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液相芯片技术一步反应法联合定量测定人血清CEA、AFP和tPSA

【摘要】  目的 建立用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和总前列腺特异性抗原(tPSA)水平的一步反应法,并对该方法进行评价。方法 制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗体夹心法测定临床血清标本。结果 联合测定CEA、AFP和tPSA的线性范围分别为0.063~200 ng/ml、0.052~66.6 ng/ml、0.016~20 ng/ml; 最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml; 批内精密度<10 %,批间精密度<14 %; 血清标本CEA、AFP和tPSA检测值与化学发光免疫分析法(CLIA)测值的相关系数为0.920~0.940,与液相芯片两步反应法测值的相关系数为0.952~0.979。该方法仅需1 μl标本,2 h即可完成检测。结论 液相芯片一步反应法具有高通量、检测范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有较大临床应用潜力。

【关键词】  液相芯片; Luminex; 肿瘤标志物

Simultaneous Quantitative Determination of Carcinoembryonic Antigen (CEA),Alpha Fetoprotein (AFP) and Total Prostate Specific Antigen (tPSA) in Human Serum by Onestep Luminex Assay

    CHEN Wei1,LI Miaoyan2,LI Ming2

    (1.Department of Pathology,Chengdu Medical College,Chengdu 610083;2.Guangzhou Darui Antibody Engineering Co.Ltd,Guangzhou 510663,China)

    【Abstract】  Objective To establish a onestep assay to simultaneously quantify carcinoembryonic antigen (CEA),alpha fetoprotein (AFP) and total prostate specific antigen (tPSA) in human serum using multiplexed Luminex assay and evaluate its assay performance.Methods Antibodyconjugated microspheres and biotinylated detection antibodies were prepared.A sandwich immunoassay was established to measure the levels of CEA,AFP and tPSA in clinical serum samples.Results The linear range for the measurement of CEA,AFP and tPSA was 0.063~200 ng/ml,0.052~66.6 ng/ml,0.016~20 ng/ml,respectively.The lower detection limit of CEA,AFP and tPSA was 31.3 pg/ml,26.0 pg/ml,7.8 pg/ml,respectively.The intra and interassay coefficients of variation were less than 9 % and 14%.The correlation coefficients (r) of measurement of CEA,AFP and tPSA were 0.920~0.940 compared with chemiluminescence immunoassay (CLIA),and 0.952~0.979 compared with the twostep Luminex assay.In addition,only 1 microliter of serum and 2 hours were required for the assay.Conclusion With the advantages of unique capability of multiplexing and highthroughput,good reproducibility,increased detection range and sensitivity,the onestep Luminex assay would have great potential in future clinical application.

    【Key words】  suspension bead array; Luminex; tumor markers

      肿瘤标志物在肿瘤的临床诊断和治疗中占有重要地位。由于数种肿瘤标志物联合检测对肿瘤的早期诊断及疗效监测更具价值,而同时检测多项指标依靠传统检测手段无法实现,因此在实际工作中亟需一种能够同时完成多指标检测的新型试剂。液相芯片是一种新型生物芯片技术平台,它在不同荧光编码的微球上进行抗原抗体及核酸杂交反应,通过两束激光分别检测微球编码和荧光信号以达到定性和定量分析目的。除了具有快速、灵敏、灵活、准确等显著特点外,液相芯片的最大优势在于高通量,即可同时对同一样本中多达100种目的分子进行分析[1]。作者已应用液相芯片技术建立了联合检测人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和总前列腺特异性抗原(tPSA)水平的两步反应法(即第一步在标准品或血清标本孔中仅加入稀释微球混合液孵育60 min,待抽滤、洗涤后再加入生物素标记抗体混合液继续第二步孵育60 min,研究待发表),为进一步缩短检测时间和简化操作步骤,本研究中作者采取一步反应法同时定量测定了人血清CEA、AFP和tPSA水平,评价了该方法的检测范围、最低检测限、精密度等指标,并将用该方法得到的临床血清标本检测值与化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)和液相芯片两步反应法的测值进行了相关性分析。

    1  材料与方法

    1.1  材料和仪器

    所有单克隆抗体均购自芬兰Medix公司,抗原均购自美国Biodesign公司,羧基化微球购自美国Luminex公司,多孔滤膜板(MultiScreen MABVN 1.2 μm)和真空抽滤装置购自美国Millipore公司,BioPlex检测系统购自美国BioRad公司。CEA/AFP、tPSA阴性和阳性血清标本(经Bayer全自动化学发光免疫分析仪检测)来自解放军301医院、南方医院。

    1.2  微球的交联

    按文献[2]的方法分别制备交联CEA、AFP和tPSA包被抗体的微球。

    1.3  抗体的生物素标记

    按文献[2]的方法分别制备生物素标记的CEA、AFP和tPSA检测抗体。

    1.4  抗原标准品的制备

    用标准品稀释液(75 mg/ml BSA,0.01% Tween 20,0.01 mol/L叠氮钠,0.01 mol/L PBS,pH 7.4)配制同时含有CEA、AFP和tPSA三种抗原的不同浓度水平的标准品。

    1.5  操作方法

    具有不同编码的抗体交联微球各取适量,用分析缓冲液(10 mg/ml BSA,0.01 mol/L叠氮钠,0.01 mol/L PBS,pH 7.4)配制成每微升含有80个各编码微球的稀释微球混合液。多孔滤膜板各孔中加入100 μl分析缓冲液预湿,真空抽滤去除液体,在标准品孔和样品孔中分别加入25 μl/孔的标准品和血清标本(血清标本预先用分析缓冲液稀释25倍),然后每孔先后加入25 μl稀释微球混合液及25 μl生物素标记抗体混合液(各抗体浓度为1~2 μg/ml),室温避光振荡孵育60 min或90 min.真空抽滤去除孔内液体,每孔用100 μl洗涤液(0.05% Tween 20,0.01 mol/L PBS,pH 7.4)洗涤3次,然后每孔加入25 μl藻红蛋白标记的链霉亲和素(SAPE,20 μg/ml),室温避光振荡孵育20 min。再次抽滤并洗涤3次后,每孔加入125 μl洗涤液重悬微球,在BioPlex检测系统上读取各孔荧光值。

    1.6  评价指标

    1.6.1  检测范围  配制含不同浓度水平CEA、AFP、tPSA的标准品,按1.5操作先后与抗体交联微球混合液、生物素标记抗体混合液和SAPE反应后,测定荧光值,得出各抗原的标准曲线。

    1.6.2  最低检测限  测定20个空白孔的荧光值,计算其平均值()及标准差(s)。荧光值等于+2 s时的抗原浓度水平即为各抗原的最低检测限。

    1.6.3  精密度  选取3个CEA/AFP、tPSA阳性血清标本进行测定。考察批内精密度时,3个血清各设8个复孔; 考察批间精密度时,3个血清各测3次,每次各设8个复孔,计算CEA、AFP、tPSA水平的、s及变异系数(CV)。

    1.6.4  与CLIA和液相芯片两步反应法血清检测结果的比较  用液相芯片一步反应法测定30份CEA/AFP和41份tPSA临床血清标本,并将其测值与CLIA和两步反应法的测值进行配对t检验和线性相关回归分析。

    1.7  统计学处理

    使用SPSS 13.0软件进行统计学分析,P < 0.05有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  反应时间的优化

    将CEA、AFP和tPSA的抗体交联微球、抗原标准品与标记抗体按一步反应法共同孵育60 min或90 min,抽滤、洗涤后再加入SAPE孵育20 min,从得到的标准品荧光值(见表1)可看出(以CEA为例),与孵育60 min相比,反应时间为90 min时的标准品荧光值更高,而背景信号更低,因此我们在后续实验中采取共同孵育90 min.表1  一步反应法采用不同反应时间所测CEA标准品的荧光值

    2.2  检测范围

    一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的标准曲线见图1.CEA、AFP、tPSA标准曲线的线性范围分别为0.063~200 ng/ml、 0.052~66.6 ng/ml、 0.016~20 ng/ml,即分别达到3.5、 3.1、 3.1个对数值; 其动态范围分别为0.031~400 ng/ml、 0.052~200 ng/ml、 0.016~60 ng/ml,即分别达到4.1、 3.6、 3.6个对数值。

    2.3  最低检测限

    一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml.

