【摘要】 目的：通过测定成人原发性肾病综合征（AINS）患者的UOSM、尿β2-MG，探讨肾小管功能与激素敏感性之间的关系。方法：采用前瞻性研究将68例AINS患者根据治疗前UOSM和尿β2-MG所测数据分为4组并给予激素治疗，通过比较各组治疗前后UOSM和尿β2-MG的变化探讨对激素的敏感性。结果：1. 肾小管间质病变有随蛋白尿时间延长而加重的趋势。2. B组患者治疗后尿β2-MG降低（P<0.05），UOSM无变化（P>0.05）；C组患者治疗后UOSM升高（P<0.05），尿β2-MG无变化（P>0.05）；A组、D组两项数据治疗前后均无差异（P>0.05）。3. A、B、C组的完全缓解率高于D组（P<0.05），UOSM降低、尿β2-MG升高是激素不敏感的危险因素。结论：UOSM、尿β2-MG数据可作为预测AINS患者对激素是否敏感的依据，且UOSM优于尿β2-MG。
【关键词】 尿渗透压；尿β2-微球蛋白；肾小管功能；激素；敏感性
The relationship between the renal tubular function and the sensitivity of glucocorticoid in the patients of ains
CHEN Jing, XIAO Qing,ZHANG Xi-Yan,et al
1. Weifang medical university, Shandong 261031, China; 2. The affiliated hospital of Weifang medical university
【Abstract】Objective：To investigate the relationship between the renal tubular function and the sensitivity of glucocorticoid in adult patients with idiopathic nephrotic syndrome. Methods:In a prospective study, sixty-eight patients of AINS were divided into four groups by urinary beta 2-microglobulin and urinary osmolality determined before curing. And the two indexes were compared before and after thempy.Results: 1、Tubulointerstitial lesions would be from bad to worse. 2、Urinary beta 2-microglobulin was decreased significantly in B group, urinary osmolality was increased significantly in C group (P<0.05) . The two indexes were no differences in A、D group(P>0.05).3、The rate of fully remission in A、B、C group is higher than D group(P<0.05).Conclusions: Determination of UOSM and urinary β2-MG may predict the sensibility of the therapy in adult patients with initially nephrotic syndrome, and UOSM is better.
【Key words】Urinary osmolality; Urinary beta 2-microglobulin; The renal tubular function; Glucoco
近年来，原发性肾病综合征肾小管间质病变(TIL)受到广泛重视，肾小球疾病临床病理研究发现肾小球疾病的发展和预后不仅与肾小球本身的损害有关，更与其肾小管间质病变的严重程度密切相关，准确判断肾小管间质的病变程度对于全面了解病情、预测疾病发展、指导临床治疗均有重要意义［1,2］。有研究认为尿液中的某些肾小管损伤的标记物可以用作肾病综合征激素治疗是否敏感的检测手段［3］，这在一定程度上弥补了肾活检的不足，是病理诊断的重要补充。但是，这些研究均偏重于反应近曲小管损伤的指标，对于反应远曲小管损伤的指标报道较少，且对后者存在争议。本研究对2007年3月至2008年8月在我院住院诊断为AINS的68例患者，检测其尿渗透压（UOSM）、尿β2-微球蛋白（β2-MG），了解AINS患者肾小管的病变程度，并探讨AINS患者肾小管功能与激素的敏感性之间的关系。
1 资料及方法
1.1 研究对象
本研究共观察68例患者，其中男性34例，女性34例，年龄18~60岁，平均（41.76±13.69）岁。原发性肾病综合征的诊断参照国内标准［4］：①大量蛋白尿（尿蛋白多于3.5 g/d），低蛋白血症（血浆白蛋白低于30 g/L），水肿（可轻可重，重时常伴体腔积液），高脂血症（血清胆固醇和/或甘油三脂增高），其中大量蛋白尿、低蛋白血症为必备条件。②排除全身系统性疾病及先天遗传性疾病所致的继发性肾病综合征。同时符合以下标准方可纳入：①年龄在18～60岁；②尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）均正常；③入院前未接受激素治疗以及在激素减量或停药的过程中复发的病例；④在外未用过非激素类消炎药及血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂；⑤所有病例采集标本时均无感染征象，血常规白细胞在正常范围。
1.2 病例分组
依据68例AINS患者治疗前所测UOSM和尿β2-MG数据，将两项均正常者编为A组；UOSM正常而尿β2-MG异常者编为B组；UOSM异常而尿β2-MG正常者编为C组；两项均不正常者编为D组。
1.3 治疗方案
所有患者均给予强的松治疗，初始剂量为1 mg/（kg·d），最大剂量为60 mg/d，清晨一次顿服，连续用药8周，激素减量参照国内标准［4］，同时给予降脂、抗血小板聚集、抗凝等治疗。
1.4 检测指标及方法
用药前及应用强的松治疗8周后分别检测UOSM、尿β2-MG、24 h尿蛋白定量。
