主题：DC

+ 关注 ≡ 收起全部文章

把患者体内细胞加工成“抗癌武器”

对多数肿瘤患者来说，在经历过手术、放疗、化疗三大常规治疗与痛苦折磨后，仍不可避免地发生复发和转移，最终面临死亡的威胁。能否有一种免于痛苦，更加有效的治疗手段？这是省“双创人才”，留美生物医学专家时宏珍博士攻关的课题。记者近日获悉，自2005年学成归国创业以来，时宏珍率领的技术团队攻克多重技术难关，在国内率先成功构建了以DC（树突状细胞）为核心的细胞免疫治疗技术平台，核心技术已获得二项国家发明专利，还有一批专利正在申请之中。为加快高新技术成果的转化，时宏珍已经和省内8家大型三甲医院建立合作研究关系，使这一技术在近千例晚期恶性肿瘤患者治疗中得到运用，取得了令人满意的临床效果。
核心技术：提取加工患者“自己的细胞”杀灭癌细胞
无须开刀，不用吃药，只要从患者体内提取“特殊”细胞，经“加工”后再输入人体，就可以激发患者自身抗肿瘤免疫能力，起到定向杀灭肿瘤细胞的作用，同时还在患者体内产生“免疫记忆”，起到防止复发的作用这就是时宏珍发明的“抗癌魔术”。
“这一技术治疗癌症，依靠的是人体自身的免疫功能”，时宏珍介绍，DC（树突状细胞）是迄今为止发现的人体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，作为人体的“哨兵和卫士”，它能够感知、识别入侵的细菌、病毒和体内变异细胞，并把这些危险信号传递给另一种免疫细胞-T淋巴细胞，最终由受到DC信号刺激后被活化的T淋巴细胞，识别并溶解肿瘤细胞。但是DC在人体内数量极少，自然情况下，难以及时彻底遏制恶性肿瘤。
时宏珍所发明的专利技术，首先从肿瘤患者外周血样本中采集DC前体细胞，体外诱导成大量DC，再通过患者肿瘤组织样本（手术、活检）制备肿瘤细胞抗原，将肿瘤抗原信号加载于DC，“等于为DC安装了精确制导系统，使之成为专门瞄准肿瘤细胞的‘细胞导弹’。”时宏珍说。
创业历程：从医8年，留美4年，在南京找到了创业施展平台
1990年，时宏珍从南京医科大学硕士毕业后，在市第一医院工作8年，一直从事肿瘤基础与临床研究。2001年获得苏州大学免疫学博士学位，毕业后应美国贝勒大学医学中心贝勒免疫研究所邀请师从该所所长，世界一流免疫学家，全球DC研究领军人物，现任国际医药巨头罗氏公司副总裁Jacques 教授，开展DC肿瘤疫苗的开发。
看好生物介入治疗技术在国内的巨大市场潜力，2005年时宏珍回国，并选择在南京创办得康生物技术有限公司。
“南京有着丰富的医疗和人才资源，事实证明，我的选择是正确的”，在南京，时宏珍获得了第一笔创业启动投资，组建了自己的人才团队，采用租贷实验室的方法，完成了技术工艺的开发，节省了创业初期自建实验室的大量投资成本，缩短了开发周期。
创业以来，时宏珍和她的团队先后成功开发出DC、CIK、DC-CIK、CTL等免疫治疗新技术系列，构建了与国际接轨的标准操作规程、质量控制与管理体系以及临床疗效评估体系，企业也通过国家高新技术企业认定，并获得南京市科委授权筹建“南京市免疫细胞技术研究工程中心”。
发展前景：吸引境内外多家投资机构前来洽谈
时宏珍的创业从最初的技术入股起步，到去年，她已经成功回购得康公司99%的股权，目前，作为公司总经理兼首席技术官，时宏珍最忙的就是和大量“闻风而来”的股权投资、风险投资机构进行洽谈。
“就我们企业来说，目前已基本经过了原始积累阶段，技术的产业化和市场化模板已经完备”，时宏珍告诉记者，下一步发展的重点就是希望找到具有医疗行业背景、资源和相关运作经验的战略投资合作者加盟得康，从而快速扩大市场规模，占领市场先机。
据悉，目前我市科技、卫生等相关部门已经与得康公司进行对接，帮助企业技术成果转化和推广应用。“我认为，人类最终战胜肿瘤，免疫治疗、生物治疗是发展趋势与方向。”对于企业未来发展，时宏珍充满信心，她表示，得康公司将用3—5年时间力争成为中国免疫治疗领域的开拓者、实践者和领导者。

日期：2012年1月8日 - 来自[肿瘤相关]栏目

mRNA修饰的树突状细胞瘤苗从基础到临床

肿瘤一直是危害人类健康的一大杀手，给我们的日常生活带来极大的困扰。目前手术、化疗和放疗是恶性肿瘤传统的三大常规治疗方法。但是,手术切除无法清除所有的肿瘤细胞,也不能去除肿瘤发生的原因,存在术后复发和转移的隐患,对于血液系肿瘤更是无能为力;放化疗则由于严重的毒副反应影响了它们的应用。近年来,作为恶性肿瘤第四种治疗模式的肿瘤生物治疗研究得到蓬勃发展,取得了一系列可喜的成果,有望成为手术、放疗和化疗的有效辅助疗法。
在2011细胞治疗技术研讨会上，谭晓华教授谈到，当前肿瘤生物治疗被认为是最有可能治愈肿瘤的方法，其最主要的手段之一是肿瘤免疫治疗，它包括通过各种刺激让机体产生免疫效应细胞或效应分子的主动性免疫和直接输注免疫效应细胞或效应分子的被动性（过继）免疫。而树突状细胞（DCs）是目前发现最强的抗原提呈细胞。DC是一把\"双刃剑\"，即可刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫，又可导致机体产生免疫耐受。优化的DC瘤苗必须提供至少三个信号：Signal 1:MHC I or II-Peptide，决定免疫反应的特异性；Signal 2： Costimulatory molecules（CD40,CD70, CD80,CD86），决定免疫反应的强度；Signal 3：Cytokines and Chemokines（IFN-γ,IL-2, IL-12,IL-15），决定T细胞的极化方向；Signal 4：homing cytokines，决定T细胞的定位和归巢。
谭教授表示：mRNA修饰DC，提供优化DC瘤苗的平台，有很多优点：可以同时向DC转染多个基因RNA分子，不仅包括肿瘤相关抗原，还可包括共刺激分子、细胞因子等；RNA分子很容易降解，无安全隐患考虑；降低DC瘤苗应用成本。在临床上，肿瘤抗原RNA修饰DC作为瘤苗在动物实验和人体外实验能有效地诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应，不同肿瘤抗原修饰负载DC刺激特异性抗肿瘤免疫反应能力不同，免疫调节基因mRNA修饰DC能显著增强DC瘤苗的活性，非成熟DC电转染CD40L、CD70 和caTLR4，可以转化为成熟的DC表型，它有很强的CD4 T淋巴细胞刺激能力，导致多种Th1细胞因子（如IFN-γ、TNF-α）的大量分泌，还能刺激肿瘤特异性CTL产生的能力是非成熟DC的500倍，成熟DC(用经典的细胞因子鸡尾酒法)的200倍。
2010年4月美国FDA批准了世界上第一个癌症治疗性疫苗Sipuleucel-T（Provenge）：用于无症状或微小症状、去势抗性的转移性晚期前列腺癌的治疗。谭教授详细的给我们讲解了DCs瘤苗的临床试验研究包括：DC来源、给药方式、给药频率、给药次数、给药剂量等；还分析了DCs瘤苗的安全性、有效性和疗效。当然在上述方面，DC瘤苗目前还存在很多问题，比如：DC瘤苗实验室制备标准化、DC临床应用、DC的疗效评价、安全性等问题，因此DC瘤苗的肿瘤免疫治疗方法广泛应用于临床还有一段路要走。
#关于谭晓华教授#
主要研究领域：肿瘤的免疫基因治疗。以课题负责人获得国家自然科学基金4项、军队杰出人才基金1项，北京市自然科学基金1项，首都医学科研发展基金1项和教育部归国留学人员科研启动基金1项。

日期：2011年9月2日 - 来自[肿瘤相关]栏目

负载抗原DCCIK细胞对NDV 修饰抗原胃癌细胞杀伤作用

【摘要】 目的探讨负载SGC7901细胞抗原的DCCIK细胞对新城疫病毒(NDV)修饰SGC7901细胞的杀伤作用，探索胃癌新的治疗方法。方法取健康成人外周血分离单个核细胞，用于诱导培养树突状细胞(DC)及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)。用反复冻融法制备胃癌细胞抗原，用于致敏DC细胞。然后分以下4组进行试验：CIK组、DCCIK组、CIK+ NDV组、DCCIK+NDV组，同时设单独的靶细胞对照(SGC7901)和效应细胞对照(CIK、NDV、DCCIK)。并与化疗药(氟尿嘧啶、顺铂)对SGC7901细胞的杀伤作用进行比较。结果用NDV修饰抗原后，无论是CIK细胞还是DCCIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率均增高。其中负载胃癌细胞抗原的DCCIK细胞杀伤率最高，效靶比为20∶1时，达到83.4%。化疗药物作用48 h时的疗效也不如单纯CIK细胞作用24 h的疗效。结论负载SGC7901细胞抗原的DCCIK细胞对经NDV修饰抗原的SGC7901细胞的杀伤效果最佳。胃癌的生物治疗效果优于普通化疗。

【关键词】 胃肿瘤;抗原,肿瘤;免疫疗法;树突细胞;杀伤细胞;新城疫病毒

　THE CYTOTOXIC EFFECT OF ANTIGENPULSED DCCIK CELLS ON NDVMODIFIED GASTRIC CARCINOMA CELLS LIU XICHUN, JIANG HAITAO, MAO WEIZHENG (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To study the cytotoxic activity of SGC7901pulsed DCCIK cells on newcastle disease virus(NDV)modified SGC7901 cells, and explore a new therapeutic approach for gastric carcinoma. Methods Mononuclear cells were isolated from peripheral blood of healthy adults, and used for induction into dendritic cells (DC) and cytokine induced killer (CIK) cells. Gastric carcinoma antigen obtained through repeated freezing and thawing was used for pulsing DCs. The experiment included four experiment groups: CIK, DCCIK, CIK+NDV and DCCIK+NDV, and two control groups: target cell group(SGC7901) and effector cell group(CIK, NDV, DCCIK). The results were compared with the effects of chemotherapeutic agents (Fluorouracil, cisplatin) on SGC7901 cells. Results The cytotoxic activities of both CIK and DCCIK cells against SGC7901 cells were increased after antigen being modified by NDV. The cytotoxicity of DCCIK pulsed with gastric cancer cell antigen was the strongest (83.4%) with E∶T: 20∶1. The effect of chemotherapeutic agents, even after 48 hours of treatment, was less than that of CIK after 24 hours of treatment. Conclusion The cytotoxic activity of SGC7901pulsed DCCIK cells against NDV modified SGC7901 cells was the strongest. Biotherapy for stomach cancer was better than that of chemotherapy.

