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田七颗粒质量标准研究

【摘要】 目的 建立田七颗粒的质量标准。方法 采用TLC法对处方中的三七进行定性鉴别,用HPLC法对制剂中人参皂苷Rg1与三七皂苷R1进行定量测定。结果 在TLC鉴别中能检出三七,人参皂苷Rg1在0.628~5.652 μg(r=0.999 8)、三七皂苷R1在0.155~1.395 μg(r=0.999 8)范围内呈良好的线性关系,平均回收率分别为99.24%(RSD=0.84%)和99.14%(RSD=1.13%)。结论 本方法操作简便,准确,重复性好,精密度高,可作为该制剂的质量控制方法。

【关键词】  田七颗粒;薄层色谱法;人参皂苷Rg1;三七皂苷R1;高效液相色谱法

Study of Quality Standard for Tianqi Granules 

  TAN Chun-yan, CHEN Rong, FAN Wei-feng

  Guangxi Yulin Pharmaceutical Co.,Ltd, Yulin 537001, China

    Abstract:Objective To establish the quality standard for Tianqi Granule. Methods Radix Notoginseng in Tianqi Granule was identified by TLC. The ginsenoside Rg1 and notoginsenoide R1 in Tianqi were determined by HPLC. Result Radix Notoginseng could be identified by TLC. The linear ranges of ginsenoside Rg1 and notoginsenoide R1 were at 0.628~5.652 μg (r=0.999 8) and 0.155~1.395 μg (r=0.999 8), respectively. The average recoveries were 99.24% (RSD=0.84%) and 99.14% (RSD=1.13%). Conclusion The method is simple, accurate and with good reproducibility and high precision, and can be used for quality control of Tianqi Granule.
   
  Key words:Tianqi Granule;TLC;ginsenoside Rg1;notoginsenoide R1;HPLC
 
    田七颗粒主要以三七为原料加工制成,具有活血定痛、祛瘀生新的作用。三七主要含人参皂苷Rb1、Rg1、Re和三七皂苷R1等20余种皂苷成分,其中人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1是含量最高的3个成分,三七皂苷R1又是三七的特征性成分[1]。本试验对制剂的质量标准进行了研究,用TLC法对处方中的三七进行了定性鉴别,并采用HPLC法测定田七颗粒中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量,方法简便,准确,重现性好,可作为该制剂的质量控制方法。

  1  仪器与试药

    Agilent1100系列高效液相色谱仪:G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1379A脱气机,G1314VWD检测器,Agilent1100化学工作站;UV-2201型紫外-可见分光光度仪。
   
  田七颗粒,广西玉林制药有限责任公司生产;人参皂苷Rg1和三七皂苷R1对照品(供含量测定用,批号:人参皂苷Rg1为0703-9914、0703-9813,三七皂苷R1为0745-200109),均由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

  2  定性鉴别
    
  取本品2 g,研细,加甲醇20 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇2 mL使溶解,作为供试品溶液。另取缺三七的阴性对照品2 g,同法制成阴性对照品溶液。再取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷 R1对照品,分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取供试品溶液、对照品溶液及阴性对照液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1对照品相应的位置上,显红色的斑点,而阴性对照液无相应斑点。

  3  含量测定

  3.1  色谱条件

    Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.05%磷酸溶液(18∶82);流速:1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。理论塔板数按三七皂苷R1计算应不低于3 000。

  3.2  对照品溶液的制备

    分别精密称取人参皂苷Rg1和三七皂苷R1对照品适量,加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1 0.396 mg和三七皂苷R1 0.092 mg的混合溶液,摇匀,即得。

  3.3  供试品溶液的制备

    取本品适量,研细,取约1.2 g,精密称定,加水适量使溶解并转移至分液漏斗中,用水饱和的正丁醇萃取3次,每次20 mL,合并正丁醇萃取液,加氨试液洗涤2次,每次20 mL,弃去氨试液,正丁醇层蒸干,残渣加甲醇溶解并移入10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用0.45 μm滤膜滤过,作为供试品溶液。

  3.4  空白试验

    按处方及制备工艺制备不含三七药材的阴性样品,再按供试品溶液的制备方法制备并测定。按照上述色谱条件,吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,分别注入色谱仪,进行测定。结果供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,分别有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。因此,可在此系统条件下对人参皂苷Rg1和三七皂苷R1进行定量分析。

  3.5  线性关系的考察 
   
  精密称取人参皂苷Rg1对照品31.4 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,作为人参皂苷Rg1对照品贮备液(0.628 mg/mL)。分别精密吸取贮备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成浓度分别为0.062 8、0.188 4、0.314 0、0.439 6、0.565 2 mg/mL的溶液。分别精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以人参皂苷Rg1对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=209.713X-0.260,r=0.999 8,人参皂苷Rg1在0.628~5.652 μg范围内呈良好的线性关系。
   
  精密称取三七皂苷R1对照品7.75 mg,置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,作为三七皂苷R1对照品贮备液(0.155 mg/mL)。分别精密吸取贮备液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成浓度分别为0.015 5、0.046 5、0.077 5、0.108 5、0.139 5 mg/mL的溶液。分别精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以三七皂苷R1对照品进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=208.065X-2.85,r=0.999 8,三七皂苷R1在0.155~1.395 μg范围内呈良好的线性关系。

  3.6  精密度试验

    取对照品溶液,重复进样6次,测定峰面积,人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的RSD分别为0.56%和0.69%,表明精密度良好。

  3.7  重复性试验

    取同一批号(030102)的田七颗粒,共6份,按“3.3”项制备,进样,测定峰面积,人参皂苷Rg1平均含量为3.708 mg/g, RSD=1.01%;三七皂苷R1平均含量为0.698 mg/g,RSD=0.92%。

  3.8  稳定性考察

    精密吸取同一供试品溶液,分别于制备后12 h内每隔2 h进样1次,测定峰面积,人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的RSD分别为1.52%和1.47%,表明样品溶液在12 h基本稳定。

  3.9  加样回收率测定

    取已知含量的样品(人参皂苷Rg1含量3.708 mg/g和三七皂苷R1含量0.698 mg/g)6份,精密称定,分别精密加入人参皂苷Rg1对照品贮备液4.5 mL和三七皂苷R1对照品贮备液3.5 mL,挥干甲醇后,按供试品溶液的制备方法制备,根据上面色谱条件测定峰面积,计算回收率,结果见表1、表2。 表1  人参皂苷Rg1加样回收率试验结果(略)表2  三七皂苷R1加样回收率试验结果(略)