1.4.1 尿渗透压
患者晚10时～次日晨6 时禁水8小时后，取晨尿2 ml。应用BS-88全自动冰点渗透压计（上海医科大学仪器厂生产）测定。
1.4.2 尿β2-微球蛋白
患者晨起排空尿液，空腹饮300～500 ml水，1小时后留取尿液2 ml置4 ℃以下保存，待送检。留尿送检期间口服碳酸氢钠以确保尿pH>6.0。检测方法为化学发光法，采用美国雅培AXSYM测定。
1.4.3 24 h尿蛋白定量
嘱患者留取24 h尿，记录总尿量，混匀后取2 ml送检。采用全自动血生化分析仪（日本OLYMPUS AU-600）测定，试剂盒购自利德曼生化技术有限公司。
1.5 疗效评定标准
参照国内肾脏病诊断与治疗及疗效标准专题讨论纪要［5］：①完全缓解：尿蛋白定量≤0.2 g/d，血浆白蛋白≥35 g/L，NS表现完全消除；②显著或部分缓解：尿蛋白≤3.0 g/d，白蛋白有改善；③无效：尿蛋白及血白蛋白与治疗前比较无大改变，肾病综合征临床表现未消除。
1.6 统计学处理
数据采用x±s表示，采用x2检验、t检验等方法，应用SPSS 16.0统计学软件处理。
2 结果
2.1 治疗前后UOSM、尿β2-MG的比较
A、B、D组患者治疗前后UOSM比较无差异（P>0.05）。C组患者治疗后UOSM升高，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）。A、C、D组患者治疗前后尿β2-MG比较无差异（P>0.05）。B组患者治疗后尿β2-MG降低，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。表1 各组患者治疗前后尿OSM、尿β2-MG比较（略）
2.2 治疗后疗效分析
A、B、C组的完全缓解率高于D组，经Fisher’s Exact Test检验差异有统计学意义（P<0.05）。以UOSM降低预测激素的敏感性，x2=13.64（P<0.05），OR值为6.64，其95%置信区间为2.3~19.19，以尿β2-MG升高预测激素的敏感性，x2=7.25（P<0.05），OR值为3.83，其95%置信区间为1.4~10.45，见表2。表2 各组患者治疗后疗效统计（略）
2.3 预测激素疗效的相关指标
以UOSM和尿β2-MG为指标预测激素疗效，其敏感性、特异性等指标见表3。表3 以尿β2-MG和尿UOSM预测激素疗效的相关指标（略）
3 讨论
肾穿刺病理检查结果显示大多数肾病综合征的病变并非局限于肾小球，肾小管间质也同样受到累及。国内外的研究表明：通过对尿液中反应肾小管功能指标的检测，可早期发现肾小球疾病患者肾小管-间质的损害［6］，预测常规检测肾功能正常的肾小球疾病发展为慢性肾功能衰竭的危险，并能预测对药物的治疗反应［7］。其检测方法简单，还能进行动态观察。本研究主要检测AINS患者UOSM、尿β2-MG在治疗前后的变化，其中UOSM反应远曲小管对水的浓缩功能，尿β2-MG反应近端肾小管的重吸收功能。
根据我们对治疗前后UOSM、尿β2-MG的变化以及缓解率的统计，提示肾小管功能正常的AINS患者，对激素敏感，完全缓解率最高；存在肾小管功能损伤的AINS患者，若肾小管损伤轻微，经激素治疗后肾小管功能可以恢复正常，完全缓解率较高；若肾小管损伤严重者，对激素治疗反应差，长期预后亦差。因此，肾小管损害的程度与激素的疗效有关，UOSM、尿β2-MG可作为预测AINS患者对激素敏感性的依据，且UOSM的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比等指标优于尿β2-MG。
同时根据我们的结果，D组病程明显长于其余各组，其近端小管、远端小管均受到累及，提示肾小管功能损害有随蛋白尿时间延长而加重的趋势，因此AINS患者应尽早治疗，同时对于提示激素治疗不敏感的患者应早期合用细胞毒药物，以减少蛋白尿对肾小管上皮细胞的毒性作用［8］。
同时，我们对部分患者进行了肾组织活检，结果如下：4例表现为微小病变性肾病（MCD），其中2例合并肾小管间质病变，治疗后1例部分缓解，1例无效；2例未合并肾小管间质病变，均完全缓解。2例表现为膜增殖性肾小球肾炎（MPGN），均合并肾小管间质病变，治疗后1例完全缓解，1例部分缓解。3例表现为系膜增生性肾小球肾炎（MSPGN），均合并肾小管间质病变，治疗后1例部分缓解，2例无效；1例表现为膜性肾病（MN）合并肾小管间质病变，治疗后无效。由此看出AINS患者肾小管间质损害的程度与肾小球病变的类型和严重程度有关［9］，如MCD的肾小管间质病变可以不显著，而FSGS、MN的肾小管间质病变往往比较严重。虽然肾活检是了解肾小球和肾小管间质病变的最好办法，但它毕竟是一种创伤性检查，具有一定的风险性，很难用来动态监测，且由于技术、设备、经济等原因，许多医院不能用作常规检查。笔者认为，在无肾穿刺活检病理检查的情况下，可以用UOSM、尿β2-MG作为预测AINS患者对激素是否敏感的依据。对于提示激素不敏感的患者，应早期合并使用细胞毒类药物并避免长期、大量的应用激素，既可以减少激素不良反应，又可延缓进行性肾损伤、维持良好肾功能。
【参考文献】
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作者单位：1.潍坊医学院内科教研室，山东 潍坊 261031；2.潍坊医学院附属医院肾内科
ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1表达的影响①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：程庆砾 陈香美 傅博 叶一舟
单位：程庆砾（解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853）；陈香美（解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853）；傅 博（解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853）；叶一舟（解放军总医院肾科肾病中心暨重点实验室 北京100853）
关键词：细胞间粘附分子-1；反义核酸；上皮细胞；细胞转染；肾脏
