主题:内毒素

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日本团队用纤维素纳米纤维成功开发吸附内毒素技术

内毒素是一种构成大肠菌及沙门氏菌细胞膜的脂多糖,一旦经注射等途径进入血液,则会引起发热、休克等生理反应。自来水、开水、蒸溜水中都存在微量的内毒素,在注射用蛋白质、疫苗溶液等的半成品中也会残留微量的内毒...即将发布

日期:2017年5月18日 - 来自[技术要闻]栏目
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复旦特聘教授Nature子刊发表免疫新成果

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,主要是脂多糖(LPS)。LPS进入机体之后能广泛影响宿主的系统和器官,危及宿主的健康甚至可能致命。

宿主细胞在面对内毒素攻击时,会主动进行防御以降低自身受到的损害,内毒素耐受ET(endotoxin tolerance)就是这样一种机制。内毒素耐受是指,宿主多次接触细菌内毒素之后,再次遭遇高剂量内毒素,只出现轻微反应或不反应。这是机体的一种适应性反应,可以有效抑制过度的炎症。

人们很久以前就认识到了内毒素耐受现象,但至今未能阐明其中的具体机制。内毒素耐受能在与促炎症基因有关的染色质区域,提高抑制性标签H3K9me2的水平。为了进一步了解这一过程,北卡罗莱纳大学的研究团队开发了一种新技术ChaC,并由此揭示了调控ET相关炎症的重要蛋白。

这项研究发表在近期的Nature Communications杂志上,领导者是北卡罗莱纳大学生物化学和生物物理学副教授陈先(Xian Chen)。陈先教授主要从事定量蛋白质组学研究,曾荣获美国总统早期成就青年科学家奖,现为教育部长江学者,复旦讲座特聘教授。

陈先教授等人用自己开发的ChaC(chromatin activity-based chemoproteomic)技术,分析了内毒素耐受过程中的调控蛋白。研究人员发现,甲基转移酶G9a/​GLP广泛影响了ET特异性的组蛋白密码重编程、染色质重塑和特定转录因子活性。研究显示,G9a依赖的表观遗传学环境,能促进​c-Myc的转录抑制活性,对慢性炎症进行基因特异性调控。文章指出,ChaC也可以用来分析与染色质结构有关的其他功能性蛋白复合体。

作者简介:

陈先  男,北京大学学士;美国宾夕法尼亚州州立大学有机化学博士;美国佛罗里达大学分子生物学及蛋白质化学博士后;美国洛斯阿拉莫斯国家实验室及加州大学生物物理系,博士后,教授研究员。复旦讲座特聘教授。

日期:2015年1月4日 - 来自[免疫系统]栏目

肝衰竭内毒素血症的中医辨治探析

    肝衰竭是临床最常见、最严重的肝病症候群。为临床疑难病症之一。越来越多研究者认识到了内毒素血症在肝衰竭发病及影响预后方面的重要作用,但是对内毒素的治疗目前尚无特效药物。因此,笔者在内科综合治疗的基础上,积极探求运用中药治疗肝衰竭的优势有很重要的现实意义。

1肝的生理病理特征

    肝为风木之脏,主疏泄而条畅气机。又藏血而调节血运,调节血运则可养筋脉润爪甲,肝受血而能上养二目,肝体阴而用阳,能调节全身气机,周转气血.促进消化吸收,维持筋脉的营养,这些生理特性决定了肝病的临床用药特点。同时人体的各项生理功能正常发挥需要五脏六腑之间的生克制化协调配合.如肝的生理功能正常发挥要靠母脏肾水来滋养肝体,脾土之运化.肺金之克制,则可成其条达之性,柔和之体。另一方面.肝的疏泄、调节血运功能正常发挥可促进胆汁的排泄、脾的升清降浊、肺的宣发与调控水液等。所以肝体自病可以导致其他脏腑的功能异常,反之亦然。比如肝衰竭时,肝体为内外毒邪所困,疏泄失常致胆汁排泄不畅而发为黄疸;肝病及脾伤胃,致运化失职而见食欲明显下降;全身气机失调波及肺脾肾而致水液代谢失常而出现腹水。

    总之,肝的这些病理特点总以肝气易郁为始发.肝火易盛是重要因素,最终导致肝“体用同病”。这为笔者分析肝衰竭内毒素血症的基本病理因素及治法治则提供了重要理论依据。
2肝衰竭内毒素血症时的病因病机特点

    肝衰竭是各种肝病中最严重的一种类型,也是许多肝病的最终阶段,分析其病机病理特点,自然也符合肝病的一般特征,比如湿热内蕴、瘀血内阻、肝阴亏虚等,但在此基础上,又有其自身的特点。
2.1  感受邪毒、正气亏虚、内毒丛生是本病的基本病理环节肝衰竭的发病,在我国以感染乙肝病毒为主,乙肝病毒性属湿热,缠绵难愈又易暗耗阴血,无论是其所致邪正剧烈交蒸的急性发病过程,还是感邪日久正气亏虚后的邪盛正弱的过程,都存在内毒丛生的一面。要弄清这一过程,首先应分清“内毒”、“外毒”的不同.以及传统医学所论之毒与现代医学所说之毒的异同。
    毒邪作为肝衰竭发病的重要原因之一。包括了外毒和内毒两方面的含义。外毒主要指疫疠、有毒的物质,如肝炎病毒、酒精、化学毒物等;内毒指湿热毒、瘀毒等,是因外毒入侵导致机体脏腑功能紊乱、气血阴阳失调所产生的对机体造成进一步损伤的病理产物,对机体功能造成“二重打击”。而现代医学认为HBV感染变异与肝衰竭的发生直接相关,病毒复制是肝衰竭发生发展的必须条件和主要原因所在,这就类似于中医“外毒”的作用过程。同时,目前关于肝衰竭发病机制的研究主要有以细胞毒性T淋巴细胞为主介导的免疫损伤学说,以肿瘤坏死因子为核心的细胞因子作用形成的内毒素一细胞因子轴肝损伤学说,炎性介质介导的肝损伤学说,肝细胞内代谢网络系统紊乱学说等等.而这些细胞毒性T淋巴细胞、肿瘤坏死因子、内毒素、白细胞介素、氧自由基等本是机体正常所需的生理物质,在“外毒”刺激下过度的产生,对机体造成“二次打击”而成为“内毒”,这属于中医学所认识的“瘀毒”、“郁毒”等范畴。从中医学的角度来讲,外毒是引起肝病发作的始动因素,并通过造成内毒(指瘀血、湿热等病理产物)产生对机体的损伤,最直接的影响就是肝体受损,进而使外毒更易入侵,无力祛邪外出而加重病情,造成“二次打击”。可见,无论中医或是西医对肝衰竭时毒的认识只是基于不同理论框架下的阐述。总之,整个肝衰竭病程中,其中心环节是感受湿热毒邪致正气耗损,内毒丛生,并以瘀血内阻为主,内外毒邪相互为患。

