【摘要】 目的 探讨应用TGF-β1基因转染和软骨细胞共培养后，促进大鼠BMSCs目的基因向软骨细胞的分化效果，为构建新型的软骨种子细胞提供思路。方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠、扩增、提取质粒pcDNA 3.1-TGF-β1，酶切、电泳鉴定并测序。实验分组：TGF-β1基因转染BMSCs组(A组)、单纯BMSCs与软骨细胞共培养组(B组)、TGF-β1转染BMSCs后复合软骨细胞共培养组(C组)、空白BMSCs对照组(D组)、软骨细胞对照组(E组)。结果 电泳显示TGF-β1目的基因条带，基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符。MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度值，C组与A、B、D、E组间差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量、TGF-β1表达均以C组最多，A组次之;Ⅱ型胶原表达以C组最多，A组次之。结论 通过TGF-β1转染同时复合软骨细胞共培养能有效促进BMSCs向软骨细胞分化，是一个较有前景的发展方向，对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。
【关键词】 BMSCs;共培养;软骨细胞;TGF-β1
Co-culture of BMSCs transfected by TGF-β1 and chondrocytes
ZHAN Xing-wang，LI Jian-xin，WEI Jian，et al.Department of Bone，the Affiliated Hospital of Medical College of Chinese People’s Armed Police Force，Tianjin 300162，China
[Abstract] Objective To investigate the secretion of target gene and differentiation of BMSCs transfected by TGF-β1 and co-culture and together into chondrocytes and to provide a new method for culturing seed cells in cartilage tissue engineering.Methods The plasmids pcDNA 3.1-TGF-β1 were amplified and extracted，then cut by enzymes，electrophoresed and analyzed its sequence.BMSCs of Wistar rats were separated and purificated by the density gradient centrifugation and adherent separation.The morphologic changes of primary and passaged cells were observed by inverted phase contrast microscope and cell surface markers were detected by immunofluorescence method.According to the transfect situation，the BMSCs were divided into 5 groups，the transfected group(Group A)，the co-culture group(Group B)，the group of TGF-β1 and co-culture(Group C)，the group of BMSCs(Group D)，the group of chondrocytes(Group E).After being transfected，the cells were selected，then the proliferation activity was tested by MTT and expression levels were tested by RT-PCR and Western blot.Results The Group C showed that it had a good prospect and important significance of clinic application in cartilage tissue engineering.TGF-β1 gene bands，gene sequencing were consistent with Gene-Bank cDNA sequences.The absorbance value with MTT determination of A，B，C，D，E group of cells in 490 nm wavelength in C group was statistically different with A，B，D，E groups(P<0.01).RT-PCR and Western blot detection were done for gene and protein expression，TGF-β1 expression in group C were most，A group followed by;Ⅱ collagen expression in C group was most，A group followed by.Conclusion By TGF-β1 transfecting cells and culturing chondrocytes at the same time is effective in promoting differentiation of BMSCs to chondrocytes.It has more great significance in clinical application of tissue-engineered cartilage.
[Key words] bone marrow stromal stem cells;co-culture;chondrocytes;TGF-β1
