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西洋参与糖尿病

    西洋参(Panax quinquefolium L),为五加科人参属植物,俗名美国人参、花旗参、洋参、广东参,原产于北美洲加拿大的蒙特利尔,魁北克和美国东部。药用部分为干燥的根,味苦,性凉,人心、肺、肾经。功能以补益为主,有滋阴生津、凝神益智功效。早在清康熙33年《补图本草备要》和清乾隆30年《本草纲要拾遗》中,已有西洋参药性的记载。我国应用西洋参已有近30G年的历史,20世纪70年代后期,在我国和日本引种栽培成功,此后对西洋参的使用与开发日益广泛深入,产品的种类、数量和质量都在逐年提高。

西洋参对高血压和心肌营养不良、冠心病、心绞痛等有一定疗效。同时,西洋参还可降低化疗放疗治癌肿引起的不良反应,常作为治疗各种癌症的辅助药剂。西洋参还具有多方面的药理活性,具有抗疲劳、强壮体魄、提高机体免疫功能、抗缺氧、抗高温、抗寒、抗心肌缺血、抗休克、降低血脂、镇静、止血等作用。而西洋参用于糖尿病的保健和治疗的报道在我国并未多见,近年来,国外对于西洋参在2型糖尿病的预防治疗方面有一些深入的研究报道,现将近年来国内外有关这方面文献作如下综述。

 1   化学成分

西洋参主要化学成分为皂苷类,其它还含有一些挥发油、多糖类、氨基酸类、聚乙炔类和酶等。

11  皂苷类化合物

    西洋参主要成分为人参皂苷类化合物,迄今为止,从西洋参中获得的人参皂苷分属三个类型:其一母体结构为达玛烷型(Dammarane);其二母体结构为齐墩果烷型(Oleanane);其三为奥克悌隆型(Oeotill01)

    1978年日本真田修一等从日本产的西洋参中分离出人参皂苷R0RblRb2RcRdRe1979年中国学者李向高从中国西洋参根中分得3种皂苷元:人参萜二醇(Panaxadial)、人参萜三醇(Panaxatri01)和齐墩果酸(Oleanolie acid)1983年魏均娴等从西洋参根中分得:R0Rb1Rg1Repseudo—ginsenoside—FII(简称 P—F11)P—Fll是奥克悌隆醇型皂苷,是西洋参中的特有成分,是同属植物人参中所没有的,是鉴别西洋参与人参的显著标志。1985年松浦广道又从西洋参根中分得:Rb1Rb2Rb3RcRdReRoRg1Rg2F2P— F11、绞股兰皂苷一XⅦ(简称Gy—XⅦ)、西洋参皂苷一R1(简称Q—R1)1987年徐绥绪等从西洋参根中分得:R0Rb1Rb2RdReRg1Rg2Rg3Rh1和一种新皂苷,命名为人参皂苷RAo1988年张祟禧等从中国黑龙江西洋参根中分得:R0Rb1Rb2RcRd ReRg1。印度学者Ashok Shgh报道从美国西洋参中发现9种皂苷,其中主要的皂苷为人参皂苷Rb类。Le Men—Olivier L等从法国产西洋参根中提得:Rb1 RdReP— F11Gy—XⅦ1998年周雨等从西洋参中分得丙二酸单酰基人参皂苷一Rbl(简称M—Rb1)Rb1Re1997年李铣等从加拿大西洋参根中分得两个新的齐墩果酸型皂苷,命名为quinquenoside— R3 ,R4(简称Q—R3Q—R4),另外还分得Rb1Rb2 Rb3RcRdReRg1Rg2Rg3Rh120R—Rh21997年王金辉等从加拿大产西洋参根中分离得到2个新化合物,命名为西洋参皂苷L4和西洋参皂苷l2,另外还分得人参皂苷 Rg1ReRdRcRb1Rb2 Rb3和假人参皂苷F11、珠子参苷 F1、绞股蓝皂苷和绞股蓝皂苷XⅦ1998年又分离得到一种ionol型葡萄糖苷---linafionoside A2000年丛登立等从西洋参叶中分离得到人参皂苷Rh1Rh2Rh32003年苏健等又从吉林产西洋参的根中分离得到10个皂苷单体,分别是24(R)一假人参皂苷RT524(R)一假人参皂苷 F11,人参皂苷Rg1Rg3ReRdRcRb1Rb2和三七皂苷 K2006年郭娜等从加拿大西洋参根中分离到8个皂苷类化合物,分别是Rg8Rg6F1Rh120(R)Rh1 Rg2ReRb1,其中Rg8为首次得到。江海鹏等于2006年也在西洋参根中分离到8个皂苷类化合物, GimenosideⅢMajoroside—F1为首次分离得到,其余是Rg1Rg220(R)Rg2RdReRb1.

    12  挥发油类

沈宁等从吉林栽培的西洋参挥发油中用GC— MS法鉴定出37种化合物,并测定了各成分的相对含量,其中倍半萜类化合物有26种,约占总挥发油75%,为西洋参中挥发物的主要成分。郑友兰等对黑龙江栽培的西洋参中挥发油成分进行了分离与鉴定,从碱性组分、强酸性组分、弱酸性组分、中性组分挥发油中共分离和鉴定出34种化合物。

13  其它

西洋参另外还含有氨基酸类、糖和多糖类、酶类、具有挥发性和很强的抗白血病细胞(h2v)的细胞毒活性的聚乙炔类化合物。

2  西洋参对糖尿病的作用

    多年来,医药学者对西洋参进行了大量的药理药效研究工作。主要集中在以下几个方面:对于中枢神经系统,具有镇静、增强学习记忆、促进神经生长、抗惊厥、镇痛、解热的作用;②对于心血管系统,具有抗心律失常、抗心肌缺血和再灌损伤等的作用;③对于血液系统,具有抗溶血、止血、降低血液凝固性、抑制血小板凝聚、调血脂、抗动脉粥样硬化、降血糖等的作用;@对于适应原样作用,具有抗疲劳、抗缺氧缺血、抗休克、抗饥渴、抗高低温和各种化学因素;对于免疫系统,具有降过氧化脂质以及丙二醛、增强SOD活力、抑制淋巴细胞转化、脾重等的作用;对于内分泌系统,作用于垂体一肾上腺皮质系统(ACTH)和垂体性腺系统、促进血清蛋白合成、促进骨髓蛋白合成、促进器官蛋白合成、促进脑内蛋白合成和脂肪合成、促进肝细胞蛋白(RNA聚合酶活力)合成、促进脂肪代谢和糖干弋谢等作用;对于泌尿系统,具有捌尿作用;对于肿瘤和病毒,具有抑制癌细胞增殖、抑祺单纯疱疹等病毒的作用,关于以上这些作用在这里就不再重述,重点进行对糖尿病的作用综述。   