    2.4  精密度

    测定3个阳性血清标本,得出一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批内CV为6.2%~9.7%,批间CV为6.2%~13.7%,说明具有较好的重复性(见表2、3)。

    2.5  与其它方法检测结果的比较

    采用一步反应法测定临床血清标本的CEA、AFP、tPSA水平,并与两步反应法及CLIA的检测结果进行统计学分析。结果表明,尽管一步反应法的测值大多高于两步反应法的测值,但配对t检验显示一步反应法与两步反应法、CLIA的测定结果在统计学上无显著性差异(P>0.05); 线性相关回归分析表明,三种方法所得测值之间的相关系数(r)为0.920~0.979,说明具有良好的线性相关关系(见表4)。表2  一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批内精密度表3  一步反应法联合检测CEA、AFP、tPSA的批间精密度表4  液相芯片一步反应法与两步反应法、CLIA血清检测值的统计学分析结果

    3  讨  论

    肿瘤标志物对于肿瘤普查、诊断、分期、疗效监测及预后判断等具有重要价值,为提高肿瘤诊断的阳性率和特异性,临床上常联合检测多种标志物,但目前常用的检测手段如放射免疫测定、酶联免疫测定、化学发光及时间分辨荧光免疫分析等每次仅能检测一种指标。

      液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术,它是一种可进行蛋白、核酸等生物大分子检测及酶学分析、受体和配体识别分析等研究的多功能技术平台。该技术主要通过可偶联探针的荧光编码微球与红绿两束激光检测实现对被测物的定性和定量分析,一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应[3,4]。与常规检测方法相比,液相芯片技术具有几大显著优点:高通量,可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析,大大提高工作效率; 液相环境更有利于保持生物大分子的天然构象,也更有利于反应进行; 灵敏度、准确性高,重复性、灵活性好; 只需要微量的样品即可进行检测[5,6]。目前国外有越来越多的学者将液相芯片技术用于基础研究和临床诊断领域中,包括检测细胞因子、过敏原、自身抗体、激素、SNP以及感染性疾病诊断、HLA分型、基因表达分析等[710]。

      为利用液相芯片技术的高通量优势,开发出可联合检测多种肿瘤标志物、以期早期发现肿瘤的诊断试剂,作者对联合检测CEA、AFP、tPSA这三种临床常用肿瘤标志物的方法进行了初步研究。在已建立同时定量测定人血清CEA、AFP、tPSA水平的两步反应法的基础上,本研究采用一步反应法进行定量测定。其检测范围广,线性范围达到3.1个对数值以上,超过了CLIA(为2.8~3个对数值),动态范围达到3.6个对数值以上; 最低检测限为7.8~31.3 pg/ml,也大大优于CLIA(分别为90~900 pg/ml)。宽检测范围和高灵敏度确保了含极高或极低水平被检物的血清标本也可被检出。一步反应法的批内和批间精密度低于14%,具有较好的重复性,临床血清测值与CLIA之间呈线性相关关系,相关系数在0.920以上。液相芯片法仅需要1 μl标本即可在2h左右同时完成三种肿瘤标志物的检测,较之CLIA(需要50~60 μl标本)大大节约了试剂、标本用量、人力以及操作时间,因此是一种优于传统检测技术的快速、高通量、多样本检测手段,具有较大的临床应用潜力。

      与抗体交联微球和生物素标记抗体分步加入的两步反应法相比,一步反应法同时加入交联微球、生物素标记抗体进行孵育,可将完成检测的时间缩短约40 min,且在设定的抗原标准品浓度范围内未见Hook反应,但其荧光背景比两步反应法稍高,AFP和tPSA的动态范围略有减小,检测灵敏度稍降。尽管一步反应法的血清测值偏高,但与两步反应法测值之间存在良好的相关性。鉴于一步反应法在操作上的简便、快速性,我们考虑可进一步优化其反应条件,如生物素标记抗体及SAPE浓度。

      下一步作者还将通过大样本测定正常人血清CEA、AFP、tPSA水平而确定一步反应法联合检测三项肿瘤标志物的正常值,并以CLIA为金标准,研究一步反应法的检测灵敏性、特异性和准确性。

【参考文献】
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[2] 陈玮,李明,吴英松,等.用液相芯片技术定量测定人血清CEA、AFP和HBsAg [J].中山大学学报,2007,28 (1):105109.

[3] Waterboer T,Sehr P,Pawlita M.Suppression of Nonspecific Binding in Serological Luminex Assays [J].J Immunol Methods,2006,309 (12):200204.

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[6] Ray CA,Bowsher RR,Smith WC,et al.Development,Validation,and Implementation of a Multiplex Immunoassay for the Simultaneous Determination of Five Cytokines in Human Serum [J].J Pharm Biomed Anal,2005,36 (5): 1 0371 044.

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[10] Flagella M,Bui S,Zheng Z,et al.A Multiplex Branched DNA Assay for Parallel Quantitative Gene Expression Profiling [J].Anal Biochem,2006,352 (1):5060.

日期:2013年2月27日 - 来自[2009年第4卷第1期]栏目
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血清CEA、CY211、NSE检测对原发性肺癌治疗后复发的诊断价值

【摘要】  目的 探讨癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CY211)、神经特异性烯醇化酶(NSE)3种标志物对原发性肺癌治疗后复发的诊断指导意义。方法 回顾性分析我院2000—2005年268例原发性肺癌患者的CEA、CY211和NSE浓度变化。结果 肺鳞癌CY211增高明显,肺腺癌CEA增加明显,小细胞肺癌NSE增加明显,联检阳性率比单项检查阳性率高。结论 联合检测CEA、CY211、NSE对于诊断肺癌复发具有重要临床意义。

【关键词】  肺癌;癌胚抗原;细胞角蛋白19片段;神经特异性烯醇化酶

Significance of measurement of CEA,CY211 and NSE for diagnosis of recurrence of primary lung cancer

  SONG Xiangqin PENG Xinguo ZHOU Yuming AN Xinye ZHAO Yanting

  Department of Inspection ,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University,Binzhou 256603

  【Abstract】 Objective To explore the significance of diagnosis for primary lung cancer recurrence by detecting the expression of CEA,CY211,NSE after therapy.Methods To analyse the expression of CEA, CY211 and NSE of 268 primary lung cancers between 2000 and 2005 in our hospital, retrospectivly.Results The expression of CY211 in squamous cancers rised remarkably; the expression of CEA in adenocarcinoma rised remarkably; and the expression of NSE in smallcell lung cancers rised remarkably. The positive rate of combined measurements was higher than that of single measurement.Conclusion It was very important to diagnose recurrence of primary lung cancer by combined measurement of CEA,CY211 and NSE.

  【Key words】 lung cancer,CEA,CY211,NSE

  原发性肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,治疗后容易复发。复发的诊断目前主要依靠影像学变化,肿瘤标记物的检测也越来越受到临床的重视。回顾性分析我院2000—2005年原发性肺癌268例患者的血清癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CY211)、神经特异性烯醇化酶(NSE)浓度变化,探讨3种标志物(CEA、CY211、NSE)对原发性肺癌治疗后复发的诊断指导意义。

  1 资料和方法

  1.1 一般资料 资料完整的经病理证实的原发性肺癌268例,其中男179例,女89例,年龄32~83岁,平均年龄54.3岁;鳞癌91例,腺癌86例,大细胞癌37例,小细胞癌54例,均有组织病理学诊断。268例治疗方法:单手术9例,手术+化疗64例,手术+化疗+放疗38例,单放疗22例,放疗+化疗129例,单化疗6例。

  1.2 仪器及试剂 罗氏公司ELECSYS 2010检测仪;试剂为罗氏公司配套试剂。血清CEA正常参考值为0~3.4 ng/ml,血清CY211正常参考值为0.1~3.3 ng/ml,NSE正常参考值为0~16.3 ng/ml。

  1.3 方法

  1.3.1 标本采集:所有被测者均采清晨空腹血。从肘静脉抽血3 ml,分离血清,-20℃保存备用,患者治疗前检查指病人确诊原发性肺癌时检测的3项标记物,确诊后1年内每个月检测1次3项标记物,第2~3年每3个月检测1次,第4~5年每半年检测1次。治疗后指某种治疗方法结束后半年的3项标记物。复发后指按复发评定标准判定后3个月3项标记物。

  1.3.2 复发评定标准:有组织学、细胞学或影像学诊断复发。

  1.4 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件分析,所测数据以x±s表示,进行重复测量资料的方差分析,两两比较用LSD法,P<0.05认为差异有统计学意义。

  2 结果

  2.1 治疗前和治疗后CEA、CY211、NSE浓度变化(表1) 治疗前与治疗后比较,CEA、CY211、NSE的浓度,均有显著性差异(P<0.01)。表1 治疗前后CEA、CY211、NSE浓度(ng/ml,x ±s)组别nCEA治疗前治疗后CY211治疗前治疗后NSE治疗前治疗后鳞癌 91 20.23±16.33* 3.51±4.31 27.91±21.55* 4.21±4.15 68.61±54.21* 18.60±15.61腺癌 86 29.65±21.41* 4.52±4.31 16.81±10.35* 3.63±3.15 59.51±43.26* 15.69±13.19大细胞癌 37 28.59±16.69* 4.33±5.34 17.65±11.21* 3.96±2.70 48.53±42.21*16.11±12.31小细胞癌 54   16.69±13.21* 2.89±2.76   11.89±9.65* 3.51±3.06   89.13±63.33* 10.69±9.86 注:与治疗后相比,*P<0.01

