主题:bFGF

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微骨折结合bFGF纤维蛋白胶复合物修复关节软骨缺损的实验研究

【摘要】  目的 探讨微骨折结合碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor bFGF)与纤维蛋白胶复合物对关节软骨缺损的修复作用。方法 选择健康成年新西兰大白兔24只,随机分为A实验组、B对照组、C对照组、D空白对照组,每组6只(12膝),所有兔子均造成股骨髁间窝直径4 mm全层软骨缺损。A实验组:软骨缺损区造成微骨折并注入1 μg bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物; B组:软骨缺损区造成微骨折并注入0.1 ml纤维蛋白胶; C组:软骨缺损区注入1 μg bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物; D组:软骨缺损区注入0.1 ml纤维蛋白胶; 术后8、12周处死动物取标本每次每组3只(6膝),大体观察膝关节活动度及修复组织与周边组织的结合情况,苏木素伊红染色和甲苯胺蓝染色观察修复组织的形态。根据Wakitani评分标准测定各组不同时间点标本光镜组织学评分,进行统计学分析。结果 术后8、12周大体观察与织学观察结果,实验组关节软骨缺损的再生修复均明显优于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 微骨折和碱性成纤维细胞生长因子都有促进软骨修复的作用,两者结合起来对软骨再生具有更明显的促进作用。

【关键词】  关节软骨; 软骨缺损; 微骨折; 碱性成纤维细胞生长因子

Experimental Study on Repair of Cartilage Defects with Combined bFGF and Microfracture

    WEI ChangHai,LI Hanxiu,HAO Qinghai

    (Department of Surgery,Weifang Medical College,Shandong Weifang 261041,China)

    【Abstract】  Objective To study the effect of bFGF combined with microfracture on repair of articular cartilage defect.Methods 24 New Zealand white rabbits were divided into group A,B,C and D randomly.The 4mm in diamete of fullthickness articular cartilage defects were made on femoral intercondylar fossa in all rabbits.Group A: microfracture was made on the cartilage defect and covered with 1 μg bFGF and 0.1ml fibrin glue.Group B:the same microfracture was made on the cartilage defect and covered with the same dosage of fibrin glue.Group C:the cartilage defect was covered with 1 μg bFGF and 0.1ml fibrin glue.Group D:the cartilage defect was covered with 0.1ml fibrin glue.The rabbits were killed in 8,12 weeks postoperatively,and the areas of cartilage defect were examined grossly,microscopically and histological scored.Results The cartilage regeneration in Group A was significantly superior to that in control group,there has a significant difference (P<0.05).Conclusion Microfracture combined with bFGF plays an effective role in articular cartilage regeneration.

    【Key words】  articular cartilage; cartilage defect; microfracture; basic fibroblast growth factor

     由于关节软骨缺乏直接的血液供应、淋巴循环和神经支配,并具有低代谢的生理特点,关节软骨缺损后的自行修复能力非常有限,关节软骨缺损的修复已成为临床骨科急需解决的问题之一。目前常用的是外源性修复方法,如钻孔术、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等。随着分子生物学研究的进展,发现软骨缺损的修复过程是一个多种因子参与的复杂过程,其中细胞因子在软骨组织工程中是不可缺少的重要组成部分,包括刺激软骨细胞增殖的生长因子和刺激软骨细胞分化的细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等组织中,是重要的有丝分裂促进因子,也是形态发生和分化的诱导因子,在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程,对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有较强的促有丝分裂作用,可促进间充质干细胞增殖、分化、增加修复细胞的数量[1]。为了观察bFGF对关节软骨缺损的修复,作者对其治疗关节软骨损伤进行了实验研究。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    ①健康新西兰大白兔24只(体重2.0~2.5 kg); ②纤维蛋白胶(哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司); ③ bFGF(北京博奥森生物科技有限公司)。

    1.2  方法

    动物分组:将24只兔子随机分为A、B、C、D组。模型制备:用3%戊巴比妥钠溶液按照1.0 ml/kg耳缘静脉注射麻醉,术区脱毛,碘伏消毒,取双膝内侧入路,显露髌股关节面,用直径4 mm 空心平头钻在股骨髁间窝正中上方造成全层关节软骨缺损区,深及软骨下骨以均匀出血为止。A组:用直径1 mm克氏针在缺损区钻孔,孔间距2 mm,共4孔用微量注射器先将1 μg bFGF与0.1 ml纤维蛋白胶混合后充填缺损区,然后涂布0.1 ml氯化钙溶液促进凝胶形成。B组:软骨缺损区造成微骨折(同A)并注入0.1 ml纤维蛋白胶; C组:软骨缺损区注入1 μg bFGF和0.1 ml纤维蛋白胶的混合物; D组:软骨缺损区注入0.1 ml纤维蛋白胶; 逐层缝合关闭,患肢不固定,放置笼内饲养,任其自由活动。分别于8、12周处死动物,取材。

    1.3  观察指标

    1.3.1  肉眼观察  观察膝关节囊有无挛缩、粘连和新生物形成,以及关节活动度、修复组织的光滑性及其与周边组织的结合情况。

    1.3.2  光镜组织学检查  将标本置于100 g/L甲醛溶液中固定,脱钙,梯度乙醇脱水,石蜡包埋后,切片行苏木素伊红染色(HE)和甲苯胺蓝(TB)染色。光镜下对修复组织的性质、表面特性和与正常软骨连接等进行组织学观察。采用Wakitani[4]制定的评分标准(见表1),双盲法对各标本进行组织学评分,利用dunnett检验将评分结果进行方差分析。

    1.4  统计学分析

    结果采用SPSS10.0软件进行统计处理,实验数据以±s表示(见表2),P < 0.05为有统计学意义。表1  各组不同时间点标本光镜组织学评分

    2  结果

    2.1  实验动物膝关节大体观察

    术后8、12周各组动物关节腔内均见少许淡黄色、清亮的关节滑液,无软组织挛缩、粘连,滑膜无充血水肿,周围软骨无破坏和骨赘形成。术后8周,A组软骨缺损区被半透明、表面光滑的类软骨组织替代,与周围关节面平齐,有一定的弹性,与周围正常软骨的分界线清楚; B、C组外观相似,软骨缺损区被薄层白色组织填充,缺损区均未完全填平,表面呈白色,半透明、不光滑、质地软、弹性差,与周围正常软骨的分界线清楚。D组缺损区被薄层纤维斑痕组织覆盖,缺损明显。术后12周,A组表面光滑,呈白色,完全填平缺损区,肉眼观与周围软骨相比,质地、色泽近似,表面与正常关节面平齐,与周围正常软骨的界限基本消失; B、C组外观相似缺损区大部分被白色,半透明组织填充,外观与周围关节面界限清晰,表面有小的突起,质地软、弹性差; D组缺损仍然存在,薄层斑痕增生,色泽灰暗,周围正常软骨的分界线清楚。

    2.2  光镜组织学观察各组软骨缺损的修复情况

    第8周,A组新生软骨组织细胞呈圆形和卵圆形,排列不规则,细胞密度大于正常软骨,软骨陷窝明显,表明修复组织大都为纤维软骨,仅少量软骨呈透明样,表面无严重的纤维化,且新生组织高于正常周围软骨平面(见图1); B、C对照组新生组织细胞呈圆形或卵圆形,形成少量纤维软骨,无透明软骨形成,与周围组织界限明显(见图2);D组软骨缺损区为斑痕组织覆盖含有少量软骨细胞。第12周,A组缺损基本愈合,修复组织细胞密度显著降低,基质均匀,细胞形态和排列接近正常软骨,修复软骨呈透明软骨样(见图3); B、C对照组缺损表面不光滑,软骨细胞排列不规则,细胞密度小于正常;D组形成大量的纤维瘢痕组织,仅有少量纤维软骨,无透明软骨形成,与周围分界明显(见图4)。表2  Wakitani评分标准

    2.3  各组不同时间点标本光镜组织学评分

    A、B、C、D数据利用dunnett检验将评分结果进行方差分析,P<0.05.A组关节软骨缺损的再生修复明显优于对照组B、C,D组,差异具有统计学意义,B、C组明显优于D组差异具有统计学意义。

    3  讨论

    Calandruccio等1962年首次发现应用软骨下骨钻孔术可以治疗关节软骨缺损[2]。国外Shapiro(1993年)、国内葛志强[3]等以兔为实验对象,行软骨下骨钻孔术修复全层关节软骨缺损,实验证实缺损区有新生透明软骨修复,钻孔对关节功能无不利影响。1999年德国学者Steadman等[4]报告临床应用“微骨折”技术修复关节软骨缺损,即采用特制的骨刀在软骨下骨表面造成“微骨折”,以提供组织再生的适宜环境和激发自身修复潜能,使关节面得以修复,经随访疗效满意。

    碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等组织中,是重要的有丝分裂促进分子,也是形态发生和分化的诱导因子,在正常生理及病理过程中参与生长发育和组织损伤的修复过程。bFGF对中胚层及神经外胚层来源的细胞都有强烈的促有丝分裂作用,能在极低浓度水平(1 ng/ml)发挥活性[5],对肢体发育和塑性尤为重要,对神经元的存活及突起的生长也有强的促进作用,此外还可刺激血管生长,软骨修复及骨折愈合等广泛的生物学效应。

    在体内,生长分化因子要有载体的保护,以避免因稀释或快速降解而失去其生物活性。因此,探寻具有保护和缓释作用的理想载体十分重要。纤维蛋白胶是由纤维蛋白原在凝血酶和钙离子作用下形成的凝胶物质,其作为软骨组织工程支架具有以下优点:①水凝胶水分含量高,摩擦系数少,和软骨相似,事实上软骨是胶原、硫酸软骨素和其他多聚糖共同形成的水凝胶; ②水凝胶基质通过保持软骨细胞外型而增强其功能; ③通过水凝胶基质bFGF被均匀分配,防治其流失; ④水凝胶有弹性、亲水性,亲水性物质可以自由扩散。纤维蛋白胶是天然水凝材料,具有无毒、无免疫型、可塑性好、具有良好生物相容性和生物降解性等优点,可以直接注射,便于关节镜下使用,是良好的生物载体。

    本实验采用的克氏针手摇钻在软骨下骨表面形成微骨折,表现为骨小梁发生穿孔、断裂。微骨折后的修复组织主要来源于松质骨间充质细胞,属于外源性修复。软骨下骨出血由红细胞、白细胞和少量的未分化细胞组成。缺损形成后不久。纤维蛋白凝块迅速填充,同时松质骨内多种功能间充质细胞发生增殖。凝块可使骨释放生长因子,血小板也能释放多种可促进骨髓间充质细胞向软骨细胞转化的细胞因子。同时bFGF起到催化剂的作用,诱导骨髓间充质细胞向软骨细胞转化[6]。本实验可见从微骨折基底及孔隙壁缘的骨样组织进一步分化成为透明样软骨。

    通过动物实验,在非负重的股骨髁间窝造成软骨缺损区,联合微骨折技术利用碱性成纤维细胞生长因子作为催化剂,诱导促进关节软骨的再生修复,与对照组相比软骨修复良好,证实了碱性成纤维细胞生长因子对诱导再生关节软骨的促进作用,为关节软骨的修复提供了新的方法。

【参考文献】
  [1] Shid J,Jingushi s,Izumi T,et al.Basic Fibroblast Growth Factor Stimulates Articular Enlargement in Vivo[J].J Orthop Res,1996,14(2):265268.