2.2毒、瘀、虚是肝衰竭内毒素血症时的基本病理因素前面已经论述了肝衰竭的重要病理特征,可以看出。内瘀的产生是整个发病过程中重要的一环,也就是外毒所致内毒产生的这一过程。因“瘀”在发病环节上的承上启下性,故笔者单独提出,以强调其重要性,因此,可以说毒、瘀、虚是肝衰竭内毒素血症的基本病理因素。

    结合现代医学对肝衰竭的病因机制研究,无论是各种肝炎病毒、化学毒物、酒精等,还是各种炎症因子、内毒素等都具有毒的特性,与中医学毒邪致病的认识相类似。所以说毒邪是肝衰竭内毒素血症的基本致病因素和病理因素之一。血是人体主要的营养物质,血液的正常运行依赖心的推动,脾的统摄和肝的调节,故肝病时最易影响到血的运行和对机体的濡润。肝衰竭患者多因感染肝炎病毒发病,肝炎病毒具疫疠毒邪之性,其性火热炽盛,其气秽浊,肝体受累最易致疏泄不畅,则血瘀滞不通:又其热毒之性入营血则耗灼阴血而成内瘀,火易动血而使其成离经之血,亦为瘀血。肝病藏血失职,则肝血亏虚,肝病克脾,使脾病而气血生化无源,亦成血虚,这更加重了体内瘀血状态。毒、瘀相互胶结,使病情加重。内毒素血症是由内毒素引发,中医学认为“热由毒生,变由毒起”,中医的热毒证与内毒素血症相似,中医的热毒和内毒素在致病上也一致。可见,肝衰竭时毒邪致瘀,瘀毒相互为患,其相互胶结日久的结果就是造成正气耗竭、阴液亏损。

    肝的病理特性时已经明确肝阴易虚,且肝本阳常有余,阴常不足,特别是在感受热毒之邪、复加瘀血内阻造成肝衰竭时。此时造成肝阴受损主要是通过几个方面造成的。一方面,湿热毒邪入侵最易耗伤津液,暗耗阴血;瘀血内停,久而易化热更易伤及阴液;另一方面,肝体自病,波及他脏,造成整个机体阴亏的一面,如肝体本受肾水的滋养,今肝阴易虚,常常过度汲取肾水,久则出现肝肾阴虚,肝肾本同源,水不涵木则肝木愈枯;肝病最易传脾,致脾的运化水谷津液功能失常,不但造成血虚血少等,还易致水液失其常道而致水湿凝聚发为水臌,患者所表现的口干渴,小便少等症状皆因脾的升清降浊功能异常,阴液疏布异常及阴液亏少。同时,气属阳,阳生于阴液,阴液已亏,日久则无生化之源则气亦亏矣,且壮火食气,毒邪易生热化火,本身对机体正气就是一种消耗,结合肝衰竭患者所表现的重度乏力、少气懒言等症状。可见肝衰竭亦最常表现出气阴两伤的虚损的一面。

    由此,笔者提出毒、瘀、虚是肝衰竭内毒素血症时的基本病理因素,热毒内蕴、瘀血内阻、气阴两虚是其基本病机。三者相互为患。

2.3清热解毒、活血化瘀、益气养阴是治疗肝衰竭内毒素血症的基本大法综合历代医家对肝衰竭治疗的经验,根据肝衰竭内毒素血症时毒、瘀、虚的病理状态,参考现代医学对内毒血症治疗的经验和缺陷,遵循辨病辨证结合的原则。即根据肝衰竭内毒素血症的基本病因、病机、病理,提出清热解毒、活血化瘀、益气养阴法为治疗本病的基本大法。本病在病机上属于“正虚邪实”,故对应的治疗原则为扶正与祛邪并举,清热解毒、活血化瘀、益气养阴法正是体现了这一原则。根据病情阶段的不同而3种治法有所偏重,以达到协同的目的。其主要作用有以下几点。(1)保护肝脏的解毒功能。肝衰竭时大量肝细胞的解毒、排泄功能受损导致及加重了内毒素血症,内毒素的清除、吞噬有赖于肝脏功能的正常发挥及免疫系统的参与。研究表明益气养阴的中药具有保护机体解毒功能的作用。如生脉注射液是具有益气养阴功效的中药制剂.实验表明其有较强的抗内毒素的作用,该作用主要是通过激活网状内皮吞噬系统,提高机体对内毒素的吞噬、降解和清除,为肝细胞的修复提供时机,更好的发挥解毒的作用。(2)改善微循环及抗DIC,促进肝细胞修复。微循环障碍及DIC时内毒素血症重要病理变化之一,直接影响着内毒素血症的预后。研究显示,清热解毒、活血化瘀的中药具有改善微循环和抗DIC的作用。于荣华等研究发现赤芍有扩血管作用,有利于改善肝脏微循环,降低门静脉的压力并阻止内毒素的吸收。由此可见清热解毒类和活血化瘀类中药具有对抗内毒素血症的作用。可以纠正因内毒素血症引起的微循环障碍,减轻肝脏损伤程度。(3)抗内毒素诱发的细胞因子或炎性因子作用。对内毒素致病机制的研究显示。内毒素诱发的炎性细胞因子对组织细胞的损害远远大于内毒素本身对机体的直接影响。许锋等通过实验研究发现,活血化瘀中药丹参对内毒素刺激下分泌的细胞因子白介素1、白介素6、肿瘤坏死因子有明显的抑制作用并呈剂量依赖性。
    综上所述,对于肝衰竭的中医药治疗,我们应当合理利用现代医学的研究成果.始终以中医理论为指导临证用药,用药原则坚持顺其疏达之性、合其柔润之体而宏观调控气血,环节用药、阶段用药并重,同时注意宏观辨治与微观辨证相结合,以期充分展现传统医学的优势。

 

 

日期:2013年8月6日 - 来自[辩证施治]栏目
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赶紧排毒吧,12大体内毒素毒不死你!