  2.2 205例临床复发患者CEA、CY211、NSE浓度变化(表2) 复发治疗后与复发后的比较,CEA、CY211、NSE浓度在统计学上的差异均有显著性(P<0.01和P<0.05)。表2 复发患者治疗后与复发后CEA、CY211、NSE浓度

  3 讨论

  原发性肺癌是常见的恶性肿瘤,治疗效果不理想,容易复发,如何诊断复发,目前靠影像学。影像学诊断早期复发很困难,因只有病灶发展到一定大小(>1 cm)才能被确诊,而且影像学多为局部检查,寻找早期反映肿瘤复发的检查是非常必要的。近些年来肿瘤标记物的检查受到重视。肿瘤标记物异常比影像学更早,任何一项肿瘤标记物的异常都可能具有提示意义。

  CEA属肿瘤细胞表面的结构抗原,在胞浆中形成,通过胞膜到细胞外面,然后进入周围的体液,因而可以从血清及腔隙积液中检测[1]。CY211由细胞角质蛋白19两个单克隆抗体组成,是酸性细胞蛋白,通常以非可溶性形式存在[2]。NSE是一种多肽酶类,其对小细胞癌的诊断有较高的敏感性和特异性,而对鳞癌和腺癌敏感性低[3]。CEA在肺癌中的阳性率约40%~60%[4]。多项研究证明CY211水平分析对诊断肺癌有临床意义,尤其对非小细胞癌敏感性高。朱亚林等[5]报道,CEA、CY211和NSE 3项联检表明,单项肿瘤标记物检测容易漏诊,而联检敏感性可大大提高。

  本研究对原发性肺癌268例进行跟踪性联检CEA、CY211、NSE,同时对268例原发性肺癌治疗复发的205例的CEA、CY211、NSE检测,治疗前、治疗后和复发后比较分析提示,肺鳞癌CY211增高明显,肺腺癌CEA增加明显,小细胞肺癌NSE增加明显,联检阳性率比单项检查阳性率高,治疗后比治疗前CEA、CY211、NSE 3项均下降,两组浓度比较有显著差异(P<0.01)。原发性肺癌治疗后CEA、CY211、NSE均明显下降,降至正常范围多在治疗结束后2~6个月(即肿瘤标记物5~6个半衰期),本研究也提示,治疗后复发患者早期诊断,检测CEA、CY211、NSE是有重要临床意义的,标记物逐渐增高提示肺癌治疗后复发,对进一步局部检查提供依据,建议肺癌治疗结束后定期复查CEA、CY211、NSE。

【参考文献】
    [1] 华正祥,董俊忠,杨亚平, 等.非小细胞肺癌患者外周血癌胚抗原和细胞角质蛋白19表达与患者预后的关系[J].临床荟萃,2008,23(3):179.

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  [3] Bonner JA, Sloan JA, Rowland KM,et al.Significance of neuron- speific enolase levels before and during therapy for small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res, 2000, 6(2): 597601.

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  [5] 朱亚林, 朱湘平. CEA、CYFR211和NSE检测在肺癌中的作用[J].放射免疫学杂志,2004,17(6):429.

日期:2011年6月30日 - 来自[2009年第32卷第5期]栏目

血清CEA、CA125在妇科肿瘤中的临床应用价值

【摘要】  目的 通过检测血清中的CEA、CA125水平含量,探讨其在卵巢癌诊断中的作用。方法 应用化学发光法分别检测卵巢良性肿瘤、卵巢癌及正常对照者血清CEA、CA125水平,并进行比较。结果 卵巢癌患者血清CEA、CA125水平均显著高于正常对照组及良性肿瘤组,且联合检测敏感、特异性和有效性均高于单项检测。结论 血清CEA、CA125联合检测提高了临床诊断卵巢癌的敏感性、特异性及有效性。

【关键词】  妇科肿瘤;免疫学检查;诊断

【中图分类号】  R737.3        【文献标识码】  B        【文章编号】  1684-2030(2010)02-0099-02

  

  女性盆腔包块种类繁多,早期诊断其良恶性,直接影响到治疗效果。卵巢恶性肿瘤(卵巢癌)在女性常见肿瘤中占2.4%~6.5%,在女性生殖系统癌、瘤中占第3位,仅次于宫颈癌和宫体癌。但病死率却为首位,造成其病死率高的原因是由于卵巢恶性肿瘤生长部位隐蔽,无法直接看到,早期卵巢恶性肿瘤症状不明显,以致确诊时60%~70%的卵巢恶性肿瘤患者已为晚期。为此,研究卵巢恶性肿瘤的病因及预防措施,寻找早期诊断方法是提高卵巢癌的生存率,降低死亡率的关键。现就2003年8月-2008年10月235例患者在我院做CEA、CA125水平测定结果,做回顾性分析,探讨其在妇科肿瘤中的诊断价值。

  1  资料与方法

  1.1  一般资料  收集我院自2003年8月-2008年10月盆腔包块患者235例,年龄24~72岁,平均38岁,其中诊断为良性肿瘤患者202例,经术后病理检测为恶性肿瘤33例,平均年龄51.6岁。

  1.2  测定方法  空腹静脉抽血3ml,离心分离血清,6h内检测。Immulite化学发光仪及配套试剂,均由西门子公司提供,严格按照仪器和试剂说明书进行操作。正常值为CEA<6.3ng/ml,OV<18u/ml超过该域值为阳性。

  1.3  统计学方法  检测数据采用x±s表示,组间比较采用t检验,P<0.05差异有显著性。

  2  结果

  见表1。表1 235例盆腔包患者检测结果比较

  3  讨论

癌胚抗原是1965年Gold和Reedman从直肠癌病人血清中发现的,是一种具有人类胚胎抗原特异性的酸性糖蛋白,是一种癌的相关抗原,由空腔脏器和胃肠道、呼吸道、泌尿道、乳腺、卵巢等恶性肿瘤疾病的肿瘤标志物,其临床应用越来越广泛。本文统计CEA在妇科良恶性肿瘤中阳性率分别为1%、12%,差异有显著性,对良恶性肿瘤有一定鉴别作用,但它缺乏特异性,临床应用价值不大,须结合其他检查加以诊断与马俊勤报道相符[1]。CA125是一种在胚胎发育过程中,于体腔上皮细胞所表达,出生后消失;但在卵巢癌细胞中又重新出现,主要分布于卵巢、子宫内膜、宫颈上皮、输卵管、胸腹膜等处,国内外对CA125等指标进行了大量的临床研究,对卵巢癌的早期诊断起了重要的作用,已广泛用于卵巢癌的诊断及术后监测[1]。而且CA125也作为一个重要指标纳入恶性肿瘤风险指数公式[2],其在检测卵巢上皮癌阳性率较高,达82%~94%。有研究报道发现,一些良性瘤变如子宫肌瘤、子宫内膜异位症、盆腔炎、有腹水或胸腔积液的良性病变均可升高。本文235例妇科肿瘤患者血清CA125在良性肿块中的阳性率为34.1%,特异性较差,且在其他部位肿瘤疾病水平也升高,与上述报道基本一致。在恶性肿瘤中尤其是卵巢上皮癌阳性率为84.8%,差异有显著性(P<0.05),所以CA125在良恶性肿瘤鉴别诊断中具有重要意义。虽然CEA、CA125对鉴别良恶性肿瘤有重要意义,但由于特异性差,不能对肿瘤进行定位诊断,所以在实际工作中,还应结合B超、影像学等方法对疾病进一步明确诊断,以避免误诊和漏诊的发生。

【参考文献】
   1 马俊勤.四种肿瘤标志物诊断盆腔包块的临床应用价值.安徽医药,2007,11(1):56.

  2 马水清,沈铿,郎景和.恶性肿瘤风险指数在卵巢恶性肿瘤术前诊断的作用.中华妇产科杂志,2001,36(3):162-164.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2010年第9卷第2期]栏目
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联合检测TP、ADA、CEA在胸腔积液性质鉴别诊断中的价值

【摘要】    目的 探讨胸腔积液TP(总蛋白)、ADA(腺苷脱氨酶)、CEA(癌胚抗原)三个项目联合检测对胸腔积液性质鉴别诊断的价值。方法 将153例由不同病因引起胸腔积液的患者分为三组,其中由肺结核、结核性胸膜炎引起的为结核组共78例,由肺癌、恶性肿瘤胸膜转移引起的为恶性组共43例,由心衰、重度营养不良引起的为漏出液组共32例,平行检测这三组胸腔积液中TP、ADA、CEA浓度。结果 结核组ADA平均为(57.6±12.2)U/L,显著高于恶性组和漏出液组(P<0.01);恶性组CEA平均含量为(31.2±10.7)μg/L,显著高于结核组和漏出液组(P<0.01);漏出液组TP平均含量为(12.5±5.3)g/L,显著低于结核组和恶性组(P<0.01)。结论 联合检测胸腔积液中的TP、ADA、CEA,有助于临床医生对胸腔积液性质的鉴别、形成的原因及对相关部位疾病的诊断。

【关键词】  胸腔积液;鉴别诊断;TP;ADA;CEA

  Value of joint detection of TP, ADA and CEA in differential dignosis of pleural effuision.