[2] Calandruccio RA,Gilmer S.Proliferation Regeneration and Repair of Articular Cartilage of Immature Animals[J].J Bone Jiont Surg(Am),1962,44:431435.

[3] 葛志强,冯传汉,吕厚山,等.孔数不同的软骨下骨钻孔术对兔软骨缺损修复的影响[J].中华骨科杂志,1997,17(6):389391.

[4] Steadman JR,Rodkey W G,Briggs KK.The Microfracture Technic in the Management of Complete Cartilage Defects in the Knee Ioint[J].Orthopade,1999,28:2632.

[5] 张海宁,侯筱魁.碱性成纤维细胞生长因子在骨科领域的应用前景[J].中华创伤骨科杂志,2004,6(4)443446.

[6] Tripple SB,Wroblesk BJ,Makower AM,et al.Regulation of Growth Plate Chon drocytes by Insulin like Growth Factor Ⅰand Basia Fibroblast Growth Factor[J].Bone Joint Surg,1993,75:177189.

日期:2013年2月27日 - 来自[2009年第4卷第1期]栏目
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牛羊膜联合应用rbbFGF对Ⅱ度烧伤创面的疗效

【摘要】    目的 观察牛羊膜覆盖烧伤创面联合应用牛碱性成纤维细胞生长因子(rbbFGF)对烧伤创面的临床治疗效果。方法 选择以Ⅱ度烧伤创面为主的中小面积热力烧伤病人43例,试验创面面积为1%~2%。将每例病人相同性质的创面等分为3份,分别应用有孔牛羊膜(治疗组)、牛羊膜(对照组1)、凡士林油纱布(对照组2)覆盖烧伤创面,3组均联合应用rbbFGF。结果 治疗组与对照组1和对照组2相比,以深Ⅱ度烧伤创面为主的病人的创面愈合时间明显缩短(F=25.36,q=7.25、3.46,P<0.01);在治疗以浅Ⅱ度烧伤创面为主的病人过程中,治疗组与对照组2相比创面愈合时间明显缩短(F=12.29,q=5.21,P<0.01),而与对照组1相比没有明显差别(q=2.60,P>0.05)。结论 有孔牛羊膜覆盖烧伤创面及联合应用rbbFGF能加速烧伤创面的愈合。

【关键词】  牛;羊膜;生物敷料;成纤维细胞生长因子2;烧伤;治疗结果

  THE EFFECT OF COMBINED BOVINE AMNION AND rbbFGF ON SECONDDEGREE BURN WOUND 

  GUOHUA, XU GUOSHI, LIU BEIBEI, et al

  (Department of Burn and Plastic Surgery, The Affiliated Qingdao Municipal Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266011, China) ;

  [ABSTRACT] Objective To observe the effect of combined bovine amnion and rbbFGF on seconddegree burn wound. Methods Fortythree patients with smallto mediumarea thermal burn were included in this study. The experimental area was1%-2%. The wound of the same nature in each patient was divided into three parts which were respectively treated with perforated bovine amnion (treatment group), bovine amnion (control group 1) and vaseline gauze dressing (control group 2) by combination of rbbFGF.  Results Compared with the control 1 and 2, the wound healing duration of seconddegree deep burns in treatment group was significantly shortened (F=25.36;q=7.25,3.46;P<0.01). For the superficial  burns, the  wound healing duration in the treatment group was shorten than control group 2 (F=12.29,q=5.21,P<0.01), but no significant difference was noted as compared with control group 1 (q=2.60,P>0.05).  Conclusion The combination of perforated bovine amnion and rbbFGF can obviously promote the healing of burn wounds.

  [KEY WORDS] cattle; amnion; biological dressing; fibroblast growth factor 2; burns; treatment outcome
   
  烧伤创面修复的质量可以直接影响病人愈后的生活质量,而烧伤后创面的有效覆盖则是保证创面修复的重要措施。许多生物敷料已广泛应用于烧伤创面,其中包括羊膜类敷料。本研究在以前应用的基础上联合应用牛碱性成纤维细胞生长因子(rbbFGF)治疗Ⅱ度烧伤创面,取得较好效果,现将结果报告如下。

  1  资料与方法

  1.1  一般资料
   
  病人纳入标准:①Ⅱ度烧伤创面为主;②中小面积烧伤病人;③热力烧伤;④创面无严重污染、感染和过多的渗出物。符合上述标准的烧伤病人43例,男22例,女21例,年龄1~80岁,中位年龄32岁,平均烧伤面积(31.50±27.25)%,试验创面面积1%~2%。伤后48 h内入院31例,48 h后入院12例。以深Ⅱ度烧伤创面为主的病人23例,深Ⅱ度创面25处(上肢创面11处,下肢创面10处,其他部位4处);以浅Ⅱ度烧伤为主病人20例,浅Ⅱ度创面28处(上肢创面12处,下肢创面11处,其他部位5处)。

  1.2  材料
   
  牛羊膜的制备:取经检验合格的健康牛分娩后6 h内的新鲜胎膜(由青岛奶牛基地提供),生理盐水反复冲洗3次,1 g/L氯己定浸泡消毒30 min。在无菌操作下取其羊膜层,剪裁为10 cm×20 cm大小。储存: 用4 g/L戊二醛溶液浸泡20 min, 生理盐水冲洗3次,冲洗后浸泡于1 g/L氯己定溶液中存储,每月更换一次氯己定溶液。在无菌条件下,用1.2 mm注射器针头在牛羊膜上打孔,每平方厘米打3~5个孔,即为有孔牛羊膜。rbbFGF由珠海亿胜生物制药有限公司生产。

  1.3  治疗方法
  
  采用同体对照,将每例病人相同性质的创面等分为3份,分别为治疗组、对照组1、对照组2。1.3.1  治疗组  以有孔牛羊膜联合应用rbbFGF治疗。常规清洁、消毒(PVPI)创面,去除坏死表皮,生理理盐水清洗创面2次,干纱布擦干烧伤创面。创面喷rbbFGF (每1%体表面积5 000 U)。生理盐水清洗有孔牛羊膜2~3次后,用干纱布蘸干,覆盖在喷有rbbFGF的创面上,超出创面边缘1 cm。其外覆盖2~3层无菌PVPI纱布。外层用无菌干纱布包扎,松紧适宜。3 d打开检视,若无感染、疼痛加重等情况,不必更换牛羊膜,用碘附消毒覆盖有牛羊膜的创面,并将rbbFGF喷于有孔牛羊膜表面;若有明显感染,创面渗出液过多,处理后原位更换牛羊膜,用上述方法处理创面再重新包扎。

  1.3.2  对照组1 

  以牛羊膜联合应用rbbFGF治疗。消毒方法和rbbFGF应用同治疗组。创面用牛羊膜贴敷,其外覆盖2~3层无菌PVPI纱布,外层用无菌干纱布包扎。3 d打开检视,若创面渗出多,形成膜下积液,处理后原位更换敷料,用上述方法处理创面再重新包扎。

  1.3.3  对照组2 

  以凡士林油纱布联合应用rbbFGF治疗。消毒方法与rbbFGF应用同治疗组。创面用凡士林纱布贴敷,其外覆盖2~3层无菌碘附纱布,外层用无菌干纱布包扎。3 d打开检视,若创面渗出多,形成膜下积液,处理后原位更换敷料,用上述方法处理创面再重新包扎。

  1.4  观察指标
   
  ①创面外观:创面渗出、水肿和炎症反应。②创面局部感染:行创面细菌培养,观察有无感染。③换药时创面疼痛情况。④肉眼观察创面开始出现上皮组织及创面愈合时间。⑤对于需要手术的深Ⅱ度烧伤创面,在手术过程中分别取治疗组和对照组1、对照组2创面组织做病理切片观察并对比愈合情况。

  1.5  统计处理
   
  所有数据均采用SPSS与PPMS 1.5[1]统计软件进行统计处理,组间比较采用方差分析。

  2  结果

  2.1  创面愈合时间
   
  治疗组与对照组1和对照组2相比较,以深Ⅱ度烧伤创面为主的病人的创面愈合时间明显缩短(F=25.36,q=7.25、3.46,P<0.01);在治疗以浅Ⅱ度烧伤创面为主的病人过程中,治疗组与对照组2相比创面愈合时间明显缩短(F=12.29,q=5.21,P<0.01),而与对照组1相比则没有明显差别(q=2.60,P>0.05)。见表1。 表1  浅Ⅱ度和深Ⅱ度创面愈合时间比较(略)

  2.2  辅助检查
   
  病人在治疗过程中未发现皮疹及其他不良反应。病人在治疗前后血、尿常规及肝、肾功能检查均未见异常。

  2.3  创面局部感染情况
   
  病人在治疗过程中,治疗组创面渗出较少并能得到有效引流,均未见明显局部炎性反应征象。对照组1和对照组2中,浅Ⅱ度创面渗出较少,均未见明显局部炎性反应征象;深Ⅱ度创面渗出较多,部分创面有轻度局部炎性反应征象。创面细菌培养,各组均未见致病菌。

  2.4  换药时创面疼痛情况
   
  治疗过程中,治疗组牛羊膜贴附良好,更换敷料次数明显少于对照组1和对照组2,从而很大程度上减轻了病人的疼痛。治疗组换药时病人脉率变化不大,疼痛明显轻于对照组1和对照组2。