摘 要：目的：探讨ICAM-1反义寡核苷酸对小鼠肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响，为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物治疗肾小管间质病变奠定基础。方法：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物参照文献合成并行全硫代磷酸化修饰。部分ICAM-1反义寡核苷酸在其5′端作FITC荧光标记。将ICAM-1反义寡核苷酸单独或脂质体转染试剂DOTAP混合后转染至培养的肾小管上皮细胞之中，转染成功后加入IL-1β诱导细胞产生ICAM-1。采用对照寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。利用免疫组化染色的方法检测细胞ICAM-1表达变化并提取细胞总RNA行逆转录PCR及Northern杂交观察ICAM-1 mRNA的表达的变化。结果：两个不同浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达；对照的寡核苷酸不能减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达。结论：小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可明显抑制IL-1β诱导的小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA 的表达，提示ICAM-1的反义寡核苷酸有可能应用于肾小管间质病变的实验治疗之中。
分类号：R692.6
Inhibition of ICAM-1 expression in renal tubular epithelial cells with ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide
CHENG Qing-Li
（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）
CHEN Xiang-Mei
（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）
FU Bo
（Department of Nephrology,General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100853）
Abstract：Objective：The blocking effects in ICAM-1 antisense oligodeoxynucleotide （ASON） on the ICAM-1 expression of renal tubular epithelial cell was investigated to probe the potential applicability of the ASON drug in renal tubulointerstitial diseases.Methods:The mouse ICAM-1 ASON was transducted into the mouse renal tubular epithelial cells with the presence of liposome DOTAP.Another oligodeoxynucleotide,which has the same base composition as the ICAM-1 ASON but a different sequence,was also transfected into the cells as a control.ICAM-1 expression of the epithelial cells was induced by interleukin-1.The changes of ICAM-1 protein expression by the cells were measured by immunohistochemistic stainging with anti-ICAM-1 antibody.ICAM-1 mRNA expression of the epithelial cells was examined by RT-PCR and Northern blotting methods.Results：①ICAM-1 ASON inhibited the ICAM-1 and ICAM-1 mRNA expressions of the epithelial cells induced by IL-1 at dosages of both 100 and 200 nmol/L.②The control oligodeoxynucleotide has no effect on the ICAM-1 expression of the epithelial cells.Conclusion:These data demonstrate that ICAM-1 ASON can selectively inhibit the ICAM-1 expression of the cells.It suggests that the ICAM-1 ASON might be applied in treatment of renal tubular interstitial diseases.
Key words：ICAM-1 Antisense Epithelial cell Transfection Kidney▲
