【摘要】 目的 检测神经细胞黏附分子(NCAM)在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达，探讨NCAM分布情况与其在视神经再生中的作用。方法 选择64只健康成年雄性SD大鼠，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型32只为实验组，自体视神经—视神经吻合模型32只作对照组。于吻合术后15天、30天、45天、60天处死动物并取出吻合段神经。利用免疫组织化学方法(SP法)和计算机图像分析技术，测定NCAM在不同吻合模型中的表达。结果 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型表达水平高于视神经—视神经吻合模型。吻合术后早期表达水平明显高于末期。结论 坐骨神经移植有助于增加NCAM表达，促进视神经再生。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经再生；坐骨神经；免疫组织化学
Expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats
ZHU Yi-hua,ZHU Jie,TANG Bao-feng,et al.
Ophthalmology Department,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats.Methods 64 SD rats were randomly divided into two groups.The right optic nerve of all rats were transected.In the experiment group,an autologuous sciatic nerve of 15mm segment in the right was anastomosed to the distal optic nerve stump.In the control group,the cut ends of optic nerve were reapproximated by sutures.Animals were allowed to survive for 15,30,45 and 60days.The anastomosed nerves were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the experiment group were significantly higher than in the control group.Conclusion NCAM could play an important role in the regeneration of the optic nerve.A sciatic nerve graft onto the transected optic nerve help to induce the regeneration in adult rats.
【Key words】 NCAM；optic nerve regeneration; sciatic nerve;immunohistochemistry
近年神经生物学研究显示：视神经具有再生潜能，只是局部的微环境影响它的再生。坐骨神经的成功再生有赖于一个适宜的微环境，因而将坐骨神经移植到受损的视神经，改变视神经微环境，有可能促进视神经再生。神经细胞黏附分子(NCAM)在神经再生中的重要作用越来越受到关注。本课题就NCAM在成年大鼠自体视神经—坐骨神经吻合模型和视神经—视神经吻合模型术后不同时期的表达进行研究，探讨NCAM在视神经修复和再生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dauley大鼠150～200g，共64只(由福建医科大学实验动物中心提供)，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型组32只作实验组，自体视神经—视神经吻合模型组32只作对照组。按吻合术后15天、30天、45天、60天分别将各组随机分入4个时间点。每个时间点实验组及对照组各8只。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 大鼠用氯胺酮10mg/kg腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，经右侧眶上缘切口钝性分离至球后、暴露视神经，距眼球壁后4mm切断视神经，将取自体右下肢长约15mm的坐骨神经近中端与视神经远中残端行端-端吻合，并在吻合处以硅胶套管，坐骨神经另一端固定于头皮下。最后缝合切口。
1.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 动物依上法暴露右眼视神经，距眼球壁4mm切断视神经，将两断端行端-端吻合。距此吻合处4mm切断视神经，将此断端固定于头皮下，最后缝合切口。
1.3 标本的取材、固定、制作 于吻合术后15天、30天、45天、60天各处死实验组及对照组大鼠各8只。取吻合段神经标本长约5mm。经10%中性福尔马林固定，常规脱蜡，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.4 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.5 免疫组织化学SP法 石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封固。切片在相同一条件下进行。以PBS代替一抗作阴性对照；以大脑阳性片作阳性对照。
1.6 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理：每组取8张不同样本切片，置于物镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.7 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经的表达平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时间OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，以P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
2.1.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 在取材的过程中可见视神经与坐骨神经断端连接良好，吻合处光滑，未见神经瘤样膨大，并且有完整且连续的神经外膜，两条神经已成为一体、视神经端明显增粗、管径与坐骨端大小基本相同。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.1.2 自体视神经—视神经吻合模型 吻合术后15天可观察到，视神经两断端外膜已连接，吻合处未见神经瘤。视神经有萎缩，管径变细。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.2 HE染色结果
2.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 15天组可见神经轴突变性较明显，大部分崩解，呈网状分层、形成较大的空泡。淋巴细胞浸润，30天组可见神经变性仍明显，空泡可见，少许视神经纤维增生，淋巴细胞浸润明显。45天组及60天组神经变性较轻，空泡明显减少，视神经纤维大量增生。
2.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 15天组视神经溃变，纤维变细小，部分断裂、不连续。较多淋巴细胞浸润。30天及45天视神经溃变明显，纤维断裂，未见明显的纤维增生。60天组视神经溃变较重，大部分纤维断裂、崩解成空泡或网状，未见有明显的纤维增生。
2.3 NCAM免疫组织化学染色结果
2.3.1 在视神经—坐骨神经吻合模型表达 在吻合术后4个不同时间组，均可见分布。表现为红色至浅红色，不规则的线状。随着术后时间增加，反应强度逐渐减弱。其中术后15天组表达相对较强，着色最深，表现为阳性、红色(见图1)。相对15天组，术后60天组反应较弱、着色较浅，表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.3.2 视神经—视神经吻合模型表达 呈弱阳性—极弱阳性，表现为淡红色稀疏地散在于神经胶质细胞附近。术后15天组可见少量表达(见图3)，其余30天组、45天组、60天组表达不明显。
2.4 计算机图像分析 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型组(SON)和视神经—视神经吻合模型组(OON)表达的OD值，见表1。SON组表达水平明显高于OON组。
表1 NCAM在SON组和OON组表达的OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族，分布在神经细胞和星形胶质细胞表面。不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAM mRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM突出的生物学功能是：和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附，在神经元发育中NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并可能促进突触的可塑性，因此认为NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥着重要作用［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸，小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［2］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号，有研究表明，NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［3］。NCAM介导的细胞间的相互作用至少在再生早期作为再生过程的一个重要反应。
雪旺细胞(SC)是重要的神经胶质细胞，SC及其分泌的分子构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。许多体外和体内实验表明，SC不仅能支持周围神经再生，还能促进脊髓、视神经等中枢神经突起生长［4］。SC不仅是视网膜神经节细胞(RGCs)再生的良好基质，还和许多分子有着密切的联系，这是RGCs成功再生不可或缺的。有学者研究显示SC利用NCAM局部的紧密联系来建立与延长轴突的稳定性接触［4］。RGCs再生不单是一个轴突在移植的坐骨神经中生长，它建立在轴突与SC之间直接的动态联系，伴随着胶质细胞之间的变化和反应，SC在再生中产生多种功能物质，如神经生长因子，这些分子共同诱导RGCs再生［4］。存活的SC能持续表达NCAM分子［5］。
本研究发现在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM在各时期吻合神经段均有较多表达，然而在自体视神经断端吻合中表达较少、到后期基本无表达。提示视神经损伤时并不能分泌较多NCAM分子促进自身修复。在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM表达水平明显增加，这进一步证实NCAM在大鼠视神经损伤及修复中发挥重要作用。随着吻合术后时间增加，坐骨神经—视神经吻合模型中NCAM表达下降，这与离体的坐骨神经溃变，SC减少，分泌NCAM下降可能有关系。
本研究成功建立大鼠视神经—坐骨神经吻合模型，组织学研究观察到较多的视神经纤维增生。我们曾用透射电镜观察了视神经—坐骨神经吻合段的超微结构，发现了再生的视神经纤维，进一步证实坐骨神经移植物的确有助于视神经再生［6］。而自体视神经两断端吻合术后未见有再生的视神经纤维。移植大鼠坐骨神经至受损的视神经局部，能改变视神经的微环境，增加了NCAM的表达，显著促进了视神经再生。