　　[KEY WORDS] stomach neoplasms; antigens, neoplasm; immunotherapy; dendritic cells; killer cells; newcastle disease virus

　　目前，胃癌仍采取以手术为主的综合治疗，疗效差。近年来细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)作为杀伤肿瘤的效应细胞引起了人们极大的关注[1]。此外树突状细胞(DC)是目前已知体内抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞，具有独特的抗原提呈和激发功能，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用[2]。新城疫病毒(NDV)可通过多种机制作用于肿瘤细胞，其中之一是修饰肿瘤抗原，使肿瘤细胞隐含的抗原发生外露。本研究体外通过NDV使胃癌细胞SGC7901的抗原显露后，研究效应细胞(DCCIK)对胃癌细胞的杀伤作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　EPICS XL型流式细胞仪(美国COULTER公司)，17550型酶标仪(AUSTRLA)。基因重组人干扰素γ(IFNγ，购自上海生物制品所)，抗CD3单抗(购自武汉博士德生物公司)，重组人白细胞介素2(IL2，购自北京远策药业有限公司)，重组人粒巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF，购自厦门特宝生物工程股份有限公司)，重组人白细胞介素4(rhIL4，购自北京军事医学科学院)，淋巴细胞分离液(Ficoll，购自中国医学科学院生物工程研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 冻融法制备SGC7901细胞抗原消化收集对数生长期的SGC7901细胞，用PBS液离心洗涤两次，再用PBS液重悬为1×1010/L，封装入冻存管。置液氮内冷冻10 min，取出后立即置37 ℃水浴10 min，重复3次。然后，以10 000 r/min离心30 min，取上清液-20 ℃保存备用。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

　　1.2.2 DC的诱导和扩增取健康献血者50 mL肝素抗凝外周血用Ficoll密度梯度离心，分离单个核细胞。用含体积分数为0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×109/L，然后以每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱培养2 h。收集非黏附性细胞于50 mL离心管中，用于诱导CIK细胞。在留有贴壁细胞的24孔板中，每孔加入含有200 μg/L的rhGMCSF和106 U/L rhIL4的RPMI1640培养液1 mL，置于37 ℃、体积分数0.05 CO2条件下培养，每3 d半量换液，同时补足上述rhGMCSF及rhIL4。观察DC培养过程中的形态变化情况。

　　1.2.3 DC负载胃癌抗原于DC培养第5天每孔加50 μL肿瘤抗原(胃癌细胞裂解液)，然后继续培养48 h。DC培养第6天加入TNFα(106 U/L)。

　　1.2.4 CIK细胞的诱导和扩增将上述诱导DC时收集非贴壁细胞，用含体积分数0.10胎牛血清的RPMI1640培养液调细胞密度为3×108/L，同时将IFNγ(106 U/L)每孔1 mL加入24孔培养板中，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱中培养24 h后再加入抗CD3Ab(25 mg/L)、IL2(109 U/L)。每3 d半量换液，同时补足抗CD3Ab及IL2。

　　1.2.5 DC和CIK细胞共培养将培养7 d的经SGC7901细胞裂解液致敏的DC与部分CIK细胞以1∶3的比例混合，以CIK细胞培养液继续培养3 d后收集并计数CIK细胞。另一部分未与DC混合的CIK细胞也收集并计数。在DC及CIK细胞培养的第7天，采用流式细胞仪分析DC细胞表型CD86、CD83，CIK细胞表型CD16+56。

　　1.2.6 CIK细胞对SGC7901细胞的细胞毒作用及NDV的影响 CIK细胞收集前1 d，消化收集对数生长期的SGC7901细胞，RPMI1640培养液调密度为5×107/L，每孔100 μL加入96孔板，其中部分孔加入50 μL的NDV(1∶160)作用12 h后，收集经抗原、DC作用的CIK及未经抗原、DC作用的CIK。调密度为1.0×109/L、5.0×108/L，2.5×108/L，分别取100 μL加入盛有SGC7901细胞及经NDV作用的SGC7901细胞的培养孔中，使效靶比为5∶1、10∶1、20∶1，各设3个复孔，并设单纯各浓度CIK为效应细胞空白对照，NDV设单独对照。每孔用RPMI1640培养液补足至300 μL。培养12 h后，每孔加入MTT液(5 g/L)20 μL，再培养4 h，吸弃上清，每孔加入DMSO 100 μL，用酶标仪于570 nm处测吸光度(A)值，计算杀伤率。杀伤率=[1-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)/靶细胞对照孔A值]×100%。

　　1.2.7 化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用分别将氟尿嘧啶(5FU)、顺铂(DDP)加入装有SGC7901细胞(5×107/L)的96孔板中，调终浓度为5FU 5、10、20 mg/L，DDP 1.2 μg/L，5FU与DDP合用组浓度为5FU 10 mg/L、DDP 2 mg/L,各浓度设3个复孔。未与5FU、DDP作用的SGC7901细胞设为靶细胞空白对照孔，将每孔用RPMI1640培养液补至300 μL。共设2个96孔板，置37 ℃、体积分数0.05 CO2恒温箱作用24、48 h后分别测A值(方法同前)，计算杀伤率。杀伤率=(1-实验孔A值/靶细胞孔A值)×100%。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果以±s表示，多组间比较采用方差分析[3]。

　　2 结果

　　2.1 DC形态学观察

　　自外周血分离的单个核细胞(PBMC)呈球形，表面光滑。加入rhGMCSF和rhIL4培养2 d后，细胞体积增大，部分细胞形态不规则，呈梭形、多边形。培养4 d后，见部分细胞悬浮生长，部分细胞有毛刺伸出。培养7 d后大部分细胞聚集，胞体增大，见多数细胞有毛刺伸出。

　　2.2 DC及CIK细胞表型分析

　　培养第7天DC细胞的CD86、CD83表达增加,测CD83的表达率为 78.3%, CD86为 80.4%。培养第7天CIK细胞CD16+56的表达率为43.4%。

　　2.3 CIK及DCCIK细胞的细胞毒活性及NDV的影响

　　随着效靶比增加，CIK细胞对SGC7901细胞杀伤作用增强，效靶比20∶1时杀伤作用高于效靶比5∶1时(F=2 305.32,q=166.36,P<0.01)。在同一效靶比下，DCCIK组对SGC7901细胞的杀伤率则明显高于CIK组(F=2 103.22～5 168.41,q=21.354～326.23,P<0.01)。同时，NDV本身对SGC7901细胞也有杀伤作用，杀伤率在20%左右，但杀伤能力低于CIK组。用NDV修饰SGC7901细胞抗原后，无论是CIK细胞还是DCCIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率均增加。其中负载胃癌细胞抗原的DCCIK细胞杀伤率最高，效靶比为20∶1时，达到83.4%。见表1。齐鲁医学杂志2010年10月第25卷第5期 Med J Qilu, October 2010, Vol.25, No.5

　　2.4 化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用

　　5FU、DDP在一定范围内，随浓度增加对SGC7901细胞杀伤作用而增强。将二者合用时对SGC7901细胞的杀伤有协同作用，明显增加杀伤效果。随杀伤时间延长，化疗药对SGC7901细胞的杀伤作用进一步增加，化疗药作用48 h与24 h的杀伤率比较，差异有统计学意义(t=4.60～37.18，P<0.05)。但48 h时化疗药物的疗效也不如单纯CIK细胞24 h的疗效。表1 CIK细胞对SGC7901细胞的杀伤率表2 24 h及48 h化疗药杀伤率

　　3 讨论

　　肿瘤细胞表面存在肿瘤相关抗原，但这些抗原的免疫原性大多较弱或隐含，不足以引起宿主有效的抗肿瘤免疫反应，导致免疫逃逸。免疫治疗的关键是要充分显露肿瘤抗原，使肿瘤特异性杀伤细胞能在肿瘤细胞上辨认出更多抗原靶点，从而更有效地杀灭肿瘤细胞。本研究基于以上认识，既重视了肿瘤的杀伤手段，就是诱导、培养和扩增肿瘤特异性杀伤细胞，又注意了使肿瘤细胞隐含的抗原显露出来，使两方面结合提高杀伤效果。

　　CIK细胞是非MHC和非TCR限制性的细胞毒淋巴细胞，由外周血单个核细胞在多种细胞因子(如IFNγ、IL1、IL2、CD3Ab等)的共同刺激下诱导而成的[4]。CIK细胞表面既有T细胞表面标志(TCRα/β、CD3)，也有NK细胞的表面标志(CD56)。其细胞毒作用几乎惟一地存在于CD3+ CD56+细胞中。CIK细胞发挥抗肿瘤作用的机制可能是通过黏附因子与肿瘤细胞相互结合后，分泌含有大量BLT脂酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解。本研究显示，CIK细胞对SGC7901细胞有较强的杀伤作用，在效靶比为20∶1时杀伤率为46.4%，比化疗药(5FU、DDP)的作用效果好。