当今世界,糖尿病已经成了人类健康的主要随题,美国加州大学洛杉矶分校地理及环境健康科学教授戴蒙德在《自然》杂志发表的研究结果显示,目前全球15亿患上2型糖尿病(或称成人糖尿病),世界范围内这一发病概率在3%左右,但发病率在各地不一:欧洲人只有2%患此病,在美国约有占总人口5%的人患有糖尿病,而非裔美国人患此病者有13%,中南美裔美国人有17%,美国土著则有50%。我国在京、沪、港和穗等大城市的成年人群中,其发病率已经接近或愈10%,我国已成为仅次于印度的第2位糖尿病大国。而糖尿病患者当中,90%为2型糖尿病患者。对于糖尿病的治疗,传统药物,尤其是在2型糖尿病的治疗上,一些植物提取物起到了良好的作用,其中的代表药物人参类已经在临床上应用多年,动物的体内实验也已经证明亚洲人参、西洋参具有降糖活性。西洋参对于糖尿病的活性研究报道多见于国外文献,国内鲜有报道。

21  药理研究

    John Zeqi Luo等研究结果表明,西洋参具有调节人体葡萄糖达到动态平衡的作用,由于西洋参对糖尿病的治疗作用机制还不清楚,从而限制了西洋参的应用。一般认为,大多数糖尿病的病因是由于胰腺p细胞分泌胰岛素的功能被破坏所致。最近一种线粒体蛋白拆分蛋白一2(UCP2)被发现,它在胰岛素的合成和β细胞的存活中起到很关键的作用,初步研究发现,西洋参提取物可以抑制UCP2的表达,保护β细胞,提高胰岛素的合成能力,由此提出西洋参对糖尿病作用机制假说,即西洋参提取物能够抑制胰腺β细胞线粒体中的UCP2的活性,提高胰岛素合成能力和抗细胞凋亡。为验证这一假说,实验中将β细胞与含白介素和不含白介素的西洋参提取物水溶液在去血清中静态培养24h,以此来评价西洋参对于UCP2的表达、胰岛素的产生、抗细胞凋亡因子Bcl2的表达、促细胞凋亡因子caspase9的表达,以及细胞的 ATP水平的影响。研究发现,西洋参能够抑制UCP2、下调caspase9,同时增加ATP的产生和胰岛素的分泌,并且上调Bcl2,减少细胞凋亡。这些发现提示,西洋参提取物能够通过抑制线粒体UCP2的活性来刺激胰岛素的产生、预防β细胞的流失,结果导致 ATP水平的提高,抗细胞凋亡因子Bcl2的增加,同时下调促细胞凋亡因子caspase9,从而降低细胞凋亡的发生,这些结果充分支持了以上的假说。

    Hasegawa H等对西洋参的有效成分RblRg的研究中发现,人参皂苷在通常情况下具有促进葡萄糖转移的功能,人参皂苷Rbl在最低lmmotL的浓度条件下就可以增加(24±5)的葡萄糖转移生理活性,人参皂苷Pg3也表现出对诱导抑制绵羊红细胞运转葡萄糖的重要作用。Yokozawa T等人研究发现,人参皂苷 Rb2可以激活模型大鼠的脂质代谢和糖代谢。

22  临床研究

    由于糖尿病发病率居高不下,而且有加速上升的趋势,使得西方国家尤其是美国进一步加大了对糖尿病的研究力度。2型糖尿病是一种临床慢性复杂疾病,不仅仅是血糖异常升高,而且常常伴随着高血压、高血脂等等一系列心血管系统的各种疾病,据统计,2型糖尿病人的死亡有75%与其并发的心血管系统疾病有关,所以,在这一类疾病的治疗上往往比较复杂,在降糖的同时有时还要降血压、降血脂,控制饮食、限制吸烟等等。由于这些常规治疗方法并不能彻底解决问题,从经济能力方面考虑,食品补充剂和植物药的应用数量急剧上升,同时也相应开展了相关临床实验研究。

    近年来,VLADIlVflR VUKSAN博士等人在西洋参餐后降糖的研究中作了大量的临床研究工作,主要采取的方法是随机、双盲、多个体交叉设计、安慰剂对照,剂量依赖性研究、时间依赖性研究等。为验证西洋参的降血糖的作用,进行了一组4中心实验,lO名非糖尿病受试者,92型糖尿病受试者,分别给与3g西洋参胶囊或安慰剂胶囊(玉米面)40min后各自口服25g葡萄糖进行干预,分别在服用葡萄糖15min30min45min~60min90min120min时间点采集血样,-20℃低温保存,3d内完成血糖测试分析,并进行统计学处理,结果显示,西洋参对于两组受试者都表现出了削弱餐后血糖过多的作用。

    研究人员对西洋参作用于2型糖尿病的剂量和时间的关系进行如下实验研究,lO2型糖尿病人(4名男性、6名女性),按计划方案分别在口服25g葡萄糖之前120min80min,40min,0min给与安慰剂胶囊(玉米面)3g~6g9g西洋参胶囊,在分别于口服葡萄糖后0min15min30min60min,90min、和120min时间点采取血样,进行血糖测试分析,结果表明,3g6g9g三个剂量没有差异性,在2h内也没有相关性。另一组实验是在12名健康受试者中进行随机交叉设计实验,剂量梯度为0g(安慰剂)1g2g3g西洋参,西洋参服用时间为在口服25g葡萄糖之前40min20min10min~0min,采血样时间点为口服葡萄糖后0min15min30min60min90min,血糖指标分析测试结果表明,西洋参降低非糖尿病人餐后血糖的作用具有时间依赖性而不具有剂量依赖性,西洋参的活性在葡萄糖干预后40min内具有时间相关性,在1—3g剂量范围内表现出相同的疗效。

    作为从食品补充剂的角度来调理2型糖尿病人的血糖,西洋参已经应用多年了,但西洋参降糖的药效物质基础尚未完全阐明,各类人参皂苷在心血管方面的活性研究较多,在对糖尿病治疗的作用机理方面还应该做进一步的深入探讨,由于西洋参提取物作为复合成分对糖尿病做了较为深入的机理探讨,阐明了西洋参提取物能够通过抑制线粒体UCP-2的活性来刺激胰岛素的产生、预防β细胞的流失,提高ATP水平,使抗细胞凋亡因子Bd-2增加,同时下调促细胞凋亡因子caspase9,降低细胞凋亡的发生,从而改善2型糖尿病患者的血糖水平,现在我们所面临的任务是要研究西洋参提取物中到底是那些成分在发挥作用,希望通过对西洋参提取物中大量化学成分的筛选研究,发现一些对糖尿病人血糖调节作用明确的化合物或化合物组合,为今后血糖调节药物的开发提供新的机会。

