2011年10月8日-11日在大连星海博览馆举行的“HPLC 2011 Dalian”会议中，来自世界各国的学生及院校带来了各自在色谱领域的研究成果和最新技术。以墙报的形式在组委会设立的专门展馆里展览，吸引了不少色谱界朋友的青睐！其中，不少作品还获得了本次大会设立的青年科学家奖、提名奖等。
HPLC 2011 Dalian 墙报展——人潮涌动，气势如虹。
2011年10月9日，第37届国际高效液相色谱及相关技术会议 （含仪器展览会） (HPLC 2011 Dalian) 暨第18届全国色谱学术报告会及仪器展览会(18th NSEC)在大连隆重开幕之际，PerkinElmer公司新品发布会座无虚席。
尊敬的各位同行：
我们诚挚的邀请您参加将于2011 年10 月8-11 日在大连召开的第37届国际高效液相色谱及相关技术会议（含仪器展览会） (HPLC 2011 Dalian) 及第 18 届全国色谱学术报告会及仪器展览会(18th NSEC)。
全国色谱学术报告会及仪器展览会一直是国内色谱领域学术水平最高、规模最大的学术报告会及展览会，每两年一次，自1977 年以来已连续举行17 届，享有较好的声誉。HPLC 国际会议是色谱领域最著名、规模最大的学术报告会，一般只在美国和欧洲轮流举行。此次全国色谱报告会与高效液相色谱和相关技术国际会议同时举行，必能进一步增强中国色谱专家和国际同行间的相互合作与交流，推进国内色谱技术的发展、学术水平的提高，使我们的全国色谱报告会进一步走向国际化。预计此次大会参会人员将达到600-1000 人。
会议摘要投稿截止日期为：
口头报告：2011 年7 月15 日
墙报： 2011 年8 月15 日
关于会议主题，投稿要求，论文格式等，请点击此处查看网上在线投稿详情。
35 岁以下的青年学者请踊跃投递口头报告摘要，并报名申请参加竞争PSC 青年科学家奖. 或由导师推荐您课题组的青年学者作为候选人。详情请点击此处查看。
*注册费包括参加学术会议、会议期间餐费、所有会议资料等。
网上在线注册地址请点击此处。
到目前为止，已有40 余位国外著名科学家、35 位大陆及5 位台湾知名学者作为特邀报告人确定参会，这意味着此次会议的邀请报告将达到80 多个。请点击此处查看这一吸引人的邀请人名单。
如果您有任何疑问，请联系我们hxl8110@126.com.
我们期待着十月在大连欢迎您！
许国旺 教授
大会副主席
代表会议组织委员会及科学委员会
【摘要】 目的 建立HPLC法测定盐酸格拉司琼葡萄糖注射液的含量和有关物质。方法 采用氰基柱， 0.05mol/L醋酸钠缓冲液[含0.25%(ml/ml)三乙胺，用冰醋酸调节pH值至6.0]-甲醇(50：50)为流动相;检测波长为302nm;流速为1.0ml/min;柱温为30℃。结果 盐酸格拉司琼在34.63～124.67μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率102.0%，RSD%为0.98%。结论 本方法灵敏迅速，准确可靠，可用于盐酸格拉司琼葡萄糖注射液的质量控制。
【关键词】 盐酸格拉司琼;HPLC;含量测定;有关物质
【Abstract】 Objective To study a new method for determination content and related compounds of Granisetron Hydrochloride and Glucose Injection by HPLC.Method Separation was carried out on an CN column using 0.05mol/L sodium acetate buffer [with 0.25% (ml/ml)triethylamine, pH adjusted to 6.0 by glacial acetic acid] - methanol (50:50) at detection wavelength 302 nm. The flow rate was 1.0 ml/min and column temperature was 30℃.Result The linear range of Gatifloxacin concentration was from 34.63 to 124.67 μg/ml.The average recovery of sample was 102.0% and RSD was 0.98%.Conclusion This method is sensitive and accurate with good repeatability and suitable for the quality control of Granisetron Hydrochloride and Glucose Injection.