关节软骨损伤是临床常见病、多发病，但软骨组织的自我修复能力有限，现有的治疗方法存在许多不足。组织工程学技术为软骨损伤的治疗提供了广阔前景，常用BMSCs作为软骨组织工程种子细胞：(1)在适当的培养条件和某些外源性和内源性生物活性因子刺激下具有向软骨细胞分化的能力[1，2];(2)体外增殖能力强，表型稳定，来源方便;(3)自体移植可避免免疫排斥。许多研究表明TGF-β1具有诱导BMSCs向软骨细胞分化的能力[3~4]。国内外许多研究也表明BMSCs和软骨细胞共培养，能够发挥协同效应，诱导BMSCs向软骨细胞分化[5]。外源性应用生长因子效率低，持续时间短，因此我们的研究在脂质体介导下，将TGF-β1基因转染后复合软骨细胞共培养，使BMSCs向软骨细胞转化，以期获得更大的软骨诱导效应和促增殖效应，为治疗软骨损伤和退变的组织工程软骨提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物与主要试剂及仪器 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只，体重约150 g，由武警医学院动物实验中心提供。质粒pcDNA 3.1-TGF-β1由金斯瑞生物科技公司构建;L-DMEM培养(Gibco公司);FBS(Hyclone公司，美国);胰蛋白酶(Sigma公司);Trizol Reagent、LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美国);Percoll分离液(Pharmacia公司);TGF-β1、Ⅱ型胶原小鼠抗大鼠单克隆抗体、ALP标记羊抗小鼠二抗(Neomaker公司);质粒DNA小量、中量提取试剂盒(Promega公司)。倒置相差显微镜、荧光显微镜(Olympus公司);超低温离心机(Sigma公司);PowerPac2000电泳仪、Mini-Protein Ⅲ垂直板电泳装置(BIO-RAD公司);PCR仪(Biometra公司);凝胶成像系统(天能公司)。
1.2 质粒pcDNA3.1-TGF-β1扩增、提取与鉴定 取1 μg TGF-β1质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑单克隆、质粒DNA小量提取试剂盒小提质粒、酶切、电泳鉴定并测序。质粒DNA中量提取试剂盒大量提取质粒，于-20 ℃保存备用。
1.3 BMSCs的分离培养 将Wistar大鼠颈椎脱臼法处死，无菌操作下取其四肢的长骨，用注射器抽取长骨内骨髓，加含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打制成单细胞悬液，分装于2个25 cm培养瓶中，取少量细胞计数。在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下静止培养5天。第6天首次细胞换液，以后每2～3天换液1次。待第10～14天贴壁细胞长满瓶底部后用0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合溶液消化并传代培养细胞。
1.4 软骨细胞的分离与培养 将Wistar大鼠颈椎脱臼法处死，在无菌操作下从其四肢的关节中取软骨，将软骨切成1～3 mm大小置无菌试管，PBS冲洗3次，1 000 r/min离心3 min，吸去PBS，加0.25%胰酶4 ml，置5% CO2培养箱30 min，吸出胰酶后再加入0.2% Ⅱ型胶原酶5 ml，置恒温摇床箱内消化6～8 h。观察大部分软骨块被消化后，收集消化液，800 r/min离心5 min，用培养液洗2次。细胞计数后移入25 cm培养瓶中，使细胞密度为2×104/L，加DMEM培养液(含10%胎牛血清，100 u/ml青-链霉素)，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液1次。原代细胞贴壁并融合成单层后传代培养。
1.5 聚羟基乙酸(PGA)支架的处理 取非编织的线性PGA 5 mg，均匀放入预制的圆柱状(内径5 mm、高1 mm)模具中，加入100 μl乙醇，压制成直径5 mm，厚度1 mm的圆柱体(PGA直径13～15 μm，制作后所得支架孔隙率约90%)。充分晾干后放入培养皿中，75%乙醇浸泡1 h，紫外线照射30 min。PBS洗涤3次，每次10 min，吸干后备用。
1.6 实验分组 实验共分4组，转染组(A组)：加入TGF-β1基因转染后BMSC;与软骨细胞共培养组(B组)：取浓度为3×106/L的第二代BMSCs和软骨细胞，按2∶1比例混匀共培养作为种子细胞;TGF-β1基因转染复合软骨细胞共培养组(C组);空白对照组(D组)：加入单纯BMSCs;软骨细胞对照组(E组)。
1.7 检测指标
1.7.1 MTT法检测转染基因对BMSCs增殖活性的影响 各组细胞以每孔1×104/ml接种于96孔板中，各10孔，每孔加培养液200 μL，24 h后每孔加入MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。
1.7.2 RT-PCR检测TGF-β1和Ⅱ型胶原表达 根据GeneBank TGF-β1、Ⅱ型胶原cDNA序列，利用Primier 5.0引物设计软件设计引物，GAPDH根据文献[6]，委托上海英俊生物技术有限公司合成。TGF-β1：上游引物5′-GCCTTTCCTGCTTCTCA-3′，下游引物5′-GCCTTTCCTGCTTCTCA-3′，280 bp;Ⅱ型胶原：上游引物5′-TGGTGGAGCAGCAAGAG-3′，下游引物5′-ATGGGTGCGATGTCAATA-3′，398 bp;GAPDH：上游引物5′-TGGAAATCCCATCACCATCT-3′，下游引物5′-GTTCATGCCCATCACAAACA-3′，198 bp。RNA提取按Trizol说明书进行，抽提细胞总RNA。取1 μg RNA进行逆转录，得到第1股cDNA，产物用于扩增目的基因。TGF-β1的PCR条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;30个循环。Ⅱ型胶原的PCR 条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃ 10 min;35个循环。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。采用ScnImage软件测定条带的净灰度值(net index，NI)，并与内参照GAPDH灰度值进行比较，计算其比值。每组8个样本。
