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微柱凝胶法在检测孕妇IgG抗体中的应用研究

【摘要】  目的 比较分析抗人球蛋白微柱凝胶法与传统试管法测定O型孕妇血清中IgG抗A(B)效价的差异。方法 采用微柱凝胶抗人球方法和经典抗人球蛋白试验平行检测364例与丈夫ABO血型不合的O型孕妇血清IgG抗A(B)水平,并作方法学评价。结果 微柱凝胶IgG抗A(B)效价几何均数明显高于经典抗人球蛋白法,差异有显著性(t=18.15,t=15.81;P<0.001)。 微柱凝胶法阳性率明显高于经典法(χ2=21.5688,χ2=13.7898;P<0.01)。微柱凝胶法和经典抗人球蛋白法高度相关,相关系数r分别为0.8485、0.8499.结论 微柱凝胶法的灵敏度明显高于经典法,需重新设定临床意义决定值。

【关键词】  IgG抗体;微柱凝胶法;经典抗人球蛋白法;孕妇

 【Abstract】 Objective To compare the gel microcolumn assay and the conventional tube test for IgG antiA(B) titration .Methods A total of 364 blood samples of O group pregnant women with non O group husbands were detected simultaneously by the conventional tube test and the gel microcolumn assay. Results The geometric mean of antiA(B) IgG titers with the gel microcolumn assay was significantly higher than that of conventional one. The differences were significant (t=18.15,t=15.81; P<0.001). The positive rate of antiA(B) IgG titers with the gel microcolumn was significantly higher than that of conventional one (χ2=21.5688,χ2=13.7898; P<0.001). The correlation coefficient was 0.8485 and 0.8499,respectively. Conclusion The gel microcolumn assay is more sensitive than classic method,and it is necessary to rebuild reference values of clinical significance.

  【Key words】 IgG antibody; Gel microcolumn assay; Coombs’ test; Pregnant women

  新生儿溶血病(HDN)是由母体内存在的与其胎儿红细胞不合的IgG血型抗体而引起的同种被动免疫疾病[1]。准确测定孕妇血清中IgG抗A(B)的效价是预测和判断新生儿溶血病发生的重要依据。近年来,微柱凝胶法因快速、简便、结果直观等优点得到了广泛应用,但其在检测灵敏度等方面与传统方法的差异尚有待评价。我们运用微柱凝胶法(卡式法)测定孕妇IgG抗A(B)效价的结果,与经典抗球蛋白法比较,现将结果报道如下。

  1 资料与方法

  1.1 研究对象

  2008年1月至2009年3月期间,在我院行产前检查O型Rh(D)阳性孕妇324名,丈夫均为非O型Rh(D)阳性,孕20周以上,年龄为22至34岁。其中妇夫血型为OA 166例,OB 158例。

  1.2 试剂与仪器

  微柱凝胶检测卡(长春博迅)、抗人球蛋白试剂、标准红细胞、0.2 mol/L巯基乙醇(2ME)、37℃水浴箱、血型血清学多用离心机和免疫微柱孵育器(长春博迅)。

  1.3 方法

  标本预处理:取孕妇3 ml外周静脉血EDTA抗凝,分离血清后,取400 μl血清标本和400 μl 0.2 mol/L 2ME,混匀后封口置37℃水浴30 min.取8只干净试管,做好标记;第1管中加入处理后的血清100 μl和300 μl生理盐水,混匀(为1∶8稀释);第2~8管中依次加200 μl的生理盐水和前一管中的血清200 μl,做倍比稀释。稀释度分别为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024.

  1.3.1 微柱凝胶检测

  取试剂卡在孔内各加入50 μl与孕妇丈夫同型的0.8%标准红细胞悬液,再依次加入上述处理的各稀释度的血清50 μl,置专用孵育器内37℃孵育15 min,再放入专用离心机内离心5 min(900 r/min 2 min,1500 r/min 3 min),结果以出现1+凝集的最高稀释度的倒数为抗体效价。

  1.3.2 经典抗人球蛋白法

  取上述处理的1∶8~1∶1024 8个稀释度血清标本参照文献[2]进行实验。结果以显微镜下观察到“+”凝集的最高稀释度为抗体效价。

  1.4 统计学方法

  采用Excel统计软件进行数据处理分析,抗体效价先做对数转换,微柱凝胶与经典抗人球蛋白法效价比较采用配对t检验,并进行直线相关性分析,阳性检出率比较采用四格表配对资料χ2检验验证。

  2 结果

  2.1 IgG抗

  A效价几何均数微柱凝胶为198.36,经典抗人球蛋白法为104.82;IgG抗B效价几何均数:微柱凝胶为123.75、经典抗人球蛋白法为75.82,两组前者均明显高于后者,差异有显著性意义(t=18.15,t=15.81;P<0.001)。

  2.2 按照经典法检测结果,IgG抗

  A(B)效价≤32为阴性,≥64为阳性[3],则经典法和微柱凝胶法检测IgG抗A效价的阳性率为50.0%和74.7%;IgG抗B效价的阳性率为40.51%和61.4%.两组的微柱凝胶法阳性率明显高于经典法(χ2=21.5688,χ2=13.7898;P<0.001),见表1、表2.

  2.3 经典法和微柱凝胶法检测IgG抗

  A效价结果高度相关,r=0.8485,回归方程式为Y=0.41737+0.9353X.以经典法IgG抗A效价64为具有临床意义决定值,根据回归方程计算,微柱凝胶法具有临床意义决定值的效价为128(127.8792)。

  2.4 经典法和微柱凝胶法检测IgG抗

  B效价结果高度相关,r=0.8499,回归方程式为Y=0.3304+0.9683X.以经典法IgG抗B效价64为具有临床意义决定值,根据回归方程计算,微柱凝胶法具有临床意义决定值的效价为120(120.0881)。表1 IgG抗A效价分布表2 IgG抗B效价分布

  3 讨论

  ABO系统引起的HDN是由于母亲体内存在着与胎儿不相配合的IgG性质血型抗体引起的同种被动免疫性疾病。该抗体能通过胎盘进入胎儿体内,导致胎儿红细胞破坏产生溶血。同时可能干扰器官发生而导致胚胎停止发育、流产或畸形,对新生儿最大危害是引起胆红素脑病(核黄疸),可造成婴儿早期死亡或使存活者留下不可逆的神经系统后遗症[4]。因此,选择一种灵敏、准确、相对稳定且重复性好的IgG抗体效价测定方法很有必要。

  微柱凝胶技术是红细胞抗原与抗体在凝胶介质中的凝集反应,结果清晰明了,无须显微镜。方法简单、可标准化、自动化、重复性好,所需标本量少,无须洗涤,结果稳定。本研究中,微柱凝胶法IgG抗A(B)效价几何均数均明显高于经典抗人球蛋白法,差异有显著性意义(P<0.001)。微柱凝胶法阳性率明显高于经典法,差异有显著性意义(P<0.001)。这表明,对于孕妇IgG抗A(B)效价的检测,微柱凝胶法的灵敏度明显高于经典抗人球蛋白法。

  HDN的发病率随母体内抗A(B)或抗Rh(D)水平的升高而递增[5],因此测定孕妇IgG抗A(B)效价对预防新生儿溶血病有重要意义,现较公认的观点是夫妇血型不合的孕妇血清抗体效价与新生儿HDN发生率呈正相关[6]。当母亲血清中IgG抗A(B)效价≥64时,婴儿有受害的机会,当效价≥128时,新生儿很可能受害[7]。因此应用科学有效的方法检测孕产妇血清IgG抗A(B)效价是预防新生儿溶血病的重要措施。目前,临床上普遍以经典的抗球蛋白法结果IgG抗A(B)效价≥64作为临床意义决定值,即ABO系统IgG抗体效价≥64时,应随访观察并监测其效价升高的水平或采取干预措施。但从微柱凝胶法测定的效价看,由于其灵敏度高,若以经典法的诊断标准将会导致对病情的过高评估。因此以微柱凝胶技术检测IgG抗A、抗B效价时,应重新界定其具有临床意义的决定值,避免造成误诊。我们的结果显示:微柱凝胶法和经典抗人球蛋白法高度相关,相关系数分别为r=0.8485和r=0.8499.根据本研究回归方程计算,以经典法测得效价64作为有临床意义的决定值,微柱凝胶法测IgG抗A和抗B效价的决定值分别为128、120.