　　研究发现，DC、CIK细胞和某些抗原肽共同培养能产生多种生物学特性。①增殖活性高,在共培养过程中,DC、CIK两种细胞的数目显著增多,增殖速度甚至呈倍数增长;②细胞毒活性强，共培养的DCCIK细胞具有更高的肿瘤杀伤活性;③杀瘤谱广，共培养的DCCIK细胞对多种肿瘤具有杀伤活性。因此，可增强对某些缺乏特异性抗原的肿瘤细胞的杀伤能力。LINN等[5]研究也证实，共培养DC、CIK能在低效靶比条件下清除大量肿瘤细胞。本研究用反复冻融法来提取胃癌细胞(SGC7901)的肿瘤相关抗原，然后用它致敏DC细胞，用于诱导特异性CIK细胞杀伤胃癌细胞，结果负载SGC7901胃癌细胞抗原的DCCIK细胞对胃癌细胞的杀伤作用明显强于单纯CIK治疗组(P<0.01)，显示出识别多克隆抗原的CIK细胞对SGC7901胃癌细胞的杀伤效果较好。

　　目前的研究报道，多数只注意了杀伤手段的开发研究，如何能使有效的杀伤细胞有的放矢，成为关键问题。研究结果表明，NDV是副黏病毒科腮腺炎病毒属的成员,其具有修饰肿瘤细胞抗原的作用，在人类癌细胞内的复制比在正常细胞内复制高10 000倍[6]，能够选择性杀伤人肿瘤细胞,其与肿瘤细胞的结合是特异和不可逆的，而对人正常细胞无明显影响[7]。VOLKER[8]研究表明，用类似人体抵抗病毒感染的机制，将肿瘤细胞体外培养，用NDV修饰抗原使其外露，使肿瘤细胞的抗原性增强，然后灭活肿瘤细胞，回输肿瘤病人，即用NDV修饰的自体肿瘤疫苗(NDVATV)进行主动特异性免疫治疗，具有明显的效果，与肿瘤病人的常规治疗的效果比较，能够明显延长病人的生存期。本研究利用NDV能增加肿瘤的免疫原性这一特点，让体外扩增的特异性CIK细胞有的放矢，有针对性地杀伤胃癌细胞。结果显示，NDV本身对SGC7901胃癌细胞具有杀伤性，但同CIK细胞及DCCIK细胞相比较，其杀伤力较弱。用NDV修饰胃癌细胞抗原后，再用特异性DCCIK细胞进行杀伤，取得了前所未有的治疗效果，杀伤率达到83.4%。该研究作为一种新方法，为胃癌的生物治疗奠定了实验基础。

　　研究发现，CIK细胞在体外培养15 d左右临床应用的量和效力比率最合适。本研究因实验条件所限，使用培养第9天的DCCIK就达到了如此的疗效，显示出用特异性DCCIK杀伤经NDV修饰抗原的胃癌细胞方法的有效性。CIK细胞是目前较理想的肿瘤杀伤细胞，用于临床肿瘤治疗前景广阔。

【参考文献】
　[1]于津浦,任秀宝. CIK细胞——肿瘤过激免疫治疗的新希望[J]. 中国肿瘤临床, 2001,28(7):557560.

　　[2]李金凤,张震宇. 卵巢癌细胞和脐血树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤免疫效应的初步研究[J]. 中国肿瘤临床, 2007,37(14):789793.[3]周晓彬,纪新强,徐莉. PPSM 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[4]NAGARAJ S, ZISKE C, SCHMIDTWOLF I G. Human cytokine  induced killer cells have enhanced in vitro cytolytic activity via nonviral interleukin2 gene transfer[J]. Genet Vaccines Ther, 2004,2(1):12.

　　[5]LINN Y C, HUI K M. Cytokine induced killer cells: NK Like T cells with cytotolytic specificity against leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 2003,44(9):14571462.

　　[6]PECORAAL, RIZVI N, COHEN G I, et al. Phase Ⅰ trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, patients with advanced solid cancers[J]. J Clin Oncoll, 2002,20:22512266.

　　[7]BIAN H, FOURNI P, MOORMANN R, et al. Selective gene transter in vitro to tumor cells via yecombinant Newcastle disease virus [J]. Cancer Gene Ther, 2005,12(3):295303.

　　[8]VOLKER S. Clinical trials of antitumor vaccination with an autologous tumor cellvaccine modified by virus infection: improvement of patient survivalbased on improved antitumor immune memory[J]. Cancer Immunol Immunother, 2005,54:587598.

日期：2011年6月30日 - 来自[2010年第25卷第5期]栏目

胰腺癌的树突状细胞治疗研究进展

【关键词】 胰腺癌；树突状细胞;免疫治疗

　　胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，早期诊断率和手术切除率均较低，预后差，因此，开展胰腺癌细胞免疫治疗研究具有重要意义。目前有关胰腺癌免疫治疗的主要方法有特异性主动免疫治疗、单克隆抗体导向治疗、细胞因子治疗和过继性细胞免疫治疗［1～3］。人树突状细胞(Denderitic cell, DC)是当前抗肿瘤免疫治疗研究热点。本文就DC在胰腺癌中的免疫治疗进行综述。

　　1 人DC的功能

　　1.1 DC特异性细胞免疫

　　免疫应答由B、T细胞介导，它们受DC调控。分布于外周防御第一线的DC大多以不成熟状态存在，它通过3种方式摄取抗原：①以吞噬方式摄取微生物和颗粒抗原［4］；②以巨胞饮方式非特异，非饱和地摄取液相可溶性抗原［5］；③以受体的内吞介导的内吞作用高效、特异地摄取受体相关抗原［6］。并且不同成熟阶段的DC摄取抗原的能力不同，不同部位的DC摄取抗原的能力也有不同，可能起因于DC本身的不均性。也有人认为：经GM-CSF和IL-4诱导在单核细胞条件培养基中成熟的DC具有最强的抗原递呈功能。DC摄取和加工抗原、表达MHCI、MHCII类分子、B7分子和粘附分子、并分泌IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-12等细胞因子，因此能有效激发T细胞应答。

　　1.2 DC及其它免疫细胞与肿瘤

　　抗肿瘤免疫是以细胞免疫为主，其中具有免疫记忆功能和特异性的主要是T细胞，而非特异性抗肿瘤免疫细胞自然杀伤细胞（NK）和gdT淋巴细胞也日益受到人们的重视。

　　1.2.1 T细胞主要有两类，CD4+辅助T细胞和CD8+毒性T细胞。它们均表达CD3标志，主要产生特异性免疫。CD4+T细胞在接受专职APC上的MHC抗原复合物和共刺激分子双重信号后，细胞发生克隆性增值,并释放出多种细胞因子，其中主要为：IL-2、INF-γ、TNF和淋巴毒素(LT)。这些因子在调节、活化细胞毒性T细胞（CTL）、巨噬细胞、B细胞的抗肿瘤效应中起重要作用。自然杀伤细胞(NK)是淋巴细胞的亚群,约占外周血淋巴细胞的15%。来自于外周血的NK细胞不经活化即可杀伤某些肿瘤细胞，并且不受MHC限制。NK细胞杀伤瘤谱非常窄，只是对少数血液来源的肿瘤有效。当NK细胞被IL-2、IFN-γ等因子活化后，其杀伤瘤谱和杀伤效率大幅度提高。NK识别不需要靶细胞表达MHCI类分子，甚至，自身靶细胞MHCI类分子可抑制NK细胞对其杀伤。在抗肿瘤免疫中，巨噬细胞具有抗原呈递功能，参与调节特异性T细胞免疫。未活化的巨噬细胞对肿瘤细胞无杀伤作用，活化后作为效应细胞产生非特异性杀伤和抑制肿瘤作用，它可产生多种杀伤靶细胞的效应因子，其中包括：超氧化物、一氧化氮、TNF及溶酶体产物等。巨噬细胞还可通过ADCC途径杀伤靶细胞。过渡活化的巨噬细胞可抑制淋巴细胞的增殖，抑制NK和CTL抗肿瘤活性。

　　1.3 DC、细胞因子与体液免疫

　　在抗肿瘤免疫中，体液免疫不占主导地位。抗体结合补体后的溶瘤作用，以及依赖抗体的细胞介导的细胞毒（ADCC）作用，DC通过自身分泌或诱导其他细胞分泌IL-12而启动CD4+Th1相关免疫应答，活化的Th细胞可通过产生IFN-γ、GM-CSF和TNT-α等细胞因子正反馈上调DC对IL-12和共刺激分子的分泌。

　　2 DC在抗肿瘤免疫中的应用

　　2.1 肿瘤免疫治疗失败常见原因

　　肿瘤微环境中的一些因子使免疫效应细胞在成熟前死亡或不能成熟。已证明肿瘤可使DC功能失常、凋亡及免疫反应中的信号传导分子缺失［7］。见于此,有人着手于肿瘤细胞DC疫苗的研究：黑色素合成肽DC疫苗的II期临床试验在匹斯堡肿瘤研究所完成（UPCI-95-60）［8］，已证明DC与肿瘤细胞抗-肽结合可成为激发抗肿瘤CTL的有效免疫原。Mule JJ［9］在鼠模型中，体外用负载肿瘤溶解物的DC作为刺激剂可驯化同系鼠T细胞，导致肿瘤特异性T细胞的增殖及细胞因子的产生，用此DC免疫几个组织学不同肿瘤的肺部微转移同系小鼠，均可激发有效的抗肿瘤效应。Kugler A等［10］用电融合术(Electrofusion technique)肿瘤细胞和同种异体DC融合，产生的融合细胞表达肿瘤抗原并具有DC的共刺激能力。