    引言:很多人都抱怨,怎么身体老出状况。是不是你中毒太深了呢?要知道体内的身体毒素不及时排毒会很要命。中医警示,赶紧排毒吧,12大体内毒素毒不死你!

   1、高血糖

    毒素症状:异常口渴,排尿次数和量增多,吃得多却日渐消瘦。

    毒素危害:糖尿病及其并发症,如糖尿病性神经病变,糖尿病性视网膜病变,糖尿病性肾病。


    2、尿酸

    毒素症状:大脚趾根部肿胀、疼痛、口渴、尿频。

    毒素危害:痛风、高尿酸血症、肾病、尿毒症。


    3、酒毒

    毒素症状:面红耳赤,脸色苍白,心悸,头痛,目眩,恶心,呕吐。

    毒素危害:酒精依赖症,酒精性肝炎,肝硬化。


    4、体内废气

    毒素症状:经常腹胀,而且放屁很臭。

    毒素危害:腹痛,溃疡恶化,皮肤老化,发生癌症的危险性增加。


    5、坏胆固醇

    毒素症状:初期没有自觉症状,出现黄色瘤(淡黄色的脂肪肿块)时可能已发展成为重症。

    毒素危害:动脉硬化,心胶痛,心肌梗塞,脑梗塞,血栓闭塞性脉管炎,胆结石。


    6、宿便

    毒素症状:天天排便仍有残便感,或长期一周内持续3天以上不排便。

    毒素危害:皮肤粗糙,腹胀,腹痛,大肠癌。


    7、乳酸

    毒素症状:身体沉重,肩膀和脖子酸痛,感到疲劳。

    毒素危害:风湿病,神经痛,发生癌症的危险性增加。


    8、自由基

    毒素症状:没有典型表现,对人体各部分都有损伤。

    毒素危害:全身各个器官老化,免疫力下降,易发生心脑血管疾病,糖尿病,癌症。


    9、淤血

    毒素症状:身体疼痛,手脚冰凉,女性表现为痛经和月经不调。

    毒素危害:身体各器官功能低下,子宫肌瘤,子宫内膜异位症,不孕症。


 
    10、水毒

    毒素症状:浮肿,眩晕,尿频,尿多。

    毒素危害:鼻炎,过敏性皮炎,体重增加,关节痛,不出汗或多汗症。


    11、内脏脂肪

    毒素症状:腹部很胖,呼吸困难,心率过速,注意力不集中,健忘。

    毒素危害:心肌梗塞,脑梗塞,糖尿病,肝硬变。


    12、浓稠的血液

     毒素症状:一般没有自觉症状,出现症状时往往已经发展成功脉硬化及其并发症。

     毒素危害:动脉硬化,血栓。

     由此看来,身体竟然存在这么多毒素,不及时排毒可是会有大麻烦。赶紧排毒吧!12大体内毒素毒不死你。


日期:2012年8月16日 - 来自[保健常识]栏目

核因子κB的结构和功能与内毒素介导的肝损伤的关系

【摘要】  核因子kappa B(NF-κB)是近年来研究极为广泛的核内转录调控因子,在细胞炎性反应、免疫反应以及细胞凋亡等过程中起着举足轻重的作用。NF-κB参与多种细胞因子及急性期反应蛋白转录活性的调控,在免疫和炎性疾病的启动中起重要作用。NF-κB在肝细胞有广泛的表达,调控的基因可编码多种细胞因子的转录,从基因水平参与肝组织炎症反应。笔者就近年来的研究对NF-κB生物学特性作一回顾,并对NF-κB的信号转导途径、其与肝组织炎症的关系、现有抑制NF-κB激活的药物和措施等作一综述。

【关键词】  核因子κB;肝脏;内毒素;炎性反应

[Abstract] Nuclear factor kappa B(NF-κB), an important transcription factor,has always been the focus for these years.It plays a pivotal role in inflammatory responses,immune reaction and cell apoptosis. As a proinflammatory transcription factor,NF-κB may trigger upregulation of cytokines and adhesion molecules,thereby initiating inflammatory responses.In addition to the roles on controllinggenes, NF-κB also has been suggested to play an essential role during the acute phase of liver injury.This review presents the recent research progression of NF-κB structure and function,furthermore,inhibitor and cotranscription factors of NF-κB together with the interaction between NF-κB. Study of NF-κB will be good for investigating the mechanism of inflammation and finding an effective means to protect liver.