日期:2010年1月14日 - 来自[药物与临床]栏目

HPLC法测定复方丹参片中人参皂甙Rb1的含量

【摘要】    目的 测定复方丹参片中人参皂甙Rb1的含量。 方法 HPLC法,流动相:乙腈-水(30:70),检测波长204nm。结果人参皂甙Rb1的线性范围:0.075mg~1.20mg,r=0.9925,回收率为99.3%,RSD为3.1%。结论 本法灵敏、准确,可作为该产品的质量控制指标。

【关键词】  HPLC法;复方丹参片;人参皂甙Rb1

  复方丹参片由丹参、三七、冰片制成,具有活血化瘀,理气止痛的功效。临床用于气滞血瘀所致的胸痹、症见胸闷、心前区刺痛;冠心病、心绞痛见上述证候者。
        
  三七是处方中的主药,人参皂甙Rb1是三七的有效成分之一,本文采用HPLC法测定人参皂甙Rb1的含量,方法简便、可靠。

  1 材料与方法

  1.1 仪器与试剂 

  SP8800高效液相色谱仪,SPECTRA200检测器,SP4270积分仪。人参皂甙Rb1(中国药品生物制品检定所),复方丹参片(山西亚宝药业集团股份有限公司生产,批号:061011、061107、061208)。乙腈为色谱纯,其他均为分析纯。

  1.2 实验条件

  1.2.1 色谱条件 

  C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-水(30:70),检测波长204nm;流速:1.0ml/min;理论板数以人参皂甙Rb1峰计算,应不少于1 000。

  1.2.2 检测波长的选择 

  取人参皂甙Rb1对照品适量,用岛津UV-2201紫外可见分光光度计在190~350nm波长下扫描。结果人参皂甙Rb1在204nm波长处有最大吸收,故选择204nm作为测定波长。

  1.3 供试液的制备 

  (1)对照品溶液:精密称取人参皂甙Rb1对照本品适量,加甲醇制成每1ml分别含0.075、0.15、0.30、0.60、1.20mg的溶液作为对照品溶液。(2)样品溶液:取复方丹参片10片磨成粉状,溶于10ml蒸馏水中,滤过,滤液用乙醚提取2次,每次15ml,弃去醚层。用水饱和正丁醇提取4次,每次10ml,合并醇层用正丁醇饱和水洗涤2次。加树脂拌匀,挥干正丁醇,置D101大孔树脂上面[1],用水洗脱至糖的反应为阴性,用水饱和正丁醇100ml洗脱收集醇液,挥干正丁醇,用甲醇转移至25ml容量瓶中并稀释至刻度,摇匀,过滤,作为供试品溶液。

  1.4 线性关系考虑 

  将上述各浓度的对照品溶液分别进样10μl,记录峰面积,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进行线性回归,计算得回归方程:Y=2 926.8x+3 041.1,r=0.9925。结果表明:人参皂甙Rb1进样量在0.075~1.20mg范围内峰面积积分值与浓度呈良好的线性关系。

  2 结果与讨论

  2.1 精密度试验 

  精密吸取上述对照品溶液10μl,重复进样5次,测得人参皂甙Rb1峰面积的RSD为0.92%。

  2.2 稳定性试验
 
  精密吸取同一批供试液10μl,每隔1h进样一次,共进样6次。结果表明:供试品溶液在5h内基本稳定,RSD为1.13%(n=6)。

  2.3 重现性试验

  取同一批样品5份,依法平行测定5次,结果RSD为1.22%(n=5)。

  2.4 回收率试验 

  测定已知含量的样品(批号060908,含量2.04mg/片),按样品溶液制备方法制备,加入对照品适量,依法测定,计算回收率。平均回收率为99.3%,RSD为3.1%。

  2.5 分别精密吸取3批样品各3份按样品溶液制备方法制备。分别精密吸取对照品溶液及样品溶液10μl注入高效液相色谱仪中测定,即得结果见表1。表1  样品溶液和对照溶液在高效液相色谱仪测定结果(略)

  2.6 要注意样品提取,按药典[2]方法药材的HPLC色谱已经很稳定,但样品的色谱较差。故改进提取方法,过大孔树脂柱,此法测试结果稳定,效果较好。本法灵敏、准确,可作为该产品的质量控制指标。

【参考文献】
    [1]马振山,大孔吸附树脂在药学领域中的研究应用[J].中成药,1997,19(12):40.

  [2]国家药典委员会 . 中国药典(2005年版)一部[S]. 北京:化学工业出版社,2005:10:11.


作者单位:广东医学院附属医院 ,广东 湛江 524001.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第1期]栏目

反相高效液相色谱法测定三七花中人参皂苷Rb1的含量

  【摘要】    目的为三七花质量标准研究打下基础。方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法对三七花中人参皂苷Rb1含量进行测定。结果人参皂苷Rb1含量在8 h内基本稳定;精密度RSD为0.55%,重复性RSD为4.12%,高、中、低浓度组的回收率分别为102.88%,97.87%,103.57%。结论方法学考察结果符合质量分析的要求,可用于三七花中人参皂苷Rb1含量测定。

  【关键词】  三七花 人参皂苷Rb1 反相高效液相色谱法

  Abstract:ObjectiveTo give the foundation of quality standard of Notoginseng bud. MethodsRP-HPLC was established to determine Rb1 of Notoginseng bud. ResultsThe stability time was 8h. Linearity, precision and reproducibility of the method were good. ConclusionThis method accords with the analysis requirement. It can be used in determining the content of  Rb1 in Notoginseng bud.