（本文图片略）
【参考文献】
1 Fercakova A.Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
2 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
3 Walsh FS,Meiri K,Doherty P.Cell signaling and CAM-mediated neurite outgrowth.Soc Gen Physiol Ser,1997,52:221-226.
4 Dezawa M,Adachi-Usami E.Role of Schwann cells in retinal ganglion cell axon regeneration.Prong Retin Eye Res,2000,19(2):171-204.
5 Dedkov EI,Kostrominova TY,Borisov AB,et al.Survival of Schwann cells in chronically denervated skeletal muscles.Acta Neuropathol(Berl),2002,103(6):565-574.
6 朱益华，朱捷，唐宝丰，等.视神经再生模型超微结构观察.福建医科大学学报，2003，37(1)：35-37.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(编号：2000F005)
作者单位：1 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
2 353000 福建南平，福建省南平市第一医院眼科
3 350004 福建福州，福建医科大学病理系
(编辑：明 石)
【摘要】 目的 观察神经细胞黏附分子(NCAM)在大鼠不同发育时期视神经及坐骨神经上的表达，探讨NCAM在视神经与坐骨神经分布的差异。方法 50只SD大鼠，按出生后天数分成5组，取部分视神经和坐骨神经，
免疫组织化学方法和计算机图像分析技术，测定大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达。结果 NCAM在不同年龄大鼠视神经和坐骨神经均见表达。坐骨神经表达水平高于视神经。出生后7天组明显高于其他年龄组。结论 大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达差异有显著性。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经；坐骨神经；免疫组织化学；大鼠
Expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of rats
SUN Jian-hua,ZHU Yi-hua,ZHU Jie,et al.
Ophthalmology Department,Loudi City Centre Hospital,Loudi 417000,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of the rats during the different developing stages.Methods 50 SD rats were randomly divided into five groups.Both optic nerve and sciatic nerve were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the sciatic nerve was higher than that in the optic nerve.The expression in the rats of 7days age was significantly higher than that in other groups.Conclusion The expression of NCAM in the optic nerve was significantly different from that of the sciatic nerve in the rats.
【Key words】 neuronal cell adhesion molecule;optic nerve;sciatic nerve;immunohistochemistry;rat
神经细胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule,NCAM),是细胞黏附分子的重要成分，具有高度黏附性。它介导神经元之间识别和黏附，在神经系统生长发育和神经再生中发挥着重要作用。本文采用免疫组织化学的方法，研究大鼠不同发育时期NCAM在视神经、坐骨神经内的分布及其变化，从而探讨视神经和坐骨神经的NCAM环境的异同及其与再生能力的关系。
1 材料与方法
1.1 动物材料 健康雄性Sprague-Dauley大鼠50只(福建医科大学实验动物中心提供)，按出生后7、15、30、45、60天分5组，每组10只。
1.2 标本的取材、固定和制作 大鼠用氯胺酮(10mg/kg)腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，沿角巩缘全周剪开球结膜，各肌间钝性分离至球后，暴露视神经，取出眼球壁后视神经长约5mm。于股后部做正中切口，暴露梨状肌下缘至胫腓分叉处的坐骨神经段，切取坐骨神经长5mm。标本经中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.3 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.4 免疫组织化学SP法 视神经、坐骨神经石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封片。切片在同一条件下进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。以大脑阳性片作阳性对照。
1.5 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理，每组取10张不同样本切片，置于光镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.6 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经表达的平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时期OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 HE染色
2.1.1 视神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维细小、结构致密，无清晰的基膜。神经胶质细胞沿纤维走向呈散在的列队状排列。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，排列疏散零乱。
2.1.2 坐骨神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维较粗大、结构较疏松，可见清晰的基膜。雪旺细胞与神经内膜紧密相连，顺纤维走向散在分布。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，纤维变粗大、相对疏松。
2.2 NCAM免疫组织化学染色
2.2.1 NCAM在坐骨神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，在不同发育时期坐骨神经膜上，呈不规则的线状分布。随着年龄增加，反应强度逐渐减弱。其中7天组对抗体着色最深，反应为强阳性、深红色(见图1)。60天组对抗体着色较浅，反应产物表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.2.2 NCAM在视神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，分散在视神经胶质细胞表面。在大鼠出生后60天内，随着年龄增加，对NCAM抗体的反应强度逐渐减弱。在5个年龄组，7天组对抗体的反应略强、着色较深(见图3)，60天组表达最弱(见图4)。
2.3 计算机图像分析 NCAM在大鼠坐骨神经和视神经表达的OD值，见表1。坐骨神经表达水平明显高于视神经。
表1 NCAM在大鼠不同发育时期坐骨神经及视神经表达OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族。1987年首次获得NCAM的分子结构。NCAM分为三个区域：形成结合位点的氨基末端，含大量碳水化合物的中央区，以及与细胞膜相连的羧基末端区［1］。电镜下观察NCAM具有3条臂组成的“人”字岛形结构。进一步研究发现它有一绞链，绞链处5个Ig域和一个纤维粘连蛋白结合在一起。由于这个结构NCAM能根据细胞间的相互作用及方向，在细胞之间进行一定程度的转动［2］。