  3  讨论
   
  羊膜作为一种重要的生物敷料覆盖烧伤创面,对加速创面愈合起到了重要的作用。与人羊膜相比,牛羊膜单张面积约6 000~ 7 000 cm2,为人羊膜的6倍左右。厚度15 μm,约为人羊膜的2倍。韧性强于人羊膜,随意性好,而且取材更易,制备简便,成本低廉。羊膜同皮肤一样,也由外胚层生成,为半透明膜,具有独特结构,无血管基质及厚基底膜,含胶原、糖蛋白、蛋白多糖等多种成分,并可表达多种生长因子mRNA 及相关蛋白,有利于细胞生长繁殖,是细胞良好载体[2]。RAVISHANKER等[3]强调了在某些发展中国家的医院建立“羊膜库”的重要性。羊膜具有许多酶参与甾体激素代谢,减轻创面水肿,分娩后羊膜还保留这些功能。早期使用羊膜,宿主吞噬细胞则能更有效地杀死细菌,又能使创面内细胞坏死降解产物激活巨噬细胞系统、成纤维细胞系统[4]。 在扫描电镜下观察牛羊膜的孔隙平均直径小于1 μm, 所以当烧伤创面分泌物渗出较多时,普通牛羊膜并不能使创面分泌物或渗出液中分子质量大的物质有效引流,有加重感染的危险,并且限制了外用药的使用。而有孔牛羊膜覆盖烧伤创面以后,能有效地保护创面,使浅表的感觉神经末梢得到良好的保护,同时,微孔既有利于创面渗出液的引流,又有利于使用外用药物rbbFGF,从而既减少了换药次数又减轻了因换药引起的疼痛和对新生上皮的损伤,使病人疼痛明显减轻,进一步加速创面愈合。
   
  rbbFGF 可显著缩短各种创面愈合时间, 提高创面的愈合质量, 实验已证实, 成纤维细胞生长因子是体内广泛存在的一类活性多肽, 对各种组织来源的细胞有促分裂与生长维持作用,对创面有明显的促修复作用。其能促进毛细血管再生, 改善局部血运循环, 加速创面愈合, 并为早期植皮修复创面创造条件[5]。 齐鲁医学杂志2010年8月第25卷第4期  Med J Qilu, August 2010, Vol.25, No.4
   
  烧伤创面以损伤最严重区域为中心分为组织坏死带、血液循环淤滞带和充血带。组织坏死带损伤是不可逆损伤;充血带组织多能自行修复;血液循环淤滞带组织处于中间生态,其发展方向决定着创面的转归,其内微循环血栓形成是创面向坏死方向转化的重要因素。若能改善局部血液循环,阻止血栓形成,可减轻局部继发损害,有利于创面愈合[6]。
   
  烧伤后1周内,中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞逐步增加,前两者可溶解、吞噬坏死组织[7]。2周后大部分坏死组织被溶解,但免疫细胞仍然大量存在,其作用可能从以分解坏死组织为主,逐渐转向调节表皮细胞、成纤维细胞、毛细血管内皮细胞等分裂增殖、细胞外基质合成等愈合反应为主。对于需要手术的深Ⅱ度烧伤创面,在手术过程中分别取烧伤创面组织做病理切片观察并对比各组的愈合情况,发现治疗组烧伤创面组织中上皮细胞数量明显多于对照组1和对照组2。
   
  综上所述,在治疗烧伤过程中,有孔牛羊膜覆盖烧伤创面和rbbFGF的有机结合,充分发挥了各自的功能,是一种治疗浅Ⅱ度和深Ⅱ度烧伤创面效果较好的方式。

【参考文献】
    [1] 周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):92.

  [2] 朱志军,徐国士, 赵静,等. 牛羊膜在烧伤创面的临床应用研究[J]. 中国修复重建外科杂志, 2006,20(7):735738.

  [3] RAVISHANKER R, BATH A S, ROY R. “Amnion Bank”——the use of long term glycerol preservel amniotic membranes in the management of superficial and superficial partial thickness burns[J]. Burns, 2003,29(4):369374.

  [4] 刘湘梅. 神经生长的生物学与病理学[M]. 北京:科学出版社, 1985:154.
 
  [5] 曾雪琴,王达利,祁建平. 优拓敷料及贝复济在烧(创) 伤创面的应用体会[J]. 遵义医学院学报, 2007,30(2):162.

  [6] 胡骁骅,孙永华,陈忠,等. 巴曲霉对深Ⅱ度烫伤创面微循环血流变化及愈合的影响[J]. 中华烧伤杂志, 2000,16:241243.

  [7] KOVALCHIN J T, WANG R, WAGH M S, et al. In vivo delivery of heat shock protein 70 accelerates wound healing by upregulating macrophagemediated phagocytosis[J]. Wound Repair Regen, 2006,14(2):129137.

日期:2011年6月30日 - 来自[2010年第25卷第4期]栏目

碱性成纤维细胞生长因子及内皮细胞生长因子对兔韧带细胞增殖的影响

【摘要】  目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF)对内侧副韧带(MCL)和前十字韧带(ACL)细胞增殖行为的影响。方法 培养10周龄新西兰白兔内侧副韧带和前十字韧带细胞,在培养液中分别加入bFGF和ECGF,以XTT方法测定细胞的增殖行为。 结果 bFGF在1 ng/ml时即对MCL细胞有显著的促增殖作用,5 ng/ml时开始对ACL细胞有促进作用,其浓度达50 ng/ml时,对两种细胞的促进作用最大。ECGF在3.125 ng/ml时即对MCL细胞有显著的促增殖作用,其浓度达12.5 ng/ml时对ACL细胞有促进作用。bFGF和ECGF在超过其最佳作用浓度后,随浓度升高促进作用不再增强。结论 bFGF和 ECGF可以促进韧带细胞增殖进而促进韧带创伤愈合。

【关键词】  碱性成纤维细胞生长因子;内皮细胞生长因子;韧带;细胞增殖

The influence of basic fibroblast growth factor and endothelial cell growth factor on the proliferation of ligamentous cells

  LI Xianrang1 CHEN Honghui2

  1 Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2 Guangzhou Red Cross Hospital

  【Abstract】 Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) and endothelial cell growth factor (ECGF) on the proliferation of the cells from medial collateral ligament (MCL) and anterior cruciate ligament (ACL).Medthods The MCL and ACL cells of tenweekold skeletally immature New Zealand white rabbit were cultured, while bFGF and ECGF were added to the cell culture media, the cellular proliferation was assayed by XTT method.Results The addition of 1 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of MCL cells significantly, 5 ng/ml bFGF enhanced the proliferation of ACL cells ,this enhancement of proliferation of both MCL cells and ACL cells was maximal in the concentration of 50 ng/ml. The adition of 3.125 ng/ml ECGF enhanced the proliferation of MCL cells significantly, 12.5 ng/ml ECGF enhanced the proliferation of ACL cells.The efficacy of bFGF and ECGF declined gradually when they present at concentrations greater than the dose with the greatest efficacy.Conlusion It is evident that bFGF and ECGF can enhance the proliferation of the ligamentous cells and they can enhance the healing of ligamentous issue injuries.

  【Key words】 bFGF, ligament,proliferation,ECGF

  韧带损伤是膝部的常见运动创伤,尤以内侧副韧带(medial collateral ligament,MCL)和前十字韧带(anterior cruciate ligament,ACL)多见,MCL和ACL是维持膝关节稳定的重要韧带,其损伤可使膝关节丧失稳定性,引起功能障碍,甚至导致骨关节炎[21]。在中央实质部完全断裂后,MCL可自然愈合,有时不需手术介入;而ACL损伤后,即使手术缝合断端,其愈合率也较低。韧带损伤后的愈合过程与一般结缔组织相似,都经过急性炎症期、修复再生期和重塑或成熟期三个阶段[2]。研究表明[3],在损伤韧带的局部存在着多种生长因子,它们被认为是韧带正常愈合过程的重要调节者。使用生长因子促进韧带愈合是近年来研究的焦点之一。作者通过体外培养MCL和ACL细胞,分别加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和内皮细胞生长因子(ECGF),以观察bFGF和ECGF对韧带细胞增殖的影响,为应用bFGF和ECGF促进韧带创伤愈合提供依据。

  1 材料与方法

  1.1 主要试剂 bFGF(暨南大学生物医学工程研究所惠赠),ECGF(Sigma公司产品,美国),DMEM培养基及胰蛋白酶(Gibco公司产品),胶原酶Ⅱ、XTT(Sigama公司,美国),胎牛血清(杭州四季青生物有限公司),酶标仪(日本Reader)。

  1.2 内侧副韧带和前十字韧带成纤维细胞培养 无菌切取兔龄10周新西兰白兔MCL和ACL,在含100 μg/ml PG和100 μg/ml SM双抗Hank's液中剔除滑膜等外周组织,以眼科剪剪成1 mm3左右的碎片。配制0.25%的胶原酶Ⅱ,将韧带组织移至胶原酶液中,37℃条件下消化1~2 h,组织消化后,无血清DMEM培养液冲洗,离心,以含15%胎牛血清的DMEM培养液悬浮细胞,接种于一次性塑料培养瓶(Corning公司,美国)中,置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养。每3 d换液一次,待细胞汇合后,以胰蛋白酶消化传代。

  1.3 XTT法测定韧带细胞增殖 收获第2~5代的MCL和ACL细胞,以5×103/孔的浓度,接种于96孔培养板上,待细胞贴壁后,分别加入1、5、10、50、100及500 ng/ml的bFGF和3.125、6.25、12.5、25、50及100 ng/ml的ECGF。对照组不加bFGF和ECGF。每组四个复孔。CO2培养箱内培养,每天观察一次。培养3 d后,每孔加入50 μl XTT(1 mg/ml)。在37℃、5%CO2培养箱内继续孵育,3 h后,在酶标仪上比色(参考波长650 nm,测量波长450 nm),读取OD值。

  1.4 统计学处理 实验所得数据以SPSS11.0统计软件进行分析,用方差分析和Dunnett法检验,α=0.05。

  2 结果

  2.1 膝关节韧带细胞培养 膝关节韧带细胞贴壁时间约5~6 d,体外培养条件下,ACL细胞的增殖速度明显慢于MCL细胞;ACL细胞原代生长约需13~15 d,MCL细胞原代生长约需11~13 d。1∶2传代的细胞不超过6代时,基本上能在5~7 d内汇合成单层。ACL与MCL细胞贴壁生长,形态呈梭形,与典型的成纤维细胞形态相似(图1、2)。