细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）是介导细胞与细胞之间粘附的重要生物分子，其在机体的炎性病变中起着十分重要的作用。目前的研究发现ICAM-1的拮抗物可以有效地阻断ICAM-1介导的细胞间的粘附及炎症发生［1，2］。近几年，随着反义寡核苷酸类药物的开发成功，利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物阻断细胞内ICAM-1 mRNA的表达，抑制体内ICAM-1的过度表达，已见文献报道［3，4］，但ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响尚未有研究报道。国外的研究和我们的前期研究均表明肾小管上皮细胞在缺氧［5］、缺血及炎症因子［6］的诱导下细胞膜上ICAM-1的表达可以明显增强，缺氧损伤的上皮细胞进而还可诱导肾小管间质成纤维细胞的增殖及ICAM-1表达的增强［7］，这些病理生理改变在肾小管间质炎症病变及间质纤维化病变中起着十分重要的作用。为利用ICAM-1反义寡核苷酸类药物实验性治疗肾小管间质病变，本研究探讨了ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 NIH雌性小鼠，重18～22 g，由解放军总医院医学实验动物中心提供。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物均由Cybersyn公司合成并行全硫代磷酸化修饰。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸及其对照物的序列参照文献［3］合成。小鼠ICAM-1反义寡核苷酸序列为：5’-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3’；其对照物的序列为：5’-TCGCATCGACCCGCCCACTA-3’。IL-1β（10 000 U/ml）为邦定公司产品。细胞转染试剂DOTAP为Boehringer Mannheim公司产品。小鼠ICAM-1的3条引物序列分别为：Sense:5’-CAACTGGAAGCTGTTTGAGCTG-3’；Antisense 1:5’-TAGCTGGAAGATCGAAAGTCCG-3’；Antisense 2:5’-GTGTTCACAGTCTTGCTCCAT-3’。Antisense 1与Sense扩增片段为437 bp，Antisense 2与Sense扩增的片段数为1 567 bp。RNA提取试剂Trizol为GIBCO BRL公司产品，逆转录试剂盒及PRC试剂均为Promega公司产品，脱氧胞苷5’-［α-32P］ 三磷酸盐（α-32P-dCTP）由北京亚辉生物医学工程公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 取NIH小鼠肾脏去包膜，剪下皮质，于80目不锈钢网筛上研磨、冲洗，在140目网筛上收集肾小管节段（纯度可达98%以上），经生理盐水冲洗2次后，将肾小管节段加入10%新生牛血清RPMI 1640培养液置于预铺1%明胶的5 ml培养瓶中培养，约5 d后可见肾小管贴壁，置换培养液继续培养至第10天可见肾小管上皮细胞长出，用0.1%胰酶/EDTA缓冲液消化传代培养3 d，取第1代肾小管上皮细胞作细胞转染实验。
1.2.2 细胞转染 将ICAM-1反义寡核苷酸与脂质体转染试剂DOTAP按1∶1（重量之比）的比例分别加入至Hepes缓冲液（20 mmol/L，pH7.4）中，配制成ICAM-1反义寡核苷酸的浓度为0.1 μg/μl的细胞转染液。将上述已制备成功的小鼠肾小管上皮细胞的培养液更换为1%新生牛血清RPMI 1640培养液后加入细胞转染液，使每瓶细胞培养液中ICAM-1反义寡核苷酸的最终浓度为100或200 nmol/L。另外按相同的方法加入对照物寡核苷酸及不含寡核苷酸的细胞转染液作为实验对照及空白对照。
1.2.3 细胞ICAM-1表达的诱导 上述细胞转染4 h 后，弃上清，更换为10%新生牛血清RPMI 1640培养液继续培养4 h后，加入人重组的IL-1β于细胞培养液中（终浓度为10 U/ml），刺激培养12 h，诱导细胞产生ICAM-1。
1.2.4 细胞RNA的提取及定量 上述各组细胞在刺激培养12 h后，弃上清，加入Trizol试剂1.0 ml瓶，氯仿抽提后，用异丙醇沉淀，沉淀的RNA用70%乙醇洗涤后，溶于DEPC水中，利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值，计算RNA的浓度。
1.2.5 逆转录PCR观察ICAM-1 mRNA的表达情况 取抽提的RNA 5 μg，按试剂盒的说明分别加入10 pmol Oligo dT、20 mmol/L dNTP、0.1 mol/L DTT及逆转录酶后于37℃水浴2 h，100℃灭活、变性3 min后，取2 μl逆转录产物，分别加入两对引物后进行热启动扩增，PCR扩增的条件分别为94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 45 s 共30个循环（437 bp）及94℃ 60 s，60℃ 60 s，72℃ 2 min共30个循环（1 567 bp），PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，观察ICAM-1 mRNA的表达情况。
1.2.6 Northern杂交检测ICAM-1 mRNA的变化 取20 μg RNA，甲醛变性凝胶电泳后转移至尼龙膜上，紫外线固定后，预杂交2 h，利用PCR扩增产物制备的ICAM-1 cDNA探针，α-32P-dCTP标记探针，杂交16 h后放射自显影观察细胞中ICAM-1 mRNA的变化。
1.2.7 免疫组化检测ICAM-1表达改变 将培养的原代肾小管上皮细胞消化传代后接种至24孔细胞培养板中，细胞接种密度为3×104/孔，将细胞分为12组，每组有3孔细胞，按方法1.2.2进行细胞转染实验，并设立不加脂质体、直接用100和200 nmol/L的寡核苷酸转染细胞，观察脂质体在细胞转染中的作用。转染后的细胞以方法1.2.4诱导细胞产生ICAM-1，同时设定不转染反义寡核苷酸及不加IL-1β刺激诱导的细胞作为空白对照。肾小管上皮细胞刺激培养结束后，细胞以95%甲醇固定10 min，加入1%小牛血清室温下阻断培养2 h，再加入大鼠抗小鼠ICAM-1单克隆抗体，4℃过夜，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化酶标记的兔抗大鼠IgS，室温下孵育2 h，以0.5%Tween/PBS缓冲液洗涤后，以30%过氧化氢及邻苯二胺发色，在倒置显微室下观察细胞膜上ICAM-1表达的改变，同时设立不加一抗和不加二抗的细胞作为免疫组化实验的阴性对照。根据肾小管上皮细胞膜上着色的程度分为-、+、++、+++4个等级记录ICAM-1表达的变化。
1.2.8 统计学处理 计量资料的比较采用t检验，等级资料的比较采用Mann-Whitney 检验法。
2 结果