  3.10  样品测定
   
  分别精密吸取10 μL对照品溶液和供试品溶液,按上述色谱条件,注入色谱仪,测定,结果见表3。表3  样品测定结果(略)

  4  讨论

    在定性鉴别项下,曾选用氯仿-甲醇-水(65∶35∶10) 10 ℃以下的下层液作为展开剂,但其相对湿度应控制在50%左右,湿度过高容易使斑点变形移位,所以选用了本试验的正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂。在含量测定项下,供试品溶液制备中还比较了另外的提取方法:乙醚脱脂和超声提取,结果比本文的含量稍低,所以选择了本试验的提取方法。参考文献[2],采用乙腈-0.05%磷酸溶液(23∶77),人参皂苷Rg1与三七皂苷R1分离好,但人参皂苷Rg1与其右侧干扰峰分不开,调整乙腈-0.05%磷酸溶液比例为(18∶82)时,人参皂苷Rg1峰形好,跟干扰峰能达到很好的分离效果。

【参考文献】
    [1] 饶高雄,王兴文.三七皂甙的检测与分析方法[J].云南中医学院学报, 2001,24(3):4.
  [2] 冯毅凡,孟 青,梁汉明.田七痛经胶囊质量标准研究[J].中成药, 2005,27(10):1146.

日期:2010年10月7日 - 来自[色谱分析实例]栏目
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血塞通滴丸中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1含量的高效液相色谱测定

  血塞通滴丸为血塞通的新剂型,其主要成分为人参皂苷Rg1,三七皂苷R1。本实验采用高效液相色谱法测定血塞通滴丸中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量。

  1  仪器与试药

  SSI公司PC-3000高效液相色谱仪,热电300紫外分光光度计,人参皂苷Rg1,三七皂苷R1对照品(中国药品生物制品检定所),血塞通滴丸(批号:20080409,20080401,20080402)本所自制。甲醇为色谱纯,水为纯化水。

  2 方法与结果

  2.1 检测波长确定称取人参皂苷Rg1,三七皂苷R1对照品适量,用甲醇配制成20μg·ml-1的溶液,在200~300 nm波长处扫描,结果人参皂苷Rg1,三七皂苷R1均在203 nm波长处有最大吸收。

  2.2 色谱条件色谱柱为岛津KromasilC18(4.6 mm×25 cm);流动相为甲醇-水(58∶42);流速为1.0ml·min-1,检测波长为203 nm;理论板数按人参皂苷Rg1,三七皂苷R1峰计算不低于10 000,分离度大于2.0。

  2.3 含量测定

  2.3.1 标准曲线的绘制

  人参皂苷Rg1:精密称定人参皂苷Rg1对照品约60mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取1.0,3.0,5.0,7.0,9.0,10.0 ml分别置10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。按上述色谱条件分别取10 μl注入色谱仪,测定。结果表明人参皂苷Rg1在浓度0.116~1.160 mg·ml-1范围内与峰面积呈良好线性关系,其回归方程Y=-99 466+3 257 868X,r=0.999 2。

  三七皂苷R1:精密称定三七皂苷R1对照品约60mg,置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0 ml分别置10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。按上述色谱条件分别取10 μl注入色谱仪,测定。结果表明三七皂苷R1在浓度0.232~0.812 mg·ml-1范围内与峰面积呈良好线性关系,其回归方程Y=11 772+2 495 523X ,r=0.998 7。

  2.3.2 重复性与稳定性试验取标准曲线测定中心浓度点连续进样6次,量取峰面积计算RSD分别为人参皂苷Rg1 1.11%,三七皂苷R11.09%,重现性良好,可准确用于含量测定。该溶液放置6 h后重复进样,峰面积基本不变,RSD分别为1.05%和0.99%。

  2.3.3  精密度测定取样品6份,精密称定,按样品含量测定方法测定RSD为2.5%。

  2.3.4  加样回收率测定取血塞通滴丸10粒,精密称定,置25 ml量瓶中,加甲醇适量,超声10 min使溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀。精密量取5.0 ml置10 ml量瓶中,精密加入人参皂苷Rg1,三七皂苷R1对照品适量,加甲醇至刻度,摇匀。按上述色谱条件分别取10μl注入色谱仪,测定。测定结果见表1。表1  加样回收率测定结果(略)

  2.3.5 样品测定取血塞通滴丸10粒,精密称定,置25 ml量瓶中,加甲醇适量,超声10 min使溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀。按上述色谱条件分别取10μl注入色谱仪,测定。测定结果见表2。表2  血塞通滴丸测定结果(略)

  2.3.6 血塞通原料测定精密称取血塞通原料约100 mg,置25 ml量瓶中,加甲醇适量,超声10 min使溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀。按上述色谱条件分别取10μl注入色谱仪,测定。测定结果见表3。表3  血塞通原料测定结果(略)

  3 讨论

  血塞通滴丸的辅料为聚乙二醇6 000。经测试聚乙二醇6 000的甲醇溶液无紫外吸收峰,对样品的测定无干扰。本方法简便、准确,可作为控制血塞通滴丸中人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的含量测定方法。

 

日期:2009年9月19日 - 来自[色谱论文]栏目

高效液相色谱法同时测定益津降糖口服液中人参皂苷Rg1及Re总皂苷的含量

  【摘要】目的测定了益津降糖口服液中人参皂苷Rg1及Re的含量。方法用高效液相色谱法,以ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)为固定相,乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400)为流动相,检测波长为203 nm,流速为1.0 ml·min-1。结果人参皂苷Rg1在0.16~6.4 μg范围内,人参皂苷Re在1.225~4.9 μg范围内呈现良好线性关系,相关系数Rg1:r = 0.999 9;r=0.999 6。平均加样回收率Rg1=96.63%;Re=95.20%,Rg1的RSD为1.34%(n=6);Re的RSD为1.14%(n = 6)。结论 方法简便、准确、重复性好。

  【关键词】  益津降糖 人参皂苷Rg1 人参皂苷Re 高效液相色谱法 含量测定

  益津降糖口服液是吉林敖东药业集团延吉股份有限公司生产,处方由人参、白术、茯苓、仙人掌、甘草与几种辅料组成。具有健脾益气,生津止渴。用于气阴两虚引起的消渴病等症。方中人参含有多种皂苷类,生物碱类化合物,其中人参皂苷为该制剂的主要活性成分,参照2005年版《中国药典》(Ⅰ部)“人参叶”项下条件[1]及相关文献[2]。采用高效液相色谱法,以乙腈、磷酸为流动相,测定其含量,该法简便、准确、精密度高、重现性好,为控制质量标准提供了可靠的依据。

