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手持式 PCR 仪?科学家们又有新突破啦

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特定 DNA 片段的技术,由诺贝尔化学奖得主 Kary Mullis 于上世纪 80 年代发明,被誉为分子生物学领域的最重大进步之一,广泛应用于分子和遗传学分析。

30 年以来,科学家们一直在试图优化 PCR 技术,并扩大它的用途。现在,来自于范德堡大学的科研团队提出一种新方法——“适应性 PCR”(adaptive PCR),有望革新传统的 PCR 技术,并为 “手持式 PCR 仪” 带来可能。相关研究成果以 “Adaptive PCR Based on Hybridization Sensing of Mirror-Image L-DNA” 为题发表在《Analytical Chemistry》期刊。

在讲解这一最新突破之前,我们先回顾下之前曾学习过的 PCR 反应。PCR 反应有 5 个核心 “原料”:DNA 模板、引物(一段被设计用于与 DNA 模板互补的片段)、核苷酸碱基、DNA 聚合酶以及缓冲液。

PCR 的反应过程包含 3 个基本步骤,依次为:变性(高温环境下模板 DNA 发生变性,由双链变成单链)、退火(低温环境下引物与单链按碱基互补配对的原则结合)、延伸(温度回升至最适宜后,DNA 聚合酶开始合成互补链)。至此获得两条精确复制地 DNA 双链。随后,PCR 反应将进入 “变性—退火—延伸” 的循环,获得更多的半保留复制链,30-40 个循环可以获得几百万倍的基因数量。

由此可见,温度和样本是实现 PCR 的关键因素。基于聚合酶制造的 PCR 仪实际上是一个温控设备,需要控制变性、复性和延伸的温度。室温的变化、样本化学成分的改变都会影响 PCR 反应。所以,实验人员可能需要经过多次试验优化出最佳的样本配比、最高效的温度设置。

尽管技术成熟,PCR 仪器却操作复杂且对样本的化学成分及反应环境高度敏感,这主要是因为没有最直接的方法从分子水平监控反应过程。

为了实现精准控制,范德堡大学的生物医学工程师 Nicholas Adams 和 Frederick Haselton 将 “开箱即用” 的理念应用于 PCR,并提出“适应性 PCR”(adaptive PCR)的新方法。他们利用左旋 DNA(L-DNA)监测、控制 PCR 反应。

左旋 DNA 是 DNA 分子的镜像,其物理特性与右旋 DNA 一样,但是它不参与大多数生物反应。因此,当带有荧光标记的左旋 DNA 被添加至 PCR 样本中,它会以相同的方式(变性、退火)提供荧光信号反映分子反应信息、

为了验证他们的设想,Adams 和 Haselton 联合物理系助理教授 William Gabella 一起创建了一个适应性 PCR 设备原型(如下图),并进行相关验证试验。

手持式 PCR 仪:左边是紫外激光器,由它照射中间的样本,右边的分光光度计负责检测样本中荧光水平的变化,从而控制 DNA 复制过程。

Adams 表示:“现有的 PCR 仪器非常挑剔。我们实验室配备有 3 台 PCR 仪。当我们将相同的样本放入 3 台仪器中,只有两台仪器正常工作。当我与仪器公司的技术人员反映这一问题时,她询问我仪器周围是否有八英尺厚的墙壁?我回复说是的。她解释是因为这堵墙干扰了气流,从而对仪器运行造成影响。当然,事实证明她是对的,因为当我把仪器移出来,它又开始正常工作了!”

技术人员对一系列可能的问题提出应对之策:仪器需放置在温度可控的房间;DNA 样本需要纯化…… 即便如此,它仍然需要实验人员耗费时间优化反应条件。

现在,适应性方法能够控制 PCR 过程,有望简化操作、提高准确性、降低其对环境的敏感性,减少仪器大小(从台式到手持)。

适应性 PCR 借助荧光标记的左旋 DNA 确定理想的变性和退火温度,从而规避了所有变量。

左旋 DNA 序列可以通过商业合成获得,其序列与需要扩增的 DNA 序列一样,而且左旋 DNA 的两条链上分别标记上一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团(当两条链完整时,淬灭基团会吸收报告基团发出的荧光信号)。