NCAM主要存在于神经系统中，NCAM在所有分化了的神经细胞以及某些星形胶质细胞中，基本上都有发现。它位于神经元表面，和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附。NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥重要作用［3］。
在胚胎发育过程中，NCAM广泛分布，表明NCAM参与许多发育过程。神经系统的正常发育依赖于细胞与其局部环境间复杂的相互作用，这些相互作用受NCAM等细胞黏附分子的介导。在神经元发育中，NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并能促进突触的可塑性。如在视投射发育过程中眼内注入抗NCAM抗体，引起视神经紊乱，导致视网膜与脑之间异常的神经连接［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸。小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［4］。实验发现NCAM抗体能阻断横切的坐骨神经再生［5］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号。近年认为NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［6］。
文献报道大鼠脑中NCAM mRNA的高峰接近于出生时期，而在随后的发育过程中降落了大约80%［2］。本研究发现NCAM在大鼠坐骨神经及视神经中均有表达，并且NCAM在大鼠坐骨神经中大量表达。大鼠越年幼，表达水平越高，随着年龄增加，表达水平相对下降，到发育晚期或成熟期其表达明显下降。NCAM在坐骨神经的表达与雪旺细胞(SC)的生物学功能密切相关。SC是重要的神经胶质细胞，包绕坐骨神经轴突，并形成髓鞘，与其周围存在的生物分子共同构成坐骨神经的微环境。存活的SC能持续表达NCAM分子［7］。在胚胎期SC能高水平的表达NCAM［3］。SC及其分泌的蛋白质等构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。
Anderson等的研究显示NCAM在胚胎视神经较多表达，出生后在视神经的表达为低水平［8］。本研究发现NCAM在大鼠视神经表达明显较坐骨神经弱，二者差异有显著性，并且随着年龄增加，表达水平明显下降，30～45天后表达更少，这可能与视神经再生能力相对较弱有关。由于不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAMmRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM结构差异会导致结合力不同。
有学者认为中枢神经再生困难可能与其缺少细胞外基质、细胞黏附分子等适宜的环境有一定关系［9］。NCAM介导的细胞间的相互作用是再生过程的一个重要环节。由于视神经与坐骨神经存在细胞外环境的差异，导致它们再生能力不同。曾有实验将周围神经移植或SC移植到受损的视神经，改变视神经环境，能显著促进视神经再生［10］。因此改善视神经再生环境，是研究神经再生的关键问题，增强NCAM表达、人为地提供适宜视神经修复和再生的微环境，可能为视神经损伤的修复开辟一条新途径。
（本文图片略）
【参考文献】
1 阿德尔曼.神经科学百科全书.上海：上海科学技术出版社，1992，821.
2 左明雪.细胞和分子神经生物学.北京：高等教育出版社，2001，284.
3 Fercakova A，Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
4 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
5 Remsen LG,Strain GM,Newmkan MJ,et al.Antibodies to the neural cell adhesion molecule disrupt functional recovery in injured nerves.Experimental neurology,1990,110:268-273.
6 Walsh FS,Meiri K,Doherty P.Cell signaling and CAM-mediated neuriteoutgrowth.Soc Gen Physiol Ser,1997,52:221-226.
7 Dedkov EI,Kostrominova TY,Borisov AB,et al.Survival of Schwann cells in chronically denervated skeletal muscles.Acta Neuropathol(Berl),2002,103(6):565-574.
8 Anderson PN,Campbell G,Zhang Y,et al.Cellular and molecular correlates of the regeneration of adult mammalian CNS axons into peripheral nerve grafts.Prog Brain Res,1998,117:211-232.
9 成军.细胞外基质的分子生物学与临床疾病.北京：北京医科大学出版社，1999，211-212.
10 Negishi H,Dezawa M,Oshitari T,et al.Optic nerve regeneration within artificial schwanns cell graft in the adult rat.Brain Res Bull,2001,55(3):409-419.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(2000F005)
作者单位：1 417000 湖南娄底，娄底市中心医院眼科
2 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
3 353000 福建南平，南平市第一医院眼科
(编辑：陆 华)
【摘要】 目的 检测神经细胞黏附分子(NCAM)在成年大鼠不同视神经再生模型中的表达，探讨NCAM分布情况与其在视神经再生中的作用。方法 选择64只健康成年雄性SD大鼠，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型32只为实验组，自体视神经—视神经吻合模型32只作对照组。于吻合术后15天、30天、45天、60天处死动物并取出吻合段神经。利用免疫组织化学方法(SP法)和计算机图像分析技术，测定NCAM在不同吻合模型中的表达。结果 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型表达水平高于视神经—视神经吻合模型。吻合术后早期表达水平明显高于末期。结论 坐骨神经移植有助于增加NCAM表达，促进视神经再生。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经再生；坐骨神经；免疫组织化学
Expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats
ZHU Yi-hua,ZHU Jie,TANG Bao-feng,et al.
Ophthalmology Department,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve regeneration model of the adult rats.Methods 64 SD rats were randomly divided into two groups.The right optic nerve of all rats were transected.In the experiment group,an autologuous sciatic nerve of 15mm segment in the right was anastomosed to the distal optic nerve stump.In the control group,the cut ends of optic nerve were reapproximated by sutures.Animals were allowed to survive for 15,30,45 and 60days.The anastomosed nerves were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the experiment group were significantly higher than in the control group.Conclusion NCAM could play an important role in the regeneration of the optic nerve.A sciatic nerve graft onto the transected optic nerve help to induce the regeneration in adult rats.