  图1 原代培养兔ACL细胞(×100) 图2 原代培养兔MCL细胞(×100)

  2.2 bFGF对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表1可见,MCL和ACL各实验组OD值均大于对照组,经统计学检验,ACL各组OD值方差分析,F=28.02,P<0.01;各实验组与对照组比较,1 ng/ml组P>0.05,≥5 ng/ml各组P均<0.01。MCL各组OD值方差分析,F=90.66,P<0.01;各实验组与对照组比较均为P<0.01。表明bFGF对MCL和ACL细胞的增殖均有促进作用。1 ng/ml bFGF 即可促进MCL细胞生长,5 ng/ml bFGF 即可促进ACL细胞生长。bFGF浓度高至50 ng/ml时,其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后,随浓度升高促进作用不再增强(P>0.05)。

  2.3 ECGF对兔韧带成纤维细胞增殖的影响 表2可见,MCL和ACL各实验组OD值均大于对照组,经统计学检验,ACL各组OD值方差分析,F=3.82,P=0.01;各实验组与对照组比较,≥12.5 ng/ml各组P值均<0.05。MCL各组OD值方差分析,F=136.06,P<0.01;各实验组与对照组比较均为P<0.01。表明ECGF 对MCL和ACL细胞的增殖均有促进作用。3.125 ng/ml ECGF 即可显著促进MCL细胞生长,浓度在12.5 ng/ml时,其促进作用达到最大值;超过其最佳作用浓度后,随浓度升高促进作用不再增强(P>0.05)。 表1 bFGF对兔韧带细胞增殖的影响表2 ECGF对兔韧带细胞增殖的影响

  3 讨论

  bFGF和ECGF是一些具有生物活性的多肽,具有趋化性、促有丝分裂和促进胞外基质合成的作用。它们可与细胞表面特异性受体结合,产生第二信使;第二信使可使细胞核根据特定的基因诱导或抑制基因组DNA向mRNA的转录,改变某些蛋白质的水平,进而促进DNA的复制和有丝分裂。

  有研究表明[4,5],在韧带损伤的前两周内内源性生长因子的量和生长因子受体数目是增多的。用RTPCR技术在分子水平揭示生长因子及其受体的mRNA转录增加,故在韧带损伤的早期生长因子合成增加[3]。同样在韧带的创伤愈合过程中,存在bFGF的调节作用[6]。组织学观察证实,在韧带修复过程中成纤维细胞的增殖是第一步[7]。Schmidt等[6]报道bFGF在某一浓度范围内均可促进MCL和ACL细胞的DNA合成。Scherping等[8]报道应用大剂量的bFGF,对ACL成纤维细胞的增殖有很强的促进作用。张堂德等[9]报道,ECGF能够同时促进内皮细胞和成纤维细胞分裂、增殖,他们的研究同时表明,ECGF对内皮细胞及成纤维细胞的作用有一个最适浓度,高于或低于最适浓度,细胞的增殖能力均会降低。笔者通过培养膝关节韧带成纤维细胞,分析了外源性bFGF、ECGF对韧带成纤维细胞增殖的影响,实验表明bFGF和ECGF对兔MCL和ACL细胞具有明显的促有丝分裂活性;在某一浓度范围内对细胞增殖的影响与因子的浓度有依赖性,超过其最佳作用浓度后,增加因子的浓度,细胞增殖不再增加。以上证实bFGF、ECGF可以促进韧带成纤维细胞增殖。bFGF和ECGF对韧带细胞作用的量效关系和峰值浓度不一致,可能与MCL和ACL细胞的不同生物学特性有关。生长因子的双相性可能与肽链受体之间的亲和力有关,少量的细胞因子可在细胞膜上结合高亲和力的受体,产生链式反应,如细胞增生及合成蛋白质;而大量的细胞因子会结合更多低亲和力的受体,不能产生新的细胞甚至起相反的作用[10]。 由于韧带损伤局部存在多种生长因子,生长因子之间的相互作用还需进一步探讨。

  近年来,随着组织工程学研究的兴起,研究人员尝试将膝关节韧带细胞与其它材料结合起来,制成具有生物活性的人工韧带。而在这种活性材料中,细胞的增殖将是十分关键的问题。如何将生长因子如bFGF、ECGF等与这些材料结合起来,也将是研究者感兴趣的问题。因而将bFGF、ECGF等应用于韧带组织工程学中,以修复韧带损伤的应用前景也将是十分广阔的。

【参考文献】
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作者单位:1 滨州医学院附属医院关节外科 滨州市 256603;2 暨南大学附属广州市红十字会医院骨外科

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第32卷第4期]栏目
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介入治疗对胰腺癌患者血清bFGF、ColⅣ、HA的影响

【摘要】  目的 探讨胰腺癌患者介入治疗前后血清碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)和透明质酸(HA)的变化及其临床意义。 方法 分别采用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)和放射免疫法测定55例中晚期胰腺癌患者行动脉栓塞化疗术治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA的含量,并与健康对照组比较分析。 结果 胰腺癌组介入治疗前bFGF、ColⅣ和HA均增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);行化疗栓塞术后,患者血清bFGF、ColⅣ和HA的含量均降低(P<0.05);应用免疫调节剂组较未用组血清bFGF、ColⅣ和HA的含量下降更显著。 结论 检测胰腺癌患者血清bFGF、ColⅣ和HA的含量的水平,有助于了解肿瘤的浸润转移和病程,介入治疗能抑制肿瘤的浸润转移,辅以合理的过继免疫治疗能增强这种作用。

【关键词】  胰腺癌;介入治疗; sTNFR-1;T淋巴细胞;rDNA转录活性

胰腺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一,由于其发病隐匿,临床上得以诊断时常常失去了手术治疗的机会。现代肿瘤学认为肿瘤新生血管的形成和浸润转移是恶性肿瘤病人致死的主要原因,研究发现碱性纤维母细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-basic,bFGF)与肿瘤血管的形成有关[1],而癌细胞在浸润转移时必须穿破基底膜,作为基底膜的主要成分的Ⅳ型胶原(ColⅣ)和透明质酸(HA)也有研究表明在肿瘤患者血清中有升高[2,3]。目前动脉化疗栓塞术(介入治疗)已成为治疗中晚期胰腺癌患者的首选方法[4],它能够有效地杀灭肿瘤细胞,在一定时间内控制肿瘤的生长,延长患者的生命。我们检测55例中晚期胰腺癌患者行介入治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA的含量,并结合临床资料探讨其意义。

  1  材料与方法

  1.1  临床材料  55例胰腺癌患者为我院2005年11月~2007年8月收住的患者,术前未进行放、化疗,男40例,女15例,年龄40~65岁,平均(50.8±4.9)岁。其中胰头癌28例 ,胰体癌12例,胰尾癌15例。按国际抗癌联盟胰腺癌TNM分期:Ⅲ期35例,Ⅳ期20例,介入治疗前均作肝、胆、胰、脾肾、腹腔淋巴结等的B超、CT或MRI等影像学检查,以了解病变大小、范围、侵犯邻近器官情况和毗邻关系。另取健康查体人员30例作为对照组。

  1.2  方法

  1.2.1  治疗方法  采用Seldinger技术股动脉穿刺插管,腹腔干动脉或肠系膜上动脉造影后超选择插管,对胰头部肿瘤选用肝动脉化疗栓塞;对胰体部肿瘤选用腹腔动脉化疗栓塞;对胰尾部肿瘤选用脾动脉化疗栓塞。常规用药为表阿霉素20~40mg、丝裂霉素10~20mg、卡铂100~200mg、5-氟脲嘧啶1 000mg。经导管灌注化疗后约30min后用超液化碘油10~20ml与适量化疗药物混悬成乳剂,行供血动脉栓塞,一般以透视下肿瘤区碘油沉积满意为止。每4~6wk为1个疗程,55例患者共行介入治疗146次,平均2.65次,其中39例在行介入治疗前后应用人重组白细胞介素-2(r-IL-2)和人重组干扰素(r-IF)等免疫调节因子。一般r-IL-2为5~10万单位,隔日1次肌注;r-IF50万单位,每周2次皮下注射。两种免疫制剂均应用4周,另外16例未用。

  1.2.2  观察指标  分别在介入治疗术前3d和术后2wk凌晨抽取患者静脉血5ml,离心取血清置-20℃冰箱保存待测。采用双抗体夹心ELISA检测法测定bFGF,所用抗bFGF免疫酶标试剂盒为美国R & D公司产品、ColⅣ、HA放射免疫试剂盒购于上海海军医学研究所,所有检测均严格按试剂盒说明书操作。

  1.2.3  统计学处理  计量资料用“x±SD”表示,采用两样本均数的t检验或介入治疗前后配对设计t检验分析处理。

  2  结果

  2.1  胰腺癌患者介入治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA的观察,由表1可见患者介入治疗术前血清bFGF、ColⅣ和HA水平均明显高于正常对照组(P<0.05),经介入治疗后bFGF、ColⅣ和HA水平均明显低于治疗前(P<0.05)。

  表1  胰腺癌介入治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平比较(略)

  注:与对照组比较,P<0.05;与治疗前比较,#P<0.05。

  2.2  使用免疫调节剂组与未使用组介入治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平比较  由表2可见,使用免疫调节剂组较未使用组血清bFGF、ColⅣ和HA降低更明显(P<0.05)。

  表2  用与不用免疫调节剂对血清bFGF、ColⅣ和HA水平的影响(略)

  注:与治疗前比较,P<0.05;与使用免疫调节剂组比较,#P<0.05。

  3  讨论
   
  实体瘤生长和转移依赖于新生血管的生成,而血管的形成受到多种促进因子和抑制因子的调节,bFGF与血管内皮生长因子(Vascular endothelia growth factor, VEGF)是两个重要的促进血管长成的因子,与肿瘤尤其是实体瘤的关系尤为密切。bFGF是由146个氨基酸组成分子量为18KD的碱性蛋白质,它具有促进源自中胚层和神经内胚层细胞有丝分裂的活性,可促进内皮细胞,与许多肿瘤的血管生成有关,研究已发现包括乳腺癌.肺癌及胃肠道肿瘤患者血清中bFGF增高,且与肿瘤的恶性程度.浸润转移及预后密切相关[1,5]。对于肿瘤患者血清中bFGF水平增高的原因,目前认为一方面是由于肿瘤生长到一定时间和程度时,肿瘤细胞坏死或死亡,bFGF从肿瘤细胞中释放到血清中;另一方面则是肿瘤细胞的旁分泌因子的作用[6]。
   