伴随着高温环境,左旋 DNA 也会发生变性变成单链,使得荧光报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。通过分析荧光信号的累积速度,研究人员可以确定所有双链分离的精确时间点。

同时,我们还需要合成左旋引物(标记有荧光淬灭基团)。当 PCR 反应进行至退火步骤,引物会与左旋 DNA 单链集合,其淬灭基团会抑制荧光信号。这时候,荧光信号又会发生变化,从而便于研究人员分析引物与所有 DNA 单链结合的时间点。

值得注意的是,左旋 DNA 的量并不会改变,因为它不参与扩增步骤。

研究人员表示,这一适应性 PCR 技术可以弥补传统 PCR 仪器的局限性,它可以让基于 PCR 的诊断有机会脱离实验室环境,例如样本制备的高标准、反应温度的严密控制。

日期:2017年1月13日 - 来自[技术要闻]栏目

2019年全球数字PCR和qPCR市场预计将达到39.7亿美元

据美国市场研究机构Markets and Markets发布的研究报告显示,2019年全球数字PCR(dPCR)和qPCR市场预计将达到39.7亿美元,2014-201919年的年均复合增长率是7.8%。

关于dPCR和qPCR的市场分析内容涉及:技术,产品(仪器、试剂、软件),最终用户(研究实验室、学校、医院、制药与生物技术COS、研究组织),应用(研究、诊断、法医)。

助长全球dPCR和qPCR市场增长的关键因素包括:老年人口的不断增长,技术的进步,传染性疾病和遗传性疾病发病率的上升,公共和私人投资、基金和赠款的增加。然而,由于dPCR的高成本、dPCR和qPCR技术的限制两大因素,也阻碍了这一市场的增长。此外,新兴国家市场渗透的不断加强和从植物来源到基因组学的药物筛选,正在给dPCR和qPCR市场提供新的增长机会,并使该市场有较大幅度的增长。

新兴市场包括:中国、印度、巴西和墨西哥,以上新兴市场吸引该领域各公司进行开发和销售dPCR和qPCR产品。此外,对以基因为基础的疾病诊断和治疗认识的提高、越来越多的公共和私人部门的支持开发新的dPCR和qPCR技术、印度基因组学市场的崛起、日本癌症研究的加强,是推进dPCR和qPCR产品在新兴市场需求的几个关键因素。

该市场包括以下公司:赛默飞世尔(美国),Bio-Rad(美国),罗氏(瑞士),QIAGEN NV(荷兰),安捷伦(美国),梅里埃(法国),Takara(日本),飞雨(美国),艾本德(德国),以及BioSistemika(斯洛文尼亚)等。

日期:2015年12月23日 - 来自[技术要闻]栏目

无创产前诊断技术之“哼哈二将”

小孩子到了一定年纪,都会对自己从哪里来产生兴趣,这个问题往往让父母支支吾吾、闪烁其词。廖信忠在《我们台湾这些年》提供了一个答案,印象深刻。他妈妈当年这么回答,大意是:爸爸给妈妈打了一针就有了你,颇具禅机。

王小平在《我的兄弟王小波》“写在前面”的部分对遗传因子的描述很得要领:“一个人本质上相当于一个万花筒。在出生之前,这个万花筒被造物之手簸动,衍生出难以计数的花纹。但一旦出生,此图案就此凝结”。遗传病本质上就是凝结成的图案有了瑕疵,这个过程从进化的角度看再自然不过,但对个人和家庭着实不幸。

听同事说她一个朋友孩子出生的时候,作为医生的父亲关心的不是宝宝是男是女,而是先检查娃娃十个手指,十个脚趾是否齐全。那些迎接宝宝降临人间的父母们,心态估计就像《阿甘正传》里面那句经典台词:生命就像一盒巧克力糖,你永远不知道盒里乾坤。

好在母体内胎儿游离DNA的发现,为无创产前检测提供了更多的可能。DNA分子计数技术的出现、成熟与广泛使用,使得对胎儿游离DNA的检测达到前所未有的精度,从而实现对不同遗传疾病的检测,无论是单基因遗传病还是染色体的非整倍性疾病。本期推荐由香港中文大学Dennis Lo实验室的Allen Chan教授撰写的综述,介绍数字PCR和NGS(深度测序对每个DNA分子进行序列读取,当然也可以看成是一种核酸层面的计数技术)这两种DNA分子计数技术在NIPT方面的应用及带来的影响。