　　2.1.1 由于肿瘤来源于机体自身突变的细胞，大部分的成分与机体正常细胞的成分相同，只有极少数异常表达的蛋白质和畸形多糖具有免疫原性。肿瘤细胞之间也存在免疫原性不同的差异，那些免疫原性较强的肿瘤可以诱导有效的抗肿瘤免疫应答，易被机体消灭，而那些免疫原性相对较弱的肿瘤则能逃脱免疫系统的监视而选择性地增殖。抗肿瘤抗体与肿瘤细胞表面抗原复合物的内化或脱落的这种抗原调变作用，致使肿瘤抗原减少，免疫原性减弱。MHCI类分子递呈功能的缺乏常常是导致肿瘤免疫逃逸的主要原因之一。共刺激分子的缺乏也是肿瘤逃逸的原因。研究较多的是共刺激分子B7，它主要表达在激活的B细胞表面。树突状细胞、IFN-γ激活的巨噬细胞上等也有B7分子表达，而在肿瘤细胞表面的表达缺如。

　　2.1.2 抗原呈递功能障碍

　　研究表明荷瘤宿主外周血获得的抗原呈递专职细胞DC往往对抗原呈递有障碍。而取自荷瘤宿主骨髓细胞在体外与GM-CSF、IL-4、TNF-α共同培养扩增的DC抗原呈递功能良好，表明肿瘤宿主的DC可能从骨髓释放到体内的成熟过程中受到了荷瘤宿主体内某些因素的干扰而削弱了对肿瘤抗原的呈递作用。

　　2.1.3 免疫抑制因子

　　带瘤动物和肿瘤患者的免疫抑制状态常可随肿瘤的切除而消失。经检测，多种动物和人类肿瘤的提取物、血清及建系的肿瘤细胞培养上清中存在免疫抑制因子，主要有TGF-b，IL-10和PGE2等。细胞因子在免疫网络中的作用也是极其复杂的。一种因子可有多重作用，如IL-1、TNF-α和IFN-γ既有促进抗肿瘤的作用，又有促进肿瘤转移和发展的一面。

　　2.2 DC在抗肿瘤免疫中的作用

　　2.2.1 DC诱导产生大量效应T细胞

　　DC可以①摄取抗原，加工后在转运至细胞内MHC-I类和II类分子富含区，形成肽-MHC分子复合物，并表达于细胞表面，T细胞可识别以肽抗原而启动MHC-I类限制性的CD8+CTL和MHC-II类限制性的CD4+Th1反应；②通过自身分泌或诱导其他细胞分泌IL-12而启动CD4+Th1相关免疫应答，活化的Th细胞可通过产生IFN-γ、GM-CSF和TNT-α等细胞因子正反馈上调DC对IL-12和共刺激分子的分泌；③直接向CD8+CTL呈递抗原，CD4+和CD8+T细胞通过共同分泌细胞因子或直接杀伤而产生抗肿瘤免疫反应；④高水平表达共刺激分子和粘附分子而促进DC与T细胞的结合。DC启动效应细胞迁移至肿瘤部位,保持效应T细胞在肿瘤部位的长期存在,并抑制肿瘤血管生成。

　　3 DC在抗肿瘤治疗中的应用方案

　　Timmerman JM等［11］证实，在体外模拟DC成熟的过程中，使其接触相应的肿瘤抗原而致敏，再将这些功能正常见负载了肿瘤抗原的DC回输体内，可有效的诱导机体抗相关肿瘤抗原的免疫应答。将灭活的肿瘤细胞在体外冲击致敏DC，或将肿瘤细胞与DC融合后再回输。应用肿瘤抗原提取物致敏DC，可提高抗原决定簇的有效浓度，增强CTL反应，在实验中一次免疫即可测到CTL。目前常用的提取物有：肿瘤细胞碎片，mRNA和洗脱肽。

　　4 胰腺癌免疫治疗

把IL-2、IL-4、IL-6、GM-CSF导入人胰腺癌细胞（AsPC-1），将这些细胞接种于BACB/C裸鼠，测量肿瘤体积，结果是：导入IL-6、GM-CSF组的肿瘤生长明显受抑制,转导IL-2、IL-4组先有小肿瘤出现，但不久后完全消退。产生IL-2、IL-4的肿瘤细胞周围有单核细胞浸润，研究认为即使在鼠T细胞缺陷状态下，从肿瘤细胞分泌的IL-2和IL-4也能发挥抗肿瘤效果。在体外将正常人和胰腺癌病人的白细胞混合培养1～2d，然后将这些细胞直接注射到胰腺癌组织中去，病人的免疫系统可在反应中活跃起来，排斥外来细胞，攻击肿瘤细胞，治疗8例晚期胰腺癌病人，收到较好的效果。肿瘤细胞培养上清对DC分化发育的影响发现：肿瘤组织的微环境存在免疫抑制性因子IL-10，对DC分化发育和抗原提呈功能起负性调节作用。转染B7-1基因的人胰腺癌细胞免疫原性增强。DC疫苗诱导免疫效应细胞能有效地抑制人胰腺癌细胞PC3，DC培养上清液能分泌抗肿瘤细胞因子［12～15］。

　　5 问题与展望

　　近十余年，肿瘤免疫学已成为最活跃的生命科学研究领域之一。其中揭示了人类肿瘤抗原，丰富了肿瘤抗原加工、呈递和抑制，识别的基础知识。T细胞、NK、DC的研究有了重要进展。基因工程抗体进入临床研究。细胞过继免疫治疗、细胞因子治疗、免疫基因治疗，肿瘤疫苗的临床研究持续稳定发展。这些生物疗法已显示出与传统常规手术、放疗、化疗三大疗法的互补性。在21世纪生物治疗必将得到突破性发展，并成为治疗肿瘤的常规疗法。基于此，我们可以相信通过胰腺癌的基因治疗和免疫治疗，特别是自体或异体DC等细胞和基因联合用于胰腺癌的治疗，将给胰腺癌患者带来新的曙光。

　　如何将基因导入DC以及DC或转基因的DC和胰腺癌细胞有效地融合，以其达到最大限度地治疗胰腺癌是当今或将来急需解决的问题。

【参考文献】
　　［1］Dallal RM,Lotze MT.The dendritic cell and human cancer vaccines［J］.Curr Opin Immunol,2000,12:553～558.

　　［2］孙早喜,孙诚谊,王福生.胰腺癌等肿瘤的免疫治疗［J］.世界华人消化杂志,2002,10(1):90～93.

　　［3］王煜,牛洪泉,董芳永,等.树突状细胞疫苗免疫治疗策略［J］. 中华实验外科杂志，2005,6(22):757.

　　［4］Inaba K,Inaba M,Naito M,et al.Dendritic cell progenitors phagocytose particulates, including bacillus Calmette-Guerin organisms, and sensitize mice to mycobacterial antigens in vivo［J］. J Exp Med 1993,178(2):479～488.

　　［5］Sallusto F,Cella M,Danieli C,et al.Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocompatibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products［J］.J Exp Med 1995,182(2):389～400.

　　［6］Sallusto F,Lanzavecchia A.Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha［J］. J Exp Med 1994,179(4):1109～1118.

　　［7］Mailliard RB,Dallal RM,Son YI,et al.Dendritic cells promote T-cell survival or death depending upon their maturation state and presentation of antigen［J］.Immunol Invest，2000 May,29(2):177～185.

　　［8］Ranieri E,Kierstead LS,Zarour H,et al.Dendritic cell/peptide cancer vaccines: clinical responsiveness and epitope spreading［J］.Immunol Invest，2000 May

　　［9］Mule JJ.Tumor vaccine strategies that employ dendritic cells and tumor lysates:experimental and clinical studies［J］.Immunol Invest 2000,29(2):127～129.

　　［10］Kugler A,Stuhler G,Walden P,et al.Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor cell-dendritic cell hybrids［J］.Nat Med.2000 Mar,6(3):332～336.

　　［11］Timmerman JM, Levy R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy［J］. Annu Rev Med 1999,50:507～529.

　　［12］Kimura M,Tagawa M,Takenaga K,et al.Loss of tumorigenicity of human pancreatic carcinoma cells engineered to produce interleukin-2 or interleukin-4 in nude mice: a potentiality for cancer gene therapy［J］.Cancer Lett.1998 Jun 5,128(1):47～53.

　　［13］泼曼.应用细胞混合体治疗胰腺癌［J］.国外医学情报,2001,22(4):26.

　　［14］孙早喜，孙诚谊，王福生.树突状细胞疫苗诱导免疫效应细胞对PC3生长的抑制作用［J］.中华实验外科杂志，2006，23（1）：26～27.

　　［15］孙诚谊，孙早喜，王福生.树突状细胞的扩增及培养上清液对胰腺癌细胞凋亡的研究［J］.中华实验外科杂志,2003,20(12):1089～1091.

作者单位：海南医学院附属医院外科，海南海口 570102.