【Key words】 Granisetron Hydrochloride; HPLC; content determination; related compounds
盐酸格拉司琼(Granisetron Hydroehloride)是一种高选择性的5-HT3受体拮抗剂，具有强效止呕作用，对因放疗、化疗及手术引起的恶心和呕吐具有良好的预防和治疗作用[1]。本品选择性高，无锥体外系反应、过度镇静等副作用。本文采用HPLC法测定盐酸格拉司琼葡萄糖注射液的含量及有关物质，结果准确可靠，辅料及降解物等不干扰主药测定。
1 仪器与试药
瑞士梅特勒XS205电子天平;美国安捷伦公司Agilent 1200高效液相色谱仪;瑞士梅特勒MP220 pH计;Phenomenex Luna 5μCN色谱柱(25cm×4.6mm);药物制剂国家工程研究中心BC-50E低温光照仪;上海建恒仪器有限公司SDH-01低温恒温恒湿箱;盐酸格拉司琼对照品(批号：100558-200602，含量：99.8%)，购自中国药品生物制品检定所;盐酸格拉司琼葡萄糖注射液[批号：10020601、10020602、10020701，规格：50ml盐酸格拉司琼3mg(以C18H24N4O计)与葡萄糖2.5g]，扬子江药业集团有限公司生产;配制流动相用甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余化试均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
用氰基硅烷键合硅胶为填充剂;以0.05mol/L醋酸钠缓冲液[含0.25%(ml/ml)三乙胺，用冰醋酸调节pH值至6.0]-甲醇(50：50)为流动相;检测波长为302nm;流速为1.0ml/min;柱温为30℃;进样量为20μl。理论板数按盐酸格拉司琼峰计算为7647。
2.2 含量测定
2.2.1 供试品溶液制备
取本品作为供试品溶液。
2.2.2 对照贮备液制备
取盐酸格拉司琼对照品34.70mg，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含盐酸格拉司琼0.6926mg的溶液。
2.2.3 阴性对照与空白干扰试验
取按处方制法制得缺盐酸格拉司琼的阴性对照适量，按供试品溶液制备法同法制得阴性对照液。取阴性对照液与流动相(空白溶剂)注入液相色谱仪，记录色谱图。由阴性对照色谱图与空白溶剂色谱图可知：在盐酸格拉司琼主峰相对应的位置无色谱峰出现，证明阴性对照与空白溶剂不干扰本品的含量测定。结果见图1。
图1 盐酸格拉司琼葡萄糖注射液HPLC色谱图A 阴性对照溶液图，B 空白溶剂图，C 样品溶液图 2.2.4 线性关系考察 分别精密量取对照储备液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8ml，分别置10ml量瓶中，分别加流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度为50%、80%、100%、120%、150%、180%的对照溶液。按上述色谱条件分别进样，测定峰面积，以对照浓度X(μg/ml)为横坐标，盐酸格拉司琼峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=1.60752e-006X+1.20833，r=0.9999，结果表明盐酸格拉司琼在34.63～124.67μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验
取浓度为100%的对照溶液，按上述色谱条件分别进样20μl，测定峰面积，计算对照品峰面积的RSD为0.06%，表明仪器的进样精密度良好。
2.2.6 重复性试验
取本品(批号：10020601)，照“2.2.1”项下制备供试品溶液，分别制备6份，按上述色谱条件分析，记录各色谱图，计算测得格拉司琼的平均含量为0.9861μg/ml，RSD为0.21%，表明方法的重复性良好。
2.2.7 稳定性试验
取上述供试品溶液，在室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12h，按上述色谱条件分析，记录色谱图，峰面积的RSD为0.12% 。说明盐酸格拉司琼样品溶液在12h内稳定。
2.2.8 回收率试验
精密量取对照贮备液5.0ml，置50ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含格拉司琼62.02μg的对照溶液;精密量取1ml，置5ml量瓶中;另取已知格拉司琼含量(批号10020601：0.9861μg/ml)的样品，精密量取1ml ，置上述5ml量瓶中，摇匀;同法制备6份，进样，测定峰面积，计算平均回收率为102.0%，RSD为0.98%，结果表明方法的准确性良好。
2.3 有关物质
2.3.1 测定方法