早期发展

1997年,Dennis Lo通过普通PCR扩增的方法证明了胎儿游离DNA的存在,该发现奠定了日后通过母体血浆中胎儿游离DNA的分析进行NIPT的基础。早期对胎儿游离DNA的检测主要集中在对父源性特异序列的定性分析,如果在母体血浆中检测到这些靶标序列,那就证明胎儿经遗传获得了父本的特异性序列。该策略的一个早期应用是通过RHD基因的序列分析进行Rh阴性血怀孕妇女的监控。

目前通过对父源性血浆游离DNA的分析进行NIPT,已经扩展到常染色体显性遗传类疾病,如软骨发育不全、肌强直性营养不良和亨廷顿氏舞蹈症等。但该策略不能应用于其他遗传模式的疾病,诸如母源性导致的常染色体显性遗传类疾病、常染色体隐性遗传类疾病和染色体的非整倍性疾病。因为这些情况下,无论胎儿是否获得致病序列,在血浆内都能检测到来源于母亲本身的靶标序列。因此需要更精确的检测技术及更强大的数据处理方式。

DNA分子的“数字式”计数 数字PCR对DNA在单分子层面的绝对计数流程与工作原理见下图。在数字PCR之前,广泛采用的荧光定量PCR通过Ct值对核酸进行定量计算,这种定量方法的理论依据是在每轮PCR循环后PCR的扩增产物翻倍,因此荧光定量PCR最小能分辨2X差异的情形。数字PCR采用计数的方式进行定量,因此检测精度更高,甚至根本不需要荧光定量PCR检测中需要的标准品。(数字PCR技术的原理、发展历程、操作流程及大致应用在本公众号的第一期和第二期有详细的介绍)

不同的数字PCR设备

早期的数字PCR往往手工进行反应体系的partition,一般在几百个partition number的水平,耗时且操作繁琐。目前越来越多的商业化数字PCR平台面市,实现了该技术的高通量、自动化。不同厂商的设备及主要性能见下表。

Fluidigm最早采用微流控芯片的方式实现了商业化的数字PCR,partition number接近1000,但该方式成本较高,尤其对于常规的临床检测而言。之后面市的基于“油包水”方式的微滴式数字PCR使用成本更低,相信在NIPT领域比微流控芯片的数字PCR有更好的应用前景。原文引述如下:

As the marginal cost for generating droplets is low, droplet digital PCR systems have gained popularity over microfluidic chip digital PCR system in NIPT service.

大规模平行测序(Massive parallel sequencing, MPS)

对于NIPT,MPS是一种有力的工具,能在一个反应里对血浆中成百万的DNA进行测序。数字PCR实验方案的设计需要以明确的靶序列信息为前提,而MPS完全不需要,这尤其使得MPS在染色体非整倍性疾病的分析方面具有优势。但目前来看,MPS在实验成本及检测时间上不如数字PCR。原文引述如下:

This characteristic is of advantage over multiplex digital PCR for analyzing different chromosomal regions simultaneously, making MPS particularly useful for aneuploidy detection. However, MPS is still much more expensive than digital PCR, and the turnaround time of analyzing a sample takes longer than digital PCR.

胎儿DNA浓度的测定

了解胎儿DNA在母血内的浓度是NIPT的质控标准之一,对后续的数据分析至关重要。早期测定胎儿DNA浓度的方法是利用荧光定量PCR分别测定胎儿特异性序列和胎儿、母体共有序列的方式来实现。通过测定SRY基因,孕早期和孕晚期胎儿DNA的平均含量分别为3.4%和6.2%。采用数字PCR检测后发现,胎儿DNA的含量更高,在早、中、晚期的含量分别是9.7,9.0和20.4%。

单基因病的检测

对于常染色体隐性遗传类疾病和常染色体显性遗传类疾病,携带者具体突变的定性分析是不够的,一种称为Relative mutation dosage(RMD)的分析是必要的,这种分析的原理见下图,其中假定胎儿DNA的含量占母体血浆的10%。