  1  器材

  1.1  仪器

  日本岛津LC10Avp系列高效液相色谱仪,包括DAD检测器,Chem Station色谱工作站(美国Agilent公司);AE163型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler公司)。

  1.2 试药

  益津降糖口服液由吉林敖东药业集团延吉股份有限公司提供(批号060601,060602,060603,061201,061202,061203,070501,070502,070503,070504),对照品,人参皂苷Re(0754200216),人参皂苷Rg1(0703-200322)均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇,乙腈为色谱纯,水为纯净水,其它试剂均为分析纯。

  2  方法与结果

  2.1  色谱条件

  色谱柱:Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈0.05%磷酸溶液(99∶400);检测波长203 nm;柱温40℃;流速1.0 ml/min;灵敏度0.08AUFS。

  检测波长的选择:用UV2401PC型紫外分光光度仪,对人参皂苷Re对照品,在 200~400 nm波长下进行紫外扫描,结果在 20 3nm波长处有最大吸收,因此选择 203 nm为检测波长。理论塔板数按人参皂苷Rg1,人参皂苷Re峰计算均不低于2 000。

  2.2 对照品溶液的制备

  精密称取经110℃干燥至恒重人参皂苷Rg1及Re对照品各10.1 mg,加甲醇溶解,并稀释至刻度,制成每毫升中各含0.3 mg的人参皂苷Rg1及Re混合溶液,即得。

  2.3 供试品溶液的制备

  精密量取供试品5 ml,加水15 ml摇匀,加氯仿萃取2次,20 ml/次,弃去氯仿层,水层用水饱和正丁醇萃取4次,20 ml/次,合并正丁醇液,正丁醇层用氨试液洗涤2次,20 ml/次,洗涤液层再用水饱和正丁醇20 ml振摇提取1次,合并前后两次正丁醇液,蒸干,残渣用甲醇溶解并移至 5 ml 量瓶中 ,加甲醇至刻度,摇匀,用 0.45μm 微孔滤膜过滤,即得。

  2.4 阴性供试品溶液的制备

  按处方比例制备不含人参皂苷的阴性样品,按“2.3”项下方法制备成阴性供试品溶液。

  2.5 系统适应性实验

  分别精密吸取“2.2”,“2.3”,“2.4”项下溶液各10 μl,按“2.1”项下色谱条件进样。结果,阴性供试品溶液摘在与人参皂苷Rg1及人参皂苷Re对照品相同保留时间处未见明显色谱峰,故认为辅料等对主药的测定无干扰。色谱见图1。

  2.6 线性范围的考察

  精密量取人参皂苷Rg1(0.320 mg/ml),人参皂苷Re(0.245 mg/ml)对照品混合溶液5,7.5,10,15,20 μl注入高效液相色谱仪中。测定其峰面积,人参Rg1峰面积分别为590523,888 502,1 189 789,1 815 921,2 400 446。并以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归,得标准曲线方程,以峰面积值(A)对进样量(C)作图,得一直线,A = 121 258.093 1C- 17 431.871,r = 0.999 9。 人参Re峰面积分别为472 305,700 232,938 757,1 418 136,1 835 231。以峰面积值(A)对进样量(C)作图,得一直线,A = 91 613.410 34C- 19 379.181 03,r=0.999 6。以上结果表明,在0.16~6.4 μg范围内,人参Rg1峰面积值与进样量有良好的线性关系;在1.225~4.9 μg范围内,人参Re峰面积值与进样量有良好的线性关系。

  2.7 精密度实验

  精密量取样品(批号060601)供试液10 μl,重复进样5次,测定其峰面积,人参皂苷Rg1的峰面积分别为914 848,916 945,905 253,927 827,913 214。人参皂苷Re峰面积分别为528 608,521 613,519 375,520 186,513 891。结果人参皂苷Rg1,人参皂苷Re的RSD分别为0.89%,1.02%,表明仪器精密度较好。

  2.8 稳定性实验

  取样品(批号060601)供试液分别于0,2,4,6及8 h,分别进样10 μl,测得样品中人参皂苷Rg1峰面积值分别为914 840,927 827,91 2315,92 118,910 423,平均值为917 105。Re峰面积值分别为528 608,520 186,516 530,518 912,520 475,平均值为520 942。RSD分别为0.76%,0.88% 。实验结果表明,样品供试液在8 h内稳定性良好。

  2.9 重复性实验

  按拟定的含量测定方法,对同一批供试品(060601)分别制备样品供试液5份,按“2.3”项下方法制备。并按“2.1”项下色谱条件进样10μl,测得峰面积值人参皂苷Rg1分别为910 852,909 816,919 572,920 545,912 256,平均值为914 608。人参皂苷Re峰面积值分别为509 402,513 273,509 341,517 554,509 373,平均值为511 789。人参皂苷Rg1的RSD =0.55%;人参皂苷Re的RSD=0.71%;人参总皂苷含量的RSD=0.69%,表明本方法重复性良好。

  2.10 回收率实验

  精密量取6份已知含量的供试品(批号060601)2.5 ml,分别加入人参皂苷Rg1(0.65 mg/ml)、人参皂苷Re(0.35 mg/ml)对照品溶液各取0.8 ml,1.0 ml,1.2 ml按上述样品制备方法和色谱条件,制备加样回收供试品溶液并注入高效液相色谱仪,以下列公式计算回收率。结果见表1。结果表明,回收率在95%~100% 之间,加样回收良好。表1  回收率实验结果(略)

  2.11  空白实验

  按处方比例及工艺自制不含人参的空白供试品,按供试品溶液的制备方法制备,测定,记录色谱图,在对照品人参皂苷Rg1,人参皂苷Re的保留时间处未出现色谱峰,因此不干扰测定。

  2.12  样品含量测定

  依上述方法测定3批益津降糖口服液中人参皂苷Rg1及Re的含量。结果见表2。表2  样品含量测定结果(略)

  3 讨 论

  本法在样品提取方法中曾试用过正丁醇合并液洗涤、氨试液洗涤、1%氢氧化钠试液洗涤、以及通过D101树脂等几种方法,实验结果表明用氨试液洗涤的样品含量最高,峰形尖锐。样品回收率高。

  提取次数考察:按照“2.3”项下的测定方法,分别用水饱和正丁醇提取1,2,3,4,5,6次,依次测定。测定结果分别为0.210,0.311,0.325,0.338,0.339,0.337 mg/ml,结果表明提取4次以后,人参皂苷Rg1及Re总皂苷基本提尽。

  本法在除脂溶性杂质萃取过程中曾试用过三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷等三种溶剂萃取,实验结果表明,用乙醚、二氯甲烷萃取时易产生乳化层,三氯甲烷萃取分层效果好,阴性无干扰。

  流动相的选择:本文分别用乙腈-0.05mol/ml磷酸二氢钾(15∶29),乙腈-水-甲酸(25∶75∶1),甲醇-0.1%甲酸水溶液(30∶70),乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400),这4种流动相进行试验,结果表明流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液(99∶400)时,效果最佳,柱压低,峰型尖锐,阴性无干扰。综上所述,本法操作简单、快速、准确可靠,可用于益津降糖口服液的质量控制[3]。

  【参考文献】

  [1]国家药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,2005:8.