1.7.3 Western blot检测TGF-β1和Ⅱ型胶原蛋白表达 PBS漂洗各组BMSCs，加入冰预冷的裂解液后，收集细胞裂解物于EP管中。超声波粉碎细胞，4 ℃下，离心半径15 cm，12 000 r/min离心10 min;收集上清液，取5 μl测定蛋白浓度。以每泳道10 μl(3 μg/μl)加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行电泳;电泳完毕后转移至醋酸纤维素薄膜;室温下脱脂奶粉封闭3 h后加入TGF-β1、Ⅱ型胶原(1∶200)一抗单克隆抗体，4 ℃过夜，TBST洗膜3次;室温下二抗(1∶200)孵育2 h，TBST洗膜3次，ALP显色，SDS-8000成像系统拍照。β-actin为内参，采用ScnImage图像分析软件测定灰度值。每组8个样本。
1.7.4 细胞形态学观察及细胞材料的黏附情况 倒置相差显微镜下连续观察细胞在支架材料上的黏附及细胞外基质的分泌情况。
1.8 统计学分析 数据应用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 质粒鉴定 TGF-β1质粒基因测序与GeneBankcDNA序列相符。EcoRⅠ和XhoI双酶切pcDNA-3.1-IGF-1经琼脂糖电泳分析可切下约408 bp的IGF-1cDNA和5 426 bp pcDNA 3.1(+)序列;EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切pcDNA 3.1-TGF-β1经琼脂糖电泳分析可切下约1 176 bp的TGF-β1 cDNA和5 468 bppcDNA 3.1(+)序列。
2.2 BMSCs形态学观察 原代细胞接种24 h后，培养瓶底可见少量贴壁且伸出突起的细胞。4、5天后数量逐渐增多，细胞呈长梭形，紧密排列形成典型均匀分布的BMSCs簇状增生(图1a);第2代以后细胞的形态比较均一(图1b)。转染后在胞浆内有细小的褐色颗粒沉积，24 h后少量细胞死亡，死亡细胞变圆，漂浮于培养基中(图1c)。
2.3 MTT法检测转染基因对BMSCs增殖活性的影响 A、C组分别为：0.6057±0.043、0.9350±0.0260，见表1。
2.4 RT-PCR检测 C组TGF-β1和Ⅱ型胶原的mRNA表达明显高于A组(P<0.01)。TGF-β1 mRNA表达以C组最多，A组次之，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅱ型胶原mRNA表达，C组也明显高于A、B、D、E组(P<0.01)，见表1。表1 TGF-β1、IGF-1、Ⅱ型胶原mRNA及蛋白表达注：C组与A、B、C、E组比较，P<0.01
2.5 Western blot检测 C组TGF-β1和Ⅱ型胶原表达明显高于A、B、D、E组(P<0.01)。TGF-β1蛋白表达以C组最多，A组次之，两组间比较差异有统计学意义(P<0.01);Ⅱ型胶原的蛋白表达，C组也明显高于A、B、D、E组(P<0.01)。见表1。
3 讨论
分离BMSCs的方法有密度梯度离心法、贴壁细胞分离法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法[7~9]。作为组织工程种子细胞，细胞纯度越高越能符合组织工程研究的要求。我们将密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，用比重为1.073 g/ml的percoll分离液分离BMSCs，具有操作简便、快速、实用等优点，是一种较理想的分离纯化方法[10]。Palmer等[11]报道，TGF-β1基因转染BMSCs能明显促进其向软骨细胞分化，在体内稳定释放的生长因子能较好地维持软骨细胞表型，防止其老化退变。田甜等[12]利用软骨细胞和BMSCs共培养取得了很好效果。TGF-β1联合软骨细胞共培养，诱导BMSCs向软骨细胞分化，具有协同作用[13，14]。近年来共培养成为热点。张勇等[15]用脂肪干细胞和软骨细胞共培养后，诱导分化为软骨细胞。刁华建等[16]用GAM成功诱导BMSCs向软骨细胞分化。我们的实验研究表明：(1)经转染后的BMSCs成功表达软骨细胞的特异性基质Ⅱ型胶原，具有软骨细胞特征;(2)在细胞外基质的表达量上，以基因转染复合共培养组最多，说明BMSCs向软骨细胞转化的能力要明显高于其他组;复合共培养才是符合机体真实内环境的需求，并有助于提高疗效。这是一个很有前景的方向，对于组织工程软骨应用于临床具有重要意义。
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11 Palmer GD，Steinert A，Pascher A，et al.Gene-induced chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in vitro.Mol Ther，2005，12(2):219-228.
12 田甜，章庆国.力学刺激促进软骨细胞与骨髓基质干细胞共培养体外软骨分化.中国美容医学，2009，5(18):658-662.
13 Fukumoto T，Sperling JW，Sanyal A，et al.Combined effects of insulinlike growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro.Osteoarthritis Cartilage，2003，11(1):55-64.
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15 张勇，赵建宁，韩宁波.脂肪干细胞与软骨细胞的共培养.中国组织工程研究与临床康复，2009，13(24):4632-4636.
16 Diao HJ，Wang JL.Improved cartilage regeneration utilizing mesenchymal stem cells in TGF-b1 gene-activated.Scaffolds Tissue Engineering:Part A，2009,15(9):2687-2698.