  LI Xue-mei.

  Huizhou Municipal Central People’s Hospital, Huizhou 516001, Guangdong, P. R. China

    Abstract:Objective  To discuss the differential diagnostic value of detection of TP、ADA and CEA in patients with hydrothorax.  Methods  There 153 patients with pleural effusion caused by different kinds of diseases were divided into three groups ,tuberculous exudation group consisted of 78 cases due to pulmonary tuberculosis or tuberculous peritonitis,malignant exudation group consisted of 43 cases due to lung cancer or pleural metastasis in malignant tumor and transudate group conssited of 32 cases due to cardiac failure or  gravis dystrophy.The levels of TP,ADA,CEA were simultaneously detected in pleural effusion of the three groups.  Results  The level of ADA(57.6±12.2U/L) in tuberculous exudation group was significantly higher than malignant exudation group and transudate group (P<0.01); The level of CEA(31.2±10.7μg/L) in malignant exudation group was significantly higher than tuberculous exudation group and transudate group (P<0.01); The level of TP(12.5±5.3g/L) in transudate group was significantly lower than tuberculous exudation group and malignant exudation group (P<0.01).  Conclusion  Joint detection of the three indicators is helpful for differential pathogenic diagnosis lung cancer accompanied with pleural effusiion.

    Key words:Pleural effusion; Differential diagnosis; TP;  ADA;  CEA

    胸腔积液在临床上多见,但其病因诊断往往困难,造成部分患者不能早期确诊而延误治疗。在它的众多病因中,由肺结核、结核性胸膜炎、肺癌、恶性肿瘤胸膜转移所致的渗出液及由心衰、低蛋白血症所致的漏出性胸腔积液占了绝大多数。临床医生如只根据临床症状和胸腔积液常规检查,有时很难对胸腔积液形成的病因做出诊断。本文对153例诊断明确的胸腔积液中的TP、ADA、CEA进行联合检测,就其对胸腔积液性质鉴别诊断的价值进行探讨。

  1  材料和方法

  1.1  研究对象 

  选择2006年1月~2006年12月期间住院患者153例。其中肺结核、结核性胸膜炎的为结核组共78例,肺癌、恶性肿瘤胸膜转移的为恶性组共43例,心衰、重度营养不良的为漏出液组共32例。所选取的患者根据病史、体征及影像学、病原学、病理学检查均符合临床诊断。

  1.2  标本采集 

  在治疗前经常规穿刺取得胸腔积液后,置于干燥试管内,离心取上清液做TP、ADA、CEA检测,并于2h内检测完。

  1.3  试剂 

  TP、CEA的试剂盒和标准品均由美国贝克曼公司生产; ADA的试剂盒和质控品均由长春汇力生物技术有限公司生产。

  1.4  方法和仪器 

  TP采用双缩脲法;ADA采用速率法;CEA采用化学发光法。CEA测定使用美国贝克曼生产的全自动化学化光仪,型号为ACCES。

  1.5  统计学处理 

  检测结果用均数±标准差(x±SD)表示,组间差异比较采用t检验分析。

  2 结果

    检测结果显示,结核组ADA活性平均为(57.6±12.2)U/L,显著高于恶性组与漏出液组(P<0.01);恶性组CEA平均含量为(31.2±10.7)μg/L,显著高于结核组与漏出液组(P<0.01);漏出液组TP平均含量为(12.5±5.3)g/L,显著低于结核组与恶性组(P<0.01),与文献[1]中漏出液的鉴别(蛋白总量常小于25g/L)一致。153例三组胸腔积液TP、ADA、CEA测定结果见表1。表1  三组胸腔积液TP、ADA、CEA测定结果(略)注:与其它组比较,*P<0.01。

  3 讨论

  3.1  胸腔积液总的可以分为渗出液和漏出液两类,但胸腔积液形成的病因则有好几大类。渗出液一般可由胸膜和肺部炎症、恶性肿瘤、结核等引起,而漏出液则多由心衰、低蛋白血症等所致。临床医生如只根据临床症状和胸腔积液常规检查,有时很难对胸腔积液形成的病因做出诊断,特别是对于渗出液的病因鉴别,尤以结核性和癌性鉴别最为困难。本文从这个方面出发,设计了由联合检测TP、ADA、CEA这个生化组合,将结核性胸膜炎、恶性肿瘤胸膜转移所致的渗出液由检测TP从渗出液和漏出液中区分出来,由本组资料结果显示漏出液组的TP含量明显低于结核性组和恶性组(P<0.01),而结核性组和恶性组相比没有很大的差异(P>0.05),所以通过TP检测结合临床症状与表现可先将漏出性胸腔积液区分出来。渗出液中主要为结核性胸膜炎和恶性胸腔积液,由于这两者的治疗方案截然不同,所以明确鉴别两者至关重要。目前,临床上确诊恶性胸积液重要依据是从胸水中找到癌细胞,确诊结核性胸积液通过结核菌涂片或培养找到结核菌,但这些方法存在着检出率低和等候结果时间长。有文献报导ADA对结核性胸膜炎有很高的诊断价值[2],本组资料结果显示结核性组的ADA的活性为(57.6±12.2)U/L,明显高于漏出液组和恶性组(P<0.01),而漏出液组和恶性组之间相比没有明显的差异(P>0.05)。结核性胸膜炎时,抗结核免疫主要通过T淋巴细胞介导的巨噬细胞的细胞免疫反应,胸膜CD4+细胞选择性增多[3],而ADA活性增高主要是与T淋巴细胞介导的免疫反应有关,因此结核性胸膜炎时,胸积液中的ADA活性增高。恶性肿瘤时,胸腔积液细胞分类中虽也以淋巴细胞为主,但机体免疫功能往往受到抑制,T淋巴细胞介导的免疫反应较结核性胸膜炎弱[4]。本组资料结果同时显示恶性组的CEA含量为(31.2±10.7)μg/L,明显高于漏出液组和结核性组的CEA(P<0.01),而在漏出液组和结核组之间相比没有明显的差异(P>0.05)。CEA是一种分子量较大的糖蛋白,一旦在闭合胸膜中产生则不易进入血液循环中,故恶性胸腔积液中CEA含量较高[5]。另经本组资料分析,结核组诊断的灵敏度为91%(71/78),特异性为92%(69/75),以ADA活性>20U/L为异常时,78例结核性胸积液中有4例ADA活性<20U/L,据文献报导ADA活性下降可能与机体免疫力低下有关[6],而这4例均为年老体弱患者,不排除是由此引起ADA活性下降。若以CEA含量>5μg/L为异常,恶性组的诊断灵敏度为95.3%(41/43),特异性为96.4%(106/110)。有的文献用葡萄糖作为联合检测的项目,笔者认为葡萄糖由于受患者自身血糖水平影响和胸积液中细菌数量和种类影响,在此对胸积液区分漏出性、结核性和恶性作用不大。各种生化指标在胸腔积液性质鉴别诊断中均有一定的临床意义,但各指标单用都有其局限性,敏感性和特异性也难达到理想的水平,故多数文献均主张将多项指标联合检测以综合分析和鉴别。本文联合检测胸腔积液的TP、ADA、CEA这个生化组合,也是有参考了这方面的意见。

  3.2  关于胸腔积液性质鉴别方法有很多,综上检测结果与分析,笔者认为除影像学、病理学和细胞学等外,应用联合检测TP、ADA、CEA这个生化组合,通过排除法,对胸腔积液性质的鉴别有其一定的临床应用价值,再结合患者临床症状与表现,有助于临床医生对病因作出早期初步诊断,降低漏诊率,及早作出治疗方案。

【参考文献】
    [1]叶应抚.全国临床检验操作规程[M].第2版.南京:东南大学出版社,1997,149.

  [2]孙耕耘.胸腔积液的诊断与治疗进展[J].临床肺科杂志,2005,10(2):141~145.

  [3]朱元钰,陈文彬.呼吸病学[M].北京:人民卫生出版社,2003,823.

  [4]何勤,谭扑泉,高纪山,等.结核性癌性胸膜炎患者胸水及外周血T淋巴细胞亚群分布状态的分析[J].中华结核和呼吸杂志,1989,12(2):96~98.

  [5]赵明,季晓鹏,鹿洁,等.肿瘤标志物NSE、Cyfra21-1、CEA对良恶性胸水鉴别诊断的价值[J].放射免疫学杂志,2005,18(4):320~321.