  Key words:Notoginseng bud;  Rb1;  RP-HPLC

  三七花是传统名贵中药五加科植物三七的花蕾,盛产于我国西部云南、广西、西藏等地,作为药材,民间用于治疗高血压病、咽痛音哑、津伤口渴等。经前期药效研究表明,其抗高血压病的有效部位为总皂苷。有研究报道[1],从三七花中分得10种化合物,经化学和光谱方法确定为β-谷甾醇、胡萝卜苷、三七皂苷、绞股蓝皂苷-Ⅸ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rb3等。三七花中人参皂苷含量最高,以人参二醇苷为主,其中又以人参皂苷Rb1较多[2]。对于人参皂苷Rb1的含量测定方法有高效液相色谱法、薄层扫描法、气相色谱法等[3],HPLC法中CN柱和反相柱均可得到较好的分离。目前,关于三七的研究大都集中在其块根,块根也是现阶段三七产业的基本原料药物。由于三七花使用区域受限,使其药材资源的经济价值未被充分利用,因此研究也较为薄弱。本研究采用RP-HPLC方法作为三七花药材中人参皂苷Rb1的含量测定方法,以期为其质量标准的建立打下基础。

  1  仪器与试剂

  高效液相色谱仪(1100化学工作站,美国安捷仑科技公司);色谱柱Alltech Platinum C18 100A 5μm 250 mm×4.6 mm;试剂均为色谱纯。人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用)。

  2 方法与结果

  2.1  色谱条件色谱柱Alltech Platinum C18 100A 5μm 250 mm×4.6 mm;流动相为乙腈-水(30∶70);检测波长为203 nm。色谱图见图1~2。

  2.2  供试品制备条件的考察

  2.2.1 甲醇回流时间的考察考察了甲醇回流时间对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表1。依据结果,确定甲醇提取时间为4 h。表1  不同甲醇提取时间对含量测定的影响(略)

  2.2.2 石油醚提取次数考察样品用甲醇提取后,提取液用石油醚(30~60℃)萃取除杂,10 ml/次,考察不同提取次数对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表2。依据结果,为缩短样品处理时间,确定石油醚提取次数为2次。

  2.2.3 水淋洗用量的考察

  考察不同水淋洗用量对糖类成分淋洗程度的影响。结果见表3。依据结果,确定水淋洗用量为70 ml。表2  不同提取次数的比较(略)表3  不同水用量的比较(略)

  2.2.4   20%乙醇淋洗用量的考察考察不同20%乙醇淋洗用量对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表4。依据结果,确定20%乙醇淋洗用量为50 ml。表4  不同20%乙醇用量的比较(略)

  2.2.5  80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量的考察考察不同80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量对人参皂苷Rb1提取的影响。结果见表5。依据结果,确定80%乙醇洗脱用量为80 ml,收集洗脱液70 ml。表5  不同80%乙醇洗脱用量及收集洗脱液量的比较(略)

  2.3 供试品溶液的制备取三七花药材粉末(过3号筛)10 g,精密称定0.2 g,置索氏提取器中,加氯仿60 ml,加热回流1 h,弃去氯仿液,药析挥去氯仿,加甲醇55 ml,加热回流4 h,提取液挥干,加水10 ml溶解,加石油醚(30~60℃)提取2次,10 ml/次,弃取醚液,水液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5 cm,长15 cm),以水70 ml洗脱,弃去水液,再用20%乙醇50 ml洗脱,弃去20%乙醇洗脱液,继用80%乙醇80 ml洗脱,收集洗脱液70 ml,蒸干,残渣加甲醇溶解并定量转移至10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。

  2.4 标准曲线的建立取人参皂苷Rb1对照品约11 mg,精密称定,用甲醇定容至10 ml容量瓶中,配制成浓度为1.16 mg·ml-1的对照品溶液。用甲醇逐级稀释成一系列浓度的标准液。按上述色谱条件进样HPLC分析,以峰面积(A)对含量(Y)进行线性回归,得标准曲线回归方程为Y=0.004 6A+0.112 9  r=0.999 9,线性范围为0.58~11.6 μg。

  2.5 精密度实验取同一人参皂苷Rb1对照品溶液,连续进样6次,精密度为0.55%。

  2.6  稳定性实验取同一供试品溶液,于0,2,4,6,8h分别进样,精密度为0.83%。

  2.7 重复性实验取相同制法制备的同一批次5份样品进行测定,结果RSD为4.12%,表明重复性良好。

  2.8 回收率实验于三七花粉末中加入适量人参皂苷Rb1对照品标准液形成高、中、低3个浓度的样品,按“2.3”处理后进行HPLC分析,计算人参皂苷Rb1的方法回收率,得回收率分别为102.88%,97.87%,103.57%。结果见表6。表6  回收率实验结果(略)

  2.9 三七花药材含量测定取三七花药材粉末10 g,精密称定0.2 g,按上述测定方法进行HPLC测定。结果见表7。 表7  三七花药材含量测定结果(略)

  3 讨论

  本文曾以三七块根研究中常用的人参皂苷Rg1作为测定指标建立含量测定方法,但在实验中发现三七花中Rg1含量远少于Rb1,以其作为测定指标有所不妥,与文献报道相符。

  由于三七花中所含组分较多,包括黄酮类、挥发油类、多糖类、氨基酸类等,且含有块根所没有的大量叶绿素,极易对测定造成干扰,故在供试品制备中选用D101型大孔吸附树脂,先用水洗去多糖,再用20%乙醇洗去黄酮类物质,最后收集80%乙醇洗脱液,结果表明可起到较好的纯化作用。

  从研究结果看,云南文山的三七花总皂苷含量高于广西靖西,表明不同产地的药材有一定差异,选材时必须加以考虑。

  【参考文献】

  [1]刘刚,鲍建材,郑友兰,等.三七化学成分研究进展[J].人参研究,2004,2:10.

  [2]田国才.三七花治疗心律失常的探讨[J].中国民族民间医药杂志,2000,44:147.

  [3]周迎春,赵怀清,梁宁,等.高效液相色谱法同时测定三七总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1含量[J].沈阳药科大学学报,2003,20(1):27.

 

日期:2009年9月19日 - 来自[色谱论文]栏目

高效液相色谱法测定蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量

  【摘要】目的用高效液相色谱法(HPLC)法测定蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量。方法色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶 ,流动相为乙腈 -水 ,梯度洗脱。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1分别在0.106~2.650 μg, 0.424~10.600 μg,0.423 2~ 10.587 μg之间呈良好的线性关系 ;制剂中 3种成分的平均回收率分别为 92.7%,93.4%和95.7%; RSD分别为2.10% (n=6),2.11% (n=6)和1.39% (n=6) 。结论该方法简便、准确、分离效果好,无干扰,可用于蛭龙血通胶囊的质量评价。

  【关键词】  三七 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 Rb1 高效液相色谱

  蛭龙血通胶囊是由三七、水蛭等5种药材组成的中药复方制剂,系中药6类新药,具有活血祛淤 、通脉活络、益气安神的功效,以三七为原料的各种制剂采用了多种测定方法,为严格控制产品质量,我们采用了HPLC作为检测手段,对蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1进行含量测定研究。