【摘要】 目的 临床评价HMG-CoA还原酶抑制剂辛伐他汀和血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）苯那普利联合治疗，对糖尿病肾病（DN）尤其是对血脂正常的糖尿病肾病（DN）的防治效果，并探讨相应机制，为临床早期防治DN提供循证医学资料。方法 采用随机对照，临床观察到辛伐他汀和ACEI类药物对有血压、血脂升高的DN患者尿转移生长因子β1（TGF-β1）、层粘联蛋白（LAM）、IV型胶原（CIV）、尿微量白蛋白排泄率及糖化血红蛋白（HbA1c）等的影响。结果 辛伐他汀和苯那普利能降低DN患者尿TGF-β1、LAM、CIV以及尿微量白蛋白的排泄率。 结论 辛伐他汀和苯那普利有抑制肾脏TGF-β1表达，减轻细胞外基质过度聚集，缓解蛋白尿持续性增加的作用。
【关键词】 HMG-CoA还原酶抑制剂；转化生长因子β；层粘联蛋白；IV型胶原；苯那普利
［中图分类号］ R587.1 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1681-6676（2010）02-0092-03
随着我国生活水平的日益提高和人口老龄化，糖尿病的发病率不断上升，其严重并发症之一-糖尿病肾病（DN）已成为终末期肾病（ESRD）主要发病因素，因此DN的早期防治至关重要。而传统意义上的控制血糖，仅能延缓部分DN患者的病情发展。他汀类（statins）药物是一类（HMG-CoA）还原酶抑制剂，苯那普利是血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI），二者临床上用于治疗高胆固醇血症和高血压，在降低胆固醇和血压的同时，接抑血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）活性，可减少DN尿蛋白量，抑制细胞外基质形成，并且可直接抑制肾小球系膜细胞TGF-β的表达。笔者应用辛伐他汀和苯那普利联合治疗100例糖尿病肾病，取得较好疗效，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 实验对象 对照组：随机选择50例DN患者，予以常规控制血糖、血压、血脂治疗，均未使用他汀类药物和血管紧张素转化酶抑制剂。辛伐他汀和苯那普利联合治疗组：选择50例2型糖尿病肾病患者（24h尿白蛋白定量30～300mg）,为血压、血脂异常组。使用辛伐他汀20mg/d、苯那普利10mg/d联合治疗。测所有组别患者的平均动脉压、血糖、糖化血红蛋白、血脂、24h尿蛋白定量、尿白蛋白/肌酐比值、尿转化生长因子β1（TGF-β1）、IV型胶原、层粘蛋白，为期6个月和12个月。
1.2 试验方法
1.2．1 TGF-β1测定 采用ELISA方法。
1.2．2 层粘连蛋白测定 放射免疫分析法。
1.3 统计学处理 所有数据均用均数±标准差表示，用SPSS10.0分析，多组间比较，用One-way ANOVA分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 血脂、血压正常组 辛伐他汀和苯那普利治疗3个月时尿蛋白总量、尿TGF-β1、IV型胶原、层粘蛋白降低（P<0.05），治疗6个月后，尿蛋白总量、尿TGF-β1、IV型胶原、层粘蛋白降低更加明显（P<0.005）。且患者血脂、血压亦控制正常，血糖亦控制稳定。对肝功能无明显影响。肾功能无恶化趋势，Ccr有上升趋势。
2.2 血脂、血压异常组 辛伐他汀和苯那普利治疗3个月时尿蛋白总量、尿TGF-β1, IV型胶原、层粘蛋白降低明显（P<0.05）,治疗6个月后，尿蛋白总量、尿TGF-β1、IV型胶原、层粘蛋白降低更加明显（P<0.005）。且患者血脂、血压亦控制正常，血糖亦控制稳定。对肝功能无明显影响。肾功能无恶化趋势，Ccr有上升趋势。
2．3 对照组 对照组6个月时尿TGF-β1、IV型胶原、层粘蛋白有升高趋势，12个月后，尿TGF-β1、IV型胶原、层粘蛋白升高更加明显（P<0. 05）。其他各项指标变化不大。
3 讨论
DN主要的发病机制有：(1)糖代谢异常：糖尿病患者血糖显著升高，并由此导致肾脏的高葡萄糖代谢。其主要原因是，肾细胞葡萄糖转运体1(GlutⅠ)活性增强，以及肾组织细胞胰岛素受体的数目和亲和力增加。胞内高糖而引起的各种损伤导致介质过多，如IGF-l、TGF-β1、AngⅡ等，这些介质又促进Glutl表达活性增强，使更多葡萄糖进入胞内。高糖代谢紊乱主要通过晚期糖基化终末代谢产物(AGEs)、多元醇通路的激活、二酰甘油-蛋白激酶C途径激活(DAG-PKC)三条途径损害肾脏。(2)肾脏因素：主要表现为细胞外基质生化异常，如赖氨酸羟化酶活性增加引起胶原蛋白赖氨酸残基羟化而导致的基质蛋白过度交联，IV型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等细胞外基质蛋白的过度沉积，以及构成肾小球阴电荷屏障的主要成分硫酸乙酰肝素合成的下降，以上病理生理过程均与转化生长因子-β1(TGF-β1)表达上调有关。