【Key words】 NCAM；optic nerve regeneration; sciatic nerve;immunohistochemistry
近年神经生物学研究显示：视神经具有再生潜能，只是局部的微环境影响它的再生。坐骨神经的成功再生有赖于一个适宜的微环境，因而将坐骨神经移植到受损的视神经，改变视神经微环境，有可能促进视神经再生。神经细胞黏附分子(NCAM)在神经再生中的重要作用越来越受到关注。本课题就NCAM在成年大鼠自体视神经—坐骨神经吻合模型和视神经—视神经吻合模型术后不同时期的表达进行研究，探讨NCAM在视神经修复和再生中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Sprague-Dauley大鼠150～200g，共64只(由福建医科大学实验动物中心提供)，随机分成2组，自体视神经—坐骨神经吻合模型组32只作实验组，自体视神经—视神经吻合模型组32只作对照组。按吻合术后15天、30天、45天、60天分别将各组随机分入4个时间点。每个时间点实验组及对照组各8只。
1.2 动物模型的建立
1.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 大鼠用氯胺酮10mg/kg腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，经右侧眶上缘切口钝性分离至球后、暴露视神经，距眼球壁后4mm切断视神经，将取自体右下肢长约15mm的坐骨神经近中端与视神经远中残端行端-端吻合，并在吻合处以硅胶套管，坐骨神经另一端固定于头皮下。最后缝合切口。
1.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 动物依上法暴露右眼视神经，距眼球壁4mm切断视神经，将两断端行端-端吻合。距此吻合处4mm切断视神经，将此断端固定于头皮下，最后缝合切口。
1.3 标本的取材、固定、制作 于吻合术后15天、30天、45天、60天各处死实验组及对照组大鼠各8只。取吻合段神经标本长约5mm。经10%中性福尔马林固定，常规脱蜡，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.4 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.5 免疫组织化学SP法 石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封固。切片在相同一条件下进行。以PBS代替一抗作阴性对照；以大脑阳性片作阳性对照。
1.6 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理：每组取8张不同样本切片，置于物镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.7 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经的表达平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时间OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，以P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 大体观察
2.1.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 在取材的过程中可见视神经与坐骨神经断端连接良好，吻合处光滑，未见神经瘤样膨大，并且有完整且连续的神经外膜，两条神经已成为一体、视神经端明显增粗、管径与坐骨端大小基本相同。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.1.2 自体视神经—视神经吻合模型 吻合术后15天可观察到，视神经两断端外膜已连接，吻合处未见神经瘤。视神经有萎缩，管径变细。周围有轻度纤维组织粘连及血管增生。
2.2 HE染色结果
2.2.1 自体视神经—坐骨神经吻合模型 15天组可见神经轴突变性较明显，大部分崩解，呈网状分层、形成较大的空泡。淋巴细胞浸润，30天组可见神经变性仍明显，空泡可见，少许视神经纤维增生，淋巴细胞浸润明显。45天组及60天组神经变性较轻，空泡明显减少，视神经纤维大量增生。
2.2.2 自体视神经—视神经吻合模型 15天组视神经溃变，纤维变细小，部分断裂、不连续。较多淋巴细胞浸润。30天及45天视神经溃变明显，纤维断裂，未见明显的纤维增生。60天组视神经溃变较重，大部分纤维断裂、崩解成空泡或网状，未见有明显的纤维增生。
2.3 NCAM免疫组织化学染色结果
2.3.1 在视神经—坐骨神经吻合模型表达 在吻合术后4个不同时间组，均可见分布。表现为红色至浅红色，不规则的线状。随着术后时间增加，反应强度逐渐减弱。其中术后15天组表达相对较强，着色最深，表现为阳性、红色(见图1)。相对15天组，术后60天组反应较弱、着色较浅，表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.3.2 视神经—视神经吻合模型表达 呈弱阳性—极弱阳性，表现为淡红色稀疏地散在于神经胶质细胞附近。术后15天组可见少量表达(见图3)，其余30天组、45天组、60天组表达不明显。
2.4 计算机图像分析 NCAM在视神经—坐骨神经吻合模型组(SON)和视神经—视神经吻合模型组(OON)表达的OD值，见表1。SON组表达水平明显高于OON组。
表1 NCAM在SON组和OON组表达的OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族，分布在神经细胞和星形胶质细胞表面。不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAM mRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM突出的生物学功能是：和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附，在神经元发育中NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并可能促进突触的可塑性，因此认为NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥着重要作用［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸，小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［2］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号，有研究表明，NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［3］。NCAM介导的细胞间的相互作用至少在再生早期作为再生过程的一个重要反应。
雪旺细胞(SC)是重要的神经胶质细胞，SC及其分泌的分子构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。许多体外和体内实验表明，SC不仅能支持周围神经再生，还能促进脊髓、视神经等中枢神经突起生长［4］。SC不仅是视网膜神经节细胞(RGCs)再生的良好基质，还和许多分子有着密切的联系，这是RGCs成功再生不可或缺的。有学者研究显示SC利用NCAM局部的紧密联系来建立与延长轴突的稳定性接触［4］。RGCs再生不单是一个轴突在移植的坐骨神经中生长，它建立在轴突与SC之间直接的动态联系，伴随着胶质细胞之间的变化和反应，SC在再生中产生多种功能物质，如神经生长因子，这些分子共同诱导RGCs再生［4］。存活的SC能持续表达NCAM分子［5］。
本研究发现在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM在各时期吻合神经段均有较多表达，然而在自体视神经断端吻合中表达较少、到后期基本无表达。提示视神经损伤时并不能分泌较多NCAM分子促进自身修复。在视神经—坐骨神经吻合模型中，NCAM表达水平明显增加，这进一步证实NCAM在大鼠视神经损伤及修复中发挥重要作用。随着吻合术后时间增加，坐骨神经—视神经吻合模型中NCAM表达下降，这与离体的坐骨神经溃变，SC减少，分泌NCAM下降可能有关系。
本研究成功建立大鼠视神经—坐骨神经吻合模型，组织学研究观察到较多的视神经纤维增生。我们曾用透射电镜观察了视神经—坐骨神经吻合段的超微结构，发现了再生的视神经纤维，进一步证实坐骨神经移植物的确有助于视神经再生［6］。而自体视神经两断端吻合术后未见有再生的视神经纤维。移植大鼠坐骨神经至受损的视神经局部，能改变视神经的微环境，增加了NCAM的表达，显著促进了视神经再生。
（本文图片略）
【参考文献】
1 Fercakova A.Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
2 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
3 Walsh FS,Meiri K,Doherty P.Cell signaling and CAM-mediated neurite outgrowth.Soc Gen Physiol Ser,1997,52:221-226.
4 Dezawa M,Adachi-Usami E.Role of Schwann cells in retinal ganglion cell axon regeneration.Prong Retin Eye Res,2000,19(2):171-204.
5 Dedkov EI,Kostrominova TY,Borisov AB,et al.Survival of Schwann cells in chronically denervated skeletal muscles.Acta Neuropathol(Berl),2002,103(6):565-574.