  [Key words] NF-κB;liver;endotoxin; inflammatory reaction

  核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)是1986年由Sen和Baltimore 发现的,当时被认为是小鼠B淋巴细胞内的一个能与免疫球蛋白κ轻链增强子B位点特异结合的核蛋白因子,而该增强子调控Ig kappa轻链基因表达[1]。由于它具有明显的B细胞特异性,当时被认为是一种组织特异性的转录因子。实验还证明NF-κB是kappa轻链增强子活性维持的必需因子。现在,多数学者认为它是广泛存在于各种类型细胞中的核转录因子。作为一种快反应转录因子,NF-κB通过参与多种细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附因子、氧化应激相关酶等基因的表达,在免疫和炎症反应、细胞凋亡、肿瘤生长、细胞分化、应激反应中发挥着重要作用。

  1 NF-κB的分子生物学特性及信号转导途径

  1.1 NF-κB/Rel家族 NF-κB是一种具有转录激活功能的蛋白质,是真核细胞转录因子Rel蛋白家族的成员,包括5种:Rel-A(p65)、RelB、C-Rel、NF-κB1 (p105/p50)和NF-κB2 (p100/p52),它们具有高度的同源性,编码的蛋白与抑制因子IκB结合并相互作用。Rel 家族的许多成员都可与其他Rel 蛋白聚合成同型二聚体或异型二聚体,以形成具有序列特异性的DNA 诱导活性核因子以调节不同靶基因的转录。虽然不是所有的组合都能形成,而且不是所有组合都具有生理相关性,但还是发现了一些具有转录活性的kappa B二聚体,它们是relB/P50、relB/P52、P65/P50、P65/P65 和P65/c-Rel,另有可能包括P50/P50[2,3]。NF-κB二聚体的组成决定了其位点识别的特异性,即决定它与不同DNA序列结合的能力。通常所指的NF-κB 是由p65和p50组成的异源二聚体(p65/p50),它是NF-κB/Rel家族成员所形成的二聚体中最常见的一种,也是含量最丰富的一种,几乎存在于所有细胞中。

  NF-κB/Rel家族成员肽链N末端均含一段由约300个氨基酸残基组成的高度保守的Rel同源域(Rel-homology domain,RHD),其中含DNA结合功能域、二聚体化功能域及核定位信号(nuclear localization signal,NLS),分别具有与DNA序列上的κB基序(κB motif)结合、与同源或异源亚基形成二聚体、与NF-κB抑制蛋白(inhibitor-κbinding,IκB)家族成员结合的功能。而其羧基末端(C端)有显著的差异,据此可将Rel蛋白质分为两类:一类含有锚蛋白(ankyrin)重复序列,如P105和P100;另一类含有反式激活(transactivation,TA)功能域,如RelA、RelB 和C-Rel。

  1.2 I-κB家族 众所周知,相对分子质量为60 000~70 000的抑制因子IκB(inhibitor κB, IκB)在静息细胞内通过非共价键以非活性形式特异地与NF-κB 结合形成一个三聚体。目前已发现的IκB 有IκBα/MAD-3、IκBβ、P105/IκB-γ、P100/IκB-δ、IκB-ε、Bcl-3六种。现在公认IκBs的共同特点是N端为信号反应区,C端均含3~8个保守的锚蛋白重复域(ankyrin repeat domain,ARD),这是IκB与NF-κB/Rel家族成员RHD结合的结构基础[4]。IκB遮蔽着NF-κB的基因定位序列,阻止NF-κB二聚体进入细胞核内与DNA结合。

  1.3 针对NF-κB的调控

  1.3.1 NF-κB的激活因子 许多因素均有诱导NF-κB核移位和活化的作用,包括前炎性细胞因子(如TNF-α、IL-1等)、氧化剂、蛋白激酶C激动剂(如佛波醇酯)和血小板活化因子、免疫刺激剂(如植物凝集素)、病毒及其代谢产物、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、紫外线等。NF-κB一旦活化,即启动许多基因的转录,包括:(1)促炎因子:TNF-α、白介素(IL-1等);(2)趋化因子:IL-8、巨噬细胞炎症蛋白-1、2(MIP-1、MIP-2)和巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1);(3)粘附分子:细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管间粘附分子-1(VCAM-1)和E-选择素;(4)炎性酶:诱导型一氧化氮合酶、诱导型环氧化酶-2和磷脂酶A2;(5)集落刺激因子(粒细胞-CSF、粒、单核细胞-CSF)。因此,NF-κB是多种促炎症基因高度转录的必需因子[5],其在调控促炎症基因的合成和释放中起决定性作用。反过来,由NF-κB调节的产物,如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB,这意味着存在一个能放大且延续炎症反应的复杂的调节环路。NF-κB并不是调节这些炎症和免疫基因的唯一转录因子,但它与其他转录因子如活化蛋白-1(activator protein-1,AP-1)共同起着中心调节作用。因此,急性炎症反应时NF-κB的活化作为机体的应激反应对于防御外界的刺激如细菌感染是必需的,然而NF-κB 的不适当激活又会导致炎症反应的过度放大,损害组织器官。

  1.3.2 NF-κB的下调及灭活 大量入核的IκB在核内积聚,并通过与NF-κB的重新结合而抑制NF-κB与DNA的相互作用。NF-κB与IκB相互作用的位点范围非常广泛,其中NF-κB的二聚化结构域是IκBα的主要识别位点。NF-κB/IκB复合物在核转出信号(nuclear export signal,NES)[6]的介导下经核孔复合物(nuclear pore complex,NPC)从胞核转运回胞质。另外,在肝细胞中,NF-κB活性的下调可能还有一个重要方式:在核蛋白酶体的作用下,NF-κB被ATP依赖性蛋白酶部分水解,由p50/p65二聚体降解为p50/p35二聚体,这种新合成的二聚体虽然仍具有结合κB序列的能力,但其转录活性已经显著降低,从而使NF-κB信号转导通路介导的生物学效应显著地降低[7]。

  2 内毒素导致肝损伤的机制

  内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外膜中的脂多糖成分,由核心寡聚糖、O-特异性多糖与类脂A组成,类脂A为LPS的毒力中心。内毒素所致的肝细胞损伤主要是通过激活Kupffer细胞引发的。Kupffer细胞是肝内定居的巨噬细胞,作为局部和全身炎症反应的重要效应细胞,在肝脏的早期损害中发挥着关键性作用。一方面Kupffer细胞具有清除LPS的功能,另一方面大量内毒素可引起Kupffer细胞过度活化,导致大量炎症介质和细胞因子的合成及释放,从而介导并加剧肝损害。