  [2]伍毅. 高效液相色谱测定复方田七滴丸中人参皂苷Re1含量[J].中国药房,2005,16(22):1737.

  [3]罗云,金城,李果,等.高效液相色谱法同时测定姜参胶囊中人参皂苷Rg1及Re的含量[J].中国药房,2007,6(18):451.

 

日期:2009年9月19日 - 来自[色谱论文]栏目
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高效液相色谱法测定蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量

  【摘要】目的用高效液相色谱法(HPLC)法测定蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1的含量。方法色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶 ,流动相为乙腈 -水 ,梯度洗脱。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1分别在0.106~2.650 μg, 0.424~10.600 μg,0.423 2~ 10.587 μg之间呈良好的线性关系 ;制剂中 3种成分的平均回收率分别为 92.7%,93.4%和95.7%; RSD分别为2.10% (n=6),2.11% (n=6)和1.39% (n=6) 。结论该方法简便、准确、分离效果好,无干扰,可用于蛭龙血通胶囊的质量评价。

  【关键词】  三七 三七皂苷R1 人参皂苷Rg1 Rb1 高效液相色谱

  蛭龙血通胶囊是由三七、水蛭等5种药材组成的中药复方制剂,系中药6类新药,具有活血祛淤 、通脉活络、益气安神的功效,以三七为原料的各种制剂采用了多种测定方法,为严格控制产品质量,我们采用了HPLC作为检测手段,对蛭龙血通胶囊中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1及Rb1进行含量测定研究。

  1  仪器与材料

  1.1  仪器

  日本岛津液相色谱仪,包括LC-2010A紫外检测器、四元泵、自动进样器。

  1.2 试刘与对照品

  乙腈为色谱纯迪马公司生产;水为娃哈哈超纯水;甲醇为分析纯;三七皂苷R1、人参皂苷Rg1与人参皂苷Rb1对照品,均来源于中国药品生物制品检定所,供含量测定用;样品为药业公司提供。

  2  方法与结果

  2.1  色谱条件

  色谱柱为Agilen  SB-C18,(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为乙腈―水按表1进行梯度洗脱;检测波长为203 nm;流速1.0ml·min-1;进样量10 μl。表1  流动相(略)

  2.2  对照品溶液的制备

  精密称取三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品适量,加甲醇制成每毫升含三七皂苷R1 0.1 mg,人参皂苷Rg10.4 mg和人参皂苷Rb10.4 mg的混合溶液,即得。

  2.3  供试品溶液制备

  取装量差异项下的本品,研细,精密称定2.5g,精密加甲醇50 ml,称定重量,放置过夜,置80℃水浴中保持微沸2 h,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加甲醇溶解并转移置10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。

  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,得到蛭龙血通胶囊的色谱分离图,见图1、图2。

  2.4  专属性按供试品溶液的制备方法

  制成缺三七的阴性样品。取样品,对照品及阴性样品按含量测定方法试验,结果在与对照品相同保留时间未见色谱峰。阴性样品见图1~3。

  2.5 精密度

  取同一对照品溶液,各10 μl,连续进样6次,分析,计算,结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积的RSD分别为2.09%,0.35%和0.31%,表明本法的精密度良好。

  2.6 线性关系的考察

  分别精密吸取对照品溶液1,5,10,15,20,25μl,注入液相色谱仪,以峰面积积分值为纵坐标,以进样量为横坐标,绘制标准曲线,分别得回归方程:三七皂苷R1为Y=271 621X+7 898.1,相关系数r=0.998 0;人参皂苷Rg1 为Y=392 803X+9 280.1,    相关系数r=0.999 5;人参皂苷Rb1为Y=276 761X+21 789,相关系数r=0.999 7。结果表明线性关系良好,其线性范围分别为三七皂苷R1为0.106~2.650 μg;人参皂苷Rg1为0.424~10.600  μg;人参皂苷Rb1为0.423 2~10.587 μg。

  2.7  重复性实验

  取同一批供试品(批号为060902)6份,按“2.3”项供试品溶液制备项下的方法操作,测定,计算。结果含量平均值为3.19 mg/粒,RSD为2.43%。表明本法的重复性良好。

  2.8  回收率实验

  分别精密吸取浓度为1.65 mg/ml的三七皂苷R1 对照品溶液1 ml、浓度为1.63 mg/ ml的人参皂苷Rg1对照品溶液4 ml和浓度为1.81 mg/ ml的人参皂苷Rb1对照品溶液4 ml,加入同一具塞容量瓶中,共取6份,分别蒸干,分别取批号为( 060902)的供试品6份,各1.2 g,置上述6个容器中,精密称定,按“2.2”项供试品溶液的制备,制成6份供试液,按上述色谱条件进行测定(见表2)。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的平均回收率分别为92.7% (n=6)、93.4% (n=6)和95.7% (n=6); RSD分别为2.10% (n=6)、2.11% (n=6)和1.39% (n=6), 结果表明本法的回收率良好。表2  回收率实验的测定结果(略)

  2.9 样品测定结果

  按上述含量测定方法对10批样品进行测定,结果见表3。表3  样品测定结果(略)

  3 讨论

  三七中主要成分为皂苷类成分,其中三七皂苷R1,人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为其有效成分之一。实验中曾参考有关文献[1] 进行提取、分离,但由于本品为复方制剂,成分复杂,且待测成分在使用紫外低波长检测时,受到结构相似的皂苷类干扰而难以得到有效分离,因此经多次实验,采用梯度洗脱的色谱分离,得到了良好的效果。

  【参考文献】

  [1]国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)[S].北京:化学工业出版社,2005:10.