2.1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达的影响 Northern杂交的结果显示与未经寡核苷酸阻断的肾小管上皮细胞比较，100和200 nmol/L两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸均可明显减少IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA表达，而对照寡核苷酸则没有明显的阻断效应（图1）。
图1 ICAM-1反义核酸可阻断肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达
Fig.1 The blocking effects of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 mRNA expression of cultured tubular epithelial cell
Note:A.ICAM-1 antisene;B.control oligonucleotide;C.transfection buffer; M.1.0 kb molecular mark
2.2 ICAM-1反义寡核苷酸阻断后细胞膜上ICAM-1表达的变化 细胞免疫组化检查显示，两个浓度的ICAM-1反义寡核苷酸在体外均可以阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞ICAM-1的表达（图2），但是，对照寡核苷酸对肾小管上皮细胞ICAM-1的表达没有阻断作用，另外，未加脂质体转染的ICAM-1反义寡核苷酸在相同的条件下对ICAM-1阻断作用不明显，如表1所示。
图2 ICAM-1反义核酸可阻断IL-1β诱导的肾小管上皮细胞表达ICAM-1
Fig.2 The blocking effect of ICAM-1 antisense oligonucleotide on the ICAM-1 expression of cultured renal tubular epithelial cell induced by IL-1β
Note:A.epithelial cell without IL-1β induction;B.epithelial cell+ICAM-1 antisense;C.epithelial cell+control oligonucleotide;D.epithelial cell+tranfection buffer
表1 ICAM-1反义寡核苷酸对肾小管上皮细胞表达ICAM-1的阻断作用（n=6）
Tab.1 ICAM-1 antisense oligonucleotide blocks the ICAM-1 expression of cultured tubular epithelial cell in vitro（n=6）
| Group | ICAM-1 antisense | Control oligonucleotide | Transfection buffer | |||||||||
| - | + | ++ | +++ | - | + | ++ | +++ | - | + | ++ | +++ | |
| 100 nmol/L+DOTAP | 1 | 4 | 1 | 01） | 0 | 1 | 4 | 1 | 0 | 0 | 4 | 2 |
| 200 nmol/L+DOTAP | 0 | 5 | 1 | 01） | 0 | 0 | 5 | 1 | 0 | 0 | 3 | 3 |
| 100 nmol/L-DOTAP | 0 | 1 | 4 | 1 | 0 | 0 | 3 | 3 | 0 | 0 | 3 | 3 |
| 200 nmol/L-DOTAP | 0 | 1 | 5 | 2 | 0 | 1 | 3 | 2 | 0 | 0 | 4 | 2 |
Note:1）P＜0.01,compared with group of control oligonucleotide and group of transfection buffer；100 nmol/L/200 nmol/L:the concentration of ICAM-1 antisense oligonucleotide；+/-DOTAP:with/without DOTAP transfection buffer
3 讨论
编码小鼠ICAM-1跨膜蛋白的基因全长cDNA共2 525 bp，其中5’非编码区有29 bp，开放框架区（ORF）为1 611 bp，其余的为3’非转录区［8］。本研究所选用的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列位于3’-非转录区。为了在实验中初步证实ICAM-1反义寡核苷酸的裂解ICAM-1 mRNA的作用，我们设计了3条PCR的引物（共两对），其中PCR产物为437 bp的两条引物均位于ICAM-1的ORF区域，产物为1 567 bp的上游引物部分在ORF区域，而下游部分则位于3’非转录区，RT-PCR的产物将ICAM-1反义寡核苷酸的靶序列包含在其中。结果表明在ICAM-1反义寡核苷酸作用后，两种RT-PCR产物均明显减少，提示ICAM-1反义寡核苷酸进入细胞后可以使肾小管上皮细胞的ICAM-1 mRNA发生降解，从而起到反义作用。
由于未经化学修饰的外源性寡核苷酸进入细胞内可能会被细胞内的核酶降解而不能与特定的序列结合，因此在合成小鼠的ICAM-1反义寡核苷酸时，我们进行了核酸的全硫代磷酸化修饰，以增强其抗核酶的活性［9］，从本实验的结果来看，ICAM-1的反义寡核苷酸转染于小鼠的肾小管上皮细胞后能使细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA表达的水平明显下降，说明ICAM-1反义寡核苷酸未被核酶降解，并发挥了反义功能。
硫代修饰的反义寡核苷酸带有较多的阴电荷，在体外细胞的实验研究中，可能出现非特异的吸附而导致“序列不依赖性抑制作用”［10，11］，为了证实ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异的，我们设立一个对照的寡核苷酸，这个对照物在碱基的种类及数量上与ICAM-1反义寡核苷酸是完全一致的，并进行了全硫代磷酸化修饰，只是其排列顺序与ICAM-1反义寡核苷酸不同，而且这一对照序列与目前已知的小鼠任何基因产物均无同源性［3］，结果表明这一个对照寡核苷酸没有抑制ICAM-1 mRNA表达的作用，提示本研究中小鼠ICAM-1反义寡核苷酸的作用是序列特异性的。