6 朱益华，朱捷，唐宝丰，等.视神经再生模型超微结构观察.福建医科大学学报，2003，37(1)：35-37.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(编号：2000F005)
作者单位：1 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
2 353000 福建南平，福建省南平市第一医院眼科
3 350004 福建福州，福建医科大学病理系
(编辑：明 石)
【摘要】 目的 观察神经细胞黏附分子(NCAM)在大鼠不同发育时期视神经及坐骨神经上的表达，探讨NCAM在视神经与坐骨神经分布的差异。方法 50只SD大鼠，按出生后天数分成5组，取部分视神经和坐骨神经，
免疫组织化学方法和计算机图像分析技术，测定大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达。结果 NCAM在不同年龄大鼠视神经和坐骨神经均见表达。坐骨神经表达水平高于视神经。出生后7天组明显高于其他年龄组。结论 大鼠视神经和坐骨神经NCAM表达差异有显著性。
【关键词】 神经细胞黏附分子；视神经；坐骨神经；免疫组织化学；大鼠
Expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of rats
SUN Jian-hua,ZHU Yi-hua,ZHU Jie,et al.
Ophthalmology Department,Loudi City Centre Hospital,Loudi 417000,China
【Abstract】 Objective To investigate the expression of NCAM in the optic nerve and sciatic nerve of the rats during the different developing stages.Methods 50 SD rats were randomly divided into five groups.Both optic nerve and sciatic nerve were taken from them and determined the expression of NCAM by immunohistochemistry.The immunohistochemistry stainings were analyzed by automatic image analysis technology.Results The expression of NCAM in the sciatic nerve was higher than that in the optic nerve.The expression in the rats of 7days age was significantly higher than that in other groups.Conclusion The expression of NCAM in the optic nerve was significantly different from that of the sciatic nerve in the rats.
【Key words】 neuronal cell adhesion molecule;optic nerve;sciatic nerve;immunohistochemistry;rat
神经细胞黏附分子(neuronal cell adhesion molecule,NCAM),是细胞黏附分子的重要成分，具有高度黏附性。它介导神经元之间识别和黏附，在神经系统生长发育和神经再生中发挥着重要作用。本文采用免疫组织化学的方法，研究大鼠不同发育时期NCAM在视神经、坐骨神经内的分布及其变化，从而探讨视神经和坐骨神经的NCAM环境的异同及其与再生能力的关系。
1 材料与方法
1.1 动物材料 健康雄性Sprague-Dauley大鼠50只(福建医科大学实验动物中心提供)，按出生后7、15、30、45、60天分5组，每组10只。
1.2 标本的取材、固定和制作 大鼠用氯胺酮(10mg/kg)腹腔麻醉，眼科手术显微镜下，沿角巩缘全周剪开球结膜，各肌间钝性分离至球后，暴露视神经，取出眼球壁后视神经长约5mm。于股后部做正中切口，暴露梨状肌下缘至胫腓分叉处的坐骨神经段，切取坐骨神经长5mm。标本经中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，作4μm厚石蜡切片。
1.3 HE染色 石蜡切片烤片过夜，常规脱蜡，苏木精染色，盐酸酒精分色，伊红染色，常规脱水后中性树胶封固。
1.4 免疫组织化学SP法 视神经、坐骨神经石蜡切片，使用SP-超敏试剂盒(福建迈新公司)染色。第一抗体NCAM Ab-1(1∶100)为美国NEOMARKERS公司产品。AEC显色，苏木精对比染色，水性封片。切片在同一条件下进行。以PBS代替一抗作为阴性对照。以大脑阳性片作阳性对照。
1.5 图像分析 光镜下，依着色强度分为强阳性、阳性、弱阳性、极弱阳性和阴性。标本经Video Pro32彩色图像分析系统(澳大利亚Leading Edge Pty Ltd)处理，每组取10张不同样本切片，置于光镜(×40)下，每张切片取3个视野，通过彩色图像分析系统，分别测量平均光密度值(OD)。
1.6 统计学方法 对所得的数据进行统计处理，用均数±标准差（±s）表示。比较NCAM在大鼠坐骨神经及视神经表达的平均光密度值，采用独立样本比较t检验，不同发育时期OD值比较采用方差分析、Post Hoc t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 HE染色
2.1.1 视神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维细小、结构致密，无清晰的基膜。神经胶质细胞沿纤维走向呈散在的列队状排列。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，排列疏散零乱。
2.1.2 坐骨神经(纵切片) 有髓神经纤维，纵行走向，纤维较粗大、结构较疏松，可见清晰的基膜。雪旺细胞与神经内膜紧密相连，顺纤维走向散在分布。出生后随着年龄增加，胶质细胞数量减少，纤维变粗大、相对疏松。
2.2 NCAM免疫组织化学染色
