体金法试剂为广州万孚公司产品,HBsAg胶体金法试剂为艾康公司产品,ELISA试剂为上海荣盛公司产品。所有试剂严格按照说明书操作。HBsAg室内质控物1ng/ml由广东省临床检验中心提供。

    1.4  仪器  雷杜RT-6000酶标仪及RT-3000洗板仪。

    2  结果

    对2612人份血样用乙型两对半测试卡胶体金法检出HBsAg阳性样本224份(占总数8%),HBsAg检出阳性212例,阴性12例,ELISA检出阳性212例,阴性12例,两者符合率100%,乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg阳性特异性为94.6%。

    3  讨论

    从上可知,用HBsAg胶体金法或ELISA结果复查,提高HBsAg的特异性。HBsAg胶体金法特异性强, 与ELISA阳性符合率100%,灵敏度与 ELISA 一致,在复查样品时较 ELISA 简单快速,观察结果直观,不需仪器设备。

    用胶体金试纸复查乙型两对半测试卡胶体金法HBsAg阳性标本,存在一定的漏检,对于可疑标本或弱阳性标本,建议用ELISA复查,降低漏检率。不同厂家或同一厂家不同批号HBsAg胶体金法诊断试剂质量存在着差异,同一厂家试剂灵敏度、反应速度批间差异非常大[1]。因此在临床工作中应通过实验研究选用质量好的HBsAg胶体金法诊断试剂,减低漏检率。

【参考文献】
  1 赵晓华,李锦,李军.5个厂家HBsAg金标诊断试剂的比较.中国输血杂志,2002,15(4):272-273.


作者单位:528441 广东中山,广东省中山民众医院

日期:2008年7月4日 - 来自[2007年第8卷第5期]栏目
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测定粪隐血几种方法的实验观察

【摘要】  目的 通过比较几种试剂测定粪隐血,以便寻找更方便、快捷、价廉准确的检测方法。方法 采用化学法(试纸法、联苯胺法)、胶体金法(按试剂说明书操作)和蚕丝蛋白膜法(按自制方法操作)比较。结果 化学法敏感度高,但特异性低。化学法和胶体金法与蚕丝蛋白膜比较在两组试验组差异均有显著性(P<0.01)。结论 化学法对粪隐血试验只能起初筛作用,进口免疫试剂价格过高,蚕丝蛋白膜法可代替免疫法,在临床应用是理想的免疫方法。

【关键词】  隐血试验;方法;评价

    粪隐血试验在病人消化道少量出血和肠道肿瘤的诊断中有极其重要的价值[1]。由于化学法检测隐血原理是因Hb有类似过氧化物酶的作用原理,易受动物血、食物、药物及其他还原性物质干扰,而进口金标免疫法胶体金法虽特异好但试剂价格昂贵。为此,我科根据免疫学原理研制出蚕丝蛋白膜试剂,对508例住院病人的粪隐血以胶体金纸条法为标准对联苯胺法、贝索纸条法、蚕丝蛋白膜法在临床应用的效果进行初步评价。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源  随机收集我院各科患者粪便459份为试验组,遵医嘱食用动物血20~50g和含铁高的蔬菜及有还原性的药物,其中有4例吞服自己2ml鲜血的自愿者。进食48h后收集的49份粪便标本,称对照组。

    1.2  试剂  胶体金法为美国进口试剂,批号0404711。贝索粪隐血2号为珠海贝索公司的产品,批号031125。联苯胺试剂(按朱忠勇《实用医学检验》)新鲜配置[2]。蚕丝蛋白膜法试剂为自行研制。