  综上所述,微柱凝胶法检测IgG抗A和抗B效价,其检测灵敏度显著高于平行进行的经典抗人球蛋白法,二者存在高度的相关性。为更好地辅助临床在HDN的产前预测与诊断上形成最接近实际情况的判断,需重新设定临床意义决定值。

【参考文献】
   [1] 张钦辉.临床输血学[M].上海:上海科学技术出版社,2000:97100.

  [2] 叶应妩,王毓三.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京:东南大学出版社,1997:101.

  [3] 高峰.输血与输血技术[M].第1版.北京:人民卫生出版社,2004:98106.

  [4] 徐丹,李江,蒋莉.微柱凝胶法检测孕妇IgG抗体效价的意义[J].中国实验诊断学,2006,10(6):681682.

  [5] Bielsa O,Lloreta J,Gelabert Mas A.Cysti crenal cell carcinoma:pathological features,survival and implications for treatment[J].Br J Urol,1998,82:1620.

  [6] Achargui S,Benchemsi N.Etude quantitative des sousclasses d’IgG antiD par Elisa au cours de la maladie hemolytique neonatale.[A quantitative determination of IgG antiD subclasses by Elisa in hemolytic disease of the newborn][J].Transfus Clin Biol,2003,10(4):284291.

  [7] Aubert S,Zini L,Delomez J,et al.Cystic renal cell carcinoma in adults.Is properative recognition of multilocular cystic renal cell carcinoma possible[J].J Urol,2005,174:21152119.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第2期]栏目
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IgM、IgG抗-E及抗-M引起配血不合1例

【关键词】  血型;IgM抗-E;IgG抗-E;抗-M

  在临床输血工作中,为了防止由免疫性抗体引起的溶血性输血反应,我们采用盐水、聚凝胺介质交叉配血,发现1例患者血清中同时存在多种血型抗体,现报告如下。

  1  病例简介

  患者女,25岁,B型RhD阳性,孕1产1。足月顺产后10d,阴道出血7h,出现昏迷,送我院。诊断为晚期产后出血,子宫复位不良。临床申请输血(Hb:70g/L),交叉配血时发现在盐水、聚凝胺介质中均出现主侧凝集,怀疑有不规则抗体存在。

  2  血型血清学检查

  2.1  试剂来源 

  ABO标准血清(长春博德有限公司),ABO标准红细胞、抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-M、抗-N、抗-P1试剂(上海血液生物医药有限公司),谱细胞(美国GAMMA公司,批号44287),并按试剂盒提供方法进行。

  2.2  患者红细胞血型 

  B、CCDee、NN、P1型,自身对照及患者红细胞直抗、抗IgG、抗C3d均为阴性。可排除抗-C、-D、-e、-N、-P1的存在。

  2.3  抗体检查 

  在盐水介质中患者血清与谱细胞中的1、3、4、5、6、8、9号呈阳性反应,根据谱细胞反应格局表鉴定出患者血清中存在抗-M,但不排除抗-E。在抗人球介质中患者血清与谱细胞中的1、3、6号呈阳性反应,根据谱细胞反应格局表鉴定出患者血清中存在IgG的抗-E。

  2.4  吸收放散试验
 
  用洗涤3次的O型ccdee、MM的浓缩红细胞与患者血清等量混合,在4℃吸收1h,吸收后的细胞经4℃冷盐水洗涤4次后在56℃放散10min,放散液与O型ccdee、MM红细胞在盐水介质中有3+凝集;吸收后的血清与谱细胞在盐水介质中反应,其中1、3、6号细胞分别有2+凝集。用洗涤3次的O型ccDEE、NN的浓缩红细胞与患者血清在37℃吸收1h,吸收后的细胞洗涤4次后用乙醚放散法制备放散液,放散液与O型ccDEE、NN红细胞在抗人球介质中有2+凝集。进一步确定患者血清中含有IgM、IgG抗-E及抗-M。

  2.5  抗体效价测定 

  采用混合的O型ccdee、MM红细胞,测患者抗-M效价为16。采用混合的O型ccDEE、NN红细胞,测患者IgM抗-E效价为8;患者血清经2-Me处理后测IgG抗-E效价,抗人球蛋白法为8。

  3 讨论 

  抗-M抗体为冷凝集素,是人体血清中常见的一种不规则抗体,多为天然产生,在37℃很少有活性,一般在体内不能引起溶血反应,但可影响交叉配血,引起配血不合。如果患者处于低温麻醉状态下手术时应注意,因为此类抗体可激活补体,当患者的体温在冷抗体最适反应温度范围内(4~20℃)时,可发生溶血反应[1]。 

  在临床输血中,Rh血型系统的重要性仅次于ABO血型系统。在C、e、E、c四种抗原中,抗-E是最常见的抗体,次为抗-c抗体[2]。Rh血型抗体除少数为天然产生外,大多数由输血或妊娠等免疫剌激产生,这些抗体均为IgG型,但在免疫早期也可有部分为IgM型。一般认为IgG抗体合成速率快,半衰期长,含量高;而IgM抗体在血内含量低,半衰期短(5d),出现早,消失快,因此在血型血清学实践中检出IgG抗体而同时检出IgM抗体的比较少见[2]。我国汉族人群中E抗原阴性者约占70%,故产生免疫性抗-E的机率比抗-D大[3]。因此输血时在Rh系统中不应只考虑D抗原阴性患者的输血,而更重要的是注意E抗原相同配血。为确保临床输血安全,特别是有输血史或妊娠史的患者,配血时应作抗体筛检,并在聚凝胺或抗人球蛋白介质中作交叉配血,以避免迟发型溶血性输血反应的发生。本例患者为女性,无输血史但有妊娠史,考虑为妊娠免疫剌激产生的IgM和IgG抗-E抗体。经输注B型RhD阳性、E抗原阴性的悬浮红细胞4单位,患者无不良反应。

【参考文献】
    [1]吕豪. 抗-M引起ABO血型正反定型不符1例[J].检验医学,2006,21(6):653.

  [2]刘达庄.免疫血液学[M].上海:上海科学技术出版社,2002,194~214.

  [3]吴晓黎. IgG型抗E抗体引起配血不合2例[J].实用医学杂志,2005,21(6):590.


作者单位:海南省人民医院,海南 海口 570311.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第10期]栏目

不同品系小鼠感染华支睾吸虫后IgG及亚类的动态观察

【摘要】  目的 观察不同品系小鼠感染华支睾吸虫后,血清中特异性抗体IgG、IgG1/IgG2a的动态变化。 方法 NaOH消化法粪检虫卵,ELISA法测定不同品系小鼠感染后4、8和12w 血清中抗体IgG、IgG1/IgG2a的动态变化。 结果 三个品系小鼠血清IgG均于感染后第4~8w升高,约在第10w达到高峰,此后开始下降并维持至观察结束的第12w;IgG1/IgG2a比值感染后逐渐增高,并持续至第12w。 结论 华支睾吸虫感染的免疫应答发生了由Th1免疫应答向Th2免疫应答转变的趋势。