  [6]叶飞,张辉,钟晶,等.腺苷脱氨酶在结核性胸膜炎鉴别诊断中的意义[J].成都医药,2004,30(2):77.


作者单位:惠州市中心人民医院检验中心,广东 惠州 516001.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第4期]栏目

癌胚抗原及铁蛋白检测对胸腔积液鉴别诊断的意义

【摘要】  目的 探讨癌胚抗原(CEA)、铁蛋白(FT)检测在良、恶性胸腔积液诊断的临床意义。 方法 对28例结核性胸腔积液患者及36例恶性胸腔积液患者的血清及胸水采用放射免疫直接测定法测定其CEA及FT水平。 结果 恶性胸水组血清CEA、FT水平显著高于结核组(P<0.01)。恶性胸水胸液CEA、FT水平显著高于结核组(P<0.001)。 结论 联合进行血清、胸水CET、FT测定对良、恶性胸液的鉴别诊断具有重要的价值。

【关键词】  癌胚抗原;铁蛋白;胸腔积液;鉴别诊断

Clinical significance of detection of carcinoembryonic antigen and ferritin in differentiating pleural effusion.

  CHEN Shan, ZOU Shao-qing.

  (Guangdong Provincial Nongken Central Hospital, Zhanjiang 524002, Guangdong, P. R.China)

  Abstract:Objective  To analyze the clinical significance of carcinoembryonic antigen (CEA) and ferritin (Ft) in differentiating benign and malignant pleural effusion.  Methods  Direct radioimmunoassay was used to detect CEA and Ft of pleural effusion and scrum in 28 tuberculous and 36 malignant pleural effusion patients.  Results  The levels of serum CEA and Ft in malignant group were higher than that of tuberculous group, showing significant difference (P<0.01).The  levels of CEA and Ft in pleural effusion in malignant group were higher than that of tuberculous group, showing significant difference(P<0.001).  Conclusion  The combined detection of CEA, Ft in pleural effusion and serum is of significant clinical value.

  Key words:Carcinoembryonic antigen (CEA); Ferritin (Ft); Pleural effusion; Differential diagnosis

  胸腔积液是临床上常见的疾病。对良性和恶性胸水的鉴别,主要是通过胸水的细胞病理学诊断以及胸膜活检、影像学检查进行鉴别。同时,肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)及铁蛋白(FT)的检测对良、恶性胸水的鉴别诊断也具有重要的意义。现回顾分析28例结核性胸水及36例恶性胸水进行CEA、铁蛋白测定结果。现报告如下。

  1  对象和方法

  1.1  对象  64例胸腔积液病例是广东农垦中心医院近两年的住院病人。其中男性35例,女性29例,年龄17~82岁,平均年龄55岁。根据胸水细胞学检查、胸膜活检、支气管纤维镜、影像学检查等进行病因诊断。良性胸水 (结核性胸膜炎)28例,其中男16例,女12例,年龄17~76岁,平均年龄35岁。恶性胸水36例,男21例,女15例,年龄34~82岁,平均年龄64岁。其中肺癌31例,乳腺癌2例,胃癌2例,结肠癌1例。

  1.2  方法  胸水的CEA和铁蛋白测定采用放射免疫法。在首次胸穿抽液时,留取4ml胸水于抗凝管内,同时抽取静脉血2ml于另一支管内送检。抽取3.8%  枸橼酸钠抗凝胸水4ml,经离心沉淀,取上清液待检,静脉血取血清待检。CEA药盒由中国原子能院同位素所提供,铁蛋白药盒由北京科美雅生物技术有限公司提供。严格按说明书检测血清的方法进行操作,测得28例良性胸水和36例恶性胸水CEA、铁蛋白水平。CEA正常参考值:<15μg/L,铁蛋白正常参考值:男性12.5~245μg/L,女性5.5~135μg/L。各组数据以均数±标准差( x±s)表示,各组指标比较采用t检验。

  2  结果

  64例胸腔积液患者血清和胸水CEA、铁蛋白含量见表1。结果显示:恶性组血清CEA、铁蛋白水平显著高于结核组(P<0.01),恶性组胸液CEA、铁蛋白水平也显著高于结核组(P<0.001)。恶性组胸水CEA/血清 CEA=1.2,恶性胸水铁蛋白/血清铁蛋白=1.15。

  表1  64例胸水患者血清和胸水的CEA、FT测定结果(略)

  3  讨论

  肿瘤标志物主要是指在肿瘤细胞分泌或脱落到体液或组织中的物质,或是宿主对体内新生物反应而产生并进入到体液或组织中的物质[1]。正常人体内缺乏肿瘤标志物或含量极低。癌胚抗原就是肿瘤标志物之一,它是一种复杂的糖蛋白,主要存在于妊娠6个月前胎儿的肠道、胰及肝中,经肝脏代谢。人体血清中癌胚抗原水平一般不超过10μg/L。1965年首次在结肠癌患者血亲清中发现癌胚抗原,然后又发现肺、乳腺等组织的恶性肿瘤也可合成癌胚抗原[2]。由于CEA分子量大,释放到胸积液中的CEA不易进入血循环,因此胸积液中的CEA水平也高于血清。有文献报道[3],若以癌胚抗原大于10μg/L、胸腔积液CEA/血清CEA之比值大于1.0为界值,对恶性胸腔积液诊断的敏感性和特异性分别为86%、89%和92%、95%。本文资料显示,恶性胸水组CEA显著高于良性胸水组(P<0.001)。其比值等于1.2,明显大于正常临界值1.0。所以对良、恶性胸水的鉴别诊断具有重要的参考价值。铁蛋白是含铁蛋白质复合物。正常人体血清中含量较少,肿瘤细胞具有较强的合成铁蛋白能力。张氏认为[3],若以胸腔积液铁蛋白水平大于200μg/L,胸腔积液铁蛋白/血清铁蛋白之比值大于1.0为界值,对恶性胸腔积液诊断的敏感性和特异性分别为75%、78%和81%、84%。本文资料显示,恶性胸水组铁蛋白为235.3±22.7(大于200μg/L),显著高于结核组(P<0.001),其比值1.15(>1.0)。所以联合检测血清及胸液CEA、铁蛋白水平对良、恶性胸水的鉴别诊断具有重要的参考价值。

【参考文献】
  [1] 万文徽,李吉友.肿瘤标志物的临床应用[J].中华医学检验杂志,1997,20:49.

  [2] 张心中,温明春,藤琳.实用肺科诊疗学[M].济南:山东科学技术出版社,2001,116~117.

  [3] 张心中,刘继华,心钠素.癌胚抗原及铁蛋白联合检测鉴别良、恶性胸腔积液[J].新医学,2004,1:57~58.


作者单位:广东农垦中心医院,广东 湛江 524002.

日期:2010年1月13日 - 来自[2007年第7卷第9期]栏目
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血清CA199及CEA联合检查对消化系统肿瘤的诊断意义

【摘要】  目的 探讨血清CA199与CEA联合检查对消化系统肿瘤的诊断意义。方法 用放免法测定29例胃癌、41例胆囊癌及胆管癌、12例胰腺癌及20例结肠癌患者血清CA199及CEA含量,并分别与正常对照组比较。结果 所有恶性肿瘤的血清CA199及CEA含量显著高于正常对照组。结论 血清CA199及CEA联合检测是消化系肿瘤良好的诊断指标,具有一定的临床意义。

【关键词】  CA199;CEA;消化系统肿瘤

消化系统肿瘤(如胃癌、胆囊癌及胆管癌、胰腺癌、结肠癌等)为我国较常见的恶性肿瘤,且近年来发病率有增长趋势,发病年龄日趋年轻化,发病年龄多为40~70岁,男多于女,患者5年生存率低,故早发现、早期诊断、早期治疗及预后判断、疗效观察和复发监测等方面具有重要意义。当前国内较为流行的糖类抗原-199(CA199)为诊断消化系统的重要肿瘤标志物[1],但其早期阳性率不高,且单一检测存在敏感性、准确性不足,故和其他肿瘤标志物进行联合检测,以提高对消化道肿瘤的检测率。为此本文对2006年6月—2008年3月在我院消化内科及普外科住院的72名消化系统肿瘤病人和35名正常人血清CA199及CEA进行联检,以探讨其对消化系统肿瘤的临床诊断价值。

  1 资料与方法

  11 一般资料 正常人组均为体检合格正常人35名(男20名,女16名),年龄17~66岁,无心肺肾肺等重要器官疾病,肝肾功能正常。病人组:消化系统肿瘤(如胃癌、胆囊癌及胆管癌、胰腺癌、结肠癌等)患者102例,男59例,女43例,年龄22~77岁,经X线、CT、胃镜、肠镜及临床和病理学检查确诊。