取本品作为供试品溶液，精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照上述色谱条件，取对照溶液100μl注入液相色谱仪中，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液与对照溶液各100μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍(扣除5-羟甲基糠醛相对应位置的峰面积)。
2.3.2 专属性试验
本品经高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏试验。结果表明，经高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏后产生的杂质峰能与主峰基线分离。
2.3.3 定量限与检测限
取对照品溶液，逐步稀释后进样100μl，待主峰峰高为基线噪音10倍时确定定量限为4.8ng，主峰峰高为基线噪音2倍时确定检测限为0.48ng。
2.3.4 溶液的稳定性
取供试品溶液，在室温放置，分别于0、2、4、6、8、10、12h，按上述色谱条件分析，记录色谱图，杂质总和的RSD为3.77% 。说明本品的有关物质检查溶液在12h内稳定。
2.3.5 重复性试验
取本品(批号：10020601)，照“2.3.1”项下制备供试品溶液，分别制备6份，按上述色谱条件分析，记录各色谱图，计算杂质总峰面积和的RSD为0.91%，表明方法的重复性良好。
2.4 样品的测定
2.4.1 含量测定
取对照品溶液、供试品溶液分别进样测定，按外标法以峰面积计算3批样品的含量分别为98.6%、99.2%和99.0%。
2.4.2 有关物质测定
分别取对照品溶液、供试品溶液进样测定，调节检测器灵敏度，记录色谱图至主峰保留时间的2倍，按主成分自身对照法计算3批样品的有关物质分别为0.47%、0.52%和0.47%。
3 讨论
3.1 实验条件的确定
根据格拉司琼分子的结构特征，因其含氮基团，在C18色谱柱上保留较强，易造成拖尾现象。故本实验采用CN 柱。通过进行分析试验后，选择甲醇与0.05mol/L醋酸钠缓冲液[含0.25%(ml/ml) 三乙氨]为流动相，在流动相中加入的三乙胺以及选择冰醋酸调节pH 6.0，可消除格拉司琼色谱峰拖尾现象，使峰形对称，提高分离选择性的目的。
3.2 稳定性的考察
经有关物质以及含量测定的稳定性试验结果，可知供试品溶液在12h内基本稳定，无新的杂质峰出现。
3.3 方法专属性考察
对本品进行高温、高湿、酸、碱、光照和氧化破坏试验，结果可知，供试品经上述破坏试验后的分解产物与主峰均能达到较好的分离,同时对本品的辅料进行测定，结果也表明辅料对主峰不形成干扰，主峰与相邻杂质峰的分离度均符合要求。综上所述，本法能够准确的用来进行含量及有关物质的测定，具有专属性强、无干扰、分析快速准确的特点，且操作简便。
【参考文献】
1 陈新谦.新编药物学,第13版.北京：人民卫生出版社，1997，347.
2 国家药典委员会.中国药典,二部.北京：化学工业出版社，2005,559.
【摘要】 目的 建立HPLC法测定精氨酸谷氨酸注射液的有关物质。方法 采用NH2柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(10：90)为流动相，检测波长210nm，柱温为30℃。结果 精氨酸、谷氨酸与降解产物焦谷氨酸分离良好，其最低检测限分别为10.2ng、69.2ng和 4.1ng。结论 本法快速、准确，可用于精氨酸谷氨酸注射液的质量控制。
【关键词】 HPLC;精氨酸谷氨酸;注射液;有关物质;焦谷氨酸
【Abstract】 Objective To study a new method for the determination of related substances of arginine glutamate Injection by HPLC.Methods Separation was carried out on a NH2 column using acetonitrile-0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate (10:90) at detection wavelength 210 nm.Results Arginine and glutamate and pyroglutamic acid were separated completely.Their detection limit were 10.2ng, 69.2ng and 4.1ng.Conclusion This method is sensitive and accurate with good repeatability and suitable for the quality control of arginine glutamate Injection.