(3)血流动力学异常：主要表现为持续肾小球高滤过和肾小球内高压，此机制主要由肾素-血管紧张素系统(RAS)活性增高所介导，阻断此病理过程的主要方法是使用血管紧张素转换酶抑制剂，此方法已被多年的实验和临床研究所证实。(4）脂代谢紊乱：主要表现为血甘油三酯(TG)、胆固醇(CHOL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及载脂蛋白B(ApoB)的显著升高，它们共同加重了肾小球硬化。在糖尿病肾病的发病过程中，转化生长因子-β1（TGF-β1）及血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）起着关键的作用。高糖环境下，糖尿病患者肾细胞葡萄糖转运体-1 （Glut-l）活性增强，后者导致胞内持续高糖，促进了AngⅡ、TGF-β1等的过度表达[1]。AngⅡ在激活肾素-血管紧张素系统（RAS），直接导致肾脏血流动力学异常的同时，也是一种重要的生长因子，具有刺激TGF-β1表达，促进IV型胶原合成等作用。而TGF-β1可促进肾脏细胞增殖，诱导细胞外基质（ECM）的合成，是导致肾脏IV型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等过度沉积主要原因。Kasiske等认为[2]，TGF-β1可看作是AngⅡ导致DN过程中的下游因子。因此，同时阻断AngⅡ和TGF-β1的生物学活性将有助于提高目前DN的治疗效率。
综上所述，他汀类药物及ACEI类药物有着调脂及降压之外的作用，能够延缓DN的进展。
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【关键词】 皮肤肿瘤 转化生长因子-α 血管内皮生长因子
转化生长因子 (TGF) -α、血管内皮生长因子(VEGF)是重要的丝裂原。目前已知许多肿瘤（包括皮肤肿瘤）可产生VEGF、TGF-α。体外实验发现TGF-α可以诱导角质形成细胞(KC)产生VEGF，二者可能在血管增生中起协同作用，从而促进肿瘤的增生及转移［1］。
1 TGF-α、VEGF的生物学作用
TGF-α是表皮生长因子(EGF)家族的重要成员之一，编码基因定位于2号染色体。成熟型TGF-α约由50个氨基酸残基组成，相对分子量为6×1013～20×1013。TGF-α通过与表皮生长因子受体(EGFR)结合发挥其生物学作用。正常人体组织一般仅有少量的TGF-α表达，但早期人类胚胎、小鼠垂体和多种人类肿瘤细胞可产生大量TGF-α［2］。
TGF-α的生物学作用［3］：①可刺激上皮细胞增生并诱导其分化，对正常细胞的生长起调节作用。②TGF–α通过刺激成纤维细胞和角化细胞增殖和移行，同时诱导细胞产生细胞外基质。③刺激体内血管生成因子和角化细胞游走，加速正常细胞向恶性转化 。④使恶性细胞自分泌TGF-α增多，使肿瘤加速成长并使致癌及转移因素增加。
Factor［4］等比较并分析了单纯c-myc和c-myc／TGF-α两种转基因小鼠肝癌动物模型中细胞核因子(NFκB)的表达情况。结果发现c-myc／TGF-α转基因小鼠动物模型中的NFκB表达率、细胞增殖率均明显高于单纯c-myc转基因小鼠动物模型，而细胞凋亡指数却低于后者。提示NFκB在c-myc／TGF-α转基因小鼠动物模型中有较高的活性，能够加速c-myc／TGF-α诱导的细胞恶变。TGF-α与EGFR结合后受体结构二聚体化和自身磷酸化, 并激活受体上的酪氨酸激酶（PTK) ,级联激活MAPK信号系统 (Raf-MEK-ERK)［5］。EPK通路激活后,信号传导因子细胞外调节蛋白激酶 (EPK)进入细胞核，引起转录因子的磷酸化，促使DNA合成而使细胞增殖、分化，并在其它因素的共同作用下使细胞向恶性转化，而转化的恶性细胞可分泌TGF-α，引起TGF- α和EGFR的过高表达，使肿瘤细胞的生长不受机体控制。
VEGF是一种分泌性糖蛋白，大小为35～45KD，现在已发现7种：VEGF-A、B、C、D、E、F以及胎盘生长因子(Placental growth factor，PIGF)［6］。其受体现已发现5种。3种为蛋白酪氨酸激酶受体：VEGFR-1即Flt(The fms-like tyrosine kinase) -1，VEGFR-2即相关磺胺二甲异嘧啶激酶受体KDR(Kinase insert domain-containing receptor )/ 胎肝激酶(Fetal liver kinase，Flk)-1, VEGFR-3(Flt-4)；2种为非蛋白激酶受体：神经纤毛蛋白受体NP(The neuropilins)-1 和 NP-2［7］。VEGF-A即是以往所称的VEGF。它的基因位于染色体的6p21，全长28kb，编码VEGF的基因长约14kb，由8个外显子和7个内含子组成。