  3 NF-κB与内毒素致肝损伤的关系

  3.1 NF-κB 在肝中的作用 NF-κB广泛存在于肝组织的多种细胞中,在肝实质细胞、内皮细胞、胆管上皮细胞和枯否细胞中均可检测到它的活性。在急慢性肝损伤中,乙醇、CCl4及(或)其代谢产物等肝细胞损伤因子可导致肝细胞损伤,肝脏KC活化,释放大量活性氧,诱导NF-κB的活化,NF-κB细胞核内移位,启动炎症因子的基因转录,进一步使炎症介质信号放大,故NF-κB可作为抗肝脏炎症反应的重要靶位。Hellerbrand等[8]通过对体外肝星状细胞(HSC)培养进行研究发现NF-κB DNA结合活性在活化的HSC中升高。研究显示,部分肝切除和TNF-α均能增强肝实质细胞NF-κB的DNA结合活性,在胚胎发生过程中NF-κB基因敲除会导致胚胎肝细胞广泛的凋亡。

  3.2 NF-κB 参与肝脏炎症反应 NF-κB作为炎症反应的转录因子,其活性的不适当或过度增强可引起如SIRS、败血症休克、急性呼吸窘迫综合征、局部缺血和再灌注损伤等许多与炎症相关的疾病。在对肝脏炎症损伤的研究中发现,NF-κB调控的基因产物参与了肝脏炎症、肝纤维化、肝细胞再生和凋亡等病理生理过程,尤其是在肝脏炎症的发生发展过程中,NF-κB的活性显著增强。在炎症反应中,NF-κB是一个快速反应的转录因子, 调控的基因可以编码多种细胞因子(如TNF-α,β),而NF-κB通过调控它们的转录过程,直接参与肝脏的急性和慢性炎症。有研究证实[9],脓毒症患者NF-κB活性增高,且临床表现的严重程度及病死率与核内NF-κB水平有很大相关性。抑制NF-κB活性可减缓急性炎症过程的进展,改善预后。Altavilla等[10]的一项研究表明,在低血容量休克中,炎症导致最终致命结果的“扳机点”是NF-κB的早期活化。Paterson等[11]比较了完全符合SIRS标准的患者与健康志愿者0、24h、48h和72h NF-κB的活性,发现SIRS患者外周血中性粒细胞和单核细胞NF-κB的活性显著高于健康志愿者,IL-6、IL-8和sICAM-1也明显增高,而且败血症患者单核、中性粒细胞的NF-κB活性与其病死率有相关性,提示NF-κB活性在炎症早期尚未达到SIRS临床诊断标准时就已明显升高,因此有可能作为SIRS和败血症的早期实验室诊断指标,并可提示患者的预后。

  4 NF-κB拮抗措施在治疗肝脏炎症方面的应用

  NF-κB是核内炎性递质基因转录的开关,通过阻断NF-κB的激活,可对细胞因子的释放进行宏观调控。故以干预NF-κB激活途径、减少炎症介质的生成为目标的治疗策略,可减轻机体的组织损伤和器官功能紊乱。由于活性氧被认为是引起NF-κB激活的重要中介分子,所以抗氧化剂被作为NF-κB抑制剂而得到深入的研究。在大鼠内毒素模型中,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)及吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)均具有拮抗NF-κB的作用,从而减轻SIRS的炎症过程。NAC可阻断NF-κB的P50、P65亚基向细胞核转移, PDTC可抑制IκB从NF-κB二聚体上解离出来,从而分别发挥抗NF-κB的作用[12]。其他抗氧化剂,如维生素E衍生物、硒蛋白、抗坏血酸、二甲基硫氧化物和S-丙烯基半胱氨酸等也能抑制NF-κB的活化[13]。非甾体类抗炎药(non - steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)是目前广泛应用的治疗各种炎症和疼痛的药物,有研究表明NSAIDs中的水杨酸盐和阿司匹林可通过阻止IκBα磷酸化及蛋白水解抑制NF-κB的活化,并有明显的剂量依赖性,其他NSAIDs,包括布洛芬、R-和S-型氟比洛芬,以及舒林酸等也可抑制NF-κB活化。糖皮质激素也是治疗与免疫和炎症反应有关的相关疾病的手段之一,但因其副作用过多大大限制了其应用。其他内源性抑制物,如抗炎细胞因子IL-4和IL-10可以抑制NF-κB的活性。另外,目前基因反义技术与圈套技术(decoy)也因直接着眼于基因调控,在多项研究中观察到了较好的治疗效果。

  5 展望

  活化的NF-κB在内毒素血症信号转导通路中处于枢纽位置。NF-κB的激活促进大量炎症介质释放,后者反过来又促使NF-κB 进一步活化,如此恶性循环势必加重肝脏炎症反应。另有研究证实,NF-κB 通过上调抗凋亡基因转录等机制拮抗细胞凋亡,减轻肝脏的炎症反应。因此,NF-κB 具有多向调节作用。越来越多的事实证明,NF-κB在全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS) 等疾病的病理生物学过程中有着重要作用。作为一种重要的转录因子复合物,其参与的炎症反应是机体进行正常防御和修复的重要机制。因此,从理论上运用各种手段在危重病早期对NF-κB水平进行监测,并对产生炎性因子的总体环节进行控制均可对相关疾病达到一定的治疗效果,但NF-κB可能只是其中的一个重要因素。随着研究的深入,NF-κB的相关作用将更全面而深入地展现在我们面前,如何根据其作用的特点调控其表达,从而预防内毒素血症休克的发生仍有待研究。

【参考文献】
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  13 Christman JW,Lancaster LH,Blackwell TS.Nuclear factor kappa B:a pivotal role in the systemic inflammatory response syndrome and new target for therapy.Intensive Care Med,1998,24(11): 1131 -1138.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2010年第8卷第1期]栏目
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地佐辛注射液细菌内毒素检查方法学验证

【摘要】  目的 对地佐辛注射液细菌内毒素的检查方法进行干扰试验验证。方法 采用《中国药典》2005年版二部附录XIE的凝胶法。结果 地佐辛注射液稀释至浓度为0.025mg/ml时对试验无干扰作用。结论 该方法有效可行,可用于该品种的细菌内毒素检查。