【关键词】  华支睾吸虫;小鼠;抗体;IgG;IgG1;IgG2a

华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)俗称肝吸虫(Liver fluke),成虫寄生在人的肝胆管内,造成胆管扩张及胆管上皮增生,严重时可引发胆管炎、胆道结石、肝硬化等合并症。该病在我国流行广泛,严重危害人类健康。研究表明,在寄生虫感染的免疫应答过程中,辅助性T细胞(T helper,Th)处于核心位置,决定免疫特异性及发生何种免疫应答。Mosmann等人于1986年首先发现小鼠CD4+T细胞在抗原刺激下可分化为Th1/Th2两个亚群,分别分泌不同类型的细胞因子,其中Th1细胞主要介导细胞免疫和小鼠IgG2a亚类抗体的产生;Th2细胞主要介导体液免疫和小鼠IgG1抗体的产生。1991年,Romagnani证实人体亦存在Th1细胞和Th2细胞两个亚型,继而Th1型和Th2型免疫应答在寄生虫感染中的作用受到重视。宿主感染曼氏血吸虫、疟原虫和囊虫后,机体发生由Th1型免疫应答向Th2型免疫应答的转变,华支睾吸虫感染FVB和BALB/c小鼠Th1/Th2型细胞因子水平发生变化[1],提示不同的Th1/Th2优势应答类型在感染性疾病的发生、发展与转归中起着重要的作用[2]。本实验选用国内实验室常用的不同品系小鼠比较观察感染华支睾吸虫后血清特异性IgG及IgG1/IgG2a的动态变化,旨在了解其免疫应答特性,为深入探讨其致病机制提供实验依据。

  1  材料与方法

  1.1  动物及材料

  1.1.1  动物  健康清洁级小鼠BALB/c、C57BL/6、昆明鼠各30只,6~8周龄,体重20~30g, SPF级环境喂养。健康豚鼠,雌雄各5只,体重(500±20)g。均由徐州医学院动物实验中心提供。自疫区购买感染华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼。

  1.1.2  试剂  辣根过氧化物酶(HRP)标记Goat Anti-Mouse IgG购自武汉博士德生物工程有限公司;HRP标记IgG1、IgG2a购自Santa Cruze 公司。

  1.2  动物模型的建立及血清样本的采集

  1.2.1  动物模型的建立  从流行区购买麦穗鱼,按常规方法[3]分离囊蚴并计数。三个品系的小鼠均随机分为实验组及对照组,实验组小鼠24只,又分为轻、中、重感染组,每组8只,感染囊蚴的数量分别为10个/鼠、20个/鼠、30个/鼠。将已分离的纯净囊蚴按上述感染剂量经口灌入小鼠胃内,再用适量生理盐水冲洗,以保证囊蚴的饲入。各品系对照组小鼠6只,采用生理盐水灌胃。

  1.2.2  血清样本的采集  感染前、感染后第4w、8w和12w自小鼠眼内眦窦采血,分离血清,-20℃冻存备用。另于感染的第10w对部分小鼠眼内眦窦采血。

  1.3  水溶性抗原的制备  将自疫区购买的阳性麦穗鱼按常规方法分离囊蚴并计数。经口感染豚鼠10只,每只感染囊蚴250个。感染后50d处死动物,从肝脏中取出虫体,用无菌生理盐水冲洗数次,洗去虫体表面粘附的胆汁、粘液和血液。抗原制备参考常规方法[4],将成虫充分研磨成匀浆,加入生理盐水,经反复冻融,4℃冰箱内冷浸2~3d,其间摇动数次。而后冰浴中,用振幅为10μm超声处理(英国Sanyo Soniprep150型超声波破碎仪)10s,反复5次,每次间歇50s。粉碎后,同上冷浸72h, 12000rpm,4℃离心10min,上清液即为华支睾吸虫成虫抗原。以分光光度仪(德国Eppendorf Biophotometer)测定蛋白含量,-20℃冻存备用。

  1.4  特异性抗体检测  采用间接ELISA法,用棋盘滴定法确定最佳抗原包被浓度。4℃包被抗原(0.05mol/L pH9.5碳酸缓冲液)过夜;用1%小牛血清封闭,37℃,30min;加入稀释的小鼠血清,37℃孵育1h;再加稀释的HRP标记二抗,37℃1h。最后用二甲亚砜配置0.1mg/ml的TMB(3.3,5.5-四甲基联苯胺)进行显色反应,避光室温静置15~20min;2mol/L H2SO4终止反应,酶标仪(奥地利CliniBio 128C)测OD值(490nm)。每步反应后均用PBS-Tween(pH7.4)清洗3次,每次5min。检测IgG和IgG1、IgG2a所用抗原包被浓度分别为20μg/ml、40μg/ml、40μg/ml;血清稀释度分别为1:100、1:50、1:50;HRP标记二抗均为1:2 000稀释。每个血清样本均设复孔,取均数,对照组血清同等条件检测。感染组与对照组血清OD值的比值≧2.1判为阳性。

  1.5  数据处理  以平均值±标准差(x±s)表示,数据比较作t检验。

  2  结果

  2.1  小鼠一般状况  对照组小鼠一般状况良好,体重增加明显,毛色有光泽,摄食活动正常。感染组小鼠感染5d后出现毛色灰暗,摄食减少,精神萎靡,其中感染30条囊蚴的BALB/c、昆明鼠出现竖毛现象。

  2.2  粪便检查  实验组小鼠感染后20d即可在粪便中查到虫卵。小鼠粪检阳性率的比较:BALB/c、C57BL/6、昆明鼠三个品系各24只小鼠粪检虫卵阳性率分别为79.17%(19/24)、12.5%(3/24) 、37.5%(9/24);经统计学处理,三个品系小鼠之间阳性率差异有统计学意义(χ2=21.48,P<0.005)。

  2.3  血清IgG抗体动态变化  ELISA检测结果以相对值(OD值)表示,感染组小鼠血清IgG随感染时间延长相对值增大,并于感染后第4~8w升高,约在第10w达到高峰,此后有所下降并维持至观察结束的第12w。对同一感染度,以BALB/c小鼠血清抗体IgG的峰值最大,昆明小鼠次之,C57BL/6小鼠最低。检测结果表明,在0、4、8、10和12w各个时间点,三个品系小鼠血清IgG的量均随感染囊蚴数量的增加而增加(表1)。

  表1  三种品系小鼠感染不同数量华支睾吸虫囊蚴后血清中特异性IgG水平的动态变化(略)

  Table 1  Dynamic changes of the specific IgG level in the sera of BALB/c mice infected with various doses of Clonorchis sinensis metacercaria

  注:(1)与正常组比较,P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)轻度与中、重度比较,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001;  (3)中度与重度比较,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001。

  (1)Compared with normal group,P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)light compared with moderate, heavy group,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)moderate compared with heavy group,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001.   

  BALB/c小鼠三个感染组血清IgG的相对值与正常组比较,4w、12w时的轻度(0.23±0.07,0.22±0.01)与各正常组(0.11±0.03,0.11±0.04)比较,差异不显著(P>0.05),其余均有统计学意义(P<0.05)。不同时间点,中度同重度感染组比较,差异不显著(P>0.05);轻度同中、重度剂量感染组,差异均显著(P<0.001)。C57BL/6小鼠三个感染组血清的IgG相对值分别同正常组比较,4w时轻、中度及10w、12w时的轻度与各正常组差异不显著外,其余均有显著性差异(P<0.05)。各时间点轻度同中度剂量感染组比较,差异不显著(P>0.05);轻度、中度同重度剂量感染组比较均于10w时差异显著(P<0.05),余差异无显著性,但是其IgG值随感染剂量的加大而增大。昆明小鼠三个感染组血清的IgG相对值分别同正常组比较,4w、8w时的轻度(0.18±0.11,0.30±0.08),及12w的轻、中度(0.13±0.04,0.25±0.03)与各正常组(0.06±0.13,0.10±0.09,0.07±0.01)比较,差异不显著,其余均有显著性差异(P<0.05);轻、中度在4w、12w时差异不显著,中度和重度在8w、10w差异不显著,其余均有显著性差异(P<0.05)。

  2.4  血清IgG1/IgG2a的动态变化  三个品系小鼠血清抗体亚类IgG1/IgG2a值,均随感染时间延长而增大,并持续至第12w。实验结果表明,在0、4、8、10和12w各个时间点,三个品系、三个感染组小鼠血清抗体IgG1/IgG2a值均随感染囊蚴数量的加重而增大(表2):三个品系、三个感染组小鼠血清的IgG1/IgG2a比值分别与各正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);BALB/c小鼠10w轻、中度分别与重度比较差异显著(P<0.05),12w时三个感染组之间差异均显著(P<0.05);C57BL/6小鼠12w时,轻度与重度比较差异显著(P<0.05)。其余包括昆明鼠在内,不同剂量之间的IgG1/IgG2a比值无显著性差异,但是其比值随感染程度的加重而增大。

  表2  BALB/c小鼠感染不同数量华支睾吸虫囊蚴后血清中IgG1/IgG2a的动态变化(略)

  Table 2  Dynamic changes of IgG1/IgG2a in the sera of BALB/c mice infected with various doses of Clonorchis sinensis metacercaria

  注:(1)与正常组比较,P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)轻度与中、重度比较,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)中度与重度比较,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001。

  (1)Compared with normal group, P<0.05、P<0.01、P<0.001; (2)light compared with moderate, heavy group,△P<0.05、△△P<0.01、△△△P<0.001; (3)moderate compared with heavy group,※P<0.05、※※P<0.01、※※※P<0.001.