日期：2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第2期]栏目

新城疫病毒对胃癌细胞抗原修饰作用的研究

【摘要】 目的研究新城疫病毒（NDV）的抗原修饰作用在抗原致敏树突细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养NDV体外杀伤胃癌（SGC7901）细胞中所发挥的影响。方法从正常人外周血单个核细胞诱导DC、CIK细胞，用胃癌细胞SGC7901抗原致敏DC。致敏DC与CIK共培养，制备经胃癌抗原致敏的DC诱导CIK细胞（抗原DCCIK）。MTT法检测抗原DCCIK对经与未经NDV作用的SGC7901细胞的杀伤效应，并观察阻断靶细胞表面非主要组织相容性复合体（MHC）后靶细胞杀伤效应的变化。结果效靶比为20∶1时，联合应用 NDV前后，抗原DCCIK对胃癌细胞SGC7901杀伤活性分别为（69.3±1.5）％和（89.0±1.4）％，差异有显著意义（t=24.49,P<0.01）；阻断靶细胞MHC分子后，抗原DCCIK对经与未经NDV作用的SGC7901细胞杀伤活性分别降低了30.8％和21.1％，与NDV修饰胃癌抗原的作用直接相关的特异性杀伤细胞对胃癌的杀伤效力约为9.7％。结论抗原DCCIK并NDV是一种有效的抗胃癌生物治疗方式，NDV可对胃癌细胞抗原进行修饰，从而增强肿瘤细胞的抗原免疫反应性。

【关键词】 胃肿瘤；树突细胞；杀伤细胞；新城疫病毒

THE EFFECT OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS ON ANTIGEN MODIFICATION AGAINST GASTRIC CANCER LI HUI, WANG ZHEN, MAO WEIZHENG, et al (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); ［ABSTRACT］ Objective To investigate the effects of antigen modification of newcastle disease virus (NDV) on killing gastric cancer (SGC7901) in vitro. Methods Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors were induced to become dendric cells (DC) and CIK, using tumor antigen extracted from gastric cancer SGC7901 cells to sensitize DC, antigenpulsed dendritic cells were cocultured with CIK to generate CIK induced by gastric cancer antigenpulsed DC (antigenDCCIK). The lethal effect of SGC7901 cells which were modified or not modified by NDV was detected by MTT and the lethal effect on target cells after blockage of MHC molecule observed as well. Results At 20∶1 effectortarget ratio, the cytotoxic activity of antigenDCCIK against SGC7901 modified or not modified by NDV was (89.0±1.4)％ and (69.3±1.5)％, respectively (t=24.49,P<0.01), after target cell MHC molecule was blocked, the cytotoxic activity reduced by 30.8％ and 21.1％, respectively, the specific cytotoxic activity directly related to cancer antigen modified by NDV was about 9.7％. Conclusion AntigenDCCIK combined with NDV is an effective antigastriccancer biotherapy, NDV can modify the antigen of gastric cancer cell and enhance its antigen immunoreactivity.

［KEY WORDS］ Stomach neoplasms; Dendritic cells; Killer cells; Newcastle disease virus

以细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）为免疫效应细胞治疗胃癌的研究已广泛开展。而用抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导CIK能进一步增强CIK的杀伤作用，并表现出了特异性杀伤活性[1]。然而，肿瘤细胞的抗原大多较弱或隐含，大大削弱了免疫效应细胞对胃癌细胞的杀伤能力。因此，将抗原致敏的DC诱导CIK与具有显露肿瘤抗原能力的新城疫病毒（NDV）联合应用可以具有更强的杀伤效果。本实验通过比较联合应用NDV前后特异性杀伤活性的变化，分析NDV显露胃癌抗原的作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人重组白细胞介素2（rhIL2）、CD3单抗人重组GMCSF（rhGMCSF）、人重组IL4（rhIL4）、肿瘤坏死因子（TNFα）、干扰素（IFNγ）购自Peprotech 公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自军事医学科学院；PBS缓冲液购自北京中山生物技术有限公司；鼠抗人HLAA、B、C，鼠抗人HLADP，鼠抗人HLADR抗体购自Biolegend公司；胎牛血清FCS购自杭州四季青生物制品公司；RPMI1640培养基购自Gibco公司；MTT液购自Sigma公司；CD3FITC/CD56PE鼠抗人单克隆抗体购自BioVision公司；NDV Lasota株，由中国动物卫生与流行病中心主任王克亮教授馈赠；人胃癌细胞SGC7901由我院肿瘤研究室提供。

1.2 冻融法制备SGC7901胃癌细胞抗原

收集对数生长期的SGC7901细胞，用PBS液调整细胞密度为1×1010/L，封装入冻存管。置液氮内冷冻10 min，放入37 ℃水浴中静置10 min，重复3次。再经10 000 r/min离心30 min，取其上清置－20 ℃保存备用。

1.3 抗原DCCIK的制备

取健康志愿者外周静脉血50 mL,肝素化，用PBS液1∶1稀释后与Ficoll液混合离心收集单个核细胞（PBMC）。加入含体积分数0.10 FCS的RPMI1640培养基，调整细胞密度为2×109/L，移入T25培养瓶中，置37 ℃、体积分数0.05的CO2细胞培养箱中培养2 h后，收集非贴壁细胞，作为CIK的前体细胞。贴壁细胞采用含0.2 mg/L的rhGMCSF、10×105U/L rhIL4和体积分数0.10的FCS的RPMI1640培养基于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养温箱中培养，每3 d半量换液。培养的第5天，在贴壁细胞培养瓶中每瓶加入0.5 mL肿瘤抗原。培养的第6天，在加入肿瘤抗原的培养瓶中每毫升培养基加入1 000 U TNFα。继续培养24 h后，获得抗原致敏的DC。收集非贴壁细胞，用含体积分数0.10的 FCS的RPMI1640培养基调整细胞密度为1×109/L，移入T25培养瓶中，同时每毫升培养基中加入1 000 U的IFNγ，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养24 h后，每毫升培养基中加入CD3单抗50 ng和1 000 U的rhIL2。每3 d半量换液，同时补足CD3单抗及rhIL2。培养的第7天将抗原致敏的DC与部分CIK以1∶3的比例混合，以CIK培养液继续培养7 d收获抗原DCCIK。

1.4 抗原DCCIK的表型检测

光镜下观察抗原DCCIK的形态；培养的第14天以流式细胞仪分析荧光染色标记抗原DCCIK细胞表型CD3/CD56。

1.5 MTT比色法测定效应细胞体外杀伤活性

取对数生长期的SGC7901细胞各100 μL，接种于96孔板中，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养，其中经NDV作用组加入20 μL的NDV（1∶1 024）作用4 h，待细胞长成单层后，MHC分子阻断组加入20 mg/L的鼠抗人HLAA、B、C、HLADP、HLADR各20 μL，MHC分子非阻断组及对照组加60 μL的PBS，37 ℃下作用1 h。调整效应细胞至所需密度，按效靶比为20∶1加入效应细胞，每种分组设3个复孔，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养20 h后，采用MTT比色法测定各组效应细胞的杀伤活性。将该实验在相同条件下重复3次,计算其杀伤活性。杀伤活性=1－实验孔A值×效应细胞对照孔A值靶细胞对照孔A值×100%。

1.6 统计学方法

使用SPSS 12.0及PPMS 1.5[2]统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，统计处理采用t检验。

2 结果

2.1 抗原DCCIK细胞表型分析

流式细胞仪分析表明，培养14 d时，抗原DCCIK细胞群中CIK特征性细胞表型CD3+ CD56+双阳性细胞所占比例可达（36.3±3.5）%。

2.2 联合应用 NDV前后抗原DCCIK的体外细胞毒活性

MTT 比色法测定抗原DCCIK组和NDV+抗原DCCIK组对胃癌细胞SGC7901的杀伤活性显示,在效靶细胞比为20∶1时，联合应用 NDV前抗原DCCIK对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性为（69.3±1.5）％，联合应用 NDV后抗原DCCIK对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性可达到（89.0±1.4）％,杀伤活性明显增强（t=24.49,P<0.01）。

2.3 靶细胞MHC分子阻断对NDV＋抗原DCCIK和抗原DCCIK体外细胞毒活性的影响

阻断靶细胞MHC分子后，NDV+抗原DCCIK联合组对胃癌细胞SGC7901的杀伤活性由（89.0±1.4）％降为（58.2±1.7）％，杀伤活性降低了30.8％；抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞的杀伤活性由（69.3±1.5）％降为（48.1±1.5）％，杀伤活性降低了21.1％。联合应用 NDV后抗原DCCIK中特异性杀伤细胞对靶细胞的杀伤活性增加了约9.7％。

3 讨论

体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法是继手术、放疗、化疗之外的另一种肿瘤治疗方法。CIK是将人外周血PBMC在体外用多种细胞因子诱导而获得的以CD3+ CD56+双阳性细胞为主的异质细胞群，是一种具有广谱杀瘤活性的MHC限制性免疫效应细胞[3,4]。DC是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞，可有效激发T细胞应答, 从而引发一系列的免疫应答[5]。利用肿瘤抗原致敏的DC与CIK共同培养可充分利用DC的作用，获得负载肿瘤相关抗原的抗原DCCIK细胞，可以提高CIK对肿瘤的杀伤效果，并表现出了特异性杀伤活性[6]。然而，肿瘤细胞表面存在的肿瘤相关抗原大多较弱或隐含，不足以引起宿主有效的抗肿瘤免疫反应并且使其能逃避免疫效应细胞杀伤，故仅注重免疫效应细胞杀伤能力的增强在抗肿瘤治疗中疗效大打折扣。NDV是副黏病毒科腮腺炎病毒属的成员，NDV能够特异性感染肿瘤细胞，而对人的正常细胞则没有杀伤作用[7]。NDV不仅有直接杀伤肿瘤细胞和调节机体免疫的作用，而且其在肿瘤细胞内复制使细胞表面产生了大量病毒表达的血凝素神经氨酸酶（HN），该酶可使肿瘤细胞表面的唾液酸量减少，暴露出隐藏的抗原决定簇，从而增加了肿瘤细胞的免疫反应性，使特异性杀伤细胞有更多的杀伤靶点[8]。先用NDV显露肿瘤抗原后再用抗原DCCIK细胞杀伤肿瘤无疑可起到抗肿瘤协同作用。本实验结果证实，抗原DCCIK联合应用NDV体外对胃癌细胞杀伤活性可达89%，是一种有效的抗肿瘤生物治疗方式。

本实验用鼠抗人HLA抗体阻断胃癌靶细胞MHC分子，阻止特异性杀伤细胞与肿瘤细胞表面的MHC抗原肽复合物识别，从而阻断特异性杀伤细胞对靶细胞的杀伤活性。结果显示，阻断靶细胞MHC分子后，NDV+抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞杀伤活性降低了30.8％，抗原DCCIK组对SGC7901肿瘤细胞杀伤活性降低了21.1％。提示抗原DCCIK联合应用 NDV后，特异性杀伤细胞对靶细胞杀伤活性明显增加。体外实验不存在NDV影响机体免疫能力的因素，联合应用 NDV前后抗原DCCIK中特异性杀伤细胞的性质和数量并没有变化，因此NDV修饰胃癌细胞抗原使肿瘤抗原显露增加与特异性杀伤活性增加直接相关。

本研究证实，抗原DCCIK联合应用NDV是一种有效的抗肿瘤生物治疗方式，联合应用NDV，除了NDV自身对肿瘤的杀伤作用外，还具有修饰胃癌细胞抗原增强其抗原免疫反应性的作用，可显著增加特异性杀伤细胞对肿瘤的杀伤能力，与NDV修饰胃癌抗原的作用直接相关的特异性杀伤细胞对胃癌的杀伤效力约为9.7％。

【参考文献】
[1]安岗,毛伟征,代震波,等. 抗原致敏树突细胞增强细胞因子诱导杀伤细胞抗胃癌的效应[J]. 中华实验外科杂志, 2008,25(4):422424.