  1  仪器与材料

  1.1  仪器

  日本岛津液相色谱仪,包括LC-2010A紫外检测器、四元泵、自动进样器。

  1.2 试刘与对照品

  乙腈为色谱纯迪马公司生产;水为娃哈哈超纯水;甲醇为分析纯;三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1对照品,均来源于中国药品生物制品检定所,供含量测定用;样品为药业公司提供。

  2  方法与结果

  2.1  色谱条件

  色谱柱为Agilen  SB-C18,(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈―水按表1进行梯度洗脱;检测波长为203 nm;流速1.0ml·min-1;进样量10 μl。表1  流动相(略)

  2.2  对照品溶液的制备

  精密称取三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量,加甲醇制成每毫升含三七皂苷R1 0.1 mg,人参皂苷Rg10.4 mg和人参皂苷Rb10.4 mg的混合溶液,即得。

  2.3  供试品溶液制备

  取装量差异项下的本品,研细,精密称定2.5g,精密加甲醇50 ml,称定重量,放置过夜,置80℃水浴中保持微沸2 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加甲醇溶解并转移置10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。

  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,得到蛭龙血通胶囊的色谱分离图,见图1、图2。

  2.4  专属性按供试品溶液的制备方法

  制成缺三七的阴性样品。取样品,对照品及阴性样品按含量测定方法试验,结果在与对照品相同保留时间未见色谱峰。阴性样品见图1~3。

  2.5 精密度

  取同一对照品溶液,各10 μl,连续进样6次,分析,计算,结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积的RSD分别为2.09%,0.35%和0.31%,表明本法的精密度良好。

  2.6 线性关系的考察

  分别精密吸取对照品溶液1,5,10,15,20,25μl,注入液相色谱仪,以峰面积积分值为纵坐标,以进样量为横坐标,绘制标准曲线,分别得回归方程:三七皂苷R1为Y=271 621X+7 898.1,相关系数r=0.998 0;人参皂苷Rg1 为Y=392 803X+9 280.1,    相关系数r=0.999 5;人参皂苷Rb1为Y=276 761X+21 789,相关系数r=0.999 7。结果表明线性关系良好,其线性范围分别为三七皂苷R1为0.106~2.650 μg;人参皂苷Rg1为0.424~10.600  μg;人参皂苷Rb1为0.423 2~10.587 μg。

  2.7  重复性实验

  取同一批供试品(批号为060902)6份,按“2.3”项供试品溶液制备项下的方法操作,测定,计算。结果含量平均值为3.19 mg/粒,RSD为2.43%。表明本法的重复性良好。

  2.8  回收率实验

  分别精密吸取浓度为1.65 mg/ml的三七皂苷R1 对照品溶液1 ml、浓度为1.63 mg/ ml的人参皂苷Rg1对照品溶液4 ml和浓度为1.81 mg/ ml的人参皂苷Rb1对照品溶液4 ml,加入同一具塞容量瓶中,共取6份,分别蒸干,分别取批号为( 060902)的供试品6份,各1.2 g,置上述6个容器中,精密称定,按“2.2”项供试品溶液的制备,制成6份供试液,按上述色谱条件进行测定(见表2)。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的平均回收率分别为92.7% (n=6)、93.4% (n=6)和95.7% (n=6); RSD分别为2.10% (n=6)、2.11% (n=6)和1.39% (n=6), 结果表明本法的回收率良好。表2  回收率实验的测定结果(略)

  2.9 样品测定结果

  按上述含量测定方法对10批样品进行测定,结果见表3。表3  样品测定结果(略)

  3 讨论

  三七中主要成分为皂苷类成分,其中三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为其有效成分之一。实验中曾参考有关文献[1] 进行提取、分离,但由于本品为复方制剂,成分复杂,且待测成分在使用紫外低波长检测时,受到结构相似的皂苷类干扰而难以得到有效分离,因此经多次实验,采用梯度洗脱的色谱分离,得到了良好的效果。

  【参考文献】

  [1]国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)[S].北京:化学工业出版社,2005:10.

 

日期:2009年9月17日 - 来自[色谱论文]栏目

人参皂甙Rb1促进3T3-L1脂肪细胞分化并抑制脂解

《中华内分泌代谢杂志》2007年第23卷第3期 中国研究者观察了人参皂甙Rb1(Rb1)对3T3-L1脂肪细胞分化和脂肪分解的作用,并探讨人参抗糖尿病的作用机制。研究者通过在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中,分别加入不同浓度的Rb1作用6d,各组脂肪细胞分别进行油红O染色,甘油三酯(TG)含量、^3H-葡萄糖转运率检测,并用实时定量PCR和免疫印迹对脂肪细胞PPARγ2、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白(ap2)和葡萄糖转运体(Glut)1、Glut4的mRNA和蛋白水平进行测定;运用表面等离子体共振技术(SPR)测定Rb1与PPARγ结合亲和力;在分化成熟的脂肪细胞加入Rb1孵育后,测定释放到上清液的甘油含量。结果发现Rb1能促进3T3-L1脂肪细胞的分化程度,并呈剂量依赖关系,10μmol/L浓度使细胞内TG含量增加约56%,同时PPARγ2和C/EBPα的mRNA和蛋白水平均显著升高,其下游基因ap2的mRNA水平也明显增加。分化过程中加入Rb1的脂肪细胞基础和胰岛素介导的葡萄糖转运率增加。Glut4的mRNA和蛋白水平均上升,而Glut1则未见显著变化;SPR检测结果显示Rb1具有PPARγ结合活性,提示Rb1是PPARγ的配体;在诱导分化成熟的脂肪细胞中,Rb1抑制基础脂肪分解,10μmol/L浓度使上清甘油含量下降约50%,但对异丙肾上腺素介导的脂解没有影响。由此,研究者得出结论,Rb1作为PPARγ的配体,通过上调PPARγ2,2C/EBPα的表达促进脂肪细胞的脂肪形成;增加基础和胰岛素刺激的葡萄糖利用;同时抑制基础脂解。以上结果表明人参和人参皂甙抗糖尿病的作用可能与促进脂肪细胞分化,增加胰岛素敏感性和抑制基础脂解有关。
日期:2008年11月25日 - 来自[内分泌代谢]栏目