  3  讨论
   
  Yoshimura[5]报道,用30~50个华支睾吸虫囊蚴感染小鼠,粪检阳性率为26.4%~100.0%。本实验用10~30个囊蚴感染BALB/c小鼠,粪检阳性率为79.17%,与上述结论相似。Yang Kyu Choi[1]和Byung-ⅡYOON[6]实验中用15个囊蚴感染小鼠,Jong In Kim[7]实验中以20个囊蚴感染小鼠,实验均获得成功。本实验为确定适合各品系小鼠的感染剂量,分别用10、20、30个囊蚴感染小鼠,并持续观察12w,未发生因感染剂量过大而致动物死亡的情况。30个囊蚴感染组粪检虫卵阳性率高,血清IgG水平明显高于10、20个囊蚴感染组,表明在进行动态观察小鼠宿主的免疫状态或病理变化时,30个囊蚴是一个较为适宜的感染剂量,亦进一步证明抗体的动态变化与宿主的感染度有一定的关系[8]。
   
  宿主感染华支睾吸虫后,激活其免疫系统,诱导细胞及体液免疫应答。已有资料显示,家兔感染华支睾吸虫后,血清抗体滴度在感染后28d开始上升,于70~80d达高峰[9]。本实验观察发现BALB/c、C57BL/6、昆明鼠三个品系小鼠血清抗体IgG,于感染后4w逐渐上升,约在第10w达高峰,总体趋势与上述结论一致。Yang Kyu Choi等[1]研究结果表明 FVB小鼠比BALB/c小鼠更易感染华支睾吸虫囊蚴,说明不同品系小鼠对华支睾吸虫感染的敏感性存在差异。考虑动物模型的易于推广性,本实验选用国内常用的小鼠品系进行比较观察。三个品系小鼠在相同感染度的条件下,以BALB/c小鼠血清抗体IgG的峰值最大,昆明小鼠次之,C57BL/6小鼠最低。抗体检测结果表明BALB/c小鼠敏感性最高,昆明鼠次之,C57BL/6不敏感,与粪检结果相一致[10]。
   
  机体在进行免疫应答的过程中,一般选择保护性应答方向,即选择消除抗原的免疫反应,这是长期进化过程中自然选择的结果[11]。自1986年Th1与Th2的概念产生以来,人们对其在机体免疫反应中的作用进行了大量的体内外研究,以表达IL-2、IFN-γ为代表的Th1亚群细胞具有增强杀伤细胞的细胞毒性作用,激发迟发型超敏反应,诱导单核因子产生,介导细胞免疫应答,诱导IgG2a产生;以表达IL-4、IL-5、IL-6和IL-10为主的Th2型细胞,可以促进肥大细胞和嗜酸性粒细胞的增值和分化,抑制单核因子产生,刺激B细胞分化、增殖和抗体产生,介导体液免疫应答,诱导IgG1产生。华支睾吸虫感染可明显影响宿主的细胞免疫功能,表现为辅助T(Th)细胞减少,尤其是Th细胞减少,而具有抑制功能的T 细胞(Ts)则相对增多,Th1处于一种低应答状态[12]。Choi.YK等[1]证实,小鼠感染华支睾吸虫后,其体内IL-4、IL-5、IL-10水平升高,且IgE水平显著升高,嗜酸性粒细胞增高。因此,可以认为华支睾吸虫感染后,能使机体Th1/Th2细胞因子水平失衡,免疫功能紊乱,并且细胞免疫功能低下有利于虫体存活。本实验观察了小鼠感染华支睾吸虫后血清IgG1/IgG2a比值的动态变化,结果显示各感染组小鼠血清抗体亚类IgG1/IgG2a比值于感染后第4w有所升高,并持续至第12w,提示了华支睾吸虫感染小鼠随时间的推移,发生了由Th1向Th2型免疫应答的漂移。这与一般认为的在蠕虫感染过程中,免疫保护作用基于Th2型细胞介导的体液免疫相符[2]。一些研究者在对华支睾吸虫感染病患者血清细胞因子水平研究时,也获得了类似的结论。当然,和其他寄生虫一样,华支睾吸虫感染的免疫平衡受感染周期、感染度及宿主之间差异的影响,其Th1/Th2免疫平衡变化也不尽相同。
   
  Th1细胞产生的细胞因子和Th2相互作用,Th1型细胞因子下调伴随着Th2型细胞因子的激活,因此何种细胞因子占主导地位决定着免疫应答转变的方向。本研究提示,在华支睾吸虫感染初期可能主要引起一个以产生Th1型细胞因子为主的优势应答,随着感染时间的延长又主要以产生Th2型细胞因子为主的优势应答,使肝脏炎症反应逐渐减弱转为慢性肝吸虫病。深入研究华支睾吸虫感染免疫调节机制,尤其深入探讨Th1/Th2亚群在免疫应答中的不同生物学功能及其相互影响,可以为阐明其免疫调节提供理论依据,而且对深入了解由Th1/Th2介导的其他感染性疾病提供更广泛的实验依据。至于华支睾吸虫感染不同病程中是何种抗原刺激机体产生免疫状态的改变,还有待进一步研究。

【参考文献】
  [1] Yang Kyu Choi,Byung-Ⅱ Yoon, Young Suk Won,et al. Cytokine responses in mice infected with Clonorchis sinensis[J]. Parasitol Res, 2003,91:87~93.

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  [5] Yoshimura,H.and Ohmori,Y.Biological and pathlolgical studies on Clonorchis sinensisⅡ.Observation on the relative susceptibility and pathologic findings of certain laboratory animals[J].Jap.J.Parasit,1972,24:222~229.

  [6] Byung-Ⅱ YOON,Yang-Kyu CHOI,Dae-Yong KIM,et al.Infectity and Pathological Changes in Murine Clonorchiasis:Comparison in Immunocompetent and Immunodeficient Mice[J]. Parasitology,2001,63(4):421~425.

  [7] Jong In Kim,Dong ⅡChung,Dong Wik Chio,et al.Egg Production of Clonorchis sinensis in Different Strains of Inbred Mice[J].The Korean Journal of Parasitology,1992,30(3):169~175.

  [8] 陈锡慰,沈一平,吴观陵,等.家兔感染华支睾吸虫血清抗体与感染度关系的观察[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),1982(2):10~14.

  [9] 王尊哲,王士谔,黄红,等.实验感染华支睾吸虫家兔血清抗体动态的初步观察[J].潍坊医学院学报,1983(2):24~27.

  [10] 付琳琳,李妍,刘宜升,等.华支睾吸虫感染小鼠模型的建立及比较[J].中国病原生物学杂志,2008(1):46~48.

  [11] 赵武述.免疫平衡研究及其临床意义[M].北京:科学出版社,2005,90.

  [12] 刘宜升,杜文平,陈明.豚鼠感染华支睾吸虫后T淋巴细胞亚群的动态变化[J].中国血吸虫病防治杂志,1993,5(2):97~99.