 

日期:2009年9月17日 - 来自[色谱论文]栏目

人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆的影响

【摘要】    目的 观察人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆的影响。方法 应用喹啉酸损毁老年大鼠双侧Meynert基底核,制备AD模型,通过被动回避跳台实验和水迷宫空间分辨能力测试,研究人参皂苷Rg1对AD大鼠学习记忆能力的影响。结果 高、低剂量人参皂苷Rg1使AD大鼠在跳台中出现的错误反应次数(13 d)和学会迷宫所需的训练次数(16 d)显著减少,其作用与1,2,3,4四氢吖啶(THA)无明显差异,另外高剂量人参皂苷Rg1作用的大鼠学会迷宫所需的训练次数比THA显著减少。结论 人参皂苷Rg1有明显改善AD学习记忆障碍的作用。

【关键词】  人参皂苷Rg1 阿尔茨海默病 基底神经节 喹啉酸

  Effect of ginsenoside Rg1 on Alzheimer's disease  of model rats

  LI Na  WANG Limin

  Functional Laboratory, Binzhou Medical University,Binzhou 256603;Department of Anatomy , Binzhou Medical University

  【Abstract】  Objective  To observe the effect of ginsenoside Rg1 on rat  of Alzheimer's disease (AD) model.Methods  Bilateral NBM of elderly rats were damaged by quinolinic acid,and the AD  model was established.The single passive aviodance stepdown training and watermaze spatial localization test were used to study the effects of Ginsenoside Rg1 on learning and memory of  AD rats. Results  Treated with low and high dosages of ginsenoside Rg1,AD rat models decreased significantly in the number of errors in stepdown (13 days) and the times training to reach the criterion in water maze task (16 days) .Except for the fact that the times of training to reach the criterion with high dosage of ginsenoside Rg1 were those than that with 1,2,3,4 tetrahydroacridine, there was no obvious diffence in the effects of low, high dosage of GMC and THA.Conclusion  Ginsenoside Rg1 can improve the abilily of learning and memory of AD model rat.

  【Key words】  ginsenoside Rg1,Alzheimer's disease,basal ganglia,nucleus basalis,quinolinic acid

  阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)又称原发性老年痴呆(senile dementia),是发生在早老及老年期、不可逆转的、渐进性的、精神行为异常的老年人神经退行性疾病,其发病率随年龄的增加而增高[1];其在世界范围内已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位致死性疾病,预防和治疗AD已成为世界各国关注的热点问题。人参作为传统中药,含有多种有效成分,具有抗衰老和改善学习记忆功能的作用。药理学研究表明,人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)具有抗衰老、增强记忆力等作用,能改善脑缺血、乙醇、淀粉样多肽和东莨菪碱等引起的学习记忆损伤[2~4]。本实验采用喹啉酸(quinolinic acid)损毁老年大鼠Meynert基底核(nucleus basalis of Meynert,NBM)制备AD动物模型[5],旨在此基础上观察人参皂苷Rg1对AD学习记忆障碍的改善作用。

  1  材料与方法

  1.1  动物与材料  健康Wistar大鼠,平均体重450 g,月龄20~22个月,人参皂苷Rg1购自中国药品生物制品检定所;喹啉酸为Sigma产品;1、2、3、4四氢吖啶(1,2,3,4 tetrahydroacridine,THA)为RBI公司产品;其他试剂为国产分析纯级产品;所用蒸馏水为重馏水。
   
  大鼠跳台系中国医学科学院药物研究所研制,迷宫设计参照宿宝贵[6]的方法;实验动物脑立体定位仪(SN23型),为日本成茂公司产品。

  1.2  方法  50只大鼠随机分为假损伤、模型、模型+低剂量人参皂苷Rg1(灌胃剂量20 mg/kg)、模型+高剂量人参皂苷Rg1(灌胃剂量40 mg/kg)、模型+THA(10 mg/kg)五组,n=10。于损伤术前2 d开始给药。灌胃体积为20 ml/kg,假损伤、模型组等体积蒸馏水,每天上午给药1次,连续16 d。
   
  手术日腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,固定在脑立体定位仪上,常规消毒后,颅顶正中切口,按AP 1.4 mm,ML 2.4 mm,DV 7.5 mm定位双侧NBM。模型组和给药组大鼠双侧NBM各注入用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解的喹啉酸2 μl(150 nmol),假损伤组注入等容量溶剂,每侧注入时间为5 min,注完后留针5 min,缝合皮肤,常规饲养,分别于术后10、11 d灌胃后1 h行跳台实验,12、13、14 d灌胃后1 h行水迷宫测试,所有测试均在早七点至下午三点之间进行,实验后用苏木精伊红染色观察NBM定位是否准确,定位有误的动物弃之不用。

  1.2.1  大鼠被动回避性跳台实验:装置为80 cm×16 cm×40 cm的茶色有机玻璃箱,箱底铺有铜栅作为刺激电极,内设高4.5 cm,直径6.5 cm的橡皮垫作为大鼠回避电击的安全平台。先放入大鼠适应5 min,随后通以36 V交流电,大鼠遭到电击后跳上安全平台,如从台上跳下,双足接触铜栅为错误反应,记录3 min内出现的错误反应数,24 h后重测验1次,以大鼠学习和次日重测验(记忆)过程中出现的错误反应次数来评价学习记忆能力。

  1.2.2  水迷宫空间分辨能力测试实验:水迷宫试验装置设计,长宽各100 cm,高35 cm,泳路宽12 cm,泳路长220 cm,水深25 cm,水温(23±1)℃。让大鼠在水中自由游泳2 min,让其熟悉环境。第2天开始测定,每只大鼠每天上、下午各连续进行4次测定,中间休息2 min,连测5 d。以大鼠自水迷宫起点游至终点所需时间和途中进入盲端的错误次数作为衡量学习获得及记忆巩固能力的指标。每次训练结束后清洗泳路侧壁以消除嗅觉提示。

  1.3  统计学处理  实验数据以x±s表示,用INSTAT软件进行单因素方差分析,比较组间差异用q检验。

  2  结果

  2.1  人参皂苷Rg1对被动回避反应能力的影响  在跳台实验学习和重测验中,模型组出现的错误反应次数比假损伤组明显增多(P<0.001),表明喹啉酸注入NBM明显破坏大鼠的被动回避反应能力;与模型组相比,模型+低剂量组、模型+高剂量组出现的错误反应次数明显减少(P<0.001或P<0.01),且与模型+THA组无差异(见表1)。

  表1  大鼠在跳台上的错误次数(略)