2.2.1 NCAM在坐骨神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，在不同发育时期坐骨神经膜上，呈不规则的线状分布。随着年龄增加，反应强度逐渐减弱。其中7天组对抗体着色最深，反应为强阳性、深红色(见图1)。60天组对抗体着色较浅，反应产物表现为弱阳性、浅红色(见图2)。
2.2.2 NCAM在视神经中的表达 NCAM抗体的阳性反应产物呈红色，分散在视神经胶质细胞表面。在大鼠出生后60天内，随着年龄增加，对NCAM抗体的反应强度逐渐减弱。在5个年龄组，7天组对抗体的反应略强、着色较深(见图3)，60天组表达最弱(见图4)。
2.3 计算机图像分析 NCAM在大鼠坐骨神经和视神经表达的OD值，见表1。坐骨神经表达水平明显高于视神经。
表1 NCAM在大鼠不同发育时期坐骨神经及视神经表达OD值 略
3 讨论
NCAM是细胞黏附分子的一员，属免疫球蛋白超家族。1987年首次获得NCAM的分子结构。NCAM分为三个区域：形成结合位点的氨基末端，含大量碳水化合物的中央区，以及与细胞膜相连的羧基末端区［1］。电镜下观察NCAM具有3条臂组成的“人”字岛形结构。进一步研究发现它有一绞链，绞链处5个Ig域和一个纤维粘连蛋白结合在一起。由于这个结构NCAM能根据细胞间的相互作用及方向，在细胞之间进行一定程度的转动［2］。
NCAM主要存在于神经系统中，NCAM在所有分化了的神经细胞以及某些星形胶质细胞中，基本上都有发现。它位于神经元表面，和邻近细胞的其他NCAM分子结合，介导神经元之间同型识别和黏附。NCAM在神经系统发育和神经再生中发挥重要作用［3］。
在胚胎发育过程中，NCAM广泛分布，表明NCAM参与许多发育过程。神经系统的正常发育依赖于细胞与其局部环境间复杂的相互作用，这些相互作用受NCAM等细胞黏附分子的介导。在神经元发育中，NCAM参与黏附与轴突生长及延伸，并能促进突触的可塑性。如在视投射发育过程中眼内注入抗NCAM抗体，引起视神经紊乱，导致视网膜与脑之间异常的神经连接［1］。
体外神经元培养的研究发现：NCAM能刺激神经元轴突延伸。小脑神经元在转染了NCAM cDNA的3T3细胞后，生长得更快，轴突分支也更多［4］。实验发现NCAM抗体能阻断横切的坐骨神经再生［5］。NCAM促进轴突生长的原因可能是它们通过为神经元突起生长提供更具黏附性的基质而起的机械性作用，或者它们的相互作用可能启动了能刺激轴突延伸的细胞内信号。近年认为NCAM激活神经元第二信号级联反应而激发神经生长［6］。
文献报道大鼠脑中NCAM mRNA的高峰接近于出生时期，而在随后的发育过程中降落了大约80%［2］。本研究发现NCAM在大鼠坐骨神经及视神经中均有表达，并且NCAM在大鼠坐骨神经中大量表达。大鼠越年幼，表达水平越高，随着年龄增加，表达水平相对下降，到发育晚期或成熟期其表达明显下降。NCAM在坐骨神经的表达与雪旺细胞(SC)的生物学功能密切相关。SC是重要的神经胶质细胞，包绕坐骨神经轴突，并形成髓鞘，与其周围存在的生物分子共同构成坐骨神经的微环境。存活的SC能持续表达NCAM分子［7］。在胚胎期SC能高水平的表达NCAM［3］。SC及其分泌的蛋白质等构成的微环境，使坐骨神经再生变得容易。
Anderson等的研究显示NCAM在胚胎视神经较多表达，出生后在视神经的表达为低水平［8］。本研究发现NCAM在大鼠视神经表达明显较坐骨神经弱，二者差异有显著性，并且随着年龄增加，表达水平明显下降，30～45天后表达更少，这可能与视神经再生能力相对较弱有关。由于不同的神经细胞有不同空间和时间的NCAM基因表达，NCAMmRNA又经历不同的剪接，因而在不同的发育时间可表现出不同的细胞黏着性。NCAM结构差异会导致结合力不同。
有学者认为中枢神经再生困难可能与其缺少细胞外基质、细胞黏附分子等适宜的环境有一定关系［9］。NCAM介导的细胞间的相互作用是再生过程的一个重要环节。由于视神经与坐骨神经存在细胞外环境的差异，导致它们再生能力不同。曾有实验将周围神经移植或SC移植到受损的视神经，改变视神经环境，能显著促进视神经再生［10］。因此改善视神经再生环境，是研究神经再生的关键问题，增强NCAM表达、人为地提供适宜视神经修复和再生的微环境，可能为视神经损伤的修复开辟一条新途径。
（本文图片略）
【参考文献】
1 阿德尔曼.神经科学百科全书.上海：上海科学技术出版社，1992，821.
2 左明雪.细胞和分子神经生物学.北京：高等教育出版社，2001，284.
3 Fercakova A，Kosice,Slovakia.Cell adhesion molecules in the neural development and plasticity.Bratisl Lek Listy,2001,102(12):552-555.
4 蔡文琴.发育神经生物学.上海：上海科学出版社，1999，60.
5 Remsen LG,Strain GM,Newmkan MJ,et al.Antibodies to the neural cell adhesion molecule disrupt functional recovery in injured nerves.Experimental neurology,1990,110:268-273.
6 Walsh FS,Meiri K,Doherty P.Cell signaling and CAM-mediated neuriteoutgrowth.Soc Gen Physiol Ser,1997,52:221-226.
7 Dedkov EI,Kostrominova TY,Borisov AB,et al.Survival of Schwann cells in chronically denervated skeletal muscles.Acta Neuropathol(Berl),2002,103(6):565-574.
8 Anderson PN,Campbell G,Zhang Y,et al.Cellular and molecular correlates of the regeneration of adult mammalian CNS axons into peripheral nerve grafts.Prog Brain Res,1998,117:211-232.
9 成军.细胞外基质的分子生物学与临床疾病.北京：北京医科大学出版社，1999，211-212.
10 Negishi H,Dezawa M,Oshitari T,et al.Optic nerve regeneration within artificial schwanns cell graft in the adult rat.Brain Res Bull,2001,55(3):409-419.