作者单位:徐州医学院病原生物学教研室, 江苏 徐州 221002.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第5期]栏目
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广东省部分地区人群百、白、破IgG抗体水平监测

【摘要】    目的 了解广东省健康人群血清中百日咳、白喉和破伤风(简称百、白、破)抗体水平,为百、白、破防控提供依据。方法 采取分层整群抽样法抽出潮州市、汕尾市、深圳市等三个地区部分健康人群,采用间接ELISA法(定量)检测正常人血清中百、白、破IgG抗体水平。结果 三个地区健康人群百日咳IgG抗体阳性率为54.1%,白喉IgG抗体保护率为76.4%,破伤风IgG抗体保护率为77.2%。结论 广东省三个地区健康人群百日咳IgG抗体阳性率较低,部分地区白喉及破伤风抗体保护率比较低,白喉及破伤风抗体保护率有随着年龄的升高而降低的趋势,提示我们要加强百、白、破的接种率和接种质量。 

【关键词】  百日咳;白喉;破伤风;抗体水平;调查;ELISA

  Results of monitoring of antibody levels of pertussis, dipheria and tetanusin healthy population in Guangdong Province.

  LIU Mei-zhen, TAN Hai-ling, HE Chang-wen, et al.

  Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 510300, Guangdong, P. R.China

    Abstract:Objective  To understand the levels of antibodies against pertussis, diphtheria and tetanus in the healthy population in Guangdong Province and provide scientic basis for immunization strategy.  Methods  Samples were collected from population of the cities of Chaozhou, Shanwei and Shenzhen and antibody levels were detected by using ELISA.  Results  The positive rate of IgG against pertussis was 54.1%. The protective rates of antibody against diphtheria and tetanus were 76.4% and 77.2%,respectively.  Conclusion  The positive rates of antibody to Pertussis were low in Guangdong Province. The protective rates of antibody to diphtheria and tetanus were low also in some areas of Guangdong Province and the antibody level tends to decrease along with the increase of age,suggesting that vaccination rates and quality be enhanced.

    Key words:Pertussis; Diphtheria; Tetanus; Antibody level; Survey; ELISA

    为了解广东省健康人群百日咳、白喉和破伤风(简称白、百、破)抗体水平,评价预防接种质量,通过对3个地方健康人群进行了检测,现将结果报告如下。

  1  材料与方法

  1.1  监测对象及标本采集 

  潮州市及汕尾市的监测对象为2~4岁、6~8岁及13~15岁等3个年龄组儿童。要求各年龄组儿童随机抽取50人。深圳罗湖的调查对象为1~4岁流动儿童及本地儿童。每人采集静脉血3ml,分离血清,置-20℃冰箱保存待检。

  1.2  检验方法和判断标准 

  采用间接ELISA法检测健康人群中百日咳、白喉和破伤风IgG抗体水平(定量),试剂盒购自德国Serion公司,均在有效期内使用,按照试剂盒说明书操作。白喉和破伤风试剂盒分别检测血清中的相应抗毒素IgG抗体水平,测定结果以IU/ml单位表示,并与免疫保护的状态相对应。根据试剂盒推荐的抗毒素浓度评估标准,本文以白喉抗毒素以≥0.1IU/ml为达安全保护水平;破伤风抗毒素以≥0.1IU/ml达保护水平,分别计算白喉及破伤风抗体保护率。与白喉和破伤风不同,对于百日咳其血清学保护抗体的水平没有临界值范围的明确定义,百日咳抗体水平按试剂盒标准判断为阳性、阴性(临界归在阴性),计算其阳性率。

  1.3  仪器设备 

  采用BIO-RAD酶标仪测定各孔OD值,波长405nm ,参考波长655nm。

  2 结果

    此次共对368名儿童的血样分别检测百日咳、白喉和破伤风IgG抗体。广东省三个地区人群百日咳IgG抗体总阳性率为54.1%,白喉IgG抗体保护率为76.4%,破伤风IgG抗体保护率为77.2%。

  2.1  百日咳IgG抗体水平 

  广东省三个地区人群百日咳IgG抗体的阳性率以汕尾市为高,100%,深圳罗湖阳性率为45.1%,潮州市最低,为40%。三个地区健康人群百日咳抗体阳性率差异有显著性(χ2=102.76,P<0.01)。不同年龄组百日咳抗体阳性率随年龄的升高而升高,各年龄组百日咳抗体阳性率差异有显著性(χ2=102.76,P<0.01)。

  2.2  白喉抗毒素水平 

  广东省不同地区人群白喉IgG抗体保护率从高到低依次为深圳市罗湖87.5%、汕尾市73.0%、潮州市为67.3%。不同地区白喉抗体保护率差异有显著性(χ2=17.14,P<0.01),见表1。不同年龄组白喉抗体保护率随年龄的升高而降低,各年龄组白喉抗体保护率差异有显著性(χ2=25.02,P<0.01),见表3。表1  广东省不同地区人群白喉IgG抗体保护率地  区检查(略)注:*上表中用国际单位进行分级是以中和试验中抗白喉毒素抗体为基础的。表2  广东省不同地区人群破伤风IgG抗体保护率地区检查(略)注:*上表中以国际单位表示的数据是在小鼠体内试验基础上检测得到的抗破伤风毒素抗体数值。表3  不同年龄组人群百日咳、白喉、破伤风的抗体水平年龄组(略)

  2.3  破伤风抗毒素水平 

  广东省不同地区人群破伤风IgG抗体保护率从高到低依次为深圳市罗湖95.1%、汕尾市75.7%、潮州为60.7%,见表2。不同年龄组破伤风抗体保护率随年龄的升高而降低,各年龄组破伤风抗体保护率差异有显著性(χ2=94.81,P<0.01),见表3。
  
  3 讨论

    根据中华人民共和国卫生部1998年版的《计划免疫技术管理规程》,目前用于检测人群中百、白、破抗体水平和检测DPT联合制剂免疫效果的方法为间接血球凝集试验和微量凝集试验。但也有文献认为,由于间接血凝反应结果不够稳定,重复性较差,还需要改进和完善,因此尚未能完全代替经典的动物法。公认的白喉抗体保护水平是0.01IU/ml血清。0.01IU/ml血清的保护水平是要求用经典的家兔皮内法测定,用血细胞凝集试验方法测定,不能以0.01单位为保护水平,而且也不能用IU来表示,因两种方法所测得的结果是不等值的。目前还没有一个公认的用血细胞凝集试验测定的保护水平抗体值。为了解广西省人群百、白、破抗体水平,首次采用德国赛润的进口ELISA试剂盒直接对血清中抗白喉及破伤风毒素及百日咳抗体进行定量检测并进行评价。
   
  本次调查对368份不同年龄组健康人进行百日咳抗体的测定,总阳性率为54.1%,汕尾市百日咳IgG抗体的阳性率最高,为100%,潮州及深圳两地抗体水平均低于国家要求的75%的指标。不同年龄组阳性率差异有显著性,总趋势随年龄的升高而升高。三个地区百日咳疫苗的使用情况不清楚,是免疫效果差或者疫苗本身的不同造成的差异尚待进一步调查。因百日咳杆菌的抗原比较复杂,不同种类及不同厂家生产的无细胞百白破联合疫苗(DTaP)其百日咳抗原的组成及含量均不相同,反映免疫效果的指标也不同。目前,我国主要采用全细胞百白破联合疫苗(DTwP)或无细胞百白破联合疫苗(DTaP)用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。不同种类疫苗其抗原成分不同,DTwP和DTaP两种疫苗的相同之处在于都含有相同的白喉和破伤风类毒素,不同之处在于百日咳的抗原成分不同,DTwP所含百日咳的主要成分是凝集原(AGG)1、2、3型,而DTaP所含百日咳的主要成分为百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)及少量AGG。新DPT疫苗(DTaP)配制时去除了百日咳全菌体疫苗中的有害成分,在保持免疫效果的同时,全身和局部副反应的发生率也明显降低了[1]。按照卫生部《计划免疫技术管理规程》(1988年版)规定,考核百日咳的血清学免疫效果采用百日咳凝集试验。对使用DTwP的地区仍然适应,而对使用DTaP的地区来说应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中抗PT和抗FHA抗体[2]。