按上图所示,如果胎儿是纯和的野生型或突变型,那么母体血浆内不同等位基因间总体的最大差值就在20%。如何对如此小的差异进行分析?Dennis Lo实验室采用了一种称为sequential probability ratio testing(SPRT)的统计学算法,具体模式及举例见下图。

下图的例子中,母亲是某种常染色体显性遗传疾病的携带者,父亲是纯和野生型。其中横坐标是母体血浆中总共被分析的分子数,纵坐标是野生型对突变型的比例。如果该比例落在颜色区域,结果则具有统计学意义。如果落在红色区域,说明胎儿的基因型为野生纯和;如果落在蓝色区域,说明胎儿的基因型为杂合。SPRT分析中,实际需要分析的分子总数目不能在实验前确认。下图的例子中显示,总共经过了4轮测试得出具有统计学意义的结果。这种分析策略可以用于诸如地中海贫血、血友病和甲基丙二酸血症等遗传病的检测。

注:如对SPRT分析想做进一步了解,请参看论文:

Lo YMD, Lun FMF, Chan KCA, et al. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc Natl Acad Sci USA 2007;104(32):13116-21

El Karoui N, Zhou W, Whittemore AS. Getting more from digital SNP data. Stat Med 2006;25(18):3124-33

染色体的非整倍性分析

通过母体血浆DNA的分析来确认染色体的非整倍性状况,在技术上面临挑战。如果假定胎儿DNA占母体血浆总DNA的10%,理论上唐氏综合症胎儿导致21号染色体含量的增加只有5%。早期检测技术不可能对如此小的差异进行分析,所以早期NIPT的努力方向致力于发现胎儿与母体之间差异化的基因序列(如SNP位点、甲基化位点等),再针对这些差异序列进行分析。但这样的工作思路不够理想:1、寻找这些差异化位点耗时耗力;2、找到的差异化位点不能适用于所有人群。

不断涌现的DNA计数技术大大加速了利用通用序列对染色体的非整倍性进行分析。目前只需要对母体血浆DNA中的目标染色体(例如21号染色体)和参照染色体分别进行计数,就能得到chromosome dosages。具体分析中,被分析的分子总数目决定了结果的精度及统计学上的有效性。如果胎儿DNA的含量较低,就要求有更多的DNA分子被分析(被计数)。计算表明:如果母体血浆内胎儿DNA的含量减少50%,那么数字PCR分析的DNA分子数目需要增加400%。本综述同时对胎儿DNA的含量与总共需要被计数分子数目之间的关系进行了计算,见下图。如果胎儿DNA的含量为5%,那么在灵敏度95%和特异性99%的条件下,总共需要计数21号染色体DNA的分子数为100,000个,同时作为参照的染色体计数总数也需要在相同的水平。

通过上述计算,采用数字PCR技术进行非整倍性分析几乎是不可能的,因为在常规采血量的条件下不可能获得如此数量级的分子数。但如果对目标染色体与内参染色体上进行多个位点的同时检测(多重检测),可以在不提高采血量的情况下增加被计数分子的总数目。这不失为一种利用数字PCR技术进行非整倍性分析的思路,原文如下:

Practically, it is difficult to use a monoplex digital PCR analysis to achieve this large number of molecules because a large volume of plasma would be required. However, if multiple targets on the potentially affected chromosome are analyzed, then digital PCR analysis for aneuploidies would still be possible with a reasonable volume of plasma.

上述设计思路在RainDance公司编号为LCN 50-07052 Rev A的Application note中已经进行了初步尝试,具体实验方案见下图。对21号染色体和18号染色体分别检测20个位点,采用Roche公司的Universal Probe Library (UPL),其中18号染色体采用FAM检测,21号染色体采用TET检测。当然,实验人员也可以根据NGS的结果来选择染色体上的具体位点及检测位点的个数。

数字PCR技术之外,NGS已经成为NIPT进行染色体非整倍性分析的成熟技术,主要的工作来自Dennis Lo实验室一系列奠基性的工作,不再赘述。可参考其中最关键的文献。