VEGF-B曾称血管相关因子(VRF)或血管相关蛋白(Vascular permeability protein ,VRP)，目前已发现两种不同剪接方式产生的两个不同的转录子，即VEGF-B167 和VEGF-B186。VEGF-C基因位于染色体4q34上，其cDNA的开放性读框编码含419个氨基酸残基，分子量46.9 kDa。VEGF-C mRNA在胚胎及成熟的组织中都有表达，成人的VEGF-C主要在心脏、胎盘、卵巢及小腺体中表达，仅少量表达于脑、肝胸腺及外周血白细胞。人VEGF-D已被克隆，基因位于染色体xp22，23 位置，含有8个胱氨酸残基，VEGF -D mRNA在成人的心脏、肺、骨骼肌、结肠和小腺体表达丰富。PIGF基因定位于14q24-q3，目前有4种异构，多表达于胎盘细胞，除甲状腺、肺外，多数成熟组织无表达。皮肤中VEGF主要来源于KC,正常皮肤中仅有少量VEGF表达，主要表达在基底膜及毛囊KC。VEGF-E在副痘病毒中发现, VEGF-F/ svVEGF在蛇毒中发现,尚在进一步的研究中［8］。
VEGF是一种内皮细胞的特异有丝分裂原，VEGF表达与组织中微血管的密度及新生血管的数量密切相关并可诱导血管发生，同时也是已知最强的血管渗透剂；还可直接作用于神经元，促进神经突触延伸，具有神经保护和神经新生作用［9］。还具有促进内皮细胞迁移的作用，并可选择性地诱导淋巴管的增生，并参与间质液的引流［10］。
VEGF主要通过上调UPA和TPA以及PAI-1基因的表达，诱导内皮细胞表达蛋白水解酶，间质胶原酶和组织因子。VEGF选择性直接作用血管内皮细胞膜上的两种亚型酪氨酸激酶受体Flt-1和KDR。Brock等研究发现［11］，VEGF与受体结合后细胞内短暂Ca2+浓度升高，微摩尔浓度的VEGF在几秒内就可使Ca2+升高数倍。VEGF对内皮细胞的作用类似内皮细胞激动剂如凝血酶和组织胺，像其他增加Ca2+浓度的激动剂一样，他通过磷酸肌醇特异性磷酸酯酶C，使胞内IP3浓度升高。Qu等发现［12］，在肿瘤血管和注射VEGF的皮肤中，VVO（Vesicular-vacular organell)的功能被上调，通过开闭窗孔起作用，引起血浆蛋白外渗。这成为肿瘤重要的营养来源。其通过诱导内皮细胞表达血浆蛋白溶酶原激活物 (PAS)及血浆溶酶原激活物抑制剂-1, 以及诱导组织因子、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase )- 1等激活凝血因子Ⅷ从内皮细胞中释放。细胞外基质的这些改变，使其更易于血管生长；而内皮细胞迁移及淋巴管的增生与肿瘤转移及免疫也有关［13］。
2 TGF-α、VEGF在皮肤肿瘤发生发展中的作用
致癌基因及抑癌基因的各种改变导致各种因子及受体在肿瘤中表达的改变。c-fos、c-myc、c-jun等一系列基因过度表达，致细胞增殖分化，导致细胞恶性变，显著促进细胞的增殖代谢，促进DNA和蛋白质的合成。
TGF-α作为EGFR的配体之一是表皮生长分化增殖转化的重要调节器。在鼠类体外实验中已证实其引起角蛋白的表达的显著改变［14］。Groves［15］等对皮肤肿瘤细胞内外EGFR的研究表明，EGFR在良性肿瘤（病毒疣、脂溢性角化、角化棘皮瘤）呈有序模式表达；在恶性肿瘤中（基底细胞癌、鳞状细胞癌）有膜标记的丢失和胞质受体的积聚；在癌前病变中，有膜受体的丢失和胞质受体的丢失（光化性角化病）或胞质受体的积聚（Bowen病）。在对101例头颈部鳞癌病人进行多变量分析时，TGF-α被证明与ERKs(Extracellular signal-regulated kinases)即 ERK1和ERK2活化有关（P<0.001）。而研究同时表明ERK1/2活化水平在有周围淋巴结转移的鳞癌（P=0.048）和复发的鳞癌（P=0.021）中较高［16］。已有实验表明，在良性和发育不良痣的痣细胞里有显著增高，在先天性和恶性黑素瘤中免疫活性却不稳定，当黑素细胞恶变时，TGF-α变得具有迁徙性［17］。在Paget病中TGF-α表达有增多［18］，与其受体增多也有关。而在Kaposi肉瘤中却低表达［19］，这可能与Kaposi肉瘤中受体丢失有关。
VEGF与多种皮肤肿瘤的研究关系表明：VEGF高表达与肿瘤患者生存期、转移有关。各种实验如原位杂交技术、RNA印迹技术、RT-PCR技术等均证实其mRNA和蛋白在皮肤肿瘤中有高效表达，如脂溢性角化病、Bowen病、角化棘皮瘤、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等，而基底细胞癌中，其mRNA不能检测出有不同的变化。动物实验显示前列腺素水平高的鳞状细胞癌中VEGF表达更高［20］。免疫组化及微血管密度(Microvessel density，MVD)测量显示［21］，光化性角化病血管发生比正常皮肤并无增高，早期仅轻度增高，只有到鳞状细胞癌晚期，血管发生才显著增强。大部分肿瘤组织开始是选择相邻组织的血管供氧，当肿瘤组织生长到一定程度，缺氧就成为新生血管发生的扳机点。促血管新生的因子的分泌增多及内源性抑制血管新生的因子的下调，也成为皮肤肿瘤发生发展的原因。BCE与众多皮肤肿瘤检测结果不同，可能由于其仅表现为细血管扩张，无血管增生及毛细血管密度的改变或未达到阈值等，BCE的生长、转移也因此受限。相反，鳞状细胞癌、恶性黑素瘤侵袭性及转移危险性高与VEGF高表达有关。而肥大细胞表达VEGF可能是侵袭性基底细胞癌发生的原因［22］。