    本文表1中“<0.1IU/ml”表示最低限度的保护,需进行基础免疫或加强免疫;“0.1~1.0IU/ml”表示有安全保护作用,建议加强免疫;“>1.0IU/ml”表示有长期保护作用,5年以后加强免疫。对368份血清抗白喉毒素人抗体的定量测定,以白喉抗毒素≥0.1IU/ml为达安全保护水平,则人群对白喉总的保护率为76.4%,其中深圳罗湖区儿童的保护率最高,为87.5%。不同年龄组白喉抗体保护率差异有显著性,总趋势随年龄的升高而降低。表2中“<0.1IU/ml”表示没有免疫或没有安全免疫保护,需进行基础免疫或加强免疫;“0.1~0.5IU/ml”表示有效的免疫保护,建议加强免疫;“0.5~1.0IU/ml”表示有效的免疫保护,不需加强免疫,因为如果抗体滴度>0.5IU/ml,进行免疫可引起副作用;“>1.0IU/ml”表示有长期保护作用(维持5~10年)。对368份血清中人抗破伤风毒素抗体的定量测定,以破伤风抗毒素≥0.1IU/ml达有效保护水平,则人群对破伤风抗体总的保护率为77.2%,深圳罗湖区儿童的保护率最高,为95.1%。不同年龄组破伤风抗体保护率差异有显著性,总趋势随年龄的升高而降低。这跟用常规间接血凝方法测定的结果一致[3]。结果提示随年龄的增高人群对白喉、破伤风易感性增强,应加强7岁时白破二联疫苗免疫。

    不同地区百白破抗体水平的测定结果表明,除百日咳抗体水平汕尾市较高外,深圳罗湖区白喉、破伤风抗体水平明显比潮州、汕尾两地高。潮州及汕尾调查地点均为农村,而深圳罗湖为城市地区,分析可能是城市接种周期短,冷链运储条件好,经济条件较好,工作人员素质高,群众易接受等有关。

  参加本次调查工作的有潮州、汕尾及深圳等县、市疾病预防控制中心相关科室的同志,管大伟对数据的统计提供帮助,谨此致谢!

【参考文献】
    [1]李小帆,陈丽,陈慧林.新老两种百白破疫苗免疫接种反应的对照观察[J].广东医学院院报,2006,24(3):287~288.

  [2]朱建琼,王莹. 两种百白破联合疫苗基础免疫后百日咳凝集抗体和白喉抗体监测分析[J]. 中国计划免疫, 2004,10(2):84~86

  [3]许崇山.深圳市南山区2002年百日咳、白喉、破伤风人群免疫水平调查分析[J]. 中国计划免疫,2003,6(9):367.


作者单位:1.广东省疾病预防控制中心,广东 广州 510300;2.汕尾市疾病预防控制中心,广东 汕尾 516600.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第4期]栏目

肺炎衣原体IgG的滴度与慢性阻塞性肺疾病严重程度的相关性

【摘要】    目的:肺炎衣原体IgG滴度与COPD严重程度的相关性。方法:选择COPD急性加重期患者30例,稳定期患者30例检测血清肺炎衣原体IgG及第一秒呼气容积占预计值百分比(FEV1%预计值)。结果:无论是COPD急性加重期还是稳定期患者的严重程度与肺炎衣原体IgG滴度无相关性。结论:肺炎衣原体IgG的滴度与慢性阻塞性肺疾病的严重程度无关。

【关键词】  肺炎衣原体IgG COPD 第一秒用力呼吸容积占预计值百分比

  Correlation between IgG of chlamydia pneumonia and severity of COPD

  HU Bo
   
  (Respiratory department of the first clinical hospital in Beihua university,Jilin 132001,China)
   
  【Abstract】  Objective:To discuss correlation between IgG of chlamydia pneumonia and severity degree of COPDMethods:30 cases acute exacerbation of COPD and 30 cases of stabilization were detected IgG of chlamydia pneumoniae and FEV1%Results:No correlation between IgG of chlamydia pneumoniae and FEV1% of either group of acute exacerbation of COPD or  stabilizationConclusion:There is no relationship of IgG of Chlamydia pneuminiae and severity degree of COPD
   
  【Key words】  IgG of chlamydia pneuminiae;COPD;FEV1%

  肺炎衣原体是20世纪80年代新发现的一种衣原体种。目前发现,人类是肺炎衣原体的唯一宿主。肺炎衣原体感染是全世界各地广泛存在、高度流行的常见病。四季均可流行,重复感染较常见,主要引起急性呼吸道感染,目前,肺炎衣原体感染约占社区获得性肺炎的10%[1]。肺炎衣原体感染的临床表现轻重不一,以肺炎为主,无特征性,通常症状较轻,有发热、咳嗽、寒战、胸痛和肌痛等,可伴随肺外表现,如脑炎、吉兰-巴雷综合征等。在部分哮喘、结节病、血管炎、冠状动脉粥样硬化、心肌炎、心内膜炎、心包炎、急性心肌梗死的患者中也有相关的肺炎衣原体感染的证据[3]。肺炎衣原体感染参与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发病,是COPD急性加重期的诱因之一[2],此类报告国内外很多见,但肺炎衣原体IgG滴度与COPD 的严重程度是否相关,国内未见报告,本课题研究30例COPD急性加重期和30例稳定期患者肺炎衣原体IgG滴度与COPD严重程度的相关性,现将结果报告如下:

  1  资料与方法

  11  研究对象  根据第6版内科学的诊断标准,选择COPD急性加重期患者30例(以上均排除冠心病、高血压、肾炎及泌尿系感染),为我院2004年1月~2005年6月入院患者,其中,男性18例、女性12例,年龄45~62岁,平均年龄564岁;病程5~10年,平均病程76年。稳定期患者30例,为同期门诊患者,其中,男性15例、女性15例,年龄44~62岁,平均年龄544岁;病程5~10年,平均病程66年。

  12  标本采集  急性加重期患者入院后第2天,稳定期患者第2天在门诊采血标本,6小时内分离出血清,保存于-20℃冰箱待检。血清学检测:IgG抗体采用微量免疫荧光试验(MIF)测定,北京协和医院试剂厂提供。兔抗人IgG荧光抗体购自美国Sigma公司。

  1.3  两组患者均检测肺功能的第一秒呼气容积占预计值百分比(FEV1%预计值)。数据采用统计学处理。

  2  结果

  21  COPD急性加重期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值  见表1。COPD急性加重期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值的关系见图1,两者之间无相关性(r=0)。

  22  COPD稳定期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值  见表2。COPD稳定期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值关系见图2。两者之间无相关性(r=0)。

  表1  COPD急性加重期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值(略)

  表2  COPD稳定期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值(略)

  图1  COPD急性加重期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值的关系(略)

  图2  COPD稳定期肺炎衣原体IgG与FEV1%预计值的关系(略)

  3  讨论
   
  COPD是一种气流受限不完全可逆为特征的肺部疾病,是呼吸系统的常见病,其患病率和死亡率均高,造成巨大的社会和经济负担。根据世界银行/世界卫生组织发表的研究,至2020年COPD将成为世界疾病经济负担第5位[3]。
   
  COPD 的诊断除根据临床症状外,客观指标是通过肺功能检查判定气流受限,其中第一秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1%预计值)是评估COPD严重程度的良好指标,其变异性小,易于操作。COPD病程分期:急性加重期是指在疾病过程中,短期内咳嗽、咳痰、气短加重;痰量增多,呈脓性或黏液脓性;可伴发热等症状。稳定期则咳嗽、咳痰、气短等症状稳定或症状轻微[3]。COPD的确切病因还不十分清楚,目前认为与空气污染和感染有关,其中肺炎衣原体感染在其发病中起重要作用,并且是COPD急性加重期的诱因之一[4]。本研究发现,虽然肺炎衣原体参与COPD的发病,但是肺炎衣原体IgG的滴度与COPD无论是急性加重期,还是稳定期患者的FEV1% 预计值无相关性,说明肺炎衣原体IgG的滴度不决定COPD患者的严重程度。
   
  其主要因为肺炎衣原体首次感染后,IgM抗体于3周后出现,且效价高,IgG于6~8周后出现。再次感染时,IgM抗体一般不出现,或仅有低效价。IgG于1~2周后迅速升高,常高于1:512[5],出现后可持续数年,广泛存在于人群中,随年龄的增长阳性率亦增高。
   