[2]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.

[3]THORNE S H, NEGRIN R S, CONTAG C H. Synergistic antitumor effects of immune cellviral biotherapy[J]. Science, 2006,311(24):1780217841.

[4]代震波,毛伟征,牛兆建,等. 体外扩增CIK细胞杀伤胃癌细胞SGC7901[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2007,14(2):100103.

[5]宫安静,孟庆海,朱湘华. 树突状细胞诱导的CTLs与CIK及LAK细胞对神经胶质瘤杀伤作用比较[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(2):159161.

[6]李世俊,张连生,柴晔,等. 树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞共培养对多药耐药肿瘤细胞系的杀伤活性[J]. 中华肿瘤杂志, 2007,29(10):733737.

[7]PECORA A L, RIZVI N, COHEN G I, et al. Phase Ⅰ trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers [J]. Clin Oncol1, 2002,20(9):22512266.

[8]EISENTHAL A, RAMARKRISHNA V, SKORMICK Y, et al. Induction of cellmediated immunity against B16BL6 melanoma in mice vaccinated with cells modified by hydrostatic pressure and chemical crosslinking[J]. Cancer Immunol Immunother, 1993,36(5):300306.

作者单位：1 青岛大学医学院附属医院普外科，山东青岛 266003； 2 山东省青岛疗养院

日期：2009年8月25日 - 来自[2009年第24卷第4期]栏目

慢性HBV感染免疫治疗研究进展

慢性HBV感染是严重危害人类健康的疾病。目前国内外对HBV感染公认的疗法是抗病毒治疗。但随着对病毒性肝炎发病机制的深入研究,人们也在尝试用各种免疫的方法治疗慢性HBV感染。
    以疫苗为基础的免疫治疗
     治疗性疫苗是通过某种途径来弥补或激发机体的免疫反应,达到清除病毒的目的。核酸疫苗又称DNA疫苗,它不仅可诱导体液免疫应答,而且能诱导强烈的细胞免疫应答,有望用于病毒性肝炎的治疗。Jung M-C等应用前S1、前S2和S抗原组分疫苗,能够引发慢性HBV携带者针对HBsAg的CD4+T淋巴细胞应答,但未能介导Thl细胞因子分泌和病毒特异性CD8+T淋巴细胞应答。Gray研究小组采用HBV核心区细胞毒性T淋巴细胞(CTL)结合表位第18-27氨基酸、破伤风毒素以及棕榈酸分子制备成治疗性疫苗,I期临床试验结果显示该疫苗安全,并能活化抗原特异性CTL,其水平与急性自限性肝炎的CTL相当。但对慢性肝炎病人的研究发现,该疫苗只激发低水平的CTL应答,不能有效清除病毒或降低HBV DNA水平。进一步研究发现,慢性病毒性肝炎病人的T辅助性细胞反应低下,不能产生大量的细胞因子以及对破伤风毒素的免疫应答,是疫苗反应低下的原因。
    以细胞因子为基础的免疫治疗
     在机体抗病毒的免疫反应中有多种细胞因子参与,其中,粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFN-α及IL-2在感染性疾病治疗中的辅助作用,受到越来越多的重视。在病毒特异性CTL的过继性回输中,研究者发现IL-2对效应T细胞的存在和增殖起关键作用。近年来,随着IFN-α重组高纯度细胞因子的研制成功,使其在临床上治疗乙型肝炎、生殖器疱疹等疾病中取得了良好效果。另外,随着对病毒性疾病的细胞生物治疗的开展,细胞因子作为细胞过继治疗中不可缺少的重要的辅助因子发挥着重要的作用,如在树突细胞(DC)的过继治疗中IL-12的刺激不仅影响DC的表型和功能,而且还对DC活化特异性T细胞作用有一定的影响。在DC的过继免疫中,有学者通过IL-12因子刺激或用构建好的缺陷型Ad-IL-12载体转染DC,使DC表达IL-12的基因来进一步改善DC的功能或活化。
    以免疫效应细胞为基础的免疫治疗
     在机体抗病毒感染的特异性免疫反应中,细胞免疫起重要作用。有研究证明,在病毒慢性感染者的机体内,特异性T细胞的杀伤活性非常弱,甚至处于“无能”状态,产生“耐受性”。回输具有病毒特异性的CTL能清除体内病毒。人们普遍认为病毒清除是CTL在组织相容性复合物(MHC)类分子限制下,通过对病毒感染细胞的细胞毒作用实现的。但在HBV转基因小鼠模型中发现,CTL在清除病毒过程中,通过分泌TNF-α和TNF-β下调HBV mRNA的水平,抑制HBV复制,却不引起肝细胞的损伤。Vitello等用一种含脂质体、T辅助细胞和CTL识别位点的HBV疫苗免疫动物和人,可明显增强CTL位点抗原性作用,增强特异性CTL的产生,治疗HBV的感染。在一些动物模型中(如HBV感染鼠)已证明回输有病毒特异性的CTL能彻底清除动物体内病毒。
    以抗原递呈细胞为基础的免疫治疗
     慢性病毒性感染的机体都存在不同程度的免疫功能低下,患者的抗原递呈细胞(APC)往往不能正确地处理和递呈抗原信号。我们的研究发现,在慢性HBV感染的病人中,DC的表型及功能均与正常人有差异,表现为参与刺激信号传导的表面分子表达下降,混合淋巴细胞培养中促淋巴细胞增殖能力下降,其究竟是病毒感染所致的结果,还是导致病毒持续感染的原因至今仍不清楚。但是采用病毒抗原多肽在体外刺激DC,可大大提高对病毒抗原的递呈,激发特异性CTL的免疫应答反应。另外,一些佐剂的使用如poly I∶C、CpG等也可在体外大大改善DC的表型和功能。这些通过体外刺激恢复并改善DC功能的研究,为基于抗原递呈细胞的临床免疫治疗奠定了基础。国内已经有学者应用抗原负载的DC疫苗治疗慢性乙型肝炎取得一定效果。但应用DC介导的免疫治疗前,有诸多问题应该深入细致研究,如:感染者DC状态功能低下究竟是感染的原因还是结果?哪种抗原或多肽是最佳刺激抗原?其剂量和作用时间如何?输注到体内的DC能否有效发挥预期的作用?
    其他免疫相关的治疗
     有研究者给42例慢性乙型肝炎患者口服含有HBsAg+preSl+preS2的疫苗,3次/周,用20~30周。结果28例患者(66.6%)出现应答,15例(35.7%)病毒载量明显下降,12例(30%)组织学改善明显,26.3%出现HBeAg阴转,并且发现T细胞应答反应。新近日本学者报告,联合拉米夫定和乙肝疫苗治疗72例慢性乙型肝炎患者,取得一定效果。72例患者应用拉米夫定12个月,其中15例(9例HBeAg阳性、6例HBeAg阴性)接受20μg乙肝疫苗皮下注射每2周1次,共12次。结果联合组9例HBeAg阳性者治疗结束时HBV DNA均阴转(100%),而单用拉米夫定组31例HBeAg阳性者只有15例(48%)阴转(P<0.05);血清转换发生率联合组为56%,单用拉米夫定组为16%(P<0.05)。57例单用拉米夫定患者停药后10例HBV DNA阳转,且4例出现肝炎发作,而联合组未发现此现象。研究结果提示,联合疫苗和拉米夫定治疗可望提高持久应答和血清转换率。

日期：2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

雷公藤多甙与DC单抗对小鼠自身免疫性甲状腺炎作用的研究

免疫学杂志 1999年第2期第15卷基础免疫学

作者：王胜军　许化溪　江淑芳　柳龙图　刘恭植

单位：王胜军、许化溪、柳龙图、刘恭植(镇江医学院免疫学研究室镇江 212001)；江淑芳(南京81医院南京 210002)

关键词：雷公藤多甙　树突状细胞单克隆抗体　自身免疫性甲状腺炎　小鼠

　　摘　要在建立小鼠自身免疫性甲状腺炎（AIT）的基础上，研究雷公藤多甙和树突状细胞（DC）单克隆抗体对诱导小鼠AIT的影响。结果表明，经雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用后，与未用药组相比，血清中TgAb水平、Tg刺激的淋巴细胞增殖能力、脾淋巴细胞产生TNF水平均显著降低（P＜0．05），其中以联合应用组尤为明显，病理学检查亦与之相符。提示雷公藤多甙、DC单抗的应用对小鼠AIT的发生具有抑制作用。

　　中图号 R392.11

EFFECTS OF TRIPTERYGIUM WILFORDII POLYGLYCOSI-DIUM

　　AND ANTI-DENDRITIC CELL McAb ON AUTOIMMUNE

　　THYROIDITIS IN MOUSE

Wang Shengjun，Xu Huaxi，Jiang Shufang，Liu Longtu，Liu Gongzhi

　　（Department of Immunology，Zhenjiang Medical College，Zhenjiang 212001）

　　Abstract In this paper，the autoimmune thyroiditis（AIT）of mice was used as an experimental model，and the effects of tripterygium wilfordii polyglycosidium（TWP）and anti-DC McAb on AIT were studied．The results showed that the levels of thyroglobulin antibody，the proliferation of lymphocytes stimulated by thyroglobulin and the levels of tumor necrosis factor were significantly decreased in the TWP or anti-DC McAb group，（P＜0．05）especially in the TWP administered Anti-DC McAb group．Pathologic observation also proved these results ．It was suggested that TWP and anti-DC McAb had immunosuppressive effect on AIT．