  12 方法

  121 肘静脉采血3ml,分离血清,-80℃备用。

  122 CA199和CEA RIAKit试剂盒由北京原子高科技技术应用股份有限公司提供,按说明书操作。

  123 测量仪器:GC-400r放射免疫计数器,由中国科技大学实业总公司提供,正常参考值CA199<37u/ml,CEA<15ng/ml。

  13 统计学处理 各组数据用SPSS120软件包,均以(x±2s)检验。

  2 结果

  21 阳性界值以正常人组x±2s为标准,CA199>37u/ml,CEA>15ng/ml为阳性。

  22 各组的CA199和CEA对消化系统肿瘤测定值及临床评价分别如表1和表2。表1 正常值和消化系统肿瘤组CA199和CEA的测定表2 消化系统肿瘤CA199、CEA单独及联合阳性及特异性率

  3 讨论

  CA199是低聚糖肿瘤相关抗原,为一种新的肿瘤标志物[2],其分子量>50万,在血清中以粘蛋白形式存在,在消化系统肿瘤的诊断方面是一种重要的肿瘤相关抗原。该抗原在胰腺癌、胆囊癌及结直肠癌中具有较高的阳性率[3],正常人血清中含量极微,无临床意义。近年来,已有文献报道[4]阳性率高达80%以上[5],本文CA199阳性率(81%)与上述报道相符。

  CEA是肠腺癌和胎儿肠中一种胚胎抗原,其相对分子量约20万的糖蛋白,在细胞浆中形成,越过胞膜入体液中,肝脏为其分解代谢的场所,血中半衰期为2天,通常体内含量极微,但来自内胚层分化组织恶变时如胃癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌等,血CEA均增高,其阳性率和肿瘤分期及分型有关,随期别增高而增大[6]。本文CEA对消化道肿瘤阳性率为556%,特异性为448%,表2提示CA199、CEA联检将大幅度提高消化道肿瘤的检出率(861%)、准确性(861%)。因而CA199与CEA联检有助于消化道肿瘤早期诊断、疗效观察及复发预测。

  肿瘤标志物是肿瘤组织产生并可以反映肿瘤细胞存在于宿主体内的化学分子,一种标志物可出现于多种肿瘤,一种肿瘤也可以有多种标志物,把敏感性和特异性较好的几种标志物结合起来,一方面可以提高对肿瘤的诊断价值,另一方面也尽可能降低检测费用。但应当指出的是,各种肿瘤标志物不是恶性肿瘤所特有,联合检测在提高恶性肿瘤检出率的同时,也增加了假阳性的概率。因此,应动态追踪观察和联合检测肿瘤标志物;并结合临床表现,才能有效提高肿瘤诊断的准确率,降低漏诊率。对于临床上考虑消化系统肿瘤患者,如果肿瘤标志物检测阴性,且需与其他相关检查联合判断,密切定期随访。

【参考文献】
    1 高岩,陈污周,范振符,等CA199免疫放射分析在肿瘤诊断中的应用标记免疫分析与临床,1997,4(2):87

  2 Mattar R,Andrade CR,Difavero GM,et alPreoperative serum levels of CA72-4,CEA,CA199 and alpha-etoprotein in patients with gastic cancerRev Hosp Clin Fac Med Uni Sao Paulo,2002,57(3):89-92

  3 董兴辉,丁振灿,张秀华CEA、CA199、CA724在大肠癌中的应用价值探讨放射免疫学杂志,2005,18(2):127-128

  4 姚奎元,田韧血清CA199、CEA联合检测中、晚期消化道癌肿肿瘤防治研究,1997,24(6):387

  5 尹伯元标记免疫学北京:原子能出版社,1998,260

  6 赵明,李晓鹏肿瘤标志物CA199与CEA联检对胰腺癌的诊断意义放射免疫学杂志,2003,16(6):355

  


作者单位:541200 广西桂林,广西壮族自治区第二人民医院消化内科

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第6卷第5期]栏目

CEA免疫组化染色对直肠癌系膜微转移及环周切缘侵犯诊断价值

【摘要】  目的 研究CEA免疫组化染色在检测肿瘤系膜微转移及环周切缘(CRM)侵犯方面的价值。方法选取经纤维结肠镜及病理证实为直肠癌病人40例,应用大组织切片技术对术后标本处理,分别行常规染色及CEA免疫组化染色,比较分析两种染色方法在检测肿瘤系膜微转移及CRM侵犯方面的价值。结果 CEA染色检测肿瘤浸润程度大于常规病理染色,差异有显著性(t=5.23,P<0.001);常规病理染色CRM阳性6例,CEA免疫组化染色CRM阳性10例,两种染色方法在诊断CRM阳性率方面差异有显著性(χ2=29.60,P<0.001);两种染色方法在检测系膜微转移方面的差异与血浆CEA水平、肿瘤分化程度有关(χ2=7.40、7.72,P<0.05),与性别、肿瘤部位、淋巴结分期无明显相关性(P>0.05)。结论 CEA免疫组化染色有助于发现直肠癌CRM侵犯及在直肠系膜中的微转移情况,直肠癌系膜内微转移与肿瘤分化程度和血浆CEA水平有关。

【关键词】  直肠肿瘤;肠系膜;肿瘤转移;免疫组织化学

 THE VALUE OF CEA IMMUNOHISTOCHEMICAL STAINING IN DETECTION OF MESENTERIUM MICROMETASTASIS AND CUTTINGEDGE INVASION IN RECTAL CANCER ZHOU JIAN, ZHOU YANBING, ZHUO HONGQING, et al (Department of General Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To assess the CEA immunohistochemical staining for detecting micrometastasis in mesenterium and cuttingedge invasion  in rectal cancer.  Methods Fourty patients with rectal cancer confirmed by colonofiberscopy and pathology were enrolled. The specimens were treated with bigslice technique. HE and CEA staining were applied to detect the micrometastasis and invasion of the tissue. Results The mesorectal invasion detected by CEA staining was deeper than the HE staining (t=5.23,P<0.001). Cuttingedge invasion was observed in six cases by conventional staining and 10 cases by CEA technique. The difference between the two staining methods was significantly correlated (χ2=29.60,P<0.001), the difference between them in terms of micrometastasis was related to plasma CEA and differentiation of the tumor (χ2=7.40,7.72;P<0.05), but not related with sex, tumor location, and lymphnode staging (P>0.05). Conclusion CEA staining is conduce to the detection of micrometastasis and cuttingedge invasion in rectal cancer patients. The mesorectal micrometastasis is associated with tissue differentiation and plasma CEA.

    [KEY WORDS] Rectal neoplasms; Mesentery; Tumor metastasis; Immunohistochemistry

    自HEALD提出全直肠系膜切除术(TME)手术方式后,中低位直肠癌治疗效果明显提高,病人术后5年生存率可达到65%,局部复发率为9%[1,2]。业已证明中低位直肠癌局部复发与肿瘤系膜浸润、环周切缘(CRM)阳性、直肠系膜残留等因素有关,在诸多局部复发相关因素中,CRM越来越受到人们的重视。CRM阳性病例术后局部复发率为15%~85%,但CRM阴性病例仍有3%~10%复发率[3]。推测与传统病理检查难以发现的病灶残留有关,即肿瘤微转移,究竟肿瘤在直肠系膜是否存在微转移及其可能发挥的作用仍然存在争议。本研究应用CEA免疫组化染色方法和常规病理检查,观察比较直肠癌系膜微转移、CRM阳性率情况,分析可能的临床病理因素。现将结果报告如下。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    2007年10月~2008年9月,选取我院普外科经纤维结肠镜及病理证实为中低位直肠癌病人手术切除标本40例,其中男26例,女14例;年龄50~79岁,中位年龄67岁。所行手术均为直肠癌根治术,按照TME手术原则,直视下锐性分离直肠系膜,其中LAR手术36例,Mile手术4例,肿瘤距远端切缘距离均超过2 cm,术后切除标本TME评分[4]3分。肿瘤位于前壁3例,后壁24例,侧壁13例;按直肠癌TNM分期(AJCC肿瘤分期第6版)标准,其中T2期12例,T3期28例; N0者25例,N1者9例,N2者6例;病理学类型:低分化腺癌8例,中分化腺癌29例,高分化腺癌3例。血浆CEA水平:术前血浆CEA水平<3.4 μg/L者13例,血浆CEA水平≥3.4 μg/L者27例。

    1.2  大切片标本制作

    所有切除标本自肠系膜下动脉注入40 g/L的甲醛溶液,然后将其置入40 g/L的甲醛溶液中浸泡48~72 h。自远端起每隔1 cm厚度进行横切面取材,取材范围为环形直肠肠壁全层,完整直肠系膜。将横向切取厚度为0.5 cm直肠肠壁组织环做成大切片标本[5~7],沿肿瘤在直肠系膜内浸润最深部位纵向切取组织条一块,厚度约1 mm,行连续切片。