【Key words】 HPLC;arginine glutamate;Injection;related substances;pyroglutamic acid
精氨酸谷氨酸(arginine glutamate，以下简称Ⅰ)是由日本味之素公司研究开发的降高血氨药物，临床主要用于治疗因急、慢性肝病如肝硬化、脂肪肝、肝炎所致的高血氨症，特别适用于因肝脏疾患引起的中枢神经系统症状的解除及肝昏迷的抢救。本品临床应用多年，疗效确切，并早已收载于日本药典，其中有关物质采用TLC法检查，但TLC法检测灵敏度较差，不能有效检出Ⅰ的降解产物焦谷氨酸，参考文献[1，2]，笔者现改用HPLC法测定其有关物质。
1 仪器与试药
XS205电子天平(瑞士梅特勒);Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);ZORBAX NH2柱(4.6mm×250mm，5μm);精氨酸对照品(编号：140685-200802)，谷氨酸对照品(编号：140690-200401)，均为中国药品生物制品检定所提供;L-焦谷氨酸(分析纯，批号：F20090909，国药集团化学试剂有限公司提供);Ⅰ注射液(规格：200ml：20g，批号分别为: 071010、071011、071012，扬子江药业集团有限公司提供);配制流动相用乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验
以氨基键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(10：90)为流动相，检测波长为210nm，柱温为30℃，进样量为20μl。分别取配制好的精氨酸溶液(浓度为1mg/ml)、谷氨酸溶液(浓度为1mg/ml)、焦谷氨酸溶液(浓度为0.1mg/ml)和混合溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1～4)，结果见表1，由图可知混合溶液出峰顺序依次为精氨酸、谷氨酸和焦谷氨酸，各峰之间的分离度均符合规定。 图1 精氨酸峰 图2 谷氨酸峰 图3 焦谷氨酸峰图4 混合溶液各物质峰表1 系统适用性试验结果
2.2 溶液配制
取样品溶液1ml置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液;精密量取供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液;另精密称取焦谷氨酸适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.02mg的溶液，摇匀，作为杂质对照品溶液。
2.3 检测限
在上述色谱条件下，以信噪比S/N=3计算，精氨酸、谷氨酸和焦谷氨酸的检测限分别为10.2、69.2和 4.1。
2.4 溶液的稳定性
取系统适用性试验项下配制的Ⅰ溶液，分别于0、2、4、6、8h取样检测，记录精氨酸、谷氨酸和焦谷氨酸的峰面积，计算得RSD分别为0.24%、0.09%和1.09%，表明Ⅰ溶液在8h内稳定。
2.5 专属性试验
Ⅰ原料药经酸、碱、氧化、高温及光照破坏试验。结果表明，经酸、碱、氧化、高温及光照破坏后产生的杂质峰能与主峰基线分离。
2.6 有关物质检查
分别取对照溶液、供试品溶液和焦谷氨酸杂质对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至谷氨酸峰保留时间的2.5倍。结果三批样品有关物质检测结果见表2。表2 三批样品有关物质检查结果
3 讨论
文献报道[3]，Ⅰ主要降解产物为焦谷氨酸，而焦谷氨酸为有害物质，故需进行控制。因Ⅰ为氨基酸类衍生物，在紫外无吸收，只能采用末端吸收波长210nm进行检测，选用NH2柱比C18柱分离效果好。 因Ⅰ溶液注入液相色谱仪中有精氨酸和谷氨酸两峰，且各自响应值不同，无法采用主成分自身对照法计算有关物质，故只能采用杂质对照品法计算焦谷氨酸含量。
【参考文献】
1 莫靖欣，贺英菊.HPLC测定复方谷氨酰胺肠溶胶囊中的有关物质.华西药学杂志，2007，22(6)：696-696.
2 孙彥君，于恩中.RP-HPLC测定人参降糖胶囊中L-焦谷氨酸的含量.中成药，2006，28(9)：1399-1401.
3 丁启龙，刘国卿.焦谷氨酸药理学研究进展.中国药理学通报，1998，14(2)：481-483.
【摘要】 目的 建立HPLC法测定加替沙星滴眼液的含量和有关物质。方法 采用ODS柱， 1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH至4.5)-乙腈(87:13)为流动相，检测波长325nm。结果 加替沙星在50～1000μg/ml范围内线性关系良好，平均回收率100.5%，RSD%为1.2%。结论 本方法灵敏迅速，准确可靠，可用于加替沙星滴眼液的质量控制。
【关键词】 加替沙星;滴眼液;HPLC;含量测定;有关物质
【Abstract】 Objective To study a new method for determination for related compounds and content of gatifloxacin eye drops by HPLC.Method Separation was carried out on an ODS column using 1% triethylamine (adjusted with phosphoric acid to a pH of 4.5) - acetonitrile (87:13) at detection wavelength 325 nm.Result The linear range of gatifloxacin concentration was from 50 to 1000 μg/ml.The average recovery of sample was 100.5% and RSD was 1.2%.Conclusion This method is sensitive and accurate with good repeatability and suitable for the quality control of gatifloxacin eye drops.