　　Key words Tripterygium wilfordii polyglycosidium，Anti-Dendritic cell McAb，Autoimmune thyroiditis，Mice

　　自身免疫性甲状腺炎（AIT）是临床上一种常见的器官特异性自身免疫性疾病，其甲状腺主要表现为慢性淋巴细胞浸润性炎症^［1，2］，雷公藤多甙（Tripterygium Wilfordii Polyglyco-sidium，TWP）作为一种免疫抑制剂已初步应用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗^［3］，我们以前的工作^［4］也提示树突状细胞（DC）单克隆抗体对正常大鼠有免疫抑制作用。本文在建立小鼠AIT的基础上，观察雷公藤多甙与DC单抗在抑制小鼠AIT发生中的作用，探讨二者对AIT治疗的可能性。

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂　雷公藤多甙片（江苏省泰州制药厂），DC单克隆抗体（33D1，美国Rockfeller大学Steinman教授惠赠）；RPMI1640培养基（Gibco公司）；HRP-羊抗小鼠IgG（华美生物工程公司）；MTT（Fluka公司）；ConA（Sigma公司），其余均为国产分析纯试剂。

　　1.2　动物　CBA小鼠，雌性，体重20g左右，中科院实验动物中心引进。

　　1.3　小鼠自身免疫性甲状腺炎（AIT）模型的建立　参见文献［5，6］。简言之，取小鼠甲状腺球蛋白（Tg）与福氏完全佐剂充分混合，注射小鼠足垫部，间隔两周注射其背部皮下，再间隔两周重复一次，于第12周时检测小鼠血清中TgAb水平，并将小鼠甲状腺作病理学检查，观察甲状腺中淋巴细胞浸润情况。

　　1.4　动物分组　①正常对照组，未作任何处理；②AIT模型组；③TWP处理组，先给小鼠TWP片溶液灌胃，剂量为30mg／（kg^.d），连续10d，再按上述方法建立AIT模型；④DC单抗（33D1）组，先给小鼠尾静脉注射33D1，剂量0．1ml，连续5d，再按上述方法建立AIT模型；⑤TWP＋33D1组，按③方法灌胃，同时尾静脉注射33D1，连续5d，再按上述方法建立AIT模型。

　　1.5　血清TgAb水平测定　采用常规间接ELISA法，结果以OD₄₉₀表示。

　　1.6　病理学检查　取小鼠甲状腺组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜检查。

　　1.7　TNF的诱生及测定　常规分离脾淋巴细胞，加入细胞培养板中（细胞浓度1×10⁷），同时加入ConA（5μg／ml）培养48h后收集上清；TNF的检测参见文献［7］。

　　1.8　Tg刺激的淋巴细胞增殖试验　参见文献［6］。

　　2　结果

　　2.1　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用对小鼠血清中TgAb水平的影响　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用组的小鼠血清中TgAb水平均明显低于AIT组，其中以联合应用组最为明显（见表1）。

　　2.2　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用对TNF的影响　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用组的小鼠，其TNF水平也明显低于AIT组（见表1）。

　　2.3　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用对Tg刺激的淋巴细胞增殖试验的影响　雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用组的小鼠，其Tg刺激的淋巴细胞增殖能力均显著低于AIT组，雷公藤多甙及联合应用组的下降水平又较DC单抗组明显（见表1）。

表1　各组小鼠TgAb、TNF水平及Tg刺激的淋巴细胞增殖能力

　　Tab 1　The levels of TgAb，TNF and the proliferation of lymphocyte by Tg in different group

Group	TgAb	TNF	Tg stimulated lymphocyte 　　proliferation response
control	0．22±0.04	26.91±3.12	0.34±0.06
AIT	1.07±0.07	44.86±3.80	0.67±0.05
TWP	0.61±0.05^a^，b	34.39±1.67^a	0.46±0.05^a
33D1	0.68±0.06^a^，b	33.27±3.77^a	0.57±0.08^a^，b
TWP＋33D1	0.41±0.06^a	30.09±3.13^a	0.42±0.04^a

note：n＝5； ^acompared with AIT：P＜0.05； ^bcompared with TWP＋33D1：P＜0.05

　　2.4　病理学检查　AIT组小鼠甲状腺，镜下可见甲状腺滤泡萎缩，同时有少量淋巴细胞浸润；而雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用的小鼠，其甲状腺滤泡基本正常，仅偶见淋巴细胞浸润；正常组小鼠未见上述病理变化。

　　3　讨论

　　现有研究表明雷公藤多甙具有一定的免疫抑制作用，且已初步应用于移植排斥反应、自身免疫性疾病的防治，本研究在应用雷公藤的同时，加入少量树突状细胞单抗，旨在观察中西医结合的免疫抑制效应，为进一步应用于自身免疫性甲状腺炎的临床治疗提供理论依据。自身免疫性甲状腺炎的典型表现为甲状腺出现淋巴细胞浸润，甲状腺滤泡萎缩，血清中TgAb水平显著升高。本试验结果显示，经雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用的小鼠，血清中TgAb水平较AIT组小鼠有显著下降，甲状腺中仅偶见淋巴细胞浸润，无其它病理改变，且联合应用较单独应用效果明显，这表明雷公藤多甙、DC单抗联合应用对抑制AIT的发生有较好的效果，至于二者是否具有相似的临床防治效果，还有待进一步研究和临床验证。

　　多数学者认为AIT的发生与T细胞功能失衡有关^［2，8］，Tg刺激的淋巴细胞试验结果提示，AIT小鼠体内存在大量的针对特异性自身抗原（Tg）的T细胞，这类T细胞是产生自身免疫的重要因素。Okayasu等^［9］用致敏活化的T细胞转移给正常小鼠，结果引起AIT的相似症状，进一步说明T细胞尤其是活化的自身反应T细胞在AIT中起着重要作用。经雷公藤多甙、DC单抗单独及联合应用的小鼠，Tg刺激的淋巴细胞增殖能力显著降低，提示雷公藤多甙、DC单抗的应用很可能是通过抑制自身反应T细胞而发挥作用。

　　活化的T细胞可产生多种细胞因子，介导攻击甲状腺滤泡，引起免疫病理损伤^［8］。TNF在炎症反应中是引起局部组织损伤的重要因子之一，它能够促进局部组织MHCⅡ类分子异常表达和其它炎症因子的释放。本文结果显示，AIT小鼠脾淋巴细胞分泌TNF的能力显著高于正常小鼠，但应用雷公藤多甙、DC单抗后，TNF水平明显降低，表明雷公藤、DC单抗对TNF等炎症因子的释放有一定的抑制作用。因此，从本实验结果来看，应用雷公藤多甙、DC单抗，尤其是联合应用对抑制小鼠AIT的发生有较好的效果，有关临床应用将作进一步的研究。

　　* 江苏省教委资助项目

　　作者简介　第一作者：男，30岁，在职硕士，讲师

　　参考文献

　　1　Misaki T，Konisni J，Nakashima T，et al．Immunohistological phenotyping of thyroid infilitrating lymphocyte in Graves′ disease and Hashimoto′s thyroiditis．Clin Exp Immunol，1985，60：104

　　2　Ahmann AJ，Burman KD．The role of T lymphocyte in autoimmune thyroid disease．Endocrinol Metab Clin North Am，1987，16：287

　　3　陶学濂，孙瑛，董怡，等.雷公藤多甙治疗类风湿关节炎的双盲研究.中华内科杂志，1987，26：399

　　4　潘志超，许化溪，刘恭植，等.大鼠树突状细胞单抗生物学特性的实验研究.免疫学杂志，1994，10：94

　　5　王胜军，许化溪，潘志超，等.小鼠实验性自身免疫性甲状腺炎的初步研究.镇江医学院学报，1997，7：7

　　6　王胜军，许化溪，刘恭植，等.实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠细胞免疫状态的研究.上海免疫学杂志，1998，18：35

　　7　章卫平，曹雪涛.WEHI164-C1细胞株检测TNF的MTS／PMS比色法的建立.免疫学杂志，1994，10：263

　　8　Utiger RD．The pathogenesis of autoimmune thyroid di-sease．N Eng J Med，1991，325：278

　　9　Okayasu I．Transfer of experimental autoimmune thyroiditis to normal syngeneic mice by injection of mouse thyroglobulin-sensitized T lymphocytes after activation with concanavalin A．Clin Immunol Immunopathol，1985，36：101

（1998-06-24收稿；1998-10-19修回）

日期：2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

手术切除肺鳞癌标本中DC浸润对预后的意义

中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷临床免疫学

作者：龚选举　阎玉虎　吴建平

单位：湖北省肿瘤医院，武汉 430070

　　关键词: 肺鳞癌；DC浸润；预后

　　摘　要　目的：研究肺鳞癌组织中DC的浸润程度及对预后的影响。方法：将S-10 0蛋白作为DC的特异性标记物，应用SABC免疫学方法检测肺鳞癌组织中DC的分布。结果：50例肺鳞癌中，DC显著浸润的20例，5年生存率为59％。轻度浸润的30例，5年生存率为19.1％。50 例鳞癌中，低分化鳞癌27例，DC显著浸润的11例，5年生存率为55％。轻度浸润的16例，5年生存率为12.8％。高分化鳞癌23例，DC显著浸润的11例，5年生存率为66.8%。轻度浸润的12 例，5年生存率为27.2%。经Log-rank检验，在显著浸润和轻度浸润组二者之间有显著差异。结论： 肺鳞癌组织中DC显著浸润的预后明显好于轻度浸润的病例。

　　中国图书分类号　R734.2

The significance to survival of DC infiltrated in lung squamous cell carcinoma excised by operation

GONG Xuan-Ju，YAN Yu-Hu，WU Jian-Ping.