已有研究表明，人的ICAM-1反义寡核苷酸抑制脐静脉内皮细胞表达ICAM-1的最适剂量为50～200 nmol/L，过低过高均会降低其抑制效率［12］，本实验研究采用了两种浓度剂量100及200 nmol/L，结果发现这两种浓度的小鼠ICAM-1反义寡核苷酸均可明显抑制肾小管上皮细胞ICAM-1 mRNA的表达。
总之，本研究结果提示小鼠ICAM-1反义寡核苷酸可以抑制小鼠肾小管上皮细胞ICAM-1及ICAM-1 mRNA的表达，且这种抑制作用是特异序列依赖性的。本研究为进一步应用ICAM-1反义寡核苷酸治疗肾小管间质炎症性疾病变奠定了基础。■
①本课题为国家自然科学基金资助项目
②通讯联系人：陈香美 E-mail:xmchen@public.bta.net.cn
作者简介：程庆砾，男，34岁，副主任医师，副教授，主要从事肾小管间质病变的研究；陈香美，女，47岁，主任医师，教授，主要从事慢性进展性肾病研究
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收稿日期：1998-07-03
修回日期：1998-10-26
【摘要】 目的 探讨氧自由基和炎症因子共同作用促进肾结石形成。方法 选择40例肾结石患者(志愿者)和健康无结石志愿者30例，分别留尿生化分光光度法测NAG、γGT、Cr、SOD、MDA和NO，放免法测β2MG和TNFα。结果 结石组尿中反映肾脏损伤的特异性指标NAG、γGT和β2MG显著升高，两组之间存在统计学差异(P<0.05)。结石组血中损伤相关因子TNFα和MDA值高于健康对照组，两组之间有显著性差异(P<0.05)；血中保护相关因子SOD值显著低于健康对照组(P<0.05)。结论 尿路结石患者尿中β2MG、γGT和NAG水平显著升高，表明尿路结石形成过程中的确导致肾小管功能损伤，而且其升高可能与氧化损伤和局部炎症反应有关。
【关键词】 肾结石；氧自由基；损伤机制
尿路结石是泌尿系统的常见病，而且复发率极高。尿路结石形成的确切机制尚不清楚，文献报道主要与肾小管氧化损伤、钙离子通道和局部炎症反应有关[1－3]。本文通过临床观察尿路结石患者血中氧化损伤、炎症反应及肾小管上皮细胞损伤的相关指标，初步探讨两者的相关性，从而为尿路结石的发生机制的阐明奠定基础。
1 材料与方法
1.1 临床分组 结石组选择40例肾结石患者(志愿者)，男24例，女16例，年龄23-65岁，体重49-72kg，患者肾功正常，无高血压，25例合并轻中度肾积水；对照组选择健康无结石志愿者20例，男15例，女5例，年龄23-65岁。
1.2 标本采集与处理 ①血浆(血清)：取肘正中静脉血6mL。②尿液：晨起空腹尿。分别按说明书要求制备标本，放于-20℃冰箱保存。
1.3 主要试剂 肿瘤坏死因子(TNFα)试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所；β2微球蛋白(β2MG)试剂盒购自中国原子能科学研究院同位素研究所(北京)；一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、 N乙酰β葡萄糖苷酶(NAG)、γ谷氨酰胺转肽酶(γGT)购自南京建成生物技术研究所；肌苷(Cr)试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。
1.4 标本检测方法 放射免疫法测定TNFα和β2MG；生化分光光度比色法测定NO、SOD、MDA、 NAG、γGT和Cr。
1.5 统计学方法 所有数据以±s表示，采用SPSS 11.5软件，用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
5期〖2〗张 越，盛斌武，贺大林，等. 氧自由基、炎症因子在结石患者肾小管损伤中的作用
2 结 果
肾结石组血中损伤相关炎症因子TNFα高于健康对照组，两组之间有极显著性差异(P<0.01)，脂质过氧化代谢产物MDA值高于健康对照组，两组之间有显著性差异(P<0.05)；而血中保护相关的抗氧化因子SOD活性显著低于健康对照组，两组之间有显著性差异(P<0.05)。
结石组尿中反映肾脏近端小管功能损伤的特异性指标NAG、γGT较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)，尿中反映肾小管重吸收功能受损的指标β2MG显著高于健康对照组(P<0.05，表1)。表1 两组血浆SOD、MDA、血清TNFα和尿NAG、γGT和β2MG测定结果*P<0.05, △P<0.01 vs.对照组
3 讨 论
我们前期的研究报道肾结石患者尿中反映肾近端小管特异性损伤的指标尿酶和反映肾小管重吸收功能的指标β2微球蛋白(β2MG)水平显著升高[4]；本临床资料显示肾结石组血中反映氧自由基损伤的指标MDA值、炎症介质TNFα升高，反映抗氧自由基损伤作用指标血浆SOD活性降低，表明肾结石的形成氧自由基和炎症反应参与肾小管损伤，与文献一致[56]。
活性氧家族(reactive oxygen species, ROS)主要包括超氧化物、羟基阴离子和过氧化氢。氧化损伤主要作用膜脂质蛋白、DNA、糖酵解酶、线粒体和细胞骨架。超氧阴离子能与其直接作用，过氧化氢能通过HaberWeissFenton反应产生大量羟基自由基，对细胞造成严重损伤。大量资料显示，ROS参与肾小管细胞的损伤，导致肾小管细胞急性坏死，但同时机体有丰富的防御系统如超氧化物歧化酶(SOD)可将过氧化物转变为O2和H2O2，后者又可在过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶的作用下变为O2和H2O，以减轻ROS的堆积。Gambar等推测肾小管持续低氧，产生大量自由基，使接近生理浓度草酸盐或(和)草酸钙结晶，而高浓度的草酸盐在局部潴留、浓缩，可产生大量氧自由基，而肾近端小管上皮细胞对ROS高度敏感，继发肾小管损伤甚至细胞坏死。本临床资料中肾结石组尿NAG、γGT和β2MG显著高于健康对照组，提示ROS可导致肾近端小管上皮细胞功能损伤[78]。