胶束电动毛细管色谱法测定西洋参中人参皂苷Rb1,Re的含量

 
    [摘要] 目的:建立西洋参中人参皂苷Re,Rb1的胶束电动毛细管色谱测定方法,考察影响分离的各因素,确定最佳色谱条件。方法:测定缓冲液为含20m mol/L硼酸、20m mol/L硼砂、60mmol/L胆酸钠和20%乙腈的混合溶液。电压20 kV,柱温25℃,检测波长203nm,压力进样5s。结果:线性范围Re为0.38~1.65mmol/L,Rb1为0.42~1.76mmol/L。加样回收率Re为97.2%,RSD=1.6%;Rb1为97.7%,RSD=1.9%(n=5)。结论:该方法具有样品前处理简单,重现性好,所得色谱图信息丰富等特点。
    [关键词]高效毛细管电泳;西洋参;人参皂苷
    西洋参Panax quinquefolius L.为五加科人参属植物,原产北美洲加拿大的蒙特利尔、魁北克和美国东部。1975年,西洋参在我国引种成功,目前在东北、华北及华东地区均有栽培。
    西洋参中人参皂苷的含量测定方法有薄层扫描法、高效液相色谱法。高效毛细管电泳(HPCE)是一种迅速发展起来的新技术,具有分离效率高,分析时间短等特点。作者在岩上正藏报道的基础上,对色谱条件作了研究,取得了满意的色谱分离效果。
    1 仪器与试药
    Beckman P/ACE System 5500毛细管电泳仪(美国Beckman公司)GOLD色谱工作站,毛细管柱为50μm×57cm(有效长度为50cm),DAD检测器,检测波长203nm。硼酸、硼砂、胆酸钠均为分析纯;乙腈为色谱纯;[SERVA(Feibiochemica GmbH & Co.];水为2次重蒸水。
    人参皂苷Re(批号0704—20012),Rb (批号0754.20018)从中国药品生物制品检定所购买,均为含量测定用对照品。
进口西洋参药材(产地美国、加拿大)购于杭州华东医药股份有限公司,国产西洋参药材(产地吉林通化)委托吉林省药品检验所购买。由本所中药室林泉主任药师鉴定为P,quinquefolius。
    2 色谱条件的优化
    2.1 对照品溶液和供试品溶液的制备
    对照品溶液:取人参皂苷Re,Rb1各约10mg,精密称定,置10mL量瓶中,加50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液:将样品粉碎过40目筛,取约1.5g,精密称定,加甲醇50mL,置水浴中加热回流1.5h,放冷 滤过,精密吸取续滤液25mL,水浴上蒸干,残渣用50%甲醇溶解并稀释至10mL,放置过夜,然后用0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
    2.2 缓冲盐的种类及浓度
    根据文献报道,选用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),内含25%乙腈和75mmol/L胆酸钠的溶液作为运行缓冲液。结果人参皂苷Re,Rb1未能达到基线分离,且Rb1的柱效不高。
    在其他色谱条件保持不变的情况下,用pH 9.0 20mmol/L硼酸-硼砂盐缓冲液,进行分离,取得了较为满意的分离。
    缓冲盐浓度以20mmol/L为佳,此时电流强度小于100mA,浓度过高电流过大,影响分离和重现性。
    2.3 缓冲液pH值对分离的影响
    取硼酸、硼砂分别配制成浓度为40mmol/L的甲、乙2种溶液。取甲、乙溶液按不同比例混合,测定pH值,再加入胆酸钠和有机改性剂乙腈,结果表明溶液pH在9.0左右变动时,对分离影响不大,但当溶液pH 为8.0时,2组分峰形较差。
    2.4 表面活性剂种类及浓度对分离的影响
    在胶束电动毛细管色谱中,十二烷基硫酸钠(SDS)是用得最多的一种阴离子表面活性剂,因此也曾选用SDS作胶束,进行试验,结果基线波动很大,分离较差。可能由于SDS在203 DITI左右波长处吸收较大造成。比较了几种不同的表面活性剂,以胆酸钠为佳。试验考察了不同浓度对迁移时间的影响,结果表明,在相同条件下随着胶束浓度的增加,迁移时间增加。
    2.5 有机改性剂对分离的影响
    常用的有机添加剂有乙腈、甲醇、异丙醇。实验表明乙腈作为添加剂使用效果最佳,有机溶剂添加剂还能显著延长迁移时间。
    通过对以上影响色谱分离诸因素的考察,确定最佳色谱条件如下:运行缓冲液为20mmol/L硼酸-硼砂缓冲溶液(pH 9.0),内含60mmol/L胆酸钠,20%乙腈,操作电压20kV,温度25℃,检测波长203nm,压力进样5s。所得对照品溶液、供试品溶液色谱图。
    3 含量测定方法的论证
    3.1 线性关系考察
    精密称取Re,Rb1对照品各适量,加50%甲醇溶解并稀释制成每1mL分别含Re0.38,0.78,0.98,1.22,1.65mg和含Rbl 0.42,0.83,0.98,1.34,1.75mg的系列混合对照品溶液,在上述色谱条件下进样5sec.后,加压分离,测得峰面积积分值。
    Re:Y=0.6073X +0.0030,r=0.9993;Rb1:Y=0.7232X一0.0098,r=0.9997。结果表明Re在0.38~1.65 g/L,Rb1在0.42~1.76g/L呈良好的线性关系。
    3.2 精密度试验
    取混合对照品溶液,上机测定5次,每次压力进样5s。测得峰面积积分值,计算RSD。Re为1.4%,Rb1为1.6%。
    3.3 重复性试验
    取同一批样品5份,按供试品溶液制备项下方法进行操作,即得同一产地的5份供试品溶液,上机测定峰面积积分值,按外标法计算含量Re,平均含量为8.75mg/g,RSD为2.4%,Rb1平均含量为21.41mg/g,RSD为1.6%。
    3.4 稳定性试验
    取同一供试品溶液,分别于配制后0,1,3,5,8,24h进样测定,结果RSD(n=5)Re为2.1%,Rb1为2.3%。结果表明样品在24h内基本稳定。
    3.5 加样回收率试验
    取已测定含量的同一批西洋参粉末约0.75g,精密称定,加入Re,Rb1对照品溶液(1.183,1.524g/L),置水浴上蒸干,然后按供试品溶液制备项下方法制成供试品液,进样测定。
    3.5 3批西洋参药材人参皂苷Re,Rb1含量的测定取西洋参粉碎成细粉,按供试液制备方法操作,在上述色谱条件下,上机测定,3批样品中人参皂苷Re,Rbl的含量。
    4 总结
    溶解样品用溶剂,经比较以50% 甲醇为佳,如用甲醇溶解,运行时易发生电流中断现象,而用水作溶剂时,残渣中的挥发油不溶解,溶液呈乳剂状。本色谱条件取得成功分离的基础是选择了合适的缓冲溶液及有机溶剂添加剂,采用硼酸.硼砂缓冲溶液,可以调节分离选择性。有机溶剂添加剂不仅能影响电渗流和电泳速率,更重要的是影响待测组分在胶束和水相之间的分配系数,实验证明乙腈是最为合适的添加剂。本法采用高达20%量的乙腈来提高分离度。胶束电动毛细管色谱法测定西洋参中人参皂苷,具有样品前处理简单,可以同时测定两种成分,所得色谱图信息丰富等优点。可以用于西洋参药材及其制剂的质量控制或品质评价。
[参考文献]
[1] 中国药典.一部.20001.1.
[2] 王旭,周富荣.HPLC法测定西洋参中人参皂苷的含量.中国中药杂志,1999,24(4):227.
[3] 孙文基,郭耀武,等.国产西洋参中总皂苷及人参皂苷的含量考察.西北药学杂志,1997,12(1):13.