  注:a与假损伤组比较,P<0.001;b与模型组比较,P<0.001

  2.2  人参皂苷Rg1对空间分辨能力的影响  在水迷宫实验中,模型组游完迷宫所需的时间明显增多,与假损伤组比较,P<0.01,表明喹啉酸注入NBM可明显破坏大鼠的空间分辨能力;与模型组相比,模型+低剂量人参皂苷Rg1组、模型+高剂量人参皂苷Rg1组和模型+THA组游完迷宫所需的时间显著减少(均P<0.01),而后面三组之间无差异(见表2)。

  表2  大鼠游完水迷宫全程所需时间和错误次数(略)

  注:a与假损伤组比较P<0.01;b与模型组比较P<0.01

  3  讨论
   
  学习和记忆是人脑神经系统的高级思维活动,与多种神经递质有关。阿尔茨海默病(AD)是一种进行性记忆和认知功能损伤为特征的退行性神经系统疾病,它的确切病因尚不明确,被认为是一种多病因机制介导的疾病。如中枢胆碱能神经系统缺损、氧化应激、炎症反应、雌激素缺失、胆固醇代谢异常、基因突变等多个环节参与其发病[1]。研究表明,大脑胆碱能神经功能与学习记忆关系密切[7],大脑胆碱能神经功能的增强与降低,和学习记忆能力的改变相平行,因而形成了学习记忆的中枢胆碱能学说。多年来,提高中枢胆碱能神经功能一直是寻找AD有效治疗药物的重要指标[8],FDA批准第一个用于治疗AD的药物THA,即是通过增强中枢胆碱能神经功能实现的。
   
  喹啉酸具有兴奋毒作用[8],能引起神经元损伤,本实验用喹啉酸注入老年大鼠双侧NBM,使大鼠在跳台实验和水迷宫测试中表现出学习记忆能力的显著下降,表明AD模型制备较成功。其原理为NBM是胆碱能神经元,由它发出的胆碱能神经纤维是大脑胆碱能神经的主要来源,NBM胆碱能神经原损伤,可引起大脑胆碱能神经功能的明显降低。从而诱发大鼠表现出学习记忆能力的显著下降。
   
  人参皂苷Rg1是从人参中提取出来的有效成分,有研究[4]表明人参皂苷Rg1可以促进小鼠脑神经发育,增加突触数目;增加脑内M2胆碱受体密度,促进脑内蛋白质合成,促进大鼠脑中cfos基因表达,提高cAMP水平;提高小鼠大脑内乙酰胆碱水平,抑制AChE活性;对培养的大鼠脑皮质神经细胞凋亡有抑制作用。人参皂苷Rg1通过抑制大脑皮质中AChE活性来提高乙酰胆碱浓度而发挥对学习和记忆的改善作用。因此,调节胆碱能神经系统功能是人参皂苷Rg1抗AD的重要物质基础及作用机制之一。本实验中,人参皂苷Rg1能显著提高AD模型大鼠被动回避反应能力和空间分辨能力,明显改善AD学习记忆障碍,其作用与THA相似或较强,表明人参皂苷Rg1可能是治疗AD的有效药物。其作用可能与药物明显增强中枢胆碱能神经功能,从而明显增强学习记忆能力有关。此外,有研究表明人参皂苷Rg1对神经系统的保护作用还与NMDA受体及iNOS有关[9,10],详细机制需进一步研究。

【参考文献】
    [1]梁妍琦,黄霄天,唐希灿. 阿尔采末病发病机制及治疗药物研究进展[J]. 中国新药与临床杂志,2006, 25(9):641648.

  [2]晓英,陈霁,张均田.人参皂苷Rg1对B2淀粉样肽(2535)侧脑室注射所致小鼠学习记忆障碍的改善作用及其机制[J].药学学报,2001,36(1):14.

  [3]申丽红,张均田.人参皂苷Rg1对脑缺血沙土鼠神经干细胞存活率和学习记忆能力的影响[J].中南药学,2004,2(1):69.

  [4]陈新梅,朱家壁.人参皂苷Rg1脂质体对东莨菪碱诱导大鼠学习记忆障碍的改善及其作用机制[J].中国临床药理学与治疗学,2005,10(8):898902.

  [5]孔乐凯,赵晓民,谢湘林.参胆合剂对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆的影响[J].泰山医学院学报,2004,25(2):8991.

  [6]宿宝贵,许鹿希. 用水迷宫检测大鼠空间辨别性学习记忆的探讨[J].解剖学研究,1999,12(1):3032.

  [7]Hartig W,Bauer A,Brauer K,et al. Functional recovery of cholinergic basal forebrain neurons under disease conditions:old problems,new solutions[J]? Rev Neurosci,2002,13(2):95165.

  [8]赵晓民,谷红霞, 谢湘林,等.非遗传性阿尔茨海默病大鼠模型建立的实验研究[J].中国临床康复,2004,8(13):24542455.

  [9]Shen L,Zhang J. NMDA receptor and iNOS are involved in the effects of ginsenoside Rg1 on hippocampal neurogenesis in ischemic gerbils[J].Neurol Res,2007 ,29(3):270273.

  [10]Leung KW,Yung KK,Mak NK,et.al. Neuroprotective effects of ginsenoside-Rg1 in primary nigral neurons against rotenone toxicity[J].Neuropharmacology,2007,52(3):827835.


作者单位:滨州医学院机能学实验室 滨州市 256603;滨州医学院解剖学教研室

日期:2008年5月29日 - 来自[2007年第30卷第5期]栏目
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反相高效液相色谱法测定人参及其制剂中人参皂苷Rg1含量

目的:建立用反相高效液相色谱法测定人参及其注射剂中人参皂苷Rg1含量。方法:用复合柱吸附层析法除去注射剂中干扰物质。采用LUNA C18色谱柱,乙腈-水-0.1%磷酸溶液(20∶40∶40)为流动相,流速1.2 mL.min-1, 203 nm为检测波长,柱温35 ℃,对人参及其注射剂进行含量测定。结果:人参皂苷Rg1的峰面积与其浓度线性关系良好(r=0.999 2);样品平均回收率为98.8%;精密度RSD为0.65%(n=5)。结论:该法简便、快速、专属性强,能满足制剂的质量控制要求。
关键词 人参皂苷Rg1 参附冻干粉针 反相高效液相色谱法