基金项目：福建省科技厅重大科研项目(2000F005)
作者单位：1 417000 湖南娄底，娄底市中心医院眼科
2 350005 福建福州，福建医科大学附属第一医院眼科
3 353000 福建南平，南平市第一医院眼科
(编辑：陆 华)
同一类型的细胞通过识别而粘附，不易分开，这种细胞粘附（Adhesion）现象早在1907就被Wilson注意到。60、70年代人们致力于发展研究粘附现象的方法和明确有特异性和选择性的分子存在。70年代末，借助免疫识别的方法，初步确定细胞粘附分子（Cell adhesion molecule,CAM）的存在。事实上，细胞的粘附在细胞周期调控、形态发生、变形和再生过程中极为关键。神经系统中神经元的粘附现象及其在突触的可塑性作用的研究近年来格外引人瞩目，以下拟介绍神经细胞粘附分子（Neural cell adhesion molecules, NCAMs）等CAMs的分子结构、信号传递和生理功能。
1 NCAMs分子结构与分子合成
1.1 神经系统细胞粘附分子分类
存在于脊椎动物和无脊椎动物神经系统的CAMs种类颇多。有关CAMs的分类尚无统一标准。一般分法是将其分为Ca2+依赖和Ca2+非依赖两大类［1，2］。前者包括粘着蛋白家族（Cadherins），后者包括整合素家族（Integrins）、选择素家族（Selectins）、免疫球蛋白超家族（Ig superfamily）和膜相联蛋白多糖（Membrane-associated proteoglycans）。免疫球蛋白超家族又包括许多成员，神经细胞粘附分子（NCAMs）属其中一个大类。在大鼠NCAMs包括NCAM、L1等几种不同分子。
1.2 NCAM的结构
NCAM是一组多肽链，每一条链都有5个连续的同源区，区内有一个链内二硫键，与免疫球蛋白超家族类似。5区之后为类似于纤维粘连蛋白Ⅲ(FibronectinⅢ)重复系列的重复区。不同肽链的的差别既表现在胞浆区的不同，也表现在与细胞膜连接的方式不同。如鸡的NCAM有3个多肽，3个多肽的胞外区都是一样的，所不同的是跨膜区和胞内区，此由mRNA不同剪切所致。两个较大的多肽以胞浆段整合到膜蛋白，大的(ld)在胞浆区有额外的261个氨基酸，小的（sd）则没有，最小的(ssd)则无跨膜区，无胞浆区。ld 和sd整合到膜上，能运动，可被脂肪酸酰化ssd无跨膜区，但锚在磷脂上，更易于在膜表面运动。sd和ld胞浆区可与细胞的有关分子相互作用，发生丝氨酸、苏氨酸的磷酸化，其中ld含有更多的磷酸化位点。5区及以上的3个位点结合有寡糖，包括多唾液酸(α-2，8-PSA)等。
NCAM的结合活性位于Fr1片段（6.5×104u），含氨基末端，无大量的PSA，不超过400残基。CNBr片段含大量PSA，PSA位于404、430和459位的天冬酰胺连接的寡糖结构（Asparagine-linked oligosaccharides，ALO）上。NCAM有4个100氨基酸的识别片段，与Igs和其他的NCAM同源，区区作用是同种亲合的结构基础，结合的区为Ⅰ和Ⅳ区，但未弄清具体的位置，这点与Igs不同。NCAM结合的特异性不代表结合区氨基酸顺序的改变，换句话说，结合的特异性不取决于氨基酸的顺序，起作用的是一系列细胞表面修饰事件。如含PSA的第5区可调控NCAM的结合能力，寡糖链的硫酸化也可通过改变电荷的状态来影响同一区结合。
NCAM的三维结构电镜分析表明，分子末段有一绞链结构，这种绞链结构有助于在细胞形态改变时易化跨膜的同种亲合，否则，不利于同种亲合。α-2，8-PSA在NCAM中的作用源于静的负电荷、巨大的排斥力量。它能改变绞接的角度以满足有复杂膜的细胞的多重同种亲合。
1.3 表达与合成的调控
NCAM中所有的多肽都是单一基因编码，该基因位置是鼠在9号染色体、人在11号。鸡的NCAM编码区至少有19个外显子，横跨50 kb，第14个外显子对3条肽通用。CAMs的表达是有位置和组织特异性的。它的合成随信号和反式调控元件的不同而不同，很多的转录后元件也可调控CAMs的合成。
目前对CAM 表达调控的基因机制已有了较多了解。NCAM和NgCAM基因中一部分调控位点已被鉴定，这些位点能与Hox和Pax基因编码的转录因子结合。在NCAM基因的RNA起始点的上游区，有SP1转录因子和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）转录因子结合位点。反式调控元件包括5个神经元限制的沉默元件（Neuron-restrictive sliencer elements）和一个Pax 产物的结合位点。CAMs合成后一个重要变化就是进行糖基化（Glycosylation）修饰。在小鸡，NCAM的每一条多肽都至少有4组ALO，最初附加的糖链都是高甘露糖链，在30 min内转成复合型。NCAM的Ig区PSA可显著影响分子之间的结合速率，因此，NCAM的PSA合成倍受重视。尽管PSA可能受物理性电活动的影响，但基本上还是受合成的调控，特别是受发育的进程调控。迄今为止，已有两种涎酸基转移酶(Sialyl transferases)被克隆，即Pst和Stx，它们参与糖基的合成。被支配的靶和电活动可影响PSA的合成，Ach和NMDA介导的钙的内流以及PKC有利于PSA的合成。
2 NCAMs在细胞粘附过程中的信号传递
现在，已初步明确各种粘附分子的结合能在胞内启动信号的传递过程。该信号途经可以与其它受体的信号途径实现对接。这里简单回顾一下常见受体介导的信号途径，它们包括：1）受体酪氨酸激酶途经（Receptor tyrosine kinase pathway，RTK）：这条途径开始于RTK，ras是该途径的中心，故又称ras途径。RTK与各种生长因子结合后，受体在膜上集中，并导致激酶的激活和特异酪氨酸残基的自动磷酸化。ras激活后，通过对转录因子的磷酸化，将信号传到胞核。但该途径并无特异性。其它信号途径可与之相通；2）G-蛋白途径；3）其它途径：一些细胞因子如白介素的受体可激活胞浆性酪氨酸激酶家族的the janus kinases(JAK-STAT)，该激酶可启动ras信号途径，也可直接激活名为STATs的胞浆蛋白，从而调控某些基因转录。值得注意的是，上述信号途径不同程度地与细胞骨架有双向作用。如较小的GTP结合蛋白分子Rho和Rac发现与肌动蛋白有关。
[page]
现有资料表明，由细胞粘附分子介导的信号传递在细胞生长、分化和行为方面有重要的作用，并有可能介入了经典的传导途径［3］。