日期:2015年10月21日 - 来自[技术要闻]栏目

成都生物所发明一种中成药中人参DNA的PCR检测方法

中国科学院成都生物研究所“中成药中人参DNA的PCR检测方法”获国家知识产权局发明专利(专利号:ZL 201210338707.4)。

传统的中成药的质量控制仅限于对药品性状上的鉴别以及化合物的含量测定。中药材制成中成药,原药材经多种制剂工艺制成中成药时其本身的性状已难以辨别;而中药本身成分复杂,一味药就几十甚至数百个化合物,一个由多种中药组成的中成药,其中化学成分就更多了,目前仅选择有限的几种化学成分的鉴定来控制中成药的质量,就为中成药造假者提供了很大的空间,例如人参,在制剂过程中不加入人参药材,仅加入被列为检测项目的化合物,或者以含有同样化合物的其他药材以假充真。

成都生物所研究人员针对以上问题公开了一种利用聚合酶链式反应(PCR)检测中成药中人参的DNA从而鉴定中成药中人参真伪性的方法。该发明在普通PCR的基础上,建立巢式PCR反应方法,可快速、准确、灵敏地检测中成药中的人参,为中成药的质量控制提供简单快速有效的方法。

日期:2015年3月2日 - 来自[生物医药]栏目

替代PCR,RPA成为致病菌检测的得力工具


重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

在今年发表的一系列文章中,RPA技术被广泛用于结核杆菌、耐药菌MRSA、沙门氏菌等常见致病菌的检测。在临床诊断和食品安全方面,为人们提供了简单快速的实地筛查方案。

RPA在临床诊断领域的应用

艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)是一种会引起感染性腹泻的重要致病菌。日前,研究人员以这种致病菌的毒力基因tcdB为靶标,开发了一个低成本的微流体RPA平台,文章发表在十月二十三日的《Analyst》杂志上。这个检测C.difficile的RPA分析芯片只需要6.4μL的初始样本,能够对扩增反应进行实时监控。

据估计,世界上约三分之一的人体内潜伏着结核病(TB)的致病菌,这些致病菌大多在肺部处于休眠状态。改善检测方法帮助TB诊断,被WHO列为公共建康的首要问题之一。RPA作为一种常温的快速DNA 扩增法,为资源匮乏的地区提供了检测TB的简便工具。研究人员在RPA的基础上,快速检测了结核分枝杆菌复合群MTC的DNA(IS6110和IS1081)。在39°C的环境下,RPA检测能在20分钟内得出高灵敏度的结果。进一步研究表明,在检测TB感染者的肺部样本时,RPA检测比荧光显微镜检测还要准确。

抗生素滥用现象使耐药菌日渐增多,目前这已经成为了一个全球性的公共健康问题。作为一种重要且危险的致病菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA一直是临床治疗中的棘手问题。在对MRSA进行DNA检测的时候,引物只能靶标一个多变的染色体区域,SCCmec。今年七月的《Plos one》杂志上发表的一项研究,通过多重RPA反应筛查了726个MRSA分离物。研究人员通过二代测序发现,24个RPA未检出的分离物中出现了新的插入突变,需要重新设计扩增引物。这一结果说明,临床上的MRSA筛查不能完全依赖DNA检测。

《Microchimica Acta》杂志今年二月的一项研究,展示了能够同时扩增和检测三种病原体的RPA芯片,包括淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙门氏菌(Salmonella enterica)和MRSA。这种芯片可以在二十分钟以内完成三种病原体和对照质粒的检测,S.enterica和MRSA的检出限可达10CFU,N.gonorrhoeae的检出限可达100CFU。这项研究中的RPA芯片,有望成为实地筛查重要致病菌的简便工具。

RPA在食品安全领域的应用

产志贺毒素的大肠埃希菌STEC是世界范围内最严重的一种食源性致病菌。《FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》杂志今年七月发表的一项研究,在RPA的基础上首次建立了等温实时的STEC检测体系。研究人员设计并评估了一系列引物和荧光探针,实现了很高的特异性和灵敏度。

沙门氏菌是一种主要的食源性致病菌。《Analytical Chemistry》杂志今年三月份发表的一项研究,将TwistFlow®沙门氏检测整合到微流体装置中,构建了检测沙门氏菌DNA的一体化分析系统。这一微流体装置整合了致病菌检测的三个主要步骤(DNA提取、RPA扩增和结果检测),能够在三十分钟内以全自动的方式完成检测。人们可以直接通过侧流层析试纸条看到沙门氏菌检测的结果。研究显示,这种装置。对PBS和牛奶的检测下限分别为10CFU/ml和100CFU/ml。