3 TGF- α、VEGF与皮肤肿瘤的诊断、治疗及预后
尽管正常组织在特殊情况下也表达TGF- α、VEGF，但表达水平极低。现有的实验技术不仅能准确地测出mRNA表达，还可以测定在肿瘤组织中的分布，RT-PCR还能做出定量分析。高水平的TGF- α、VEGF可以导致鳞状上皮细胞癌的转移及复发而低水平的VEGF可以限制基底细胞的转移，提示表达水平可能成为一个区分肿瘤恶性程度的指示，且与肿瘤转移及复发关系密切。两项指标联合可以更准确的判断肿瘤患者癌细胞的分化程度、浸润深度、是否存在淋巴道及远处转移，对肿瘤的临床诊断、治疗以及预后均具有重要的实际意义。
特殊设计与修饰的VEGF、TGF-α及其受体、基因抑制剂以及调节酶释放系统的方法，均可抑制血管新生、促进细胞凋亡，已经成为肿瘤治疗的新方法。近几年在这方面开展了不少研究，给皮肤肿瘤的治疗也带来了新契机。抗VEGF的有贝伐单抗（Bevacizumab/Avastin）等，抗VEGFR有SU5416、SU6668、PTK78、ZK22584、ZD4190、Sunitinib（SU11248）及AZD2171等，抗EFGR的有Panitumumab，西妥昔单抗（Cetuximab/Erbitux），曲妥单抗（Trastuzumab）等［23］。另外，还有一些酶抑制剂也能作用于这两因子的作用环节：酪氨酸激酶抑制剂如Lapatinib（GW572016）、Erlotinib、Gefinib，基质金属蛋白酶抑制剂(Matrix metalloproteinase inhibitors,MMI)等［24］。其中同一种药物也可能作用于多个环节，如ZD6474可同时抗VEGFR和EGFR的酪氨酸激酶。多种药物联合化疗及各种治疗的毒副作用的研究也在进行中。有研究表明在用sorafenib (BAY 43-9006)治疗光化性角化病时，引起斑丘疹、掌跖感觉迟钝、秃头、干燥症等［25］。基因治疗现主要采取小分子RNA干预，用于皮肤肿瘤尚在进一步研究中。
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作者单位：广东医学院附属医院皮肤科,广东 湛江 524001
【摘要】 目的 探讨转化生长因子β（TGF β）Ⅱ型受体(TGF β RⅡ)在尖锐湿疣（CA）皮损中表达情况及其意义。 方法 采用半定量PCR技术分别检测20例CA皮损及10例正常对照包皮中TGF β RⅡ的mRNA的表达。 结果 CA皮损中TGF β ⅡR的mRNA的表达水平显著低于正常对照包皮组织（P＜0.05)。 结论 TGF-β信号通路中TGF-β RⅡ表达的下降可能与CA疣体的发生相关。
【关键词】 尖锐湿疣；转化生长因子β；Ⅱ型受体;转化生长因子β
转化生长因子β（Transforming Growth Factor β，TGF-β）是一种公认有效的上皮细胞生长抑制因子，而TGF-β的Ⅱ型受体（TGFβRⅡ）是TGFβ信号通路转导中较关键的受体，它们的相互作用，在上皮细胞肿瘤的发生和发展方面发挥着重要的作用［1］，尖锐湿疣（Condyloma acuminatum ,CA）是人乳头瘤病毒（HPV）感染的性传播疾病，也是一种表皮的良性肿瘤，具有迁延不愈、顽固难治等特点。我们既往的研究已经表明TGF-β在CA皮损中的表达水平是显著上升的［2］，但它的上升却未能发挥对CA皮损上皮细胞的生长抑制作用，为了更深入的探索TGF-β在CA发病中的作用，我们采用了半定量PCR技术进一步检测了CA皮损及正常包皮组织中TGF β RⅡmRNA的表达和意义，以探讨TGF-β的信号转导通路在CA发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 标本来源 在皮肤科门诊收集CA患者20例，临床皮损典型并经病理证实，其中男12例，女8例，平均年龄35岁，平均病程5.2月，既往未接受任何治疗，无其他相关系统性疾病。10例正常男性包皮取自接受包皮环切术的个体，平均年龄26岁。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 RNA提取试剂盒以及PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，逆转录试剂盒购自日本东洋纺公司，PCR引物由上海生工代为合成。
1.2.2 标本收集 每一标本取材后均立即分成两份，一份置于10％甲醛磷酸缓冲液中固定后，按常规脱水、透明、石蜡包埋进行病理确诊，另一份立即放入液氮冻存备用。