【关键词】  地佐辛注射液;细菌内毒素;凝胶法;干扰试验验证

 地佐辛(dezocine)是一种强效阿片类镇痛药,能缓解术后疼痛,其镇痛强度、起效时间和作用持续时间与吗啡相同,成瘾性小,皮下、肌肉注射吸收迅速,肌注30min内生效,静注15min内生效。为探讨地佐辛注射液细菌内毒素检查方法的可行性,笔者采用凝胶法进行了一系列试验,现将结果报告如下。

  1 仪器与试药

  1.1 仪器

  ZH-2型自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂);DC-3A型干式恒温器(南京三爱斯技术开发有限公司); LC-233B1鼓风干燥箱(上海爱斯佩克环境设备有限公司)。

  1.2 试药

  细菌内毒素检查用水(BET水)[批号:0912020,规格:50ml/瓶,来源:湛江安度斯生物有限公司]、细菌内毒素工作标准品(CSE)[批号:150601-200964,效价:160Eu/支,来源:中国药品生物制品检定所]、鲎试剂(TAL)〔批号:0911021(λ=0.125Eu/ml,干扰预试验用)、0911062(λ=0.25Eu/ml,正式干扰试验用),规格:0.1ml/支,来源:湛江安度斯生物有限公司〕、地佐辛注射液〔批号:09092701、09092801、09092901,规格:1ml:5mg,来源:扬子江药业集团有限公司〕。整个试验过程应防止微生物污染,所用器械应经处理,保证无外源性物质干扰[1]。

  2 方法[1~3]与结果

  2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

  用BET水将CSE稀释成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ 4个浓度的内毒素标准溶液,每一浓度稀释液平行做4管,依法进行试验。结果表明上述两个批号的TAL的复核灵敏度与标示灵敏度相符,均在0.5~2.0λ范围内,可用于试验。

  2.2 供试品干扰试验预试验[4]

  本品标准中规定限值L为“每1mg细菌内毒素应不得过10Eu”,其规格为5mg/ml,即原液浓度为50Eu/ml。 由于目前市售鲎试剂的灵敏度为0.5~0.03Eu/ml之间,则供试品的最大有效稀释倍数(MVD)= CL/λ =100~1666之间,对应于灵敏度(λ)为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03Eu/ml,采用不超过最大有效稀释倍数即原液稀释为100、200、400、833、1666倍的溶液(供试品浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 Eu/ml)作为供试品溶液;另制备同样系列浓度的供试液,并使每一供试液均含有2λ(0.25 Eu/ml)浓度的内毒素溶液作为供试品阳性溶液。取λ为0.125Eu/ml的鲎试剂,分别与上述两个系列溶液反应,每个浓度平行2管。同时分别取2支鲎试剂加入BET水作为阴性对照,取2支加入2λ(0.25Eu/ml)内毒素溶液作为阳性对照。结果见表1。表1 干扰试验预试验结果

  2.3 供试品干扰实验

  取灵敏度(λ)为0.25Eu/ml的鲎试剂进行正式干扰试验,则供试品最大有效稀释倍数(MVD)= CL/λ =200倍。用BET水将地佐辛注射液稀释至0.5Eu/ml、0.25Eu/ml的两个不同浓度溶液作为供试品溶液。另取一支细菌内毒素标准品,加入1.0ml BET水使溶解,用封口膜将瓶颈封严,置漩涡混合器上混合15min,然后用BET水依次稀释至1.0、0.5、0.25、0.125、0.06(Eu/ml)的不同浓度溶液,其中0.5、0.25、0.125、0.06(Eu/ml)的浓度溶液作为Es系列溶液。再取1.0、0.5、0.25、0.125(Eu/ml)的Es系列溶液分别与0.5Eu/ml的供试品溶液1:1混合,作为Et系列溶液。取鲎试剂36支,分别用0.1ml的BET水复溶后,加入上述Es、Et系列溶液各0.1ml,每个浓度平行4管,同时取2支鲎试剂加入BET水作为阴性对照,取2支加入0.25 Eu/ml的供试品溶液作为供试品阴性对照,置(37±1)℃保温(60±2)min后观察,结果见表2。表2 干扰试验结果

  2.4 供试品细菌内毒素检查

  取本品,按照《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法,选用灵敏度(λ)为0.25 Eu/ml的鲎试剂依法检查,结果见表3。说明地佐辛注射液的细菌内毒素检查结果均小于10Eu/mg。表3 干扰试验结果

  3 讨论

  凝胶法是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机制,通过采用翻转180°的目测方法来判断终点。此方法操作简单、经济、快速。供试品预干扰试验的目的是通过对一系列含2λ细菌内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂反应,初步筛选出对鲎试验无干扰的样品浓度范围,可大大降低试剂的消耗,节省时间,减少干扰试验的盲目性。表1结果说明,样品的浓度在稀释100~1666倍时,对细菌内毒素检查法均无干扰作用。表2、表3结果说明,当供试品的浓度稀释至200倍时,采用灵敏度(λ)为0.25Eu/ml的鲎试剂对地佐辛注射液(1ml:5mg)的细菌内毒素进行检查,该方法可行。

【参考文献】
   1 国家药典委员会.中国药典,2005年版,二部.北京:化学工业出版社,2005,附录ⅪE85.

  2 中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范.北京:中国医药科技出版社,2005,267-269.

  3 熊向党,冯聚锦,韦群.细菌内毒素检测技术与应用.湛江安度斯生物有限公司,2007,6(1):13-19.