TNFα主要由激活的巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞及B淋巴细胞分泌，是具有多功能的多肽，它在炎症反应过程中起着较重要的作用。TNFα能激活补体系统,通过其细胞毒性作用加剧组织损伤；介导脂类介质及其他多肽介质的产生；TNFα导致肾小管细胞损伤的机制可能有两方面[9]：①诱导氧自由基的产生，促进中性粒细胞“氧化爆发”，产生氧自由基等活性氧介质并导致肾脏损伤；②通过中性粒细胞介导局部炎症反应。有资料显示[10]，微血管内皮细胞是TNFα的主要靶细胞，TNFα导致肾小球及肾小管周围的毛细血管损伤，肾小管上皮细胞出现营养障碍，以致出现肾小管上皮细胞变性和坏死。由于TNFα升高激发细胞因子网络效应，其中血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)的升高，一方面促使粒细胞聚集，加重炎症反应；另一方面，可使毛细血管通透性增加，加重肾小管损伤，而磷脂酶A2的升高，可水解肾小管上皮细胞膜卵磷脂，使之生成游离脂肪酸和溶血卵磷脂，后者使肾小管上皮细胞膜溶解。本临床资料提示，血中TNFα显著高于健康对照组，提示大量草酸盐在局部潴留、浓缩，继发肾小管损伤导致细胞坏死，趋化单核细胞系统，吞噬细胞形成结石核心，同时管腔内的高浓度草酸盐进入细胞间质，使诸多炎症因子参与肾结石的形成过程，可导致肾小管上皮细胞、血管内皮细胞等多种细胞损伤，从而使尿酶NAG、γGT和β2MG显著升高[11]。
综上所述，本临床资料显示肾结石患者尿酶NAG、γGT和β2MG显著升高，表明尿路结石长期刺激可引起肾小管功能损伤；血浆MDA值，血清TNFα升高，血浆SOD活性降低，表明自由基和炎症反应参与肾结石患者肾小管损伤的过程，且很可能是肾结石复发的重要原因；肾小管处于持续的恶性低氧自由基张力状态，使接近生理浓度草酸盐或(和)草酸钙结晶及原尿中草酸盐过饱和，在长段亨氏襻激发炎症反应，导致细胞向着骨源细胞系分化，在亨氏周围和(或)肾乳头形成钙化斑[8,11]。
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作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院：1. 泌尿外科；2. 老年外科
【摘要】 目的 通过观察染镉后的小鼠肾小管上皮细胞的形态结构改变以及Bcl2、Bax蛋白表达情况，探讨镉对肾小管上皮细胞毒性作用的可能机制。方法 选取雄性小鼠40只，随机分为高、中、低剂量染镉组和对照组4组，各染镉组分别按4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg体重进行一次性皮下注射氯化镉，对照组皮下注射相应剂量的生理盐水。于染镉后48 h处死动物，取出肾脏，常规石蜡包埋，切片，HE染色观察肾小管上皮的形态学改变；免疫组织化学技术检测肾小管上皮中Bcl2、Bax蛋白的表达。结果 染镉组小鼠的肾小管上皮细胞肿胀，胞质疏松，染色浅，空泡变性；细胞核固缩、核溶解；可见凋亡小体。部分肾小管周围有淋巴细胞浸润，有的肾小管管腔内可见嗜酸性凝固物。染镉组肾小管上皮中Bcl2蛋白表达降低(F=11.873,P＜0.01)，Bax蛋白表达升高(F=18.734,P＜0.01)，并且Bcl2蛋白的表达量与染镉剂量呈负相关（r=-0.698,P＜0.01），Bax蛋白的表达量与染镉剂量呈正相关（r=0.697,P＜0.01）。结论 氯化镉使Bcl2蛋白表达降低，Bax蛋白表达增高，且呈剂量效应关系；并可影响肾皮质的肾小管上皮的形态结构。
【关键词】 镉 肾小管上皮 Bcl2 Bax 凋亡
Effect of morphological structures and expression of Bcl2 and Bax protein on renal tubule epithelia induced by cadmium
WANG Dong CAI Heng CUI Chunhong et al
Department of Histology and Embryology, Binzhou Medical University,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective By means of observing the morphological changes and situation of Bcl2，Bax proteins expression of epithelia on renal tubule of mice exposed to cadmium, in order to investigate its possible mechanism of cadmium toxicity on epithelia of renal tubule.Methods Forty male mice were randomly divided into four groups, which were highdose cadmium group、 middledose cadmium group、lowdose cadmium group and control group.Mice in three cadmium poison groups were subcutaneously injected cadmium chloride with dose of 4 mg/kg，2 mg/kg，1 mg/kg respectively. Mice in control group were injected 1ml/kg normal saline through subcutaneous. Mice were killed on 48h after being poisoned. And kidneys were extracted, embedded with paraffin routinely, and sliced. The samples stained with HE staining, for observing morphological changes of renal tubules under light microscope. Expression of Bcl2 and Bax proteins were detected by immunohistochemistry.Results In the renal tubule of renal cortex of cadmium poison groups epithelia swelled, cytoplasts were loose and stained