　　(Hubei Cance r Hospital，Wuhan 430070)

　　Abstract　Objective: To study the infiltration degree of TIDC in lung cancer and the effect of it on prognosis.Methods: Use S-100 protein as the specific la bel marker of DC,adopt immunohistochemistry SABC method to detect the distributi on of DC in lung cancer.Results:Among 50 lung squamous cell carcinomas, 20 ar e infiltrated with DC markedly,five-year survival rate is 59%.30 showed slight d egree infiltrated,five-year survival rate is 19.1%.Among 50 squamous cell car cin oma,27 are low differentiate squamous cell carcinoma,and 11 are DC infiltrated m arkedly,five-year survival rate is 55%,while 16 are slight degree infiltrated,f i ve-year survival rate is 12.8%;23 are high differentiate squamous cell carcino ma ,and 11 are DC infiltrated markedly, five-year survival rate is 66.8%,while 12 a re slight degree infiltrated, five-year survival rate is 27.2%.These data wer e e xamined with Log-rank test,there is significant difference between markedly inf iltrated group and slightly degree infiltrated group.Conclusion: The prognosis of lung squamous cell carcinoma cancers which have DC markedly infiltrated is su perior to those of slightly degree infiltrated patients.

　　Key words　Lung squamous cell carcinoma　DC infiltrated　Progno sis

　　应用免疫组织化学的方法研究肿瘤组织中树突状细胞（Dendritic cell,DC）的浸润，自90年代以来成为免疫学界一直关注的热点，国内某些实验室也开始转入这方面的研究［1-3］。研究手术切除的实体瘤内的DC浸润情况，国外时有报道，国内则研究甚少。我们研究了手术切除肺鳞癌组织中DC的浸润情况，报道如下。

　　1　材料与方法

　　材料来源于1978年至1994年间湖北省肿瘤医院手术切除的肺鳞癌病例共50例。为了便于分析比较，选择的病例在治疗方式及临床分期上都一致（T₂N₀M₀）。所有病例都获得随访及生存时间的统计。全部病例的组织切片均为原发肺鳞癌病理切片。肿瘤组织中DC的标记，采用免疫组织化学即S-100蛋白阳性方法进行研究。由于DC内也存在 S-100蛋白，因此，将S-100蛋白作为TIDC的特异性标记物^［4］。免疫组化方法采用SABC法。所有试剂采用武汉博士德生物公司提供的即用型试剂盒，操作步骤按试剂盒说明进行。S -100蛋白阳性标记的树突状细胞在肿瘤组织中的浸润程度是依据Furukawa等提出的分级标准：0～20个阳性细胞为无至轻度浸润；20个以上为显著浸润。生存曲线是通过Kaplan-Mei er方法获得。预后的因素通过Log-rank检验分析^［5］。

　　2　结果

　　2.1　DC的分布　S-100蛋白阳性标记的DC主要散在分布于肿瘤组织内和癌性间质中，很少见于周围肺组织。这种细胞同肿瘤细胞紧密接触，呈褐黑色，其形态学上有一个不规则的核，胞浆呈分枝状突起，形似树突状，因此而得名树突状细胞，见图1。

　　2.2　DC的浸润　50例鳞癌中，DC显著浸润的20例,占40%。DC无至轻度浸润的30例，占60%。50例鳞癌中，高分化鳞癌23例，其中显著浸润的11例，占47.8％；无至轻度浸润的12例，占52.2％。低分化鳞癌27例，其中显著浸润的11例，占40.7%，无至轻度浸润的16例，占59.3%。

　　2.3　DC浸润与生存的关系　依据DC浸润的程度分为2组，即DC在瘤组织内显著浸润和DC在瘤组织内无至轻度浸润。50例肺鳞癌中，DC显著浸润的20例，存活最长的9年，最短的1.6年，平均4.7年，5年生存率为59％。DC无至轻度浸润的30例，存活最长的6年，最短的1年，平均存活2.7年，5年生存率为19.1％（X²＝6.50,P=0.01,P＜0.05）。50例中高分化鳞癌23例，其中DC显著浸润的11例， 5年生存率为66.8%。无至轻度浸润的12例，5年生存率为27.2%(X²=2.95,P=0 .07，P＞0.05)。低分化鳞癌27例，其中显著浸润的11例，5年生存率为55％。无至轻度浸润16例，5年生存率为12.8％（X²=4.71,P=0.04，P＜0.05，见图2，3，4）。

　　3　讨论

　　能够手术切除的肺癌病人，尽管其病理类型及临床期别一样，但术后病人的生存时间却明显不同，这提示机体内部的免疫功能对肿瘤的发生、发展及限制有一定的作用，这一作用随着免疫学研究的不断深入而进一步得到证实。DC是目前已知功能最强的抗原提呈细胞。自从Steinman 70年代首次报道以来，DC的研究一直受到关注^［3］。90年代以后，由于 DC的体外大量扩增获得成功，从而使DC的研究逐步成为肿瘤实验研究中的一个不断升温的热点。近来的研究发现，大部分外科切除的实体瘤内DC浸润程度与患者的预后有关。浸润DC数量多，则患者的预后好，反之亦然，因此也称肿瘤浸润树突状细胞(Tumor infiltrating dendritic cells,TIDC)，提示瘤内DC与肿瘤的发生、发展有密切的关系。Tsujitani等研究了210 例手术切除的胃鳞癌患者，结果表明DC即S-100阳性显著浸润的82例患者5年生存率为60 .4 %，而轻度浸润的128例患者5年生存率为18.8%^［6］。类似的结果也见于对结、直肠腺癌及食管癌的研究^［4］。Furukawa等研究了40例手术切除的肺鳞癌组织内DC的浸润情况，结果显示，显著浸润的22例患者中，其5年生存率为86.4%，而无至轻度浸润的18例患者5年生存率为38 . 9%^［5］。本文研究了手术切除的50例肺鳞癌组织内DC的浸润情况，其结果显示，50 例中DC显著浸润的20例，DC无至轻度浸润的30例。经Log-rank检验，二者有显著性差异。50例鳞癌中 ,低分化鳞癌27例，其中显著浸润的11例，无至轻度浸润的16例，经Log-rank检验二者有显著差异。高分化鳞癌23例，其中显著浸润的11例，无至轻度浸润的12例，经Log-rank检验，二者无显著性差异。本研究还对手术切除肺鳞癌患者清扫的区域淋巴结进行了研究。结果显示区域淋巴结内DC反应的情况，无论在高分化鳞癌或低分化鳞癌中对病人的生存均无明显影响（P＞0.05），因此，从本组研究的结果看，在肺鳞癌组织中DC显著浸润的病例，其生存和预后明显好于无至轻度浸润的病例，这点与Furukawa等报道的相一致^［5］。同时，DC 在不同分化的肺鳞癌组织内浸润的程度对生存及预后有影响。DC在低分化鳞癌中浸润的程度对预后有影响，而对高分化鳞癌则影响不大。关于DC参与肿瘤免疫的机理，据目前研究的材料提示，它不能直接杀伤肿瘤细胞，但其最大特点是能够显著刺激初始型T细胞(Native T cells)增殖。在机体的细胞免疫和体液免疫中起重要的调控作用^［3］。虽然一个任意选择的免疫学因素与癌症的临床预后的相关性仅处于分析阶段而不足以反应整个复杂机制。但本文可提示浸润于肿瘤中的DC可能在宿主对抗肿瘤的防卫机制中起着重要的作用而影响病人的预后。影响肿瘤病人的预后有诸多因素，但DC的浸润及其对肿瘤的影响，从目前的研究资料来看不得不认为是一个重要的因素。当然对DC的研究还处于实验阶段，进一步的研究将揭示其真正面目。

图1　肺鳞癌组织中S-100蛋白标记阳性DC(SABC法，×200)

　　Fig.1　S-100 protein labeled positive DC in lung squamous cell carcino ma(SABC method,×200)

图2　肺鳞癌中DC浸润对生存率的影响

　　Fig.2　Effect of DC infiltrated to the survival rate of lung squamous cel l carcinoma

图3　肺高分化鳞癌中DC浸润对生存率的影响

　　Fig.3　Effection of DC infiltrated to survival rate of lung high-differe ntiated squamous cell carcinoma

图4　肺低分化鳞癌中DC浸润对生存率的影响

　　Fig.4　Effection of DC infiltrated to survival rate of lung poorly-diffe rentiated squamous cell carcinoma

　　作者简介：龚选举，男，46岁，主任医师，主要从事肺癌和乳腺肿瘤的研究

　　参考文献

　　1，Schuler G,Steinman R M.Dendritic cells as adjuvants for immune mediat ed resistance to tumor.J Exp Med,1997;186:1183

　　2，Adema G J,Hartgers F,Verstraten R et al. A dendritic-cell-derived C-C chemokine that preferentially attracts native T cell.Nature,1997;387:713

　　3，曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展.中国免疫学杂志，1998；14(3)：161

　　4，Lu L,Qian S,Hershberger P A et al. Fas ligand(CD95L) and B7 expressoin on dendritic cells provide counter-regulatory signals for T cell survival and pro liferation.J Immunol,1997;158:5676

　　5，Furukawa T,Watanabe S,Kodama T et al. T-zone histocytes in adenocarcino ma of the lung in relation to postoperative prognosis.Cancer,1985；56:2651

　　6，Tsujitani S,Kakeji Y，Watanabe A et al. Infiltration of dendritic cells in relation to tumor invasion and lymph node metastasis in human gastric cancer.Ca ncer,1990;66:2012

［收稿1999-12-15　修回2000-05-17］

日期：2009年2月21日 - 来自[检验医学]栏目

共 6 页，当前第 1 页 9 1 2 3 4 5 6 :