1.2.3 组织总RNA提取 参照（TaKaRa公司）说明书要求从组织中抽提总RNA。用UV-2201型紫外分光光度计（SHIMADZU，日本）测定所提RNA的纯度及含量，A260/A280比值均在1.8～2.0之间。另取适量RNA进行琼脂糖凝胶电泳验证所提RNA质量。
1.2.4 逆转录合成cDNA 参照逆转录试剂盒（TOYOBO公司）说明进行，反应体系轻微离心后，置于GeneAmp 2700型PCR仪（美国）中，反应条件为：42℃ 30min、99℃ 5min，所得cDNA产物保存于-20℃冰箱待用。
1.2.5 引物设计 以18s rRNA作为内参基因。TGF-β RⅡ引物,上游：5’-GCAGGTGGGAACTGCAAGAT-3’，下游：5’-GAAGGACTCAACATTCTCCAAATTC-3’，扩增产物75bp；18s rRNA引物,上游：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’,下游：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’,扩增产物112bp。
1.2.6 半定量PCR及其结果判定 取转录产物cDNA 1.5μl，上下游引物各0.5μl，Premix Taq酶12.5μl，加灭菌蒸馏水10μl至总反应体积为25μl。混匀，离心，以矿物油覆盖，置GeneAmp 2700型PCR仪（美国）中，95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 60s，共35个循环；72℃ 7min。每一样本均设置以蒸馏水为模板作阴性对照。1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察，PCR产物片段大小与预期的相一致。对结果照相后进行计算机灰度扫描，采用BandScan5.0图像分析软件进行电泳条带的平均光密度（OPTDM）和发光面积（AREA）的测定。PCR产物的含量用电泳条带的累光密度（OPTDI）的数值表示（OPTDI=OPTDM×AREA）。TGF-β RⅡ的相对含量以同一标本的18s rRNA的PCR产物含量的比值来表示，即OPTDITGF-β RⅡ/ OPTDI18s rRNA。
1.3 统计学处理 采用t检验，用sas8.0统计分析软件进行统计学处理。P＜0.05视为差异有统计学意义。
2 结果
20例CA、10例正常对照包皮组织均能扩增出TGF-βRⅡ目的片段以及18s rRNA内参片段，阴性对照不能扩增出特异片段，PCR产物电泳结果见图1。CA皮损中TGF-βRⅡmRNA的相对含量为0.659±0.116 ，包皮组织中为0.837±0.076，两两比较差异有统计学意义(χ2=3.758，P＜0.01)，TGF-β RⅡ mRNA在两组间的表达差异有统计学意义，从转录水平来看，在CA皮损中TGF-β RⅡ的表达水是平明显下降的。
图1 半定量PCR检测TGF-β RⅡ mRNA在CA组及包皮组中的表达（略）
M为DNA标准参照物；1～2：CA皮损；3～4：正常包皮；1,3：TGF-β RⅡ（75bp）；2,4：18s rRNA（112bp）
3 讨论
TGF-β1是一种多功能的细胞因子，广泛参与细胞生长、分化、凋亡以及血管生成，细胞外基质的形成等，与免疫抑制及肿瘤形成等病理过程密切相关［3］。研究认为，TGF-β1发挥生物学效应，有赖于与效应细胞表面受体正常结合并启动一系列的级联信号反应，目前比较明确的TGF-β受体有三型，其中TGF-β RⅡ是唯一能够通过自身磷酸化而被激活的丝苏氨酸蛋白激酶受体，对TGF-β信号通路的正常启动具有关键作用［3］。TGF-β1的正常启动和活化将可有效的抑制上皮细胞的生长，维持表皮内环境的稳定，抑制上皮细胞肿瘤的发生和发展［2］。研究已经发现，在多种增殖性疾病或肿瘤中存在TGF-β1表达的异常上升，但TGF-β RⅡ的表达却明显降低甚至缺如［4～6］，提示TGF-β RⅡ是介导TGF-β1发挥正常作用的信号调控因素之一，TGF-β RⅡ表达的下降，可能影响了TGF-β1的上皮细胞生长抑制功能的正常发挥，甚至促进了肿瘤的形成。本组的研究结果也显示，在CA皮损中TGF-β RⅡ的表达是明显下降的，与正常人对照组相比，差异有统计学意义。我们认为，HPV感染引起角质形成细胞表面TGF-β RⅡ表达的下降，使得病毒感染细胞对TGF-β1的敏感性降低，从而影响了TGF-β1的正常诱导和启动，使其抑制上皮增殖的功能不能有效发挥，病毒感染细胞呈现过度增殖，导致了CA疣体的形成和发展。
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作者单位：中山大学附属第二医院，广东 广州 510120； 南方医科大学附属顺德第一人民医院皮肤科，广东 佛山 528300.