    1.3  操作方法  化学、免疫3种方法分别按各自操作规程操作。蚕丝蛋白膜法操作程序:(1)取修饰好的蚕丝膜片塑料条4条(按照以下4组做好标记编号),放室温3min,然后分别滴加待检患者粪便悬液,即试验条片、阳性对照条片、阴性对照条片、空白对照条片各组相应的标本20μl。(2)将以上各组加有粪便悬液的受体膜,置微波炉(市售)(LOW档)反应2min使粪便悬液种的Hb与蚕丝膜上的抗人Hb抗体结合。(3)以PBS-Tween 20 0.1mol/L、pH7.4冲洗膜4~5次,然后于每片丝膜上覆盖一片酶标抗体聚脂膜,使丝膜上形成抗体HbAb-Hb-HRP-抗人HbAb的复合物。(4)再次放微波炉反应2min后立即取弃酶标抗体聚脂膜片,同时以PBS-Tween 20 0.1mol/L、pH7.4冲洗蚕丝蛋白复合膜4~5次。(5)吸干后滴加H2O2与TMB显色剂各1滴置微波炉中1min,取出片膜可见蚕丝膜上阳性对照呈蓝色。(6)观察结果。阳性即可见丝膜上呈现鲜明的蓝色,阴性对照和空白对照条片均为无色。

    2  结果

    以胶体金法的测定结果为标准,分别计算并比较两组样本的3种方法各自的敏感性、特异度及胶体金法的一致性。结果见表1~4。 表1  无指引组4种方法的测定结果表2  指引组4种方法的测定结果表3  试验组3种方法的敏感度、特异度比较表4  两组样本3种方法测定结果与胶体金法结果之间的配对χ2检验P值

    3  讨论

    胶体金免疫法是被世界卫生组织和世界胃镜检查协会推荐作为粪便隐血试验的一种较为确认的方法[2]。但因其成本偏高,在某种程度上限制了其推广应用。在临床应用中,研发更为方便、快捷、准确,且成本低廉的新的粪便隐血检验方法将成为免疫学试验研究的课题。

    单克隆抗体胶体金试验法特异地针对人血红蛋白抗原表位[3]。因此,本文以胶体金免疫法的测定结果为标准,分别对联苯胺法、贝索试纸法、蚕丝蛋白膜法。在临床应用中进行对比,其结果:在试验组和对照组,联苯胺法、贝索试纸法虽然敏感度较高,但特异度不高,在试验组中分别是76.3%、79.1%;在对照组中特异度更低,分别是31.8%、36.4%;与胶体金法缺乏明显的一致性(P<0.01),而蚕丝蛋白膜法敏感性高达100%,特异度也高达100%,具有很好的特异性、灵敏性与胶体金法均表现高度的一致性(P<0.05),基本上能排除饮食及药物等居多还原剂的干扰。

    由此可见,两组中联苯胺法、贝索试纸法与胶体金法其结果存在明显差异(P<0.01),而蚕丝蛋白膜法与胶体金法差异无显著性,均表现高度的一致性(P>0.05)。故在临床应用中,蚕丝蛋白膜法无疑是一种经济、便捷、精确的粪便隐血检测新方法。

 

【参考文献】
  1 王莉.胶体金试纸与联苯胺法检测隐血的比较.临床检验杂志,2002,20(3):144.

2 朱忠勇,陈之航.临床医学检验.上海:上海科学技术出版社,1978,202.

3 Young GP,St John DJ,Winawer SJ,et al.Choice of fecel occult blood tests for colorectal cancer screehing.Yecommendations based on performance characteristics in population studies.a WHO(World Health Organization) and OMED(World Organization for Digestive Endoscopy)report.Am J Gastroenterol,2002,97(10):2499-2507.

4 李林海,黄晓雁,张云龙,等.三种粪便隐血试剂实验效果观察.临床检验杂志,2004,22(2):113.