    1.3  免疫组化染色方法

    将组织切片分别行苏木精伊红(HE)及CEA染色。CEA染色采用Zymed公司的PicTure二步法免疫组化检测试剂。组织切片脱蜡、水化→高压锅热修复→PBS冲洗→滴加一抗,37 ℃孵育2 h→PBS冲洗→应用DAB溶液显色→蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。

    1.4  阅片方法

    由两位病理学医师在显微镜下观察肿瘤在系膜内浸润深度,判断肿瘤浸润的层次,并确定肿瘤浸润最深部位,对肿瘤侵犯外缘进行标记,应用螺旋测微器测量所标记点与CRM之间的距离并读数,读数精确至0.02 mm。测量肿瘤外缘距周边切缘(盆筋膜脏层)的距离(D),以D≤1 mm定义为CRM阳性[8]。

    1.5  数据统计分析

    所有数据应用SPSS 12.0及PPMS 1.5[9]统计软件处理,HE染色及CEA染色之间肿瘤浸润程度差异应用配对t检验,而对于CRM阳性及CEA染色系膜微转移阳性率的相关影响因素分析应用χ2检验及Fisher精确检验法。

    2  结    果

    2.1  CEA免疫组化染色阳性情况

    CEA免疫组化染色肿瘤系膜浸润深度的可信区间为(2. 3±0.4)cm,HE染色可信区间为(2.7±0.5)cm。两种染色方法检测系膜浸润深度的差异有显著性(t=5.23,P<0.001)。本组CEA免疫组化染色共检出在系膜内微转移病例27例,系膜微转移阳性率为67.5%; HE染色CRM阳性6例,阳性率为15.0%;CEA免疫组化染色CRM阳性10例,阳性率为25.0%;两种染色方法在CRM阳性率方面比较,差异有显著性(χ2=29.60,P<0.001)。

    2.2  CEA免疫组化染色阳性相关因素分析

    血浆CEA水平<3.4 μg/L病例CEA免疫组化染色阳性率38.5%(5/13),而血浆CEA水平≥3.4 μg/L阳性率为81.5%(22/27),两者之间比较差异有显著意义(χ2=7.40,P<0.05);高分化腺癌阳性率为0(0/3),中分化腺癌为69%(20/29),低分化腺癌为87.5%(7/8),差异有显著性(χ2=7.72,P<0.05);CEA免疫组化染色系膜微转移阳性率与病人性别、肿瘤部位、淋巴结分期无明显相关性(P>0.05)。表1。表1  直肠系膜微转移相关临床病理因素分析临床病理因素nCEA免疫组化染色阳性例数 注:*应用Fisher精确检验法。

    3  讨    论

    CEA免疫组化染色结合大组织切片技术,可以直接用肉眼观察或显微镜监测包括肿瘤原发灶、直肠壁和直肠系膜标本全貌。应用CEA 免疫组化技术研究直肠癌在系膜浸润还未见报道。本研究应用CEA免疫组化染色对直肠癌标本进行术后病理评价,并研究CEA免疫组化染色在直肠系膜肿瘤微转移监测方面的意义。

    本研究结果显示,CEA免疫组化染色检测出直肠肿瘤在直肠系膜内的微转移率达到67.5%,并且两种不同染色方法,直肠肿瘤在系膜内的浸润深度之间有统计学差异。CEA免疫组化染色与常规病理染色相对比,其直肠系膜微转移灶检出率及肿瘤细胞浸润深度比较均有明显统计学差异,提示CEA免疫组化染色能够发现常规病理染色所未发现的肿瘤细胞浸润微转移。并且也表明CEA免疫组化对于直肠癌细胞敏感度较常规病理染色高。CEA免疫组化提示的肿瘤细胞在直肠系膜内的高转移率,表明直肠癌病人术后直肠系膜内存在常规病理所不能发现的微转移灶,进一步证明了低位直肠癌手术施行全直肠系膜切除、保持标本环周完整性的重要性。但直肠癌病人的系膜内微转移与生存率及局部复发率的关系,仍需要进一步临床随访研究来证实。

    GOSENS等[8]的研究显示,T3、T4期直肠癌病例CRM阳性率分别为17%、25%,CRM阳性病例局部复发率为43%,而阴性病例局部复发率为8%,生存率则分别为58%和80%。CRM浸润是直肠癌局部复发和影响生存率的重要因素。本研究HE染色肿瘤CRM阳性率为15%,CEA免疫组化染色CRM阳性率为25%,两种染色方法在CRM阳性率检测方面差异有显著性。这也表明在常规病理染色显示CRM为阴性的病例,在系膜内仍有可能有直肠肿瘤细胞的残余,从而可能导致直肠癌CRM阴性病人术后局部复发。因此,CEA免疫组化染色较常规病理染色更有助于发现直肠肿瘤细胞在系膜内的残留及微转移灶。

    本研究结果显示,血浆CEA水平处于正常范围和高于正常范围其CEA免疫组化染色阳性率分别为38.5%、81.5%,两者之间差异有显著性,表明血浆CEA水平高于正常值的直肠癌病例,其CEA免疫组化阳性率高于血浆CEA正常病例,CEA免疫组化染色对于血浆CEA水平增高病例敏感度更高。这种情况考虑与肿瘤的浸润、侵袭能力有关,高侵袭能力的肿瘤细胞,组织表达CEA能力较高,而且CEA表达水平与微转移相关,与文献报道基本一致[8]。

    TOCCHI等[11]研究也表明,淋巴结浸润是盆腔局部复发的重要因素。本研究显示,N0、N1、N2淋巴结分期病人标本CEA免疫组化染色阳性率差异有显著性,表明淋巴结侵犯与肿瘤细胞在直肠系膜内的浸润与微转移灶相关,也提示淋巴结侵犯是直肠癌的不良预后信息,但淋巴结浸润及淋巴结微转移在直肠癌病人术后局部复发及预后方面的作用还有待进一步研究。CEA免疫组化染色阳性率与病人性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度无明显相关性。

    总之,本研究结果显示,CEA免疫组化染色可以作为直肠癌病人术后常规病理染色一个重要补充,结合大组织切片技术,能够对直肠癌术后标本进行全面、详细观察,能够发现直肠癌细胞在系膜内常规病理所不能发现肿瘤微转移灶。但是CEA免疫组化染色检测肿瘤在直肠系膜的微转移与直肠癌病人预后及局部复发的关系,仍需进一步研究观察。

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[9]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

[10]GOSENS M J, KLAASSEN R A, TANGO I, et al. Circumferential margin involvement is the crucial prognostic factor aftermultimodality treatment in patients with locally advanced rectal carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2007,13(22 Pt 1):66176623.

[11]TOCCHI A, MAZZONI G, LEPRE L, et al. Total mesorectal excision and low rectal anastomosis for the treatment of rectal cancer and prevention of pelvic recurrences[J]. Arch Surg, 2001,136(2):216220.


作者单位:青岛大学医学院附属医院普外科,山东 青岛 266003

日期:2009年8月25日 - 来自[2009年第24卷第5期]栏目
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实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 CK20 mRNA和CEA mRNA的临床意义

【摘要】  目的 探讨大肠癌患者外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的表达及其临床意义。方法 采用实时定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)技术,对68例大肠癌患者及30例健康志愿者(对照组)术前外周血CK20 mRNA和CEA mRNA水平进行检测。结果 在对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA 均无表达,而在大肠癌组中CK20 mRNA阳性表达率为45.6%,CEA mRNA阳性表达率为39.7%,二者联合检测阳性率为55.9%,较单项检测阳性率高(P>0.05),二者的表达与性别、肿瘤部位和肿瘤分化程度无明显相关,与肿瘤临床分期、淋巴结转移和肝脏转移明显相关。结论 CK20 mRNA和CEA mRNA可作为大肠癌细胞血行播散的标志,联合检测有助于提高肿瘤微转移的检出率及判断预后。

【关键词】  大肠肿瘤;微转移;外周血

Clinical significance of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction

    ZHOU Hai-yin,GE Cheng-hua,WANG Shi-wei,YE Gu-xiang,TANG Wen-xian,ZHAO Xu-hong,FAN Zhen-ni.Department of General Surgery,The Central Hospital of Yangpu District,Shanghai 200090,China

    [Abstract]  Objective  To investigate the expression of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer and its clinical significance.Methods  CK20 mRNA and CEA mRNA were detected in 68 patients with colorectal cancer before operation,30 health adults by QRT-PCR.Results  CK20 mRNA and CEA mRNA were undetected in the control group,the positive rate of CK20 mRNA among colorectal cancer patients was 45.6%,and of CEA mRNA was 39.7%.The positive rate of combination detection was 55.9%.It was higher than the rate of detection alone.There was no statistically significant difference of positive rate between two detection methods.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA were not significantly correlated with sex of patients,the place of the tumor or differentiation level of cancer cells,but correlated with clinical stage,lymph nodes metastasis and liver metastasis.Conclusion  CK20 mRNA and CEA mRNA were useful maker of blood dissemination of colorectal cancer cell and the positive rate of micrometastasis  be maybe raised by combination detection.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA may be regarded as a reference indicator.