  浸润和转移是恶性肿瘤病人死亡的主要原因之一,癌细胞在向外周转移时必须穿破基底膜,ColⅣ和HA是基底膜的主要成分,对ColⅣ和HA破坏是肿瘤细胞浸润转移的基础。肿瘤细胞几乎不产生ColⅣ,癌基质细胞产生的ColⅣ比正常基质细胞产生也明显减少,肿瘤细胞通过分泌大量ColⅣ酶,协同尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-type plasminogen activator uPA)等共同作用,从而破坏基底膜的结构[7,8]。HA系N-酰糖胺与D-葡萄糖醛酸组成的粘多糖,主要分布于结缔组织,并与胶原结构蛋白、蛋白聚糖等构成基底膜的主要成分,在许多发育和调控过程如细胞粘附、创伤愈合、肿瘤发生及血管形成中起重要作用。导致肿瘤患者血清中HA增高的原因目前认为有肿瘤细胞的直接产生、肿瘤细胞浸润周围结缔组织、HA酶抑制物的大量堆积等。已有的研究报告显示,肿瘤患者特别是实体瘤患者血清中ColⅣ和HA均升高,且与肿瘤的恶性程度、浸润转移、治疗效果及患者的预后存在明确的相关性[9,10]。
   
  本文检测了45例中晚期胰腺癌患者接受介入治疗前后血清bFGF、ColⅣ和HA水平变化,结果显示,胰腺癌组治疗前血清bFGF、ColⅣ和HA水平均增高,与对照组比较有显著性差异(P<0.05);行介入治疗后,患者血清血清bFGF、ColⅣ和HA水平降低,治疗前后有明显的差异(P<0.05)。说明介入治疗作为有效的治疗手段降低了肿瘤患者的肿瘤负荷,部分解除了肿瘤对机体的浸润及血管生成影响,不失为一种有效的胰腺癌治疗措施。
   
  研究还观察到,对39例应用免疫调节因子患者较16例未用患者接受介入治疗后血清bFGF、ColⅣ和HA水平降低更显著(P<0.05),提示应用免疫调节因子除了对改善肿瘤患者的免疫功能有重要作用外,对于抑制肿瘤对机体的浸润及血管生成也有重要的影响。因此,在肿瘤治疗中有必要尽早选择适当的过继免疫疗法,以提高和改善患者免疫功能,并调动机体自身抗肿瘤浸润和转移作用,以进一步提高胰腺癌患者介入治疗的疗效。
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                             

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作者单位:解放军第三零三医院191临床部放射科,广西 贵港 537105; 解放军第421医院消化科,广东 广州 515005.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第5期]栏目

非创伤性股骨头坏死股骨头局部bFGF与BMP-2 mRNA表达的研究

【摘要】  [目的]探讨非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head ,NONFH)股骨头局部碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenic proteins,BMP-2)表达的变化情况及其意义。[方法]收集经全髋关节置换术取下的NONFH的股骨头标本30例作为实验组,新鲜股骨颈骨折标本10例作为对照组。于坏死区、健存区取材,经固定、脱钙后,制成切片,光镜观察其病理变化,并运用原位杂交技术分别对其bFGF与BMP-2的表达情况进行检测。[结果]实验组组织结构紊乱,破碎,骨小梁稀疏、不完整,有大量的空骨陷窝,而对照组骨小梁相对较完整、排列整齐,骨小梁中的骨细胞清晰可见,偶见空骨陷窝。实验组中bFGF与BMP-2的阳性表达强度及面积均明显低于对照组,结果有统计学意义(P<0.05)。[结论]NONFH股骨头局部bFGF与BMP-2表达的降低,极有可能是导致其自身修复能力不足的重要原因。增加股骨头局部bFGF与BMP-2的表达可能有助于股骨头缺血坏死的修复。

【关键词】  非创伤性股骨头坏死; 碱性成纤维细胞生长因子; 骨形态发生蛋白-2; 表达

Expression of bFGF and BMP-2mRNA of the local femoral head in nontraumatic osteonecrosis of femoral head∥NIU Dong-sheng,BAI Zhi-gang,WANG Wei-jun,et al.Orthopedic Department,Ningxia People’s Hospital ,Yinchuan 750021, China

  Abstract: [Objective]To explore the change and its significance of the expression of basic fibroblastic growth factor (bFGF) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) of the local femoral head in nontraumatic osteonecrosis(NONFH). [Methods]Thirty samples of femoral heads of NONFH were collected as the experimental group and 10 fresh samples of femoral heads of femoral neck fracture as control group. The specimens were collected at the time of total articular replacement arthroplasty. The bone tissues from necrosis area and healthy area were made into general sections after immobility and decalcification. Pathological changes were exexamined by optical microscopy and the expression of bFGF and BMP-2 in femoral head was determined with in-situ hybridization technique.[Results]The organization structure of experimental group was disorganized, cracked,and the bone trabecula was rarefactive and non-intact . There were a great number of empty lacune in bone trabecula. The intensity and area of positive expression of bFGF and BMP-2 in femoral head of the experimental group were obviously lower than that of control group. The result had statistical significance(P<0.05).[Conclusion]The decreased expression of bFGF and BMP-2 in femoral head of NONFH may be reason for insufficient repair function.

  Key words:nontraumatic osteonecrosis of femoral head; basic fibroblastic growth factor; bone morphogenetic protein-2; expression

  非创伤性股骨头坏死(nontraumatic osteonecrosis of femoral head ,NONFH)是临床上常见的骨科疾病,其常用的治疗方法远期疗效并不理想,至病程晚期多数会出现关节面塌陷而需人工关节置换。股骨头坏死的自行修复能力有限,常遗留软骨下骨坏死不能修复[1、2],而造成这种现象的确切原因尚不明确。股骨头坏死区的血管再生及新骨形成,是其病理逆转的重要因素之一,也是治疗股骨头坏死的关键[2]。Mont等[3]提出应用细胞因子治疗股骨头坏死具有广阔的前景,bFGF和BMP-2是近年来研究较深入的两种生长因子。本文通过对NONFH人体股骨头标本中bFGF与BMP-2表达的研究,探讨影响股骨头局部骨形成、骨修复的原因,为临床防治提供新的思路与理论依据。

  1 资料和方法

  1.1 一般资料 股骨头标本均来源于全髋关节置换术。实验组30例,男性21例,女性9例;年龄38~77岁,平均(55.3±9.6)岁,Ficat分期,Ⅲ期13例,Ⅳ期17例;其中,服用激素者16例,酗酒者10例,原因不明者4例。对照组10例均为新鲜股骨颈骨折标本(伤后3 d内手术),男性7例,女性3例;年龄41~80岁,平均(58.5±11.2)岁;且排除风湿、类风湿、心血管及免疫系统等疾病,并无烟酒嗜好及服用激素史。

  1.2 主要试剂 bFGF原位杂交检测试剂盒(MK1054),BMP-2原位杂交检测试剂盒(MK1782-h),DAB显色试剂盒等(均由武汉博士德生物工程有限公司提供)。其中,bFGF所包含的mRNA探针为:

  ①5’-GGCTT CTTCC TGCGC ATCCA CCCCG ACGGC-3’;

  ②5’-AGCAG AAGAG AGAGG AGTTG TGTCT ATCAA-3’;

  ③5’-TGGAA TCTAA TAACT ACAAT ACTTA CCGGT-3’。

  BMP-2所包含的mRNA探针为:

  ①5’-AGCAT GTTCG GCCTG AAACA GAGAC CCACC CCCAG-3’;

  ②5’-GCACC AAGAT GAACA CAGCT GGTCA CAGAT AAGGC-3’。

  1.3 标本制作 将股骨头沿冠状面对半剖开,于坏死区(包括负重区关节软骨及软骨下坏死区域)、健存区(包括坏死区以远硬化带及髓心部分)各凿取一块约1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块,所有标本经固定、脱钙后,常规石蜡包埋、切片,厚度为5 μm。

  1.4 光镜观察 HE染色后,在高倍光学显微镜(100及400倍)下观察其组织病理学变化。

  1.5 原位杂交测定bFGF mRNA与BMP-2mRNA 实验步骤严格按照说明书操作。以胞浆出现棕黄色颗粒为阳性表达,以PBS代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取5个骨小梁视野和5个髓腔内视野,以IPP(Image-Pro Plus 5.1)图像分析软件及Smartscape 2002生物显微图像分析软件测定其阳性染色面积占整个视野面积的百分比和平均灰度值,取算数平均数作为每张切片的平均染色面积百分比和平均灰度值,前者代表bFGF mRNA或BMP-2 mRNA分布面积的大小,后者代表单位面积内bFGF mRNA或BMP-2 mRNA的含量。

  1.6 统计方法 数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 11.5软件统计分析,两组数据间采用两独立样本t检验及直线相关检验。r为相关系数,-1≤r≤+1 表示两变量呈直线相关关系,r为正数表示正相关,r为负数表示负正相关。P<0.05有统计学意义。

  2 结果

  2.1 组织形态学观察

  2.1.1 大体改变

  对照组:肉眼观股骨头球形外观存在,关节表面完整、光滑;剖面见关节软骨厚度均匀一致,软骨下骨小梁清晰可见。

  实验组:肉眼观股骨头形态不规则,关节面凹凸不平,股骨头负重区有面积不等的软骨剥脱、缺失,部分标本负重区塌陷;剖面见关节软骨薄厚不均,负重区可见软骨剥脱及塌陷,软骨下可见囊性变区,内为类肉芽样组织,其下为硬化带。

  2.1.2 光镜改变

  对照组:软骨结构较完整,骨小梁粗大、密集、排列整齐,软骨细胞及骨细胞清晰可见,核大,位于中央,偶可见空骨陷窝,可见形态正常的黄骨髓(图1)。

  实验组:关节软骨脱落、碎裂,空骨陷窝多见;软骨下为坏死区,骨小梁稀疏、变细、破碎明显;可见到坏死骨被纤维组织所包裹、取代,破骨细胞散在其间;坏死区无明显血管再生及骨修复。骨髓组织坏死明显,髓腔内脂肪细胞明显增生、肥大(图2)。