作者单位:435000 湖北黄石,黄石市中医医院检验科

日期:2008年6月30日 - 来自[2007年第6卷第5期]栏目

HBsAg胶体金试纸条的应用评价

【关键词】  HBsAg胶体

   胶体金试纸条已广泛用于临床检测,为了解HBsAg胶体金试纸条的准确性,笔者对628例体检者进行乙肝表面抗原筛检,并与酶联免疫法相比较,从而对胶体金试条有一个正确的认识。

    1 材料与方法

    1.1 材料 628份清晨空腹血液3 ml,加入试管中备用。

    1.2 试剂 HBsAg胶体金试条,由蓝十字生物药业有限公司生产,在有效期内使用。酶联免疫试剂盒,由上海荣盛生物技术有限公司生产,在有效期内使用。

    1.3 方法 胶体金法是将测试纸有箭头的一端插入检测样血清中,约10 s取出平放,满25 min观察结果。测试纸插入样本深度不可超过标志线。酶联免疫法按试剂盒使用说明书操作,结果用DQSO-20型酶标仪读取。

    1.4 结果判断 胶体金法(1)阳性:在检测线位置及对照线位置各出现一条紫红色反应线;(2)阴性:反在对照线位置出现一条红色反应线;(3)无效:测试纸无红色反应线出现,或仅在检测线位置出现一条红色反应线,表明实验失败或检测试纸失效。酶联免疫法:标本OD值≥0.14为阳性,标本OD值<0.14为阴性。

    2 结果

    2.1 检测结果 胶体金法:35例阳性,6例检测线呈色较浅样本未做断定。酶联免疫法:39例阳性。胶体金法与酶联免疫法符合率为99%。587例样本胶体金法为阴性,酶联免疫法也是阴性。35例样本胶体金法为阳性,酶联免疫法也是阳性。6例胶体金法未定样本,酶联免疫法有4例为阳性,2例为阴性。

    2.2 胶体金法与酶联免疫法出现偏差的原因 应考虑是否是试纸条的质量问题,以及操作者的工作经验和实验室的工作环境。

    3 讨论

    (1)628例样本来源均是教师,阳性检出率较低,但也可说明问题。(2)胶体金试纸条为单包装,使用方便快捷,便于保存和使用方法的掌握,有利于经验少的操作者使用。(3)价格合理,省时省力,是进行筛检较好的检测方法,也是较偏远农村卫生院检验室能够使用也方便使用的一种检测方法。虽然存在偏差但也较易校正,笔者认为是一种较好的检测方法。

    (编辑:林剑雷)


作者单位:028400 内蒙古开鲁,开鲁县妇幼保健所

日期:2008年6月30日 - 来自[2007年第5卷第6期]栏目
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抗人巨细胞病毒IgM胶体金快速检测试剂研制成功

        北京英诺特生物技术有限公司自主研发的抗人巨细胞病毒IgM胶体金快速检测试剂,具有简便快速的特点,成为基层医疗单位开展优生优育和提高人口素质的好帮手。  
  据悉,2006年成立的北京英诺特生物技术有限公司,是一家专注于体外诊断试剂研发生产的高科技企业。公司成立以来,根据中国国情特点和国内外技术发展趋势,产品研发方向直接定位于国际上最新的第三代免疫诊断技术———胶体金快速检测试剂,并立足于自身研发力量和国内外技术合作资源,建立了基因重组表达和胶体金工艺研究两个技术平台。在由博士、硕士为主体的公司研发团队努力下,首创完成了具有完全自主知识产权的抗人巨细胞病毒IgM胶体金快速检测试剂。该试剂不但具有很好的灵敏度和特异性,而且具有简便快速的特点。其检测结果判定不需要任何辅助仪器的特点更适合我国广大基层医疗单位,特别是农村基层医疗单位的广泛应用。该产品的研制成功,将更好地服务于优生优育领域,为降低出生缺陷人口,提高我国人口素质做出贡献。该研究项目获得了北京中关村科技园区创新基金的资助,促进其更快发展,服务社会。  
  该公司通过科学管理和资源整合,充分发挥了企业的科技优势,在自主研发的基础上,已向国家知识产权局申请4项发明专利。这些具有自主知识产权的核心技术,将成为企业快速发展的强大助推器。
日期:2008年3月4日 - 来自[技术要闻]栏目
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