  肺炎衣原体感染后,并不能产生长期的免疫保护反应,故常发生反复感染。肺炎衣原体感染具有慢性、持续倾向的原因可能是:肺炎衣原体可通过阻断宿主细胞线粒体细胞色素的释放及半胱天冬氨酸蛋白酶3的活性,抑制凋亡,从而导致慢性感染[6];肺炎衣原体可通过分泌一种蛋白酶样活性因子,减少宿主细胞主要组织相容性复合物抗原表达所需的转录因子的产生,从而逃避宿主的防御机制,引起持续反复感染[7]。因此,肺炎衣原体反复感染使IgG持续增高,与COPD的严重程度无相关性。
   
  国内有研究显示,肺炎衣原体感染与COPD无直接关系,即单纯肺炎衣原体感染并不能引起COPD的发病,可在吸烟等所致病变的基础上加重[8],本研究与此结论相同。
   
  本研究发现,肺炎衣原体感染与COPD急性加重期患者的严重程度无相关性,还由于COPD急性加重期多数为细菌参与的混合感染[4],因此,肺炎衣原体IgG的滴度不决定COPD患者的严重程度。
   
  综上所述,肺炎衣原体虽然参与COPD的发病,并且是COPD急性加重期的诱因之一,但肺炎衣原体IgG的滴度与FEV1%预计值无相关性,即与COPD的严重程度无关,是否与其他因素有协同作用,有待于进一步研究。

【参考文献】
    [1] Grayston JT,Campebell LA,Kuo CC,et alA new respiratory tract pathogen:Chlamydia pnemoniae strain[J]TWAR J Infect Dis 1990,6(4):618-625

  [2] 杨小琼肺炎衣原体感染与慢性阻塞性肺疾病严重程度和急性加重的相关性[J]中国综合临床, 2005,21(10):890-891

  [3] 叶任高.内科学[M]第6版24-25

  [4] 刘 慧COPD急性加重期肺炎衣原体感染的临床分析[J]临床肺科杂志,2006,9(6):646-648

  [5] Janet S,Butel,Stephen A,et alJawetz ,Melnick &Adelberg's Medical Microbiology[M]第22版.北京:人民卫生出版社,2001:312

  [6] Fan P,Dong F, Huang Y, et alChlamydia pneuminiae secrection of a protases-like activity factor for degrading host cell transcription factor required for major histo-compatibility complex antigen expression [J]Infection & Immunity,2002,70(1):345-349

  [7] Kroegel,Rodel,Miller RD,et alChlamydia pneuminiae,clarithromycin,and severe asthma[J]Chest,2001,120(3):1035-1036

  [8] 赵燕妮肺炎衣原体感染与慢性阻塞性肺疾病的关系的研究[J]中华内科杂志,2004,43(5):333-337


作者单位:北华大学附属医院呼吸科,吉林 吉林 132001

日期:2009年8月24日 - 来自[2009年第21卷第6期]栏目
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血清P53-IgG抗体测定及其临床价值初步研究

摘 要 目的 建立血清P53蛋白IgG抗体(P53-IgG) 酶免疫测定法,初步探讨其临床价值。方法 以P53MoAb为包被抗体,以亲和层析纯化浓缩P53蛋白作为中介,自行建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。结果 78例消化道癌P53-IgG阳性率34.62%(27/78),而32名献血员和30例非癌住院患者均为阴性,P均<0.01。48例经免疫组化P53蛋白染色阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%(27/48),显著高于阴性对照组(0/30),P<0.01。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%,敏感度34.62%,阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。本方法测定特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%。结论 血清P53-IgG测定与P53蛋白表达相关,是P53基因研究的新的辅助指标之一。

  关键词:血清学诊断;酶联免疫吸附测定;P53抗体

  P53抑癌基因是研究最为深入的肿瘤相关基因之一,其与肿瘤产生、肿瘤生长调控|肿瘤细胞凋亡等关系密切。P53基因表达与肿瘤浸润转移和复发潜能有关,P53基因蛋白(即P53蛋白)阳性的肿瘤预后不良。检测 p53基因/蛋白对评价患者预后和提高患者术后生存期限具重要价值。P53基因/蛋白检测以往仅限于手术切除肿瘤组织的免疫组织化学染色和DNA原位杂交。最近发现 p53基因/蛋白阳性肿瘤患者血清中存在特异性的抗P53蛋白抗体(P53-IgG),P53-IgG测定可用于肿瘤转移,复发预测和P53表达动态观察,已引起了国内外学者的关注[1,2]。本研究自行建立了P53-IgG测定方法,并探讨其临床初步应用价值,现报道如下。

  材料和方法

  一、材料

  1.试剂:CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia 公司,瑞典 ),P53 MoAb(MS-105,Clone: Pab 1801,福州迈新生物技术公司进口分装),酯化生物素(美国Sigma公司),亲和素(上海丽珠东风试剂厂),免抗人IgG酶标抗体(丹麦Dako公司)。

  2.标本来源:血清标本130份,其中献血员32份,年龄23~42岁;非癌住院患者30份(脑卒4份,肝硬化12份,高血压11份,消化性溃疡3份),年龄31~64岁;消化道癌78份(胃癌62份,肝癌11份,大肠癌5份),年龄48~78岁。以上肿瘤均经手术,病理证实。所有标本经肘静脉取血3 ml,新鲜分离血清,置-20℃保存,备用。

  二、方法

  1.P53蛋白粗制品的制备:收集数份经冰冻切片P53染色阳性胃癌组织,仔细剔除正常组织、纤维,并剪成1 mm×1 mm×1 mm,加入4倍体积的冰冷0.1 mol/L Tris 盐酸缓冲液 (内含0.1%苯磺酰氯,1.0% triton-100)高速匀桨,4℃搅拌过夜,次日再超声粉碎(0℃15 s×8次),10 000 r/min离心15 min,弃沉淀,上清液经生理盐水透析平衡[3]。另取预经对0.1 mol/L NaHCO3透析平衡的P53 MoAb 1 ml与1gCNBr-Sepharose 4B按说明书交联,即为亲和层析柱,将上述肿瘤上清液流穿此柱,经解吸后即可获P53粗制品。加0.1%NaN3置2~8℃保存。

  2.P53 MoAb与酯化生物素交联:同文献报道[4]。制备生物素化P53 moAb置30%甘油2~8℃保存。

  3.血清P53-IgG测定:将亲和素以10 mg/L浓度包被微孔,4℃过夜,次日取出洗涤3次后,用10%小牛血清37℃封闭30 min,洗涤2次,加入生物素化MoAb 50 μl和50 μl预经反应 4℃过夜的血清-P53粗制品混合液(血清1∶50,P53粗制品1∶25,等量混匀),混匀1 min,37℃反应60 min,洗涤3~5次,加入免抗人IgG酶标抗体,37℃反应60 min,洗涤3~5次,加四甲基联苯胺盐酸盐(TMB)底物避光显色10~15 min,以50 μl/孔2 mol/L盐酸终止反应,以490 nm测各孔A值。同时设立阴性及空白对照。阳性判断标准:凡大于献血员平均吸光度X+2.56s以上者为阳性。

  4.方法学质控:同一样本同次重复20孔,计算批内差异,同一样本不同批次连续检测10次,计算批间差异。

  三、统计方法

  采用卡方检验。

  结果

  1.从近20 g肿瘤组织中用亲和层析法分离P53粗制品420 mg,用Western-Blot法鉴定内含数种杂蛋白,与P53 MoAb呈强反应。

  2.不同疾患血清P53-IgG阳性率测定结果表明献血员、非癌住院患者均无P53-IgG表达(0/32,0/30),消化道肿患者P53-IgG阳性率34.62%(27/78),显著高于前两组,P值均<0.01。血清P53-IgG测定的特异性100%,敏感性为34.62%。

  3.免疫组化染色P53阳性患者血清P53-IgG测定结果示30例P53阴性患者P53-IgG均阴性,而48例P53阳性患者P53-IgG阳性率56.25%,二者差异有显著意义,P<0.01。提示P53-IgG表达与P53基因/蛋白表达密切相关。血清P53-IgG测定的阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。