【Key words】 gatifloxacin; Eye Drops; HPLC; content determination; related compounds
加替沙星(gatifloxacin 以下简称为Ⅰ)是日本杏林制药公司继诺氟沙星、氟罗沙星和左氧氟沙星之后研发的氟喹诺酮类抗菌药[1]，加替沙星在眼科感染中应用广泛、安全、有效[2]。本公司根据临床需要开发滴眼液，采用HPLC法测定加替沙星含量和有关物质。
1 仪器与试药
瑞士梅特勒XS205电子天平;美国安捷伦公司Agilent 1100高效液相色谱仪;Diamonsil C18柱(4.6mm×200mm，5μm); Ⅰ对照品(中国药品生物制品检定所，含量99.8%，编号130531-200201);Ⅰ原料药(江苏永达药业有限公司，含量99.2%，批号20050122);Ⅰ滴眼液(扬子江药业集团有限公司中试产品);配制流动相用乙腈为色谱纯、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH至4.5)-乙腈(87:13)为流动相;检测波长为325nm;进样量10μl;流速1.0ml/min;柱温：35℃;理论板数以Ⅰ峰计不低于2500。取辅料按处方比例配成空白溶液，进样测定结果表明辅料无干扰。见图1。
A.对照品溶液图 B.空白辅料图 C.样品溶液图
图1 加替沙星HPLC色谱图
2.2 溶液配制 精密称取Ⅰ对照品适量，加稀磷酸溶液(2→1000)适量使溶解，加0.039%磷酸二氢钠溶液稀释成每1ml中含0.5mg的对照品溶液。同法取Ⅰ样品适量，用0.039%磷酸二氢钠溶液稀释成每1ml中含0.5mg的供试品溶液。
2.3 线性关系考察 精密称取Ⅰ对照品适量，加稀磷酸溶液(2→1000ml)适量使溶解，加0.039%磷酸二氢钠溶液稀释成每1ml含10mg的溶液，精密量取上述溶液适量，制成每1ml含1、0.05、0.1、0.25、0.5、0.8、1.0mg的溶液，摇匀后进样测定，以峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=20295988C+22157，r=0.9999，表明在0.05～1.0mg/ml范围内线性关系良好，以信噪比S/N=3测定Ⅰ最低检测限为10.3μg/ml。
2.4 专属性试验 Ⅰ原料药经酸、碱、光照和氧化破坏试验。结果表明，经酸、碱破坏后产生的杂质峰能与主峰基线分离。
2.5 重现性和稳定性试验 精密取Ⅰ样品适量，加上述稀磷酸溶液，制得0.4、0.5、0.6mg/ml的溶液各3份，分别进样测定，计算得1峰面积RSD分别为0.47%、0.59%和1.02%。取上述0.5mg/ml的Ⅰ溶液，分别于0、1、2和4h进样测定，记录峰面积，计算得RSD为0.52%，表明1溶液在4h内稳定。
2.6 回收率试验 分别按处方量的80%、100%和120%精密称取Ⅰ原料药适量，加入处方量辅料，制得Ⅰ滴眼液的模拟样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液各3份，分别进样测定，计算平均回收率为100.5%，RSD为1.4%(n=9)。
2.7 样品测定
2.7.1 含量测定 取对照品溶液，供试品溶液分别进样测定，按外标法以峰面积计算3批样品的含量分别为99.7%、100.1%和100.4%。
2.7.2 有关物质测定 分别取对照品溶液，供试品溶液进样测定，调节检测器灵敏度，记录色谱图至主峰保留时间的3倍，按主成分自身对照法计算3批样品的有关物质分别为0.38%、0.47%和0.25%。
3 讨论
HPLC法测定Ⅰ所用流动相有1%三乙胺溶液(用磷酸调节pH至4.5)-乙腈和柠檬酸-乙腈等。当以柠檬酸-乙腈为流动相时调整流动相的比例，可在24min后检出Ⅰ经酸、碱破坏的产物。而采用本色谱条件不仅使Ⅰ的保留时间由25min提前至8min左右，且可在20min内可检测出Ⅰ经酸、碱破坏的产物。采用本法测定加替沙星滴眼液的含量和有关物质简单、快捷、方便。
【参考文献】
1 朱曼，王睿.第四代氟喹诺酮类抗菌药——加替沙星. 中国临床药理学与治疗学,2001,6(4):377.