    [Key words]  colorectal cancer;micrometastasis;peripheral blood

    大肠癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年升高趋势,其术后复发及远处转移率达20%~45%[1]。因此早期检测出循环癌细胞对判断肿瘤复发和转移及指导临床综合治疗有重要意义[2]。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象  68例大肠癌患者选自2007年1月~2008年3月在我院接受手术治疗并经病理确诊的患者,男39例,女29例,年龄26~88岁,中位年龄65岁。临床分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期24例,Ⅲ期27例,Ⅳ期11例。肿瘤分化程度:高分化腺癌26例,中分化28例,低分化11例,未分化3例。对照组30例健康志愿者来自同期我院健康职工。

    1.2  仪器与试剂  定量PCR仪(美国生物应用公司ABI7500),Trizol试剂(上海闪晶分子生物科技公司),CK20 mRNA和CEA mRNA PCR试剂盒(上海达为科生物科技公司)。

    1.3  RNA提取  采集对照组及大肠癌组患者术前肘静脉血5 ml(草酸钾抗凝),1 h内用淋巴细胞分离液分离有核细胞,将分离的有核细胞收集到1.5 ml离心管中,12 000 rpm离心5 min,弃上清,在沉淀中加入Trizol 500 μl,混匀置室温10 min,加入氯仿200 μl混匀,4 ℃ 10 000 rpm离心5 min,吸取上层水相于1.5 ml离心管中,并加入2倍体积预冷异丙醇混匀,置-20 ℃冰箱20 min,4 ℃ 10 000 rpm离心10 min(以沉淀RNA)。弃上清,用预冷75%酒精(DEPC处理水配制)500 μl漂洗一次,4 ℃ 10 000 rpm离心10 min,弃上清,留沉淀,充分吸尽残留液,65 ℃干式恒温器,干燥10 min,20 μl DEPC处理水融解RNA,-80 ℃保持待用。

    1.4  逆转录反应制备cDNA  标本处理后的RNA 70 ℃预变性5 min,迅速置于冰浴以防RNA复性,反应体系的配制方法:RT反应液18 μl,M-MLV逆转录酶1 μl,RN asin 1 μl加入离心管中混匀,在每个反应管中加入20 μl上述反应液,加入预变性的RNA 5 μl,37 ℃水浴60 min,95 ℃预变性5 min,以灭活M-MLV逆转录酶。

    1.5  PCR扩增反应  每管取PCR反应液43 μl,Taq酶2 μl加入总无菌离心管中混匀,每个反应管中加入45 μl上述反应液,加入RT反应液5 μl,95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共40个循环,最后72 ℃延伸10 min;根据所获得的标准曲线得到各检测标本的浓度(copies/ml)。

    1.6  结果判断  以RNA浓度≥1.0×103 copies/ml为阳性,<1.0×103 copies/ml阴性[3]。

    1.7  统计学处理  CK20 mRNA和CEA mRNA阳性率用百分率表示,采用EXCEL软件统计,率的比较用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有显著统计学意义。

    2  结果

    2.1  CK20 mRNA和CEA mRNA的表达  大肠癌组中CK20 mRNA阳性者的水平为(11 055.95±1 649.61)copies/ml,CEA mRNA阳性者的水平为(12 664.36±2 990.17)copies/ml。CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中表达列于表1。表1显示大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率分别为45.6%(31/68)和39.7%(27/68),对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率均为0,大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率之间差异无统计学意义(P>0.05),CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率在大肠癌组与对照组之间差异有显著统计学意义(P<0.01)。表1  CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中的表达

    2.2  联合检测阳性率(至少一项阳性)与单项阳性比较  大肠癌组中联合检测阳性率55.9%(38/68)较CK20 mRNA 45.6%(31/68)与CEA mRNA 39.7%(27/68)单项检测的阳性率有明显升高,但与单项比较差异无统计学意义(P>0.05)。

    2.3  CK20 mRNA和CEA mRNA的表达与大肠癌临床病理因素的关系  表2显示CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在患者性别、肿瘤部位及分化程度之间比较差异无统计学意义,CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在肿瘤临床病理分期之间比较差异有统计学意义(P<0.05),CEA mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异亦有统计学意义(P<0.05),而CK20 mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异有显著的统计学意义(P<0.01),CK20 mRNA和CEA mRNA在肝脏有无转移患者阳性表达的比较差异有显著的统计学意义(P<0.01),可见肿瘤分期越晚,淋巴结和肝脏转移者其阳性表达率越高。表2  CK20 mRNA和CEA mRNA阳性表达与肿瘤临床病理因素的关系

    3  讨论

  大肠癌的复发和转移与其他恶性实体肿瘤一样,以微转移为基础和前提,然而常规检测方法不能有效检测出微循环中的癌细胞和微转移灶,因此术前不能及时发现微转移,不利于肿瘤的正确分期及治疗方案的制定,术后不能及时发现复发及转移,以致不能更好地改善预后和延长生存期[4]。随着PCR技术的不断发展,实时定量PCR(QRT-PCR)技术能从106~107个细胞中检出1个肿瘤细胞,该技术具有敏感性高、特异性强、简单快速的优点,使外周血肿瘤微转移的检测成为可能[5]。近年来细胞角蛋白家族成员作为检测微转移的指标备受关注[6]。细胞角蛋白是上皮细胞骨架的主要成分,表达于正常上皮细胞、上皮细胞原发性肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK20具有组织特异性,其局限于胃肠上皮细胞,在正常骨髓、血液和淋巴结中均无表达,而几乎全部胃大肠肿瘤均明显表达,且侵袭、转移、扩散到其他器官时始终保持稳定[7]。CEA是一种特异性较高的肿瘤相关抗原,大约95%的大肠癌有CEA基因表达。因此根据CK20与CEA的分布特点使其成为特异的大肠癌的肿瘤标志物及微转移检测指标。Funaki等[8]、Xu等[9]利用RT-PCR技术检测大肠癌患者外周血微转移癌细胞,发现大肠癌复发和转移者CK20 mRNA均为阳性,并且随Dukes分期的进展CK20 mRNA的表达水平增加。钟平来等[10]发现直肠癌患者外周血CEA mRNA表达阳性率与远处转移有明显相关性,对术后的判断具有较高的可信度,本实验支持上述观点。本研究结果显示68例大肠癌患者外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达率分别为45.6%和39.7%,显示微转移在近40%的大肠癌患者中存在,联合检测阳性率为55.9%,较单项为高,虽然差异没有统计学意义,但联合检测有助于提高检出率。同时本研究还显示,CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达率均与肿瘤临床病理分期、淋巴结转移和肝脏转移相关,而与性别、肿瘤生长部位、肿瘤分化程度无明显相关,这表明肿瘤分期越晚,肿瘤释放入循环血中的癌细胞越多,CK20和CEA的表达阳性率越高,复发和转移的几率越大,预后越差,亦提示CK20 mRNA和CEA mRNA可以作为肿瘤细胞血行播散的独立标志物。因此尽早动态监测外周血中CK20 mRNA和CEA mRNA有助于早期发现微转移及微转移病灶的形成,对于肿瘤分期和恶性程度做出更精准的判断。CK20 mRNA和CEA mRNA在Ⅲ~Ⅳ期患者中的阳性率阳性表达率较高,可将这两项指标用于大肠癌术前常规实验室检查,以利肿瘤的分期。对于术前检测出外周血CK20 mRNA和CEA mRNA高表达的大肠癌患者,应该可以认为循环血中存在癌细胞,我们提出可以在术前采用新辅助化疗方法抑制与杀灭微转移癌细胞,从而控制微转移及微转移灶的形成。

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7 Castells A,Boixl L,Bessa X,et al.Detection of colonic cells in peripheral blood of colorectal cancer patients by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction.Journal of Cancer,1998,78:1368-1372.

8 Funaki NO,Tanaka J,Ohshio G,et al.Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients.Br J Cancer,1998,77:1327-1332.

9 Xu D,Li XF,Jiang WZ,et al.Significance of CK20 mRNA expression in peripheral blood of colorectal cancer patients by real-time fluorescent quantitative RT-PCR.Zhejiang Daxue Yixue Ban,2004,33:403-406.

10 钟平来,吴秉,赵士芳,等.CEA mRNA检测对消化道癌症的临床价值.浙江医学,2005,27(2):156-158.


作者单位:200090 上海,上海市杨浦区中心医院普外科(△中心实验室)

日期:2009年8月24日 - 来自[2009年第6卷第2期]栏目
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