  2.2 原位杂交技术检测bFGF mRNA的表达 两组切片均可见到阳性表达,在纤维细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、破骨细胞、间质细胞等细胞中均有表达,骨细胞中则无明显表达。其中,实验组阳性表达的强度及面积百分比要明显低于对照组,结果有统计学意义(P<0.05)(见表1,图3~6)。

  表1 bFGF mRNA阳性表达平均灰度值与面积百分比(x-±s)组别n平均灰度值(%)面积百分比(%)对照组1048.43±4.9623.99±6.43实验组3075.20±7.238.06±3.54 t’值-10.8537.475P值0.0000.0002.3 原位杂交技术检测BMP-2 mRNA的表达 两组切片均可见到阳性表达,在软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、纤维细胞及间质细胞中均有表达,在骨细胞中很少表达。实验组阳性表达的强度及面积百分比要明显低于对照组,结果有统计学意义(P<0.05)(见表2,图7~10)。

  表2 BMP-2mRNA阳性表达平均灰度值与面积百分比(x-±s)组别n平均灰度值(%)面积百分比(%)对照组1052.35±5.3820.78±5.41实验组3078.31±6.756.83±3.13t’值-11.0187.734P值0.0000.0002.4 bFGF与BMP-2表达的相关性分析

  将实验组与对照组bFGF与BMP-2表达的平均灰度值做直线相关检验,结果表明二者呈正的直线相关关系,相关系数r为0.741,P<0.01。 图1对照组关节软骨及软骨下骨小梁较完整(×100) 图2实验组关节软骨表层脱落、碎裂,软骨下骨小梁坏死(×100) 图3对照组bFGFmRNA在软骨细胞中的表达较强(×100) 图4实验组bFGFmRNA在软骨细胞中的表达较弱(×100) 图5对照组bFGFmRNA在纤维细胞及血管内皮细胞中的表达较强(×100) 图6实验组bFGFmRNA在纤维细胞及血管内皮细胞中的表达较弱(×100) 图7对照组BMP-2 mRNA在软骨细胞及成骨细胞中表达较强(×100) 图8实验组BMP-2 mRNA在软骨细胞及成骨细胞中表达较弱(×100)

  图9对照组BMP-2 mRNA在间质中表达较强(×100) 图10实验组BMP-2 mRNA在间质中表达较弱(×100)

        3 讨论

  本实验中作者发现实验组标本全部出现关节软骨塌陷,软骨下的死骨大都已经被肉芽组织所取代,虽然病程大都在1年以上,但很少能在坏死区见到新骨形成,仅个别病例在纤维组织中有软骨岛形成,充分说明在股骨头发生坏死后,其坏死区的骨修复过程极为缓慢,或基本处于停滞状态,表明NONFH发生后股骨头局部骨修复能力明显不足。

  骨诱导、骨形成是由多种生长因子参与并调节的过程[4],其中,bFGF和BMP是极为重要的生长因子。bFGF可促进骨和软骨细胞蛋白质的合成和分化增殖,加速新骨形成过程;同时bFGF也是一种强大的血管生长因子,可促进血管及新骨形成。bFGF在促进新生血管形成的同时,带来未分化的间充质细胞,从而增强BMP的诱导成骨能力[5、6]。BMP主要成骨作用是诱导间充质细胞分化为成骨细胞和成软骨细胞,具有高效诱导成骨活性[7],其在体内诱导成骨的过程是软骨内成骨过程。研究[8~10]证实激素等致病因素对BMP-2及VEGF的表达有明显的抑制作用,由于其它促血管生成因子的血管生成作用是通过增强VEGF的表达及生成来实现的,VEGF可介导其他因子的作用,抑制 VEGF将阻断 bFGF的成血管活性[11]。由此可以推测股骨头坏死的主要致病因素对bFGF的表达也可能存在明显的抑制作用,其作用途径可能是通过上述致病因素对VEGF及BMP-2的表达抑制来实现的,而这一点有待进一步研究证实。本实验中观察到实验组bFGF及BMP-2的表达较对照组明显减弱,由此我们认为:bFGF与BMP-2在股骨头局部的表达减弱可能是股骨头在发生坏死后局部的骨诱导、骨修复能力不足的重要原因。在NONFH患者中,正是由于致病因素抑制了bFGF及BMP-2的表达,使得bFGF与BMP-2含量降低,最终影响到股骨头的自身修复。如果有方法可以拮抗致病因素的这种抑制作用,进而促进bFGF与BMP-2的表达,很可能有助于股骨头坏死的修复。

  在股骨头缺血坏死中,往往由于其软骨下死骨被肉芽组织填充而载荷能力下降,最终软骨骨折致股骨头负重区塌陷。保留股骨头的治疗要求快速再血管化及重建骨小梁和软骨下骨,bFGF与BMP可以作为治疗因子辅助植骨材料通过刺激成骨、促进关节软骨修复、血管长入等多方面用于治疗股骨头坏死。目前已经有在动物实验中运用bFGF、BMP及VEGF等生长因子治疗股骨头缺血性坏死并取得良好疗效的研究报道[12~15]。由此,我们认为:临床中如果能在ONFH发病早期及时诊断,并通过应用介入、基因转染、手术等方法增加股骨头局部外源性bFGF与BMP-2的浓度,可能会增强股骨头局部自身的修复能力,在股骨头负重区软骨下坏死发生后短期内即由新生骨组织进行修复、替代,软骨下的机械强度得以加强,即可有效地预防软骨的塌陷,也许会成为一种有效的治疗方法。

  有研究发现[17、18],在骨的形成和修复过程中,bFGF与BMP-2的表达相互影响、相互促进,本实验中将bFGF与BMP-2表达的平均灰度值做直线相关检验后结果为正的直线相关,从而证实了这一理论。

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作者单位:1.宁夏回族自治区人民医院骨二科,银川 750021;2.宁夏医科大学,银川 750004

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第15期]栏目
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bFGF在局灶性脑缺血再灌注大鼠肝脏中表达的研究

【摘要】  目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在局灶性脑缺血再灌注大鼠肝脏中的表达及其作用。方法 采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,术后48 h取其肝脏,观察bFGF在肝脏中的表达情况,设假手术组进行对照。结果 模型组大鼠肝脏中可见肝细胞水肿、体积增大,胞浆疏松化,部分肝细胞出现脂肪变性,肝血窦狭窄,门管区炎细胞增多;bFGF表达增高,主要表达在肝小叶中央静脉周围。结论 局灶性脑缺血再灌注后肝脏中bFGF出现上调。

【关键词】  脑缺血再灌注;肝脏;成纤维细胞生长因子;大鼠

 The expression of bFGF in liver  after cerebral ischemia reperfusion in rats

    LI Yanuo1  SUN Yan2   LI Xiaoyan1  et al

    1 Department of Histology and Embryology, Binzhou Medical University, Yantai 264003;

    2 Department of Orthopedic, Yantai Shan Hospital

    【Abstract】   Objective  To explore the expression and effect of the bFGF in liver after focal cerebral ischemia reperfusion in rats.Methods  Focal cerebral ischemia and reperfusion rat model was established with left middle cerebral artery occlusion by using thread inserting. Reperfusion was given to the rats after 2 hours ischemia. After 48 hours of the operation, the samples were taken out and processed for pathological changes of liver tissue by light microscopy. The expression of bFGF was analysed by immunohistochemistry and compared with sham operation. Results  The liver cells in model group were hydropic degeneration. Some of the liver cells occurred fatty changed and inflammatory cells infiltrated of the portal areas. The hepatic sinusoid became narrower than Shamoperated group. The expression of bFGF was higher in model group than that in Shamoperated group.Conclusion  The study indicated that bFGF was upregulated, which possibly could promote liver tissue repair after cerebral ischemia reperfusion.

    【Key words】  cerebral ischemia,reperfusion,liver,bFGF,rats

    组织或器官在一定时间缺血缺氧后会造成损伤,血供恢复后损伤会进一步加重称为缺血再灌注损伤(IRI),其中脑缺血再灌注损伤最为常见。脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程,除导致脑组织病变外,机体多脏器可同时受累,肝脏作为最易受累的器官之一,在临床和实验中受到人们的高度重视,但其机制还不完全清楚[1,2]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种具有肝素结合特性的肽类细胞生长因子,广泛分布于各种正常组织和器官,研究发现脑缺血再灌注后脑组织中bFGF表达增高,对损伤具有一定修复作用,但有关bFGF在脑缺血再灌注后肝组织中的表达,尚未报道[3]。本研究采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,探讨bFGF在脑缺血再灌注大鼠肝脏中的表达及其作用,从而为临床预防和治疗脑缺血再灌注后肝脏损伤提供实验依据。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康雄性Wistar大鼠32只,体质量280~320 g,由山东大学动物中心提供(许可证号:scxk鲁20030004)。

    1.2  主要试剂  抗bFGF单克隆抗体购于CHEMICON公司,PV6001免疫组化检测试剂盒、内源性过氧化物酶阻断剂、DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

    1.3  大鼠MCAO模型的建立  参照Koizumi等[4]线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。取直径为0.2 mm、长5 cm的尼龙渔线,一端近火将其烧成直径为0.24 mm的球形,使之变成规格一致、头端光滑的栓线,在距栓线头端18 mm、28 mm的位置以记号笔标记。使用前依次用75%乙醇、肝素钠注射液浸泡。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1ml/100g)麻醉后,将其仰卧于手术台上,固定四肢及头部,垫高颈部,取颈部正中切口2 cm,显露左侧胸锁乳突肌,钝性分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,结扎颈总动脉近心端,并于此结扎线的上方穿线备用,注意避免损伤迷走神经,再结扎颈外动脉,以动脉夹暂时夹闭颈总动脉分叉处,在距动脉夹约1 cm的近心端剪一“V”形小口,将栓线插入,栓线到达动脉夹处时以备用线将其扎住以免滑脱。向外侧轻拉颈外动脉结扎线,栓线沿内上方角度插入,以便顺利进入颈内动脉,避免误入翼腭动脉。栓线前端到达大脑前动脉处遇阻力时止,提示线已阻塞大脑中动脉,此时所做的第一个标记到达颈外动脉和颈内动脉分叉处,第二个标记到达“V”形切口处。剪断多余的结扎线,缝合切口,缺血2 h后轻拔栓线皮肤外的残端,至有阻力时提示线的头端已至颈外动脉,拔出约0.5 cm,实现再灌注。术中及术后环境温度调节在25~30℃左右,密切注意生命体征。