2 杜煜,郭惠元.广谱、高效、低毒的新喹诺酮类抗菌药加替沙星. 国外医药·抗生素分册,2001,22(1):34-39.
【摘要】 目的 建立同时测定三叶青中槲皮素和山奈酚的HPLC方法。方法 色谱柱：phenomenex C18(250mm×4.60 mm，5μm);流动相：甲醇-0.4%磷酸(60:40);检测波长：370nm;流速：1.0ml/min。结果 槲皮素的线性范围为0.0497～0.1491μg，平均回收率为98.32%，RSD为1.64%(n=6);山奈酚的线性范围为0.0246～0.123μg，平均回收率为98.39%，RSD为1.84%(n=6)。结论 该方法简单、快速、准确，可为三叶青药材的质量控制提供实验依据。
【关键词】 高效液相色谱法;三叶青;槲皮素;山奈酚
Simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Tetrastigmatis hemsleyani by HPLC
ZHOU Guo-hui，HUANG Jian-cheng，HUANG Zhen-bo. Center for Disease Control and Prevention of Heyan,Guangdong 517300,China
【Abstract】 Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of quercetin and kaempferol in Tetrastigmatis hemsleyani.Methods The HPLC system consisted of phenomenex C18 column (250mm×4.60mm,5μm), methanol-0.4%phosphate acid (60:40)as mobile phase, flow rate of 1.0mL·min-1. The detection wavelength was at 370nm.Results The linear ranges of quercetin and kaempferol were 0.0497～0.1491μg ( r= 0.9999) , 0.0246～0.123μg (r=0.9997)，,and the average recoveries were 98.32% with RSD 1.64%( n=6),98.39% with RSD 1.84%( n=6), respectively.Conclusion This method is simple，fast and accurate, and can be used to control the quality of Tetrastigmatis hemsleyani.
【Key words】 HPLC;Tetrastigmatis hemsleyani;quercetin;kaempferol
三叶青(Tetrastigmatis hemsleyani)又名有角乌蔹莓、石老鼠，为葡萄科崖爬藤属植物叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)[1]。主要分布于长江以南各地，生于阴湿山坡、山沟或溪谷旁林下，以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血祛风的功效[2]。药理研究证实槲皮素和山奈酚等黄酮类化合物是三叶青抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分[3，4]。目前有关三叶青中多种成分含量同时测定方面的研究还未见报道。本文采用了高效液相色谱法同时对三叶青中槲皮素和山奈酚进行了测定，为初步建立三叶青药材质量控制方法及其制剂的质量标准提供了依据。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪：岛津LC-10A液相色谱仪，SPD-10A紫外检测器，南宁威玛龙色谱工作站。色谱柱为phenomenex C18(250mm×4.60mm，5μm);槲皮素对照品(100081-200406)购自中国药品生物制品检定所;山奈酚对照品(110861-200405)购自中国药品生物制品检定所。三叶青药材产自广西，经浙江大学现代农业示范中心周建华老师鉴定为Tetrastigmatis hemsleyani的干燥根;甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素和山奈酚对照品适量，加甲醇制成每1ml含槲皮素9.94μg和山奈酚7.38μg的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末2.0g，精密称定，置50ml磨口圆底烧瓶中，精密加入5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液25ml，称定重量。水浴回流2h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液过0.45μm的微孔滤膜，滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件 色谱柱phenomenex C18(250mm×4.60mm，5μm)，柱温30℃;流动相甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)，流速1.0ml/min ，检测波长370nm。