PCR-ELISA已经是一个用途相当广泛的成熟技术。《Analytica Chimica Acta》杂志今年二月发表的一项研究,首次用RPA取代了PCR,将快速的常温扩增、生物素/链霉亲和素体系、和比色法免疫分析结合起来。这种RPA-ELISA分析法可以用来筛查食品中的安全隐患,比如过敏原(榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米)、转基因成分(P35S和TNOS)、致病菌(Salmonella sp.和Cronobacter sp.)以及真菌(Fusarium sp.)。这项研究显示,RPA-ELISA在上述应用中均得到了令人满意的结果,有着很高的灵敏度和可重复性。

日期:2014年12月22日 - 来自[技术要闻]栏目

开源qPCR:每个人都可以做DNA诊断

qPCR:英文全名是 Real-time Quantitative PCR Detecting System,即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,其中 PCR 指聚合酶链式反应。

实时 PCR 热循环仪(Real-Time PCR)是一种功能强大的技术,可以检测大肠杆菌和李斯特菌这类食源性污染物,也可以诊断 艾滋病(HIV)和疟疾这类感染,目前肆虐非洲大陆的埃博拉病毒也能用它来帮助诊断。选择性地繁育动植物、监测水质、发现 DNA 中可能发生突变的基因组,这些问题 qPCR 都能轻松解决。qPCR 能帮助人类更早地完成人类基因组计划,在不久的将来,或许长生不老也不再是奢望。

但是,普通 PCR 机器成本高达 2000 美元,在那些真正需要的地方,人们很难负担起其昂贵的费用。为了改变这一现状,来自美国加州的 Chai Biotechnologies 着手制造更低成本的开源 qPCR(Open qPCR)。2010 年,创始人 Josh Perfetto 和 Tito Jankowski 在 Kickstarter 上开始众筹,并成功交付了世界上第一款开源的实时 PCR 热循环仪。如今,约有 800 台 PCR 在世界各地被需要的人们使用着。四年后 Chai Biotechnologies 再次走上了 Kickstarter,这一次,Josh 组建了一支囊括了电气、机械、光学和软件工程师在内的强大研发队伍,他们的目标就是将 qPCR 提升至更专业的水平,不仅仅是拷贝 DNA,还要将其转换成数据。

产品硬件

开源 qPCR 的加热模块拥有 16 个反应孔,能容纳 100 或 200 微升试管。该加热模块在 0~100℃之间可以以 5℃/s 的速率加热,许多 PCR 方案能够在 30 分钟内完成。

机器运行嵌入式 Linux 系统,不仅可以通过 800×480 像素的电容式触摸屏控制机器,还有 USB、以太网和无线网络接口,让用户通过 Web 浏览器或其他网络系统控制机器。

与世界各地的电源系统都兼容(110—240 V,47—63 赫兹),在特殊情况下允许以太阳能或电池供电的方式使用。

硬件设计的 BOM、SolidWorks 和 Eagle CAD 等文件在产品发布后都将作为开放源代码公布。

产品软件

利用 HTML5 和 JavaScript 等网络技术开发的开放而直观的用户界面。

提供了强大的协议编辑器,支持基本周期和步骤编辑,以及控制升温速率和自动分布降温等高级功能。

可视平板布局编辑器允许对每一个反应孔的样品、目标、标准和控制分别进行调控,并分别观察其荧光曲线。

包括实时控制,Web 用户界面和科学分析的代码在内的所有软件资料也将在产品发布后作为源代码公布。

软硬件的分析之后,或许你看到只是一堆高深的专业名词,依然不明白开源 qPCR 可以做什么?了解下面四个方面也许你就会明白了。

基因分型方面:

发现 DNA 里关于运动能力的基因;

确定基因遗传特征,比如与乳腺癌有关的 BRCA 变种;

基于所需的基因型选择性繁殖动物。

食品安全方面:

在食品供应中鉴别大肠杆菌、李斯特菌或沙门氏菌; 通过测试病原体和微生物指标监测水质;

检测掺杂在汉堡中的马肉或金枪鱼罐头中的海豚肉。

科学研究方面:

分析基因在细胞中的表达水平;