    1.4  动物筛选  大鼠麻醉清醒后按Longa等[5]5分制方法进行神经功能评分。0分:无神经损伤症状,活动正常;1分:轻微神经功能缺损,不能完全伸展右侧前肢;2分:中度局灶性神经功能缺损,行走时向右侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,行走时向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。其中得分在1~3分者被认为模型制作成功,纳入实验。并设假手术组,仅模拟手术,不阻塞大脑中动脉,每组各10只大鼠。

    1.5  肝组织病理学观察  术后48 h,大鼠以3.5%水合氯醛麻醉后,解剖分离肝脏,生理盐水冲净,浸入4%多聚甲醛溶液中固定12 h,修整组织块,PBS冲洗6 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,5 μm厚度切片,行HE染色,光镜下观察其组织病理学改变。

    1.6  免疫组织化学染色  石蜡切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢溶液37℃ 30 min,蒸馏水冲洗后微波修复;PBS漂洗3次,滴加10%山羊血清封闭液,37℃孵育30 min;滴加兔抗bFGF单克隆抗体(1∶400),4℃孵育过夜;PBS漂洗3次,滴加生物素化羊抗兔IgG(1∶200),37℃孵育30 min;PBS漂洗3次,DAB显色液显色5 min;苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜观察。阴性对照以PBS代替一抗,其余步骤相同。

    2  结果

    2.1  MCAO模型组大鼠生理行为及脑组织变化  MCAO模型组大鼠出现左侧Horner's征阳性(即左侧眼球下陷,眼裂变小),不能伸右前肢;提尾时,右前肢内收屈曲,头弯向右上;右侧肢体肌力下降,严重者行走时向右侧转圈,出现不同程度的运动功能障碍。断头取脑后可见左侧大脑半球水肿明显,经TTC染色,可见左侧大脑顶叶皮层、部分额叶皮层和基底节呈现白色,为梗死部位,其余部位染成鲜红色,假手术组未出现白色梗死灶(见图1、2)。

    2.2  MCAO模型组大鼠肝组织形态学变化  低倍镜下可见模型组和假手术组肝小叶均正常,肝细胞呈条索状,围绕小叶中央静脉放射状排列;MCAO模型组大鼠肝细胞水肿,胞浆疏松化,组织切片染色变浅,同时肝血窦、门管区变窄。高倍镜下可见肝细胞由于水肿而体积增大,形状变圆,边缘模糊略呈气球状,部分细胞胞浆内可见空泡样脂肪变性,同时在肝血窦和门管区可见炎性细胞浸润(见图3、4)。

    2.3  bFGF在MCAO模型组大鼠肝组织中的表达  假手术组大鼠肝组织中bFGF表达较少,仅在肝小叶中央静脉周围部分肝细胞胞浆内出现棕黄色淡染颗粒。模型组大鼠bFGF呈阳性表达,阳性细胞数较假手术组显著增高,肝细胞胞浆内可见棕黄色、粗大颗粒,细胞核及肝血窦内皮细胞亦见有阳性表达;阳性细胞在分布上呈现一定规律,肝小叶中央静脉处较多,向小叶周边呈递减趋势,肝门管区阳性细胞较少或未见阳性表达(见图5、6)。

    3  讨论

    缺血再灌注损伤(IRI)是造成术后肝功能衰竭的重要原因之一,而碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在缺血再灌注肝损伤中的作用并不清楚,相关的报道也较少,于是我们采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,旨在研究bFGF在大鼠局灶性脑缺血再灌注后肝脏损伤中的作用,从而为临床预防和治疗脑缺血再灌注后肝脏损伤提供实验依据。

    3.1  脑缺血再灌注模型的选择  大鼠脑缺血模型是研究脑血管损伤机理和防治措施的常用动物模型。大鼠脑血管的解剖和生理功能与人类相似,而且血管变异小、梗死部位相对容易控制、实验重复性好,能很好地模拟人类急性脑缺血的病理生理过程。大脑中动脉区是人类脑梗死的好发部位,因此大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的理想动物模型[6,7]。线栓法制备局灶性脑缺血再灌注动物模型的机制是依靠栓线的前端阻塞大脑前动脉根部,阻止经大脑前动脉反流的血液;依靠栓线的侧壁阻塞颈内动脉和后交通支的血流,从而使该侧大脑中动脉的血液完全中断,根据研究需要确定缺血时间,拔除栓线可以使血管复通实现再灌注。此法具有不开颅、创伤小、不影响缺血性脑水肿及颅内压病理变化的自然过程,可准确控制缺血及再灌注时间,操作亦较简单等优点[8]。因此,本实验采用此法制备MCAO模型大鼠,能较好地模拟临床疾病。

    3.2  脑缺血再灌注后对肝脏的影响  本实验研究发现,急性局灶性脑缺血再灌注后大鼠肝组织出现损伤,主要表现为肝细胞水肿、体积增大、胞浆疏松化、部分肝细胞胞浆内出现空泡样脂肪变性,肝血窦、门管区变窄,可见大量炎性细胞浸润。肝细胞这些病理变化表明肝细胞处于缺能状态,研究证实是由于肝细胞线粒体发生异常改变导致,质膜上的离子泵失灵,钠水进入肝细胞引起细胞肿胀。肝脏是机体能量代谢的重要器官,具有多种细胞器,其中线粒体是能量的供应站,是氧化磷酸化产生ATP的场所,肝脏损伤时,线粒体的改变最为突出[9]。因此,还需进一步在电镜下研究MCAO模型大鼠肝脏线粒体的改变对肝脏损伤的影响。

    3.3  bFGF在脑缺血再灌注后肝组织中的表达  bFGF在体内分布广泛,具有多种生物学功能,如促血管形成、诱导胚胎发育,参与伤口愈合、组织修复、神经组织生长和再生、动脉粥样硬化的斑块形成等许多病理生理过程,在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着重要作用。在正常肝组织中的bFGF呈弱阳性表达,主要分布于肝细胞及肝窦内皮细胞中,是一种促进细胞有丝分裂的诱导因子,在血管发生中起重要作用[10]。肝纤维化时bFGF主要见于纤维间隔区、门管区、肝窦内皮细胞、肝细胞、纤维母细胞、小胆管及再生肝细胞等,而肝窦内皮细胞、成肌纤维样细胞、血管内皮及平滑肌细胞和肝细胞是bFGF分泌的主要细胞,研究发现,随着肝细胞变性坏死的加重,肝组织bFGF表达明显增强,尤其在炎症坏死区表达较显著[11]。近年来研究表明,bFGF对部分正常细胞具有转化作用,与肿瘤的发生发展及转移有密切关系。原发性肝癌组织中bFGF的表达主要位于胞浆,而且bFGF的表达与原发性肝癌的大小、病理分级、有无包膜、HBsAg及AFP无明显关系。据报道,bFGF在原发性肝癌的浸润和转移中发挥重要作用,提示bFGF与肝癌预后有关[12]。

    本研究显示脑缺血再灌注后大鼠肝组织中bFGF表达量增多,可能对肝脏起到保护组织、刺激细胞增殖分化、调控炎性反应、诱导毛细血管胚芽形成、减轻其水肿程度等,对肝组织损伤的修复起到促进作用,但其机制并不清楚。

    综上所述,大鼠脑局灶性缺血再灌注后肝细胞出现水肿、胞浆疏松化、部分肝细胞出现脂肪变性等改变;肝脏中bFGF的表达有所增高,但机制及其对损伤肝组织的作用还需要进一步研究。

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作者单位:1 滨州医学院组织学与胚胎学教研室 烟台市 264003;2 烟台市烟台山医院骨科

日期:2009年8月25日 - 来自[2008年第31卷第6期]栏目

纤维母细胞生长因子的提纯及抗血清的制备

纤维母细胞生长因子的提纯及抗血清的制备

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 分子与细胞免疫学

作者:孙庆霞 王晓红 弓长丽 付平平 王维忠

单位:孙庆霞(吉林省临床检验中心,长春130021);王晓红(吉林省人民医院检验科,长春130021)弓长丽(吉林省人民医院检验科,长春130021);付平平(白求恩医科大学第三临床学院,长春130031);王维忠(白求恩医科大学第三临床学院,长春130031)

  中国图书分类号 R392.1

  1974年Grospodarowicz从牛垂体中提纯出碱性成纤维母细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)后,其临床意义得到广泛的重视。目前,bFGF被认为是某些恶性肿瘤诊断的一项敏感性指标,具有操作简便、特异性高等优点。为建立bFGF诊断试剂盒,我们将Grospodarowicz的方法稍加改进,从牛脑提取了bFGF,并制备了抗bFGF血清。

  1 材料与方法

  1.1 材料 牛脑购自长春市屠宰厂;肝素-Sepharose、CM-Sephadex C-50购自Pharmacia公司;低分子量标准蛋白购自上海东风生化试剂公司;丙烯酰胺、N、N-亚甲基丙烯酰胺、溴酚兰、过硫酸铵、考马斯亮蓝、十二烷基磺酸钠购自Serva公司。

  1.2 方法

  1.2.1 提纯抗原 先将新鲜牛脑组织匀浆,用硫酸铵分步沉淀蛋白,再进行CM-Sephadex C-50离子交换层析和肝素-Sepharose亲和层析,收集活性组份。

  1.2.2 抗血清的制备 将bFGF抗原分6次免疫雄性新西兰白兔,首次100 μg抗原加福氏完全佐剂,后脚掌皮内多点注射,第2至第6次用100 μg抗原加福氏不完全佐剂,背部皮内多点注射,间隔2w,末次免疫7 d后颈动脉放血,分离血清备用。

  1.2.3 抗原鉴定 将活性组份除盐、浓缩后用12%聚丙烯酰胺凝胶按常规方法进行聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳,以判定等电点,将活性组份用12%聚丙烯酰胺凝胶按常规方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),以测定分子量并鉴定纯度,采用lowry氏法测定蛋白质浓度,蛋白质活性用人脐静脉内皮细胞测定。