人参皂苷是珍贵传统中药人参的主要活性成分,常被用来作为人参制剂中定量指标。对不同的人参皂苷组分的分析,方法也各不相同,如薄层扫描法[1]、比色法[2]、分光光度法[3]。近年来高效液相色谱法以其分离效果好、准确、快速、样品制备简单等优势而广泛用于人参制品的质量标准研究[4,5]。复方参附冻干粉针由人参、附子组成,为阳厥脱急症用药。本文采用反相高效液相色谱法测定复方参附冻干粉针中人参皂苷Rg1的含量,得到较满意的结果。
1 仪器与试药
  高效液相色谱仪:GILSON 307和306 PUMP,Unipoint工作站;HP1100型检测器;7725I进样阀;Eppendorf柱恒温箱。
  人参皂苷Rg1对照品由中国药品生物制品检定所提供。人参药材为市售,经本院生药室鉴定为药典收载品种;参附冻干粉针和人参阴性对照品由本院药化室研制。
  DA201大孔树脂为天津农药厂产品;732H阳离子交换树脂为河北保定化学试剂厂产品;中性氧化铝为上海市五四农场化学试剂厂产品。
  甲醇、乙醇、乙腈、磷酸均为市售分析纯。
2 色谱条件
  LUNA C18分析柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),美国Phenomenex产品。流动相:乙腈-水-0.1%磷酸溶液(20∶40∶40),流速1.2 mL.min-1。紫外检测器203 nm波长处检测,柱温35 ℃。

3 复合树脂-氧化铝柱制备
  树脂处理:732H阳离子树脂,用10%氯化钠溶液浸泡18 h后,用水洗20 min。然后按顺序分别用2倍于树脂量的5%盐酸、2%氢氧化钠溶液、5%盐酸、水清洗后备用;DA201树脂,用水洗后,再用5%氢氧化钠溶液清洗,最后用水洗至近无色即可。
  使用0.7 cm×7 cm玻璃柱,取已处理好的DA201大孔树脂湿重4 g放入柱底,上盖脱脂棉少许,加中性氧化铝0.4 g再盖脱脂棉,加入已处理的732H型阳离子交换树脂湿重1.0 g,盖上脱脂棉,用水平衡待用。
4 线性关系考察
  精密称取人参皂苷Rg1对照品,用乙腈-水-0.1%磷酸溶液(20∶40∶40)配成1 g.L-1的对照品溶液。
  准确吸取1 g.L-1对照品溶液2.0,6.0,10.0,14.0,16.0 μL,依次进样,按上述色谱条件测定峰面积,以平均峰面积的积分值(n=2)为纵坐标,对照品进样量(μg)为横坐标,进行线性回归,得回归方程(n=5)为:
Y=-3.163×106+4.716×106X r=0.999 2
5 精密度试验
  取1 g.L-1对照品溶液,重复进样5次,每次10 μL,求得峰面积的RSD为0.65%。
6 加样回收试验
  精密称取人参皂苷Rg1对照品用水溶解配成2 g.L-1和4 g.L-1的对照品溶液。取20支参附冻干粉针分为2组,每组10支,一组中每支分别加2 g.L-1对照品溶液1 mL溶解,再加水1 mL洗出合并,精密量取5 mL按“7.2”方法处理后,取10 μL进样测定,计算平均回收率为98.6%, RSD为1.5% (n=3)。另一组中每支分别加4 g.L-1对照品溶液1 mL溶解,再加水1 mL洗出合并,重复上述方法,进样量为10 μL,测得平均回收率为98.8%, RSD为1.7% (n=3)。
7 样品测定
7.1 人参药材 将人参药材粉碎,于80 ℃干燥至恒重,称取1.0 g置于索氏提取器中,加入甲醇100 mL提取5 h,浓缩回收甲醇至20 mL,挥干甲醇,用乙腈-水-0.1%磷酸溶液(20∶40∶40)溶解于50 mL量瓶中并稀释至刻度。精密吸取10 μL测定含量,结果人参中人参皂苷Rg1的含量为1.38 mg.g-1,RSD为1.9%(n=3)。
7.2 参附冻干粉针 取参附冻干粉针10支,每支用2 mL水溶解后洗出合并。精密量取5 mL加至上述复合树脂-氧化铝柱上,用水洗脱,弃去流出液。再用乙醇洗脱,流出液置水浴上蒸发干燥后,用乙腈-水-0.1%磷酸溶液(20∶40∶40)溶解,移入10 mL量瓶中,稀释至刻度。精密吸取10 μL进样,结果2批样品中人参皂苷Rg1含量分别为0.181 g.L-1和0.179 g.L-1,RSD分别为1.8%和2.6%(n=3)。色谱图见图1-B。
7.3 缺人参对照品 取缺人参对照品10支,按“7.2”方法处理后,吸取10 μL进样。结果见图1-C。在人参皂苷Rg1的保留时间处未见明显干扰峰出现。
8 讨论
  采用高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1的含量,所得的色谱峰型比较宽,对精确积分有一定影响。因此选择适当的柱温及合适的流动相非常重要。
  实验中使用甲醇或乙醇溶解样品常常干扰结果,稳定性也比较差。改用流动相直接溶解样品后,得到了较好的实验结果。

于超(重庆市中药研究院 重庆 400065)
刁长发(重庆市中药研究院 重庆 400065)
夏文娟(重庆市中药研究院 重庆 400065)
周碧珍(重庆市中药研究院 重庆 400065)

参考文献

日期:2007年5月25日 - 来自[色谱分析实例]栏目

HSCCC法从人参总皂苷中分离制备人参皂苷Re与Rg1

                                        

 

 

                                                        HSCCC法从人参总皂苷中分离制备人参皂苷Re与Rg1

日期:2007年5月18日 - 来自[色谱论文]栏目
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RP-HPLC法测定清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1及Rb1含量