2.4 测定法 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各l0μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件，以外标法计算含量。见图1。
图1 槲皮素、山奈酚混合对照品(A)和三叶青样品HPLC色谱图(B)
1.槲皮素 2.山奈酚2.5 线性关系考察 精密吸取槲皮素和山奈酚混合对照品溶液适量，共5份，分别置于10ml量瓶中，加入甲醇至刻度，使槲皮素质量浓度分别为4.97、7.455、9.94、12.425、14.91μg/ml,使山奈酚质量浓度分别为2.46、4.92、7.38、9.84、12.3μg/ml,各精密吸取l0μl注入高效液相色谱仪，依法测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得到槲皮素和山奈酚的线性回归方程分别为：Y=63337X-22810.5，r=0.9999Y=49937X+4690，r=0.9997结果表明：槲皮素在0.0497～0.1491μg范围内具有良好的线性关系，山奈酚在0.0246～0.123μg范围内具有良好的线性关系。
2.6 精密度考察 取同一混合对照品溶液，分别重复进样6次，测定结果，对照品溶液中槲皮素RSD=0.42%(n=6)，山奈酚RSD=0.54%(n=6)。
2.7 重复性试验 取本品6份，精密称定样品，按“含量测定”项下样品含量测定的方法操作，制成供试品溶液，测定槲皮素的平均含量为99.12μg/g，RSD为1.21%;山奈酚的平均含量为101.67μg/g，RSD为1.22%。
2.8 稳定性试验 将供试品溶液在室温下贮存，于0、2、4、8、12h测定，结果样品溶液在12h内基本稳定，槲皮素和山奈酚RSD分别为0.86%和1.13%。
2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品共6份，约1g，分别加入等量槲皮素和山奈酚对照品，照供试品方法制备，测定含量，槲皮素和山奈酚平均回收率分别为98.32%和98.39%, RSD分别为RSD=1.64%(n=6)和1.84%(n=6)，结果见表1。表1 加样回收率试验结果
2.10 样品测定 按“2.2”项下方法,制备供试品溶液,测定3份三叶青药材中槲皮素和山奈酚的含量,测定结果见表2。表2 三叶青中槲皮素和山奈酚的含量(μg/g)
3 讨论
分别选择甲醇-水溶液(50:50)、甲醇-水溶液(60:40)、甲醇-0.4%磷酸溶液(50:50) 和甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)为流动相进行试验，结果甲醇-0.4%磷酸溶液(60:40)的分离效果较好。实验中曾采用不同溶剂对药材进行提取，分别用95%乙醇、70%乙醇、甲醇、70%甲醇、5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液、5%盐酸溶液和70%甲醇(1:4)混合溶液进行提取，含量测定结果显示,槲皮素和山奈酚在70%乙醇溶液且在酸性条件下提取效果较好;同时还采用5%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液、25%盐酸溶液和70%乙醇(1:4)混合溶液进行提取,对槲皮素和山奈酚进行含量测定。结果槲皮素和山奈酚含量无明显差异，考虑到酸性过强对色谱柱的损害，故本实验选用5%盐酸溶液和70%乙醇(4:1)混合溶液进行提取;比较了超声提取和加热回流提取效果,发现回流提取的组分分离较好,同时槲皮素和山奈酚的峰面积都明显大于超声提取,因此样品采用回流提取;另外,分别将样品回流提取0.5、1、1.5、2、2.5h,发现槲皮素和山奈酚在2～2.5h内山奈素的含量提高不明显,故本实验的样品处理中采用2h的提取时间。目前,对三叶青药材的研究较少, 有关三叶青中多种成分含量同时测定方面的研究还未见报道,本实验建立了三叶青药材中槲皮素和山奈酚的含量测定方法,且方法简单可行，重复性好,结果准确可靠,可为三叶青药材及其制剂的质量标准的建立提供一定的参考。
【参考文献】
1 国家中医药管理局. 中华本草. 上海：上海科学技术出版社，1999，448-451.
2 伍昭龙，吕江明.中药三叶青的研究现状. 中国民族民间医药杂志, 2006，(1)：15-18.
3 刘东,杨俊山.中国特有植物三叶青化学成分的研究.中国中药杂志,1999,24(10):611-612.
4 刘东, 鞠建华, 林耕，等. 三叶崖爬藤中的新黄酮碳甙. 植物学报, 2002,(44):227-229.
(编辑:汪 洋)