来源:东方医药网

日期:2007年5月18日 - 来自[色谱论文]栏目

RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1及Rb1含量

摘要:目的:建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1、HPLC含量测定方法。方法:采用YWG-Cl8色谱柱(250 mm×4.6mm,10μm),检测波长:203nm。人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(21:79),流速:1.2mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(31:69),流速:0.9mL/min。结果:该法人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD=1.16%(n=5)。人参皂苷Rb1的平均回收率为99.32%,BSD=2.52%(n=5)。结论:本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一。
关键词:清脑宣窍方;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;RP-HPLC;含量测定
清脑宣窍方为现代名中医经验方,由栀子、三七等中药组成,经临床实践证明对于缺血性脑中风具有良好的疗效。我们运用复方有效部位研究思路与方法,对清脑宣窍方治疗脑中风的有效部位进行了分离富集,且根据复方有效部位及其主要化学成分的研究分析,确定以复方有效部位中总皂苷、总环烯醚萜苷以及主要成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl、栀子苷的含量,来有效控制清脑宣窍方有效部位的内在质量。我们建立了人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的反相高效液相色谱测定方法,并运用于测定该方有效部位样品及其药材中的人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的含量,为该方有效部位质量标准的建立和控制提供依据。
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱系统(Waters 600 HPLC Pump,Waters 2487紫外检测器,Minnium32色谱工作站);MZITIFTR-AE240型电子分析天平,CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。索氏提取器。
对照品人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1,购自中国药品生物制品检定所(批号分别为:0703-200120,704-200115)。
栀子、三七药材均购自安国药材市场,经北京中医药大学中药学院生药系刘春生副教授鉴定为三七Pananx notoginseng (Burk).F.H.Chen、栀子GaMe-niajasminoides Ellis.。乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 人参皂苷Rg1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(21:79);流速:1.2mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rg1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.1.2 人参皂苷Rb1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(31:69);流速:0.9mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rb1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.2 对照品溶液的制备
精密称定人参皂苷Rgl对照品6.20mg置于50mL量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度(浓度为0.124g/L),摇匀,作为人参皂苷Rg1对照品溶液。
精密称定人参皂苷Rb1对照品4.63mg置于25mL量瓶中,用30%乙溶液稀释至刻度(浓度为0.185g/L),摇匀,作为人参皂苷Rb1对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 有效部位样品溶液的制备
取有效部位约15mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入30%乙醇,超声处理后,稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL上反相C18层析柱(内径1cm,填料为1g),先用35%甲醇溶液洗脱25mL,弃去;再以甲醇洗脱50mL,蒸干,甲醇超声溶解并定容至2mL容量瓶中,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.3.2 药材供试品溶液的制备
分别称取3种不同产地三七药材各3份,每份约0.5 g,置索氏提取器中,加乙醚适量加热回流提取1h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置索氏提取器中加甲醇适量,加热提取至甲醇无色,取甲醇提取液,挥干,残渣加甲醇溶解转移至25mL容量瓶中,定容。另取2mL转移至10mL容量瓶中,定容、摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为三七药材供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
按照处方比例称取除三七外其他药材适量,按照有效部位的工艺制得阴性样品,再按2.3.1项下方法制备阴性样品溶液。
2.5 线性关系的考察
分别精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液(浓度为0.124g/L)2.0,4.0,8.0,12.0,16.0μL及人参皂苷Rbl对照品溶液(浓度为0.185g/L)4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,注入高效液相色谱仪,分别按上述色谱条件,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得人参皂苷Rgl回归方程为Y=301733X一3220.2,r=0.9999(n=5)。得人参皂苷Rbl回归方程为Y=244308X一8563.1,r=0.9998(n=5)。结果表明,人参皂苷Rgl在0.248~1.984μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系,人参皂苷Rbl在0.760~3.70μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验
精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液和人参皂苷Rbl对照品溶液各10μL,分别连续进样5次,测得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.28%。人参皂苷Rbl峰面积的RSD为0.65%,表明方法的精密度良好。
2.7 稳定性实验
取有效部位样品约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。精密吸取有效部位样品溶液10μL,分别在制备后0、4、8、12、24 h进样,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积,计算峰面积RSD分别为0.91%及1.16%,表明样品溶液在1d内稳定。
2.8 重现性实验
精密称取同一批有效部位样品5份(约15mg),按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,进样,测得人参皂苷Rgl平均含量为5.88%,RSD为0.88%,人参皂苷Rbl平均含量为6.72%,RSD为1.76%,表明方法重现性良好。
2.9 回收率实验
称取已知含量的有效部位样品5份,每份约7.5mg,精密称定,置10mL量瓶中,分别定量加入0.124g/L人参皂苷Rg1对照品溶液3.2 mL及0.185g/L人参皂苷Rb1对照品溶液3mL,加入30%乙醇,以下按有效部位样品溶液的制备项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,注入液相色谱仪,依法测定,计算人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD为1.16%。人参皂苷Rb1平均回收率为99.52%,RSD为2.32%。
2.10 样品含量测定
2.10.1 有效部位样品含量测定
取3批有效部位样品各3份,每份约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rb1及人参皂苷对照品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,外标一点法测定含量。
2.10.2 三七药材样品含量测定
精密称取3批不同药材市场三七药材样品各3份,按三七药材样品项下制备,再分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品溶液10μL,外标一点法测定含量。
3 讨论
在对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1进行含量测定时,栀子成分对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1色谱峰有干扰,本论文建立了反相柱层析预处理方法,可以消除栀子成分的干扰,获得很好的分离。在使用YWG-C18色谱柱和紫外检测器的情况下,用梯度洗脱同时测定人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1时,基线向上漂移,导致较大误差,且分离时间较长,故使用两种色谱条件进行分别测定,可得到很好的结果。
参考文献
1 梁吉春,石任兵,刘斌,等.银翘散研究方法的新探讨.北京中医药大学学报,1999,22(1):37~38
2 陈萍,韦强.复方益血胶囊中人参皂苷Rg1定量分析方法研究.中国药科大学学报,20O3,34(1):35—37
日期:2007年5月18日 - 来自[色谱论文]栏目

RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1及Rb1含量

摘要:目的:建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1、HPLC含量测定方法。方法:采用YWG-Cl8色谱柱(250 mm×4.6mm,10μm),检测波长:203nm。人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(21:79),流速:1.2mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(31:69),流速:0.9mL/min。结果:该法人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD=1.16%(n=5)。人参皂苷Rb1的平均回收率为99.32%,BSD=2.52%(n=5)。结论:本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一。

关键词:清脑宣窍方;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;RP-HPLC;含量测定

    清脑宣窍方为现代名中医经验方,由栀子、三七等中药组成,经临床实践证明对于缺血性脑中风具有良好的疗效。我们运用复方有效部位研究思路与方法,对清脑宣窍方治疗脑中风的有效部位进行了分离富集,且根据复方有效部位及其主要化学成分的研究分析,确定以复方有效部位中总皂苷、总环烯醚萜苷以及主要成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl、栀子苷的含量,来有效控制清脑宣窍方有效部位的内在质量。我们建立了人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的反相高效液相色谱测定方法,并运用于测定该方有效部位样品及其药材中的人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的含量,为该方有效部位质量标准的建立和控制提供依据。
1 仪器与材料
    Waters高效液相色谱系统(Waters 600 HPLC Pump,Waters 2487紫外检测器,Minnium32色谱工作站);MZITIFTR-AE240型电子分析天平,CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。索氏提取器。
对照品人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1,购自中国药品生物制品检定所(批号分别为:0703-200120,704-200115)。
    栀子、三七药材均购自安国药材市场,经北京中医药大学中药学院生药系刘春生副教授鉴定为三七Pananx notoginseng (Burk).F.H.Chen、栀子GaMe-niajasminoides Ellis.。乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 人参皂苷Rg1的色谱条件
    YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(21:79);流速:1.2mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rg1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.1.2 人参皂苷Rb1的色谱条件
    YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(31:69);流速:0.9mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rb1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.2 对照品溶液的制备
    精密称定人参皂苷Rgl对照品6.20mg置于50mL量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度(浓度为0.124g/L),摇匀,作为人参皂苷Rg1对照品溶液。
    精密称定人参皂苷Rb1对照品4.63mg置于25mL量瓶中,用30%乙溶液稀释至刻度(浓度为0.185g/L),摇匀,作为人参皂苷Rb1对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 有效部位样品溶液的制备
    取有效部位约15mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入30%乙醇,超声处理后,稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL上反相C18层析柱(内径1cm,填料为1g),先用35%甲醇溶液洗脱25mL,弃去;再以甲醇洗脱50mL,蒸干,甲醇超声溶解并定容至2mL容量瓶中,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.3.2 药材供试品溶液的制备
    分别称取3种不同产地三七药材各3份,每份约0.5 g,置索氏提取器中,加乙醚适量加热回流提取1h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置索氏提取器中加甲醇适量,加热提取至甲醇无色,取甲醇提取液,挥干,残渣加甲醇溶解转移至25mL容量瓶中,定容。另取2mL转移至10mL容量瓶中,定容、摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为三七药材供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
    按照处方比例称取除三七外其他药材适量,按照有效部位的工艺制得阴性样品,再按2.3.1项下方法制备阴性样品溶液。
2.5 线性关系的考察
    分别精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液(浓度为0.124g/L)2.0,4.0,8.0,12.0,16.0μL及人参皂苷Rbl对照品溶液(浓度为0.185g/L)4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,注入高效液相色谱仪,分别按上述色谱条件,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得人参皂苷Rgl回归方程为Y=301733X一3220.2,r=0.9999(n=5)。得人参皂苷Rbl回归方程为Y=244308X一8563.1,r=0.9998(n=5)。结果表明,人参皂苷Rgl在0.248~1.984μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系,人参皂苷Rbl在0.760~3.70μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验
    精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液和人参皂苷Rbl对照品溶液各10μL,分别连续进样5次,测得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.28%。人参皂苷Rbl峰面积的RSD为0.65%,表明方法的精密度良好。
2.7 稳定性实验
    取有效部位样品约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。精密吸取有效部位样品溶液10μL,分别在制备后0、4、8、12、24 h进样,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积,计算峰面积RSD分别为0.91%及1.16%,表明样品溶液在1d内稳定。
2.8 重现性实验
    精密称取同一批有效部位样品5份(约15mg),按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,进样,测得人参皂苷Rgl平均含量为5.88%,RSD为0.88%,人参皂苷Rbl平均含量为6.72%,RSD为1.76%,表明方法重现性良好。
2.9 回收率实验
    称取已知含量的有效部位样品5份,每份约7.5mg,精密称定,置10mL量瓶中,分别定量加入0.124g/L人参皂苷Rg1对照品溶液3.2 mL及0.185g/L人参皂苷Rb1对照品溶液3mL,加入30%乙醇,以下按有效部位样品溶液的制备项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,注入液相色谱仪,依法测定,计算人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD为1.16%。人参皂苷Rb1平均回收率为99.52%,RSD为2.32%。
2.10 样品含量测定
2.10.1 有效部位样品含量测定
    取3批有效部位样品各3份,每份约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rb1及人参皂苷对照品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,外标一点法测定含量。
2.10.2 三七药材样品含量测定
    精密称取3批不同药材市场三七药材样品各3份,按三七药材样品项下制备,再分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品溶液10μL,外标一点法测定含量。
3 讨论
    在对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1进行含量测定时,栀子成分对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1色谱峰有干扰,本论文建立了反相柱层析预处理方法,可以消除栀子成分的干扰,获得很好的分离。在使用YWG-C18色谱柱和紫外检测器的情况下,用梯度洗脱同时测定人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1时,基线向上漂移,导致较大误差,且分离时间较长,故使用两种色谱条件进行分别测定,可得到很好的结果。

参考文献
1 梁吉春,石任兵,刘斌,等.银翘散研究方法的新探讨.北京中医药大学学报,1999,22(1):37~38
2 陈萍,韦强.复方益血胶囊中人参皂苷Rg1定量分析方法研究.中国药科大学学报,20O3,34(1):35—37

日期:2007年5月18日 - 来自[色谱分析实例]栏目
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