  4 戴艳,吉同琴,陈祥峰.注射用兰索拉唑细菌内毒素检查法.中国药师,2009,12(1):122-123.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2010年第10卷第7期]栏目

动态浊度法测定精氨酸中细菌内毒素的含量

【摘要】  目的 考察精氨酸细菌内毒素的定量分析方法。方法 按《中国药典》2005年版二部收载的动态浊度法进行试验。结果 将精氨酸配制成12.5mg/ml的溶液时进行定量测试效果满意。结论 可以用细菌内毒素定量测试浊度法替代家兔热原法来控制精氨酸的质量。

【关键词】  精氨酸;动态浊度法;细菌内毒素

精氨酸为氨基酸类药,主要功能为营养支持剂。标准采用家兔法检查其热原[1],本文采用检测细菌内毒素的动态浊度法,对精氨酸进行添加内毒素回收试验及与家兔热原法比较,初步建立了精氨酸的细菌内毒素定量检查方法,用于替代传统的家兔热原法。现小结如下。

  1 实验材料

         精氨酸:原料药,批号09011001、09011002、09011003(石家庄精晶药业有限公司,热原检查合格);细菌内毒素工作标准品,批号:150601-200862,效价120EU/支(中国药品生物制品检定所);鲎试剂(TAL)批号0901162、0806272,灵敏度(λ)为10~0.03EU/ml(湛江安度斯生物有限公司);细菌内毒素检查用水(BET水)批号090270,内毒素含量≤0.015EU/ml(湛江安度斯生物有限公司);EDS-99细菌内毒素测定系统(湛江正杰科学仪器有限公司)。

  2 方法与结果

  2.1 精氨酸的细菌内毒素限值(L)的计算[1] 根据精氨酸注射液的用法用量说明,其成人每次最大用量为10~20g,分4h滴完。精氨酸成人的最大用量为83mg/(kg·h),人体致热阈值 (K):5.0EU/kg,则精氨酸的L为:K/M=0.06EU/mg,结合精氨酸的热原剂量:(50mg/ml的溶液,10ml/kg),计算其L值为0.01EU/mg,考虑到安全因素,笔者认为规定精氨酸的L值以0.01EU/mg较为合理。

  2.2 细菌内毒素标准曲线的制备 取细菌内毒素工作标准品1支,用BET水将内毒素进行2倍稀释,使其最终浓度分别为1.0、0.5、0.250、0.125、0.0625、0.0312EU/ml的稀释系列,各取0.1ml分别加到预先加有0.1ml TAL的反应管内,混合均匀,插入EDS-99细菌内毒素测定系统内进行检测,每个浓度重复3管,结果见表1。标准曲线回归方程为:lgT=2.7416-0.3350lgC,r=-0.9887(>0.98),最低浓度为0.031EU/ml,且空白对照管的平均反应时间>3600s在检测时间外,因此标准曲线成立。表1 细菌内毒素标准曲线的制备

  2.3 内毒素回收试验 取精氨酸用BET水溶解,并分别稀释成每1ml溶液中含精氨酸50、25、12.5、6.2、3.1mg的溶液,记为Ai液;同时另取5管,进行同样的稀释,并在稀释液中添加内毒素浓度为0.25EU/ml的细菌内毒素标准溶液,记为Bi液,进行回收率试验。分别取上述各液0.1ml加入预先加有0.1mlTAl的反应管中,混合均匀,插入仪器内进行测定,每个浓度重复2管,计算平均回收率,结果见表2。表2 回收率试验(样品批号:09011001,n=2)

  2.4 干扰试验及样品内毒素测定 取3批精氨酸分别用BET水稀释成含12.5mg/ml的溶液,按“2.3”项方法进行试验,结果见表3。表3 精氨酸干扰试验及样品测定

  3 小结

  3.1 从表2精氨酸的干扰试验结果表明:样品在稀释成50mg/ml时已无干扰,而在12.5mg/ml时有更好的回收率。因此在日常检测时,选择12.5mg/ml浓度的溶液作为供试液。

  3.2 表3结果表明,3批样品浓度在12.5mg/ml时进行干扰试验及定量测试,结果内毒素回收率均在50%~200%范围内,样品的内毒素含量均小于0.00248EU/mg(0.031EU/ml/12.5mg/ml),样品内毒素含量符合规定。

  3.3 精氨酸中细菌内毒素定量检测的方法:取本品,用BET水溶解并稀释成每1ml中含精氨酸12.5mg的溶液,按《中国药典》2005年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法进行检查,每1mg精氨酸中含细菌内毒素的量不得过0.01EU。

  3.4 传统的家兔热原法操作繁琐费时,且影响的因素多,细菌内毒素凝胶法又只是一个限度检查,而定量法测定细菌内毒素的优点在于,能较正确地反映样品中内毒素的真实含量,且具有更低的检测下限,该方法值得推广应用。

【参考文献】
    1 国家药典委员会.中国药典,二部.北京:化学工业出版社,2005,831;附录85-88.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2009年第9卷第8期]栏目
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关于鲎试剂在细菌内毒素检查法中使用的探讨

【摘要】  鲎试验因其简单﹑快速﹑灵敏﹑准确的特点,被世界各国广泛采用,中国药典和欧美药典将其定为法定的细菌内毒素检查法,大范围地替代了热源检查法。为了确保其检查结果的准确性,本文对鲎试剂的使用进行了探讨,以规范鲎试剂的正确使用。

【关键词】  鲎试剂;细菌内毒素检查法

 【Abstract】 TAL reagent test because of its simple, fast and accurate characteristics was widely adopted around the world. Chinese Pharmacopoeia, European and the United States Pharmacopoeia set it as the statutory bacterial endotoxins test, replaces the pyrogen test on a large scale. In order to ensure the accuracy of test results, the main discussion of this paper is the use of tachypleus tridentatus leach(TAL),to regulate the proper use of TAL.