不需要添加凝胶即可得到 PCR 是否有效的即时反馈;

通过操纵和重新排列的 DNA 完成生物工程系统。

健康方面:

检测病毒,如艾滋病(HIV)和埃博拉;

检测昆虫为媒介传播的病毒,如疟疾和西尼罗河病毒。

目前市售的实时 PCR 试剂价格比较昂贵,Chai Biotechnologies 已在研发低成本的 PCR 试剂,但待其面世还尚需时日。不过 Chai Biotechnologies 已经为参与众筹的买家提供了入门包(Starter Packs),其中包含了足够 50 次 PCR 反应的试剂。此外,参与众筹的买家还能获得 Biohacker 套件奖励(包括早期开源数据库的访问权限、PCR 引物和对照文库、一个实验室移液器、PCR 试纸、采集 DNA 的无菌棉签等)。

降低硬件成本以及提升软件系统的兼容性和稳定性已成为开源 qPCR 面临的最大挑战,Chai Biotechnologies 在完成原型机并确定采购的关键零部件供应商之后,计划于 2015 年 3 月份交付第一批产品。对于他们来说,开源 qPCR 是一项长期而艰巨的任务,也将是对人类生活产生重大影响的项目。路途中难免充满风险和挑战,但只要众多陌生人的支持就是不断向前的动力。

日期:2014年12月8日 - 来自[技术要闻]栏目

核酸检测的革命:可替代PCR的犀利技术


自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR,这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。 英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的TwistAmp? 核酸扩增产品,能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低,特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。 RPA技术犀利在何处 常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤,而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37°C - 42°C之间,无需变性,在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要温控设备,RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。 据介绍,RPA检测的灵敏度很高,能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平,从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理,适用于无法提取核酸的实地检测。 RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA,还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测,还可以对扩增过程进行实时监控,甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。 目前,TwistAmp? 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过,经过特别优化的RPA扩增,也可以生成更长的扩增产物,或者减慢扩增速度(便于定量),甚至在更低的温度下进行反应。 RPA技术的基本原理 RPA技术主要依赖于三种酶:能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。 ViaFect转染试剂 重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。 RPA扩增的基础体系(TwistAmp? Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂,我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测,产物纯化后可用于下游研究。 在这个基础体系中添入不同的酶和探针,就可以实现多样化的RPA应用。举例来说,TwistAmp? Basic RT添加了逆转录酶,可以对RNA模板进行一步法扩增。 TwistAmp? exo结合了专利的exo探针技术和核酸外切酶III,能实现数据的实时读取,就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少,适合获得强荧光信号进行动力学分析,不适合终点检测(比如跑胶)。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来的TwistAmp? exo RT,可以一步实现RNA模板的实时扩增。 TwistAmp? fpg是一个添加了核酶fpg的实时报告体系。fpg探针技术的荧光累积比较慢,但终点的扩增子产量不会减少,因此也能支持终点分析。TwistAmp? nfo加入了核酶nfo,可以用“三明治法”进行终点检测,比如测流层析试纸条LFD。 除此之外,RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。 RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的,因为RPA引物比一般PCR引物长,通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率,影响扩增速度和检测灵敏度。 在设计RPA引物时,变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟,用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用,不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。 需要注意的是,目前的TwistAmp? 扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外,受目前的生产方法所限,RPA反应不适合用于E. coli标准实验室菌株的扩增。

日期:2014年10月31日 - 来自[技术要闻]栏目

博晖创新首获PCR诊断试剂注册证

    博晖创新10月23日晚间公告称,2013年10月,由公司子公司广州呼研所博晖生物技术有限公司研制、公司注册生产的甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒取得了国家食品药品监督管理局颁发的《医疗器械注册证》。

  该产品名称为甲型流感病毒及乙型流感病毒核酸检测试剂盒,主要用于定性检测人口咽拭子样本中甲型流感病毒或(和)乙型流感病毒RNA,有效期至2017年10月9日。

  博晖创新表示,该产品为公司首个获得注册的PCR诊断试剂,将进一步提高公司的核心竞争力和市场拓展能力,对公司未来经营产生积极的正面影响。同时公司预计该注册证的取得不会对今年的业绩产生重大影响。

日期:2013年10月25日 - 来自[技术要闻]栏目
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