NCAM、L1可改变胞内的pH和cAMP，对胞内Ca2+的影响更引人注目。NCAMs所致的突起生长需要G蛋白和L型、N型钙通道的参与,模拟钙通道的开放则同样能刺激突起的生长［4］。使用酪氨酸激酶的抑制剂表明，在突起生长的过程中，非受体的酪氨酸激酶的活性是增高的，且在钙通道激活之前。L1所到之处所致的Ca2+变化也是L型钙通道开放的结果。进一步研究表明，NCAM可激活酪氨酸激酶基因fyn,而L1则激活酪氨酸激酶基因src。除此之外，NCAM还可通过花生四烯酸（AA）激活钙通道。可见，NCAMs涉及G蛋白和酪氨酸激酶途径。Ig家族的信号传导作用还可在与之有相同结构的酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸化酶看出。这两类酶有胞外区，也有Ig的结构域,能触发同种、钙非依赖的粘附，还可刺激激酶的活动。如NCAM抗体能造成tubulin的酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸的脱磷酸化，表明NCAM、L1涉及酪氨酸激酶和磷酸化酶的调节。
在非神经系统中，细胞基质与细胞粘附所致的基因表达非常常见。但有关由CAMs等介入的细胞与细胞粘附所涉及的基因表达报道较少。
生长因子、肿瘤激活因子、激素等都能影响到各种CAMs的合成。神经生长因子、cAMP可刺激PC12和Schwann 细胞表达L1和NCAM。许多胞内信号系统和胞外信号分子能由神经冲动产生,它们进而调节CAMs的表达。如一部分神经递质能上调培养的N2A细胞和小脑颗粒细胞中L1的表达。在海兔研究发现，神经肽能降低其运动神经元的表面海兔的细胞粘附分子(apCAM)的表达,而5-HT则降低其感觉神经元的apCAM的表达。
最近的离体试验表明，神经冲动也可影响CAMs的表达。在胚胎背根神经节（DRG）中,自发电活动的发展与外周靶的神经支配相偶合,发现动作电位的作用能使突触长芽，并进入大鼠的背根神经节。给培养DRG神经元施予低频电刺激可下调L1的表达,但不影响NCAM,当用高频刺激时，对L1无影响。低频刺激可导致明显的轴突解聚（Defasciculation）和粘附的降低。神经冲动活动也对突触的形成和稳定发挥作用,在小鸡肌纤维孵育之前,NCAM和N-粘着素水平极低,而在除神经支配后迅速增加。神经冲动亦能调节PSA-NCAM转移到皮层神经元表面的过程。
3 CAMs在神经系统可塑性中的作用及其机制
各种不同的CAMs大量存在于海马的前后突触的膜上。采用多种技术手段，现在已积累了有关CAMs参与神经系统可塑性的大量资料［5～9］。第一，在经常发生神经发生和可塑性的脑区有发育阶段特性的突起生长和细胞的迁移，并有CAMs的表达；第二，在突触可塑性和学习中，有CAMs表达的变化和各种转录后修饰；第三，抗体和抑制NCAM表达可损害突触传递长时程增强(LTP)和学习。。
L1和NCAM的相互影响涉及LTP，这种相互关系依赖于L1上的寡甘露糖链，它能结合NCAM的第四个Ig区，若这种关系被破坏，LTP则被强烈抑制。提示第四区似乎特别关键，而第一区则不然。海马脑片注入NCAM抗体阻断高频刺激所致的LTP，而不影响基本的突触传递。当LTP建立10 min后，L1和NCAM抗体对其无影响，表明NCAM涉及LTP的起始阶段。曾报道过L1的抗体和重组片断对LTP的影响,在用星形胶质细胞异位表达L1的转基因鼠上,LTP受损,而一般突触传递和PTP、双脉冲易化不受影响，说明L1介导的突触形态改变是LTP维持所必需的。
神经细胞粘附分子参与可塑性有两个机制：其一为CAM介导的细胞骨架动力的改变，涉及活动依赖的突触重建。N-粘着蛋白的胞浆区直接与细胞骨架作用，而NCAM、L1的胞浆区直接与ankyrins（位于特异胞膜区的胞浆表面的spectrin结合蛋白家族的一员）相连。其二为胞内信号系统。这种胞内信号有如下的特点：就是胞内信号的改变可反馈到突触后膜，通过CAM调控细胞与细胞的粘附，以迅速地改变突触的结构和效率。胞内蛋白水解酶calpain水解NCAM的胞内区能较快地解除和重新组织突触的结构联系。
在研究Aplysia的缩鳃反射时，发现有新的突触联系形成，且与长期记忆平行。在此过程中既有新的蛋白合成，也有蛋白的减少，如海兔CAM(apCAM)，但这种减少只发生在感觉神经元的细胞表面，新蛋白的合成则受cAMP的调控［10,11］。看来，apCAM是使感觉神经元通过同种亲合造成粘着而限制生长，训练使apCAM发生内在化作用（Internalization）,造成感觉神经元的突触前解粘。在多种动物的长时突触可塑性中，发现都有依赖cAMP、PKA介导的转录和CREB介导的基因表达现象。CREB已被鉴定存在CREB1（激活子）和 cREB2(抑制子)两种类型。最近，又确定了3个基本的记忆突变型，即dnc, rutabaga和amnesiac,它们都涉及cAMP途径。CREB所致的基因表达是执行突触结构功能成分生长的一个因素。dnc突变中，CREB2抑制功能性而不是结构性可塑性，在FasⅡ减效基因中，CREB1可致突触结构和功能的增强。在野生型，CREB1的表达并不能增强突触功能。提示，CREB和FasⅡ的作用是平行的。cAMP的升高，降低CAM，促进结构生长，与此同时，CREB1则刺激突触功能的增强。
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反复暴露感觉神经元于血清素,发现apCAM能产生某特异形式的磷酸化，从而使apCAM内在化和降解（涉及依赖泛素水解酶途径）。这种降解有利于突触前轴突的同种亲合的解除、长芽和与突触后细胞新联系的建立。那些有胞浆尾巴含降解信号顺序的apCAM能被降解，而只有细胞表面部分的apCAM而则不被降解。要完成此降解过程，MAP与CREB还需刺激泛素C末端水解酶的表达［12］。
现已明确兴奋性氨基酸AMPA受体与LTP的维持有关,那么NCAMs是否与这类兴奋性氨基酸受体有关呢?通过神经氨酸酶减少NCAMs中的唾液酸残基（Sialic acid residues，SSR)会影响到NCAM的结合特性。神经氨酸酶作用皮层神经元膜(15'、37℃)后，使NCAMs140 和180 的外观大小减少约5%,而对不同的氨基酸受体大小无影响。但使放射标记的AMPA与其受体结合率提高20%,对其它氨基酸受体则无明确影响。说明,胞外环境特别是SSR可影响AMPA受体的结合特性［13］。在海马的空间和非空间学习中,海马齿状回的NCAM的PSA的瞬时和时间依赖的修饰是其特点之一。
从以上对有关NCAMs文献复习看出，NCAMs作为神经元胞膜上的结构分子，既参与了常规的跨膜信号传递，又参与形态结构的形成与维持，因而在突触活动，特别是可塑性活动中发挥了特殊作用。但由于NCAMs分子结构复杂，种类多，目前仍有许多问题有待阐明，如NCAMs与常规的膜受体有何具体空间关系与功能联系尚不清楚。
国家自然科学基金资助，NO.3960048
作者简介：胡志安，男，35岁，讲师，博士生
作者单位： 胡志安 黎海蒂 综述 第三军医大学基础医学部生理学教研室 重庆，400038
董燕麟 审校 第三军医大学基础医学部生物化学教研室 重庆，400038
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