  4.5例P53-IgG阳性患者在肿瘤切除后15 d,30 d测定仍为阳性,6~12月后复查P53-IgG均为阴性。提示P53-IgG水平随肿切除缓慢下降,速度较慢可能与IgG半衰期长有关。

  5.本方法测定的特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%。

  讨论

  P53抑癌基因分野生型和突变型2种。野生型存在于正常体细胞内,对细胞的生长、分化起调控作用,含量甚微,用现行技术不能检测到野生型蛋白;突变型P53基因由于其DNA碱基突变(多为点突变),致合成的P53蛋白构象改变,正常生理功能丧失或减弱,并致P53蛋白在细胞核内异常堆积,易被现行技术检测到,业已证明这种异常的P53蛋白多表达于肿瘤细胞内,其表达是否与肿瘤预后有关[5]。Crawford等[1]发现突变型P53蛋白随肿瘤细胞的死亡崩解而释放入血,刺激机体免疫系统产生特异性的自身抗体。Trivers等[2]认为测定血清P53-IGG对预测肿瘤浸润转移和复发有重要价值。与传统的免疫组化染色法相比较,血清P53-IgG测定取材更方便,更有利于术后复发监测及P53动态观察。

  我们在国内率先建立了血清P53-IgG酶免疫测定法。采用进口P53 moAB作为第一抗体(包被抗体)避免了结果的假阳性、假阴性反应,保证方法的高特异性;采用亲和素-生物素技术可提高方法检测灵敏度。结果显示,本法检测特异性100%,批内差异3.8%,批间差异16.2%,具较高灵敏度。我们在试验中发现直接采用P53蛋白粗制品包被微孔时,其检测灵敏度低,P53蛋白粗制品用量大。遂设计了先将样本血清与P53蛋白粗制品反应,形成抗原抗体复合物,然后再分别与P53 moAb、免抗人IgG酶标抗体反应,则避免了P53蛋白粗制品直接包被时的不足。

  本试验结果表明,献血员和非癌住院患者血清P53-IgG均阴性,78份消化道肿瘤其阳性率为34.62%,48份经免疫组化染色P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阳性率56.25%。P53-IgG的肿瘤诊断特异性100%,敏感性34.62%,阳性预测值100%,阴性预测值58.82%。提示P53-IgG与P53蛋白表达相关。然也有部分P53蛋白阳性患者血清P53-IgG阴性。因而P53-IgG阴性不能排除P53蛋白阳性可能,其原因可能与机体荷瘤大小、时间等有关,尚需作进一步探讨。另作者观察了P53-IgG阳性患者手术后的P53-IgG动态变化,发现术后15 d、30 d P53-IgG仍阳性,但术后6~12月则转为阴性。

  作者单位:谢鑫友(310016杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  姜红英(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  林洁(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  费春荣(310016 杭州,浙江大学医学院附属邵逸夫医院)

  参考文献

  1,Crawford LV,Pim DC,Bulbrook rD.Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int J Cancer, 1982, 30:403-408.

  2,Trivers GE, Cawley HL, DeBenedtti VM,et al.Anti-p53 antibodies in sera of workers occupationally exposed to vinyl chloride. J Natl Cancer inst,1995,87:1400-1407.

  3,朱永良,钱可大,唐训球,等,抗胃癌细胞单克隆抗体的制备.浙江医科大学学报,1996,25:21-23.

  4,洪孝庄,孙曼雯,主编.蛋白质连接技术.北京:中国医药科技出版社. 1993. 35-37.

  5,Mudenda B, Green JA, Green B, et al. The relationship between serum P53 autoantibodies and characteristecs of human breast cancer. Br J Cancer, 1994,6:1115-1119.


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

霍奇金淋巴瘤患者及亲属中EB病毒载量与抗病毒衣壳抗原IgG滴度正相关

法国Besson等报告,霍奇金淋巴瘤(HL)患者血清中抗EB病毒衣壳抗原(VCA) IgG滴度随外周血单个核细胞(PBMC)中EB病毒载量的增加而增加。在HL患者的健康一级亲属中也存在同样相关性,提示抗VCA IgG滴度和病毒载量可能是EB病毒再激活的标志。[J Clin Microbiol 2006, 44(1): 47]
     用于血清学检测的EBV抗原包括EB病毒核抗原-1(EBNA-1),VCA 和早期抗原(EA)。原发感染后,抗VCA和抗EBNA-1抗体将终生持续存在。EBNA-1在潜伏感染时表达,而VCA和EA类似于最近发现的EB病毒反式激活蛋白(ZEBRA),在裂解性感染时表达。因此,高滴度的抗VCA、抗EA和抗ZEBRA IgG被认为是EB病毒再激活的标志。
     除了血清学检测,在PBMC、血清或全血中也可测定EB病毒载量。在健康人的PBMC中,通常可以检测到低水平的病毒载量,并且在每个个体内保持恒定。相反,被诊断为EB病毒相关淋巴恶性肿瘤(HL、 B细胞淋巴瘤和移植后淋巴增生异常)患者的PBMC和(或)血清中病毒载量高。有关EB病毒血清抗体滴度和病毒载量之间关系的研究还非常少。
     血液病房中被诊断为HL至少1年且完全缓解的患者被纳入该研究。入选标准为年龄在15~35岁,诊断时HIV阴性。患者的一级亲属也参加该研究。确定所有受试者的病史并采集血液标本。采用酶联免疫吸附试验试剂盒测定抗EBNA-1 IgG、抗VCA IgM、抗EA IgG和抗VCA IgG的滴度。采用荧光探针标记的实时定量PCR测定PBMC中的病毒载量。
     结果显示,共纳入72例HL患者,平均年龄为32岁,男女比率为1.1。在29例(40%)患者的PMBC中检测到EB病毒,平均病毒载量为240拷贝/106 PMBC。检测出和未检测出EB病毒的患者抗EBNA-1和抗EA IgG滴度无差异。相反,检测到EB病毒患者的抗VCA IgG滴度明显高于未检测到病毒者。抗VCA IgG滴度与病毒载量显著正相关。
     共141名一级亲属参加了该研究,父母和兄弟姐妹的平均年龄分别为58岁和31岁。HL患者亲属抗VCA IgG滴度低于HL患者,校正年龄后为4218 U/ml 对 4737 U/ml(P=0.03)。一级亲属中,检测出和未检测出EB病毒者的抗EBNA-1和抗EA IgG 滴度无显著差异,相反,检测到EB病毒的亲属抗VCA IgG滴度明显高于未检测到病毒者,抗VCA IgG滴度和病毒载量明显正相关。
     该研究首次在具有免疫能力的大样本人群中对EB病毒特异性血清抗体滴度和PBMC中的病毒载量进行了联合分析。研究表明,抗VCA IgG滴度和EB病毒载量与所感染EB病毒的表型明确相关。提示抗VCA IgG滴度和病毒载量可能是EB病毒再激活的标志。

日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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间接免疫荧光试验在人群埃可30型肠道病毒IgG抗体检测中的应用

目的 建立埃可30型肠道病毒(Echovirus 30,Echo30)国内流行株血清特异性IgG抗体检测的间接免疫荧光法(IFA),了解人群既往感染情况.方法 采用由爆发人群分离得到的病毒株感染人胚肺二倍体细胞(MRC-5)制备抗原片,探讨IFA检测血清Echo30 IgG抗体的方法,并初步用于检测苏北病毒性脑膜炎爆发后收集的该地区儿童血清中Echo30 IgG抗体.结果 建立了Echo30肠道病毒血清特异性IgG抗体的IFA检测方法.在44份健康儿童血清中筛检到28份(63.6%)Echo30 IgG抗体阳性,3份患者血清Echo30 IgG抗体均为阳性.结论 Echo30国内流行株IgG抗体的IFA操作简便、经济,可用于血清流行病学调查.爆发地区儿童中存在大量的无症状感染者.

间接免疫荧光试验在人群埃可30型肠道病毒IgG抗体检测中的应用


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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