  1.2.4 抗体的鉴定 采用免疫双向扩散分析法。

  2 结果

  2.1 牛脑bFGF的鉴定 纯化样品PAGE图经考马斯亮蓝G-50染色显示,所提取的蛋白在上样位置没动,而同时分析的牛血清白蛋白有泳动,因凝胶体系的pH=8.9,可推断所提纯蛋白PI>8.9。

  纯化样品SDS-PAGE图经考马斯亮蓝G-50染色显示,所提取蛋白为2条密切相关的带,分子量分别为16 400、16 000,以16 400组分为主,16 000组分含量很少。

  2.2 抗血清的鉴定 制备的抗血清与提纯的bFGF及基因重组的bFGF反应,形成沉淀线,而与免疫前的兔血清不形成沉淀线。

  3 讨论

  PAGE结果显示:bFGF的PI>8.9,SDS-PAGE结果显示:我们提纯的牛脑bFGF含有2种组分,这和以往的报道基本吻合,但我们提纯的牛脑bFGF以高分子量组分为主,低分子量组分很少,提示两组分子含量差异一部分是原组织中存在的,也有一部分是在提纯过程中引入的。

  bFGF分子量小,抗原性偏低,国外制备多克隆抗体均采用人工合成含前10至20个氨基酸的小肽,再连接到牛血清白蛋白上,增大分子量,借以增加抗原性,我们以提纯bFGF为抗原采用小剂量皮内多点注射法,免疫新西兰白兔,经多次加强,获得了效价适中的抗体,制备的抗血清与提纯的bFGF及基因重组的bFGF反应,形成沉淀线,而与免疫前的兔血清不形成沉淀线,经Westren blot实验证明:与肠癌组织中的bFGF反应特异,效果良好,说明我们制备的抗血清特异性较好。

  作者简介:孙庆霞,女,35岁,硕士,副主任检验师,主要从事临床检验工作

  指导教师:王维忠,男,58岁,教授,博士生导师,从事临床免疫学研究

[收稿1999-11-27 修回s]


日期:2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目
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脑星形细胞瘤中bFGF及其受体对血管新生和肿瘤细胞增殖的影响

脑星形细胞瘤中bFGF及其受体对血管新生和肿瘤细胞增殖的影响

中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 肿瘤免疫学

作者:李艳云 李玉林 张丽红 刘兴吉 杨晓智

单位:李艳云 李玉林 张丽红 白求恩医科大学基础医学院病理科,长春130021;刘兴吉 白求恩医科大学第一临床医学院脑外科,长春 130021;杨晓智 长春市卫生防疫站,长春 130061

关键词:星形细胞瘤;碱性纤维母细胞生长因子;增殖细胞核抗原;免疫组织化学;血管内皮细胞

  中国图书分类号 R361.1

  摘 要 目的:为探讨碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)及其受体(FGFR-2)对人星形细胞瘤的血管新生及细胞增殖的作用。方法:采用免疫组织化学方法。结果:发现bFGF及其受体,增殖细胞核抗原(PCNA)在瘤细胞及血管内皮细胞中均有表达,高级别星形细胞瘤的表达阳性率高于低级别者。bFGF在瘤细胞中的表达阳性率分别与FGFR-2及PCNA的表达阳性率呈正相关关系(P<0.01,P<0.05)。bFGF及其受体在血管内皮细胞中的表达阳性率与血管密度呈正相关关系(P<0.01)。结论:初步揭示了bFGF促进肿瘤内血管新生及对瘤细胞恶性增殖的作用。

The influence of bFGF and its receptor on the angiogenesis and proliferation of tumor cells in human astrocytoma

LI Yan-Yun,LI Yu-Lin,ZHANG Li-Hong et al

  (Department of Pathology,Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021)

  Abstract Objective:To determine the influence of basic fibroblast growth factor (bFGF) and its receptor (FGFR-2) on the angiogenesis and proliferation of tumor cells in human astrocytoma.MethodsImmunohistochemical study was used by a panel of antibodies.ResultsPCNA,bFGF and FGFR-2 all expressed on the tumor cells and vascular endothelial cell;The expression of bFGF had positive relativity to that of FGFR-2 and PCNA respectively in the tumor cells (P<0.01,P<0.05),the higher the axtrocytoma grade ,the stronger it expressed PCNA,bFGF and FGFR-2;the expression of bFGF and FGFR-2 also had positive relativity to the vascular density (P<0.01).ConclusinsbFGF play an important role on the angiogenesis and related to the malignant proliferation of tumor cells.

  Key words Astrocytoma bFGF PCNA Immunohistochemistry VEC

  bFGF是目前所知的较强的促血管新生因子,对血管内皮细胞具有明显的促分裂及趋化作用[1]。对肿瘤细胞亦有促增殖作用。它通过与其受体结合而发挥作用。本文对26例脑星形细胞瘤进行了免疫组织化学研究,以探讨bFGF与脑星形细胞瘤的血管内皮细胞和瘤细胞的关系。为阐明肿瘤间质血管发生机制及利用肿瘤血管的生物学特性判定肿瘤的性质及肿瘤预后提供参考依据。

  1 材料与方法

  1.1 材料 取自本校附属医学院1994年9月至1995年12月手术切除的脑星形细胞瘤,26例。按Kernohan标准分级,Ⅰ级2例,Ⅱ级10例,Ⅲ级10例,Ⅳ级4例。5例正常尸检脑组织做对照。全部

  病人手术前均未经任何抗癌治疗。所取组织均用Bouin氏液固定24 h,常规石腊包埋,连续4 μm厚切片,备HE染色及PCNA,bFGF和FGFR-2的免疫组织化学染色。免疫组织化学染色为链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)。SP试剂盒及PCNA购自DaKo公司,bFGF及FGFR-2为SANTACRUZ公司产品,严格按说明书进行操作,DAB显色,Mayer苏木精染核,中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照,用已知阳性标本作阳性对照。

  1.2 结果判定及统计学处理 染色阳性信号呈棕黄色颗粒,在目镜网格测微尺下,对每张阳性切片任选10个视野,计数每一例阳性细胞的平均数(

  2 结果

  2.1 星形细胞瘤中,血管内皮细胞及瘤细胞均表达bFGF、FGFR-2及PCNA。高级别星形细胞瘤表达bFGF、FGFR-2及PCNA的阳性率均高于低级别者,其差异均具有显著性(P<0.01)。

  2.2 FGF与FGFR-2在星形细胞瘤中的表达呈正相关关系(r=0.67,P<0.01),两者紧密相关。

  2.3 离血管越近,PCNA表达越强。PCNA与bFGF在星形细胞瘤的瘤细胞中的表达具有相关性(r=0.52),两者紧密相关(P<0.05)。

  2.4 在星形细胞瘤中,随血管密度的逐渐增大,bFGF与其受体在血管内皮细胞中的表达强度也相应增加,后两者与前者之间分别存在回归直线,其回归方程分别为YbFGF=0.42+0.02X,YFGFR-2=0.43+0.03X,P<0.01。

  3 讨论

  实体肿瘤的生长离不开肿瘤诱导的新生血管[2]。虽然实体肿瘤有诱导血管新生的潜能,但肿瘤细胞本身并不是开始就有这种能力,它必须在某些生长因子的刺激下,转化为具有诱导血管生成的表型,才能发挥这种作用[3]。能够使肿瘤细胞转化为具有诱导血管生成表型的物质主要是一些多肽类生长因子,其中bFGF的作用较为显著[4]。本文的研究结果显示:bFGF及其受体在血管内皮细胞及星形细胞瘤的瘤细胞中均有不同程度的表达。表明血管内皮细胞和星形细胞瘤的瘤细胞均可产生bFGF,两者均存在bFGF的受体。比较bFGF及FGFR-2在瘤细胞中的阳性率发现,两者呈正相关关系,且紧密相关,因此bFGF对血管内皮细胞和星形细胞瘤瘤细胞的促增殖作用是通过bFGF的受体来完成的。高级别星形细胞瘤表达bFGF及其受体的阳性率和强度均高于低级别者,提示bFGF参与肿瘤的恶性变过程。为了证实bFGF在体内具有促增殖作用,本文作了PCNA的免疫组化研究,结果表明:随着脑星形细胞瘤恶性度的增加,PCNA在星形细胞瘤中的表达强度逐渐增强,并与bFGF的表达强度成正相关关系,表明bFGF在体内确有促进瘤细胞增殖的作用。离血管越近,瘤细胞表达PCNA越强,提示肿瘤细胞的增殖离不开血管这一肿瘤赖以生存的内环境。此结果在初步揭示了血管新生与肿瘤增殖关系的同时,提示控制血管生成在肿瘤治疗中具有可行性。

  bFGF可以刺激肿瘤的发生[5]。在本研究中,随单位视野内血管密度的逐渐增加,bFGF及FGFR-2在血管内皮细胞中的表达强度逐渐增强,并成正相关关系,后两者与前者之间有直线回归,因此bFGF能够促进脑星形细胞瘤中新生血管的形成。血管内皮细胞增殖的结果一方面可使bFGF的含量增加,另一方面可导致新生血管的形成。两者均作用于瘤细胞,引起更多数量的瘤细胞增殖,此间瘤细胞与内皮细胞相互作用,形成了以瘤细胞为主的bFGF的旁分泌和自分泌体系。血管内皮细胞与瘤细胞不断增殖的结果,导致肿瘤不断增大,血管数量不断增加,肿瘤的恶性度也亦见增高。所以,脑星形细胞瘤的瘤细胞及血管内皮细胞表达bFGF及其受体的强度可作为判定星形细胞瘤的恶性度及预后的重要指标。

  作者简介:李艳云,女,34岁,博士,主要研究肿瘤间质;

  李玉林,男,49岁,博士生导师,教授,主要研究肿瘤间质

  4 参考文献

  1 Villaschi S, Nicosia R F. Angiogenic role of endogenous basic fibroblast growth factor released by rat aorta after injury. American Journal of Pathology,1993;143:181

  2  Folkman J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst, 1990;82:4

  3  Folkman J, Klagsbrun M. Angiogenic factors. Science, 1987;235:442

  4  Kandell J, Wetzel B E, Radvanyi F. Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma. Cell, 1991;66:1095

  5 Paulus W,Grothe C, Sensenbrenner M. Localization of basic fibroblast growth factor, a mitogen and angiogenic factor in human brain tumors. Acta Neuropathol, 1990;79:418

收稿1998-11-05 修回1999-08-12


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