  【Key words】 TAL;bacterial endotoxins test

  1 鲎试剂的分类

  鲎试剂是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物,经低温冷冻干燥而成的生物试剂,专用于细菌内毒素检测。

  1.1 按原料来源分 一种是由美洲鲎血液提取的称美洲鲎试剂(Limulus Amebocyte Lysate),缩写为LAL,由美国生产;另一种是由东方鲎血液中提取的称东方鲎鲎试剂(Tachypleus Amebocyte Lysate),缩写为TAL。TAL与LAL有相同的功效。

  1.2 按实验方法分 细菌内毒素检查法包括两种方法,即凝胶法和光度测定法,后者又包括浊度法和显色基质法[1]。则鲎试剂可分为:凝胶法鲎试剂、动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂。

  凝胶法鲎试剂通过与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素的方法。

  动态浊度法鲎试剂、终点浊度法鲎试剂、动态显色法鲎试剂和终点显色法鲎试剂则都是定量检测内毒素的。

  1.3 按使用特点分

  1.3.1 普通鲎试剂 灵敏度0.5~0.125EU/ml,适用于仅需要检测内毒素限量的样品。

  1.3.2 高灵敏度鲎试剂 灵敏度0.06~0.015 EU/ml,适用于内毒素限量较低的样品细菌内毒素检查。

  1.3.3 特异性鲎试剂 灵敏度0.5~0.015EU/ml,适用于成分较为复杂,会对鲎试剂产生干扰的样品[2]。

  1.3.4 定量法鲎试剂 最低检测限0.03~0.005 EU/ml,适用于需要对内毒素进行定量测定的样品。

  2 鲎试剂在细菌内毒素检查法中的正确使用

  内毒素检查法结果准确与否与所用鲎试剂的灵敏度相关性很大[3],而鲎试剂的灵敏度与它的正确使用又密切相关。所以,一定要严格执行鲎试剂的质量标准,规范使用鲎试剂。

  2.1 保证所使用鲎试剂的质量 鲎试剂的质量主要表现在其灵敏度、自凝时间与成胶状态三个方面:灵敏度稳定;自凝时间不低于24h[4];具有一定的缓冲能力与合适的pH;反应后即形成坚实凝胶,将成胶安瓿翻转180°而不会被破坏。而质量稍差的鲎试剂存放一定时间后(如半年)其灵敏度可能发生变化,而灵敏度的改变会使测定结果所反映的供试品中内毒素的允许限值发生变化[5]。因此,需选择具有国家颁发的批准文号,质量稳定的鲎试剂。

  2.2 对鲎试剂灵敏度进行监测性复核 由于不同厂家鲎试剂质量不尽相同,即便是相同厂家不同批号的鲎试剂也有差异,这便导致鲎试剂灵敏度复核值与标示值不尽一致,因此鲎试剂的复核值对检测结果有显著影响[6]。每使用新批号鲎试剂时应复核其灵敏度;对留样鲎试剂自生产之日起,每6个月进行一次灵敏度检测,其灵敏度在有效期内应符合规定。有研究表明,鲎试剂的灵敏度在符合标准规定及适当的贮存条件下,3年内其灵敏度变化不大,是稳定的。建议可适当延长其有效期[7,8]。因此,对鲎试剂灵敏度进行监测性复核有利于确保实验的准确性,同时可以最大程度地使用鲎试剂。

  2.3 使用过程正确操作 选择合适的操作方法与顺序,在鲎试剂的使用过程中尤为重要。在操作过程中要注意以下几点:(1)实验室要求洁净、无尘埃流通;检验人员同时注意卫生的保持。在整个使用操作过程中应防止微生物的污染,例如空气的流动,人员的口沫、汗液污染等。(2)鲎试剂开启、溶解和配制时应尽量避免将安瓿外瓶壁脏物、瓶壁碎片、砂轮锯屑等异物混入鲎试剂中,避免鲎试剂外损。(3)鲎试剂中含有多种蛋白质,用力振摇会产生气泡,一旦起泡难以消除,而影响检测的准确性,所以在整个操作过程中都要轻力以避免因过分震动而引起的误差。(4)量取和加样反应物时,一定要加到试管底部接近鲎试液而不接触鲎试液的管壁处。(5)生成凝胶的最适pH值为6~8,对于氯化钠注射液、葡萄糖注射液(5%,10%)等注射液,不需考虑供试液的pH值,而检查其他制剂时,尤其是一些本身缓冲能力较强或偏酸、碱的供试品,应考虑供试品的pH值[5]。(6)使用时要严格控制温度和时间。当鲎试剂一加入内毒素及样品混合液中时反应已开始,并在一定的温度范围内,反应温度越高,反应速率越大;保温时间的增长,也会提高鲎试剂的灵敏度,增加假阳性的发生[9],导致较大误差。因此,要注意控制温度的变化和保温时间。(7)保持实验器具的洁净。每次检验完毕,应及时将玻璃器具充分清洗后于250℃干热灭菌处理,待烤箱温度升至设定的温度后开始计时,干烤至少1h[10]。也可用其他经确证不干扰细菌内毒素的检查的适宜方法。对于塑料、橡胶等不耐热器材可用30%双氧水浸泡4h,用无热原水冲洗,70℃干燥备用。

  2.4 鲎试剂的贮存 虽然冻干的鲎试剂在常温条件下是相对稳定的,但还是应存放在2℃~8℃下,避免长时间放置在高于25℃的温度条件下导致因贮藏不当、质量下降而引起的检验误差。

  3 建议

  3.1 一般中草药注射液由于成分复杂,以及含糖注射液中常含有β-葡聚糖[11],使其干扰因素较多。而使用特异性鲎试剂,可利用其能够屏蔽β-葡聚糖引起的鲎试剂凝聚反应,仅与内毒素反应的原理,以消除干扰[12~14],从而减少或消除假阳性反应[15]。

  3.2 当夏天室温较高时,控制鲎试剂使用过程中温度的变化,可通过在冰水浴中进行加样以取得较好效果;同时,实验操作从鲎试剂的复溶到放入恒温仪应尽量在1.5h内完成。

  3.3 虽然目前的鲎试剂相对稳定很多,但还是应存放于2℃~8℃的条件下,并保持温度的稳定,如冰箱发生故障,无法保持温度时,就应及时更换贮存设备。

  3.4 对于已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放置在冰冷的表面上或于2℃~8℃的冰箱内存放24h以内;亦或在复溶并冻结后将其存放在-20℃以下,可存放28天,但只能冻融一次。

【参考文献】
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