摘要:目的:建立清脑宣窍方有效部位中人参皂苷Rg1、Rb1、HPLC含量测定方法。方法:采用YWG-Cl8色谱柱(250 mm×4.6mm,10μm),检测波长:203nm。人参皂苷Rg1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(21:79),流速:1.2mL/min,人参皂苷Rb1的流动相为乙腈-0.05%磷酸水(31:69),流速:0.9mL/min。结果:该法人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD=1.16%(n=5)。人参皂苷Rb1的平均回收率为99.32%,BSD=2.52%(n=5)。结论:本法操作简便、准确,可作为清脑宣窍方有效部位的质量控制方法之一。
关键词:清脑宣窍方;人参皂苷Rg1;人参皂苷Rb1;RP-HPLC;含量测定
清脑宣窍方为现代名中医经验方,由栀子、三七等中药组成,经临床实践证明对于缺血性脑中风具有良好的疗效。我们运用复方有效部位研究思路与方法,对清脑宣窍方治疗脑中风的有效部位进行了分离富集,且根据复方有效部位及其主要化学成分的研究分析,确定以复方有效部位中总皂苷、总环烯醚萜苷以及主要成分人参皂苷Rg1、人参皂苷Rbl、栀子苷的含量,来有效控制清脑宣窍方有效部位的内在质量。我们建立了人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的反相高效液相色谱测定方法,并运用于测定该方有效部位样品及其药材中的人参皂苷Rg1及人参皂苷Rbl的含量,为该方有效部位质量标准的建立和控制提供依据。
1 仪器与材料
Waters高效液相色谱系统(Waters 600 HPLC Pump,Waters 2487紫外检测器,Minnium32色谱工作站);MZITIFTR-AE240型电子分析天平,CX-250型超声波清洗器(北京医疗设备二厂)。索氏提取器。
对照品人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1,购自中国药品生物制品检定所(批号分别为:0703-200120,704-200115)。
栀子、三七药材均购自安国药材市场,经北京中医药大学中药学院生药系刘春生副教授鉴定为三七Pananx notoginseng (Burk).F.H.Chen、栀子GaMe-niajasminoides Ellis.。乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为重蒸水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 人参皂苷Rg1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(21:79);流速:1.2mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rg1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.1.2 人参皂苷Rb1的色谱条件
YWC-Cl8(250mmx4.6mm,10μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸水(31:69);流速:0.9mL/min;检测波长:203nm;柱温:室温。在上述条件下,样品中人参皂苷Rb1色谱峰与其他成分分离良好,且阴性样品无干扰。
2.2 对照品溶液的制备
精密称定人参皂苷Rgl对照品6.20mg置于50mL量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度(浓度为0.124g/L),摇匀,作为人参皂苷Rg1对照品溶液。
精密称定人参皂苷Rb1对照品4.63mg置于25mL量瓶中,用30%乙溶液稀释至刻度(浓度为0.185g/L),摇匀,作为人参皂苷Rb1对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
2.3.1 有效部位样品溶液的制备
取有效部位约15mg,精密称定,置10mL量瓶中,加入30%乙醇,超声处理后,稀释至刻度,摇匀,精密量取2mL上反相C18层析柱(内径1cm,填料为1g),先用35%甲醇溶液洗脱25mL,弃去;再以甲醇洗脱50mL,蒸干,甲醇超声溶解并定容至2mL容量瓶中,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为供试品溶液。
2.3.2 药材供试品溶液的制备
分别称取3种不同产地三七药材各3份,每份约0.5 g,置索氏提取器中,加乙醚适量加热回流提取1h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,置索氏提取器中加甲醇适量,加热提取至甲醇无色,取甲醇提取液,挥干,残渣加甲醇溶解转移至25mL容量瓶中,定容。另取2mL转移至10mL容量瓶中,定容、摇匀,用0.45μm微孔滤膜滤过,作为三七药材供试品溶液。
2.4 阴性样品溶液的制备
按照处方比例称取除三七外其他药材适量,按照有效部位的工艺制得阴性样品,再按2.3.1项下方法制备阴性样品溶液。
2.5 线性关系的考察
分别精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液(浓度为0.124g/L)2.0,4.0,8.0,12.0,16.0μL及人参皂苷Rbl对照品溶液(浓度为0.185g/L)4.0,8.0,12.0,16.0,20.0μL,注入高效液相色谱仪,分别按上述色谱条件,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标,对照品进样量为横坐标,绘制标准曲线并进行线性回归,得人参皂苷Rgl回归方程为Y=301733X一3220.2,r=0.9999(n=5)。得人参皂苷Rbl回归方程为Y=244308X一8563.1,r=0.9998(n=5)。结果表明,人参皂苷Rgl在0.248~1.984μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系,人参皂苷Rbl在0.760~3.70μg范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度实验
精密吸取人参皂苷Rgl对照品溶液和人参皂苷Rbl对照品溶液各10μL,分别连续进样5次,测得人参皂苷Rg1峰面积的RSD为1.28%。人参皂苷Rbl峰面积的RSD为0.65%,表明方法的精密度良好。
2.7 稳定性实验
取有效部位样品约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。精密吸取有效部位样品溶液10μL,分别在制备后0、4、8、12、24 h进样,测定人参皂苷Rgl及人参皂苷Rbl色谱峰峰面积,计算峰面积RSD分别为0.91%及1.16%,表明样品溶液在1d内稳定。
2.8 重现性实验
精密称取同一批有效部位样品5份(约15mg),按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,进样,测得人参皂苷Rgl平均含量为5.88%,RSD为0.88%,人参皂苷Rbl平均含量为6.72%,RSD为1.76%,表明方法重现性良好。
2.9 回收率实验
称取已知含量的有效部位样品5份,每份约7.5mg,精密称定,置10mL量瓶中,分别定量加入0.124g/L人参皂苷Rg1对照品溶液3.2 mL及0.185g/L人参皂苷Rb1对照品溶液3mL,加入30%乙醇,以下按有效部位样品溶液的制备项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL,注入液相色谱仪,依法测定,计算人参皂苷Rg1平均回收率为100.71%,RSD为1.16%。人参皂苷Rb1平均回收率为99.52%,RSD为2.32%。
2.10 样品含量测定
2.10.1 有效部位样品含量测定
取3批有效部位样品各3份,每份约15mg,精密称定,按2.3.1项下方法制备样品溶液。分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rb1及人参皂苷对照品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,外标一点法测定含量。
2.10.2 三七药材样品含量测定
精密称取3批不同药材市场三七药材样品各3份,按三七药材样品项下制备,再分别精密吸取样品溶液10μL、人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1对照品溶液10μL,外标一点法测定含量。
3 讨论
在对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1进行含量测定时,栀子成分对人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1色谱峰有干扰,本论文建立了反相柱层析预处理方法,可以消除栀子成分的干扰,获得很好的分离。在使用YWG-C18色谱柱和紫外检测器的情况下,用梯度洗脱同时测定人参皂苷Rg1及人参皂苷Rb1时,基线向上漂移,导致较大误差,且分离时间较长,故使用两种色谱条件进行分别测定,可得到很好的结果。
参考文献
1 梁吉春,石任兵,刘斌,等.银翘散研究方法的新探讨.北京中医药大学学报,1999,22(1):37~38
2 陈萍,韦强.复方益血胶囊中人参皂苷Rg1定量分析方法研究.中国药科大学学报,20O3,34(1):35—37
日期:2007年5月18日 - 来自[色谱论文]栏目
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