lightly. Some cells presented vacuolar degeneration, karyopyknosis, and karyolysis. Apoptotic bodies could be found among the healthy cells. Around renal tubules, inflammatory cells infiltrated obviously. Some lumens of renal tubules were filled with acidophil solidified necrotic substance. With increase of cadmium dose the injury of renal tubules was more serious. In cadmium poison groups, the expression of Bcl2 protein on the epithelia of renal tubales decreased,and that of Bax protein increased.And there was a negative correlation between the expression of Bcl2 in the epithelia of renal tubules and doses of cadmium（r=-0.697,P＜0.01）, a positive correlation between the expression of Bax in the cells and doses of cadmium（r=0.698,P＜0.01）.Conclusion It showed that excess cadmium chloride could have adverse effects on morphological structure of renal tubular epithelia, and induce increase of Bax expression and decrease of Bcl2 expression,with a doseeffect relationship.
【Key words】 cadmium,renal tubule epithelia, Bcl2, Bax,apoptosis
镉是一种环境和职业污染物，在人体内的半衰期可长达12.1～22.7年，为最易在人体内蓄积的毒性物质之一［1］。镉主要经呼吸道和胃肠道吸收进入体内，肾脏是其最主要的蓄积部位和靶器官。大量的体外和体内研究表明，镉可以诱发多种类型细胞的凋亡，在某些细胞类型具有剂量效应关系［2～4］。随着对细胞凋亡研究的不断深入，发现Bcl2 家族的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要作用，而Bcl2 和Bax分别是Bcl2 家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡蛋白［5］。目前，对于镉致肾小管上皮细胞凋亡的机制还尚未完全清楚。本研究旨在观察镉中毒时小鼠肾小管上皮的形态学改变，以及Bcl2和Bax蛋白表达的变化，以探讨镉诱导肾小管上皮细胞凋亡与Bcl2和Bax蛋白表达的关系，为明确镉的肾毒性机制提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂 氯化镉(CdC1·2.5H2O，分析纯，为广州化学试剂厂生产），兔抗鼠Bcl2、Bax多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），即用型SPKit（过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒）和浓缩型DABKit(二氨基联苯胺试剂盒)（武汉博士德生物工程有限公司生产），其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器 PL300电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司），石蜡切片机和摊片机（德国LEICA），生物显微镜（日本Olympus），IMAGEPROPLUS图像分析系统（美国Media Cybernetics），BX31数码显微照相系统(日本Olympus公司)。
1.3 实验动物分组及处理 选取体重15～20 g 清洁级昆明种雄性小鼠40只（烟台绿叶制药有限公司实验动物中心提供），自由饮水，摄食。随机将小鼠分为4组（高、中、低剂量染镉组和对照组），每组10只。一次性染镉，高、中、低剂量染镉组分别按4 mg/kg、2 mg/kg、1 mg/kg体重行皮下注射氯化镉，对照组按1 ml/kg体重皮下注射生理盐水。于染镉后48 h脱颈椎处死小鼠，迅速剖腹，取出肾脏，置于4%多聚甲醛中固定12 h，常规石蜡包埋，制备5 μm连续切片。
1.4 常规HE染色
1.5 SP法（streptavdinperoxidasebiotin method）免疫组织化学染色 每组10只小鼠，在每只小鼠肾脏的连续切片中每隔10张取一张，共取10张，石蜡切片常规脱蜡，3%双氧水甲醇室温10 min；滴加10%山羊血清封闭液，37℃孵育30 min；滴加兔抗Bcl2或Bax，4℃过夜；滴加抗兔生物素化二抗37℃孵育30 min；滴加辣根过氧化物酶标记生物素，37℃孵育30 min；每步间用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗5 min×3次，DAB显色液显色5 min，蒸馏水终止反应，常规脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察，拍照。阴性对照：用PBS代替一抗，其余步骤同上。利用图象分析系统测定平均光密度值，每只小鼠求出一个均值，以其表示Bcl2和Bax蛋白表达情况。
1.6 统计学处理 数据以平均值±标准差( x±s)表示，用SPSS11.0软件进行单因素方差分析(Oneway ANOVA)和相关分析，两组间比较用最小极差法（LSD），P＜0.05表示有显著性意义。
2 结果
2.1 镉对肾小管上皮形态结构的影响 对照组的肾小管管腔清晰可见，上皮细胞排列整齐，形状规则，近曲小管的上皮细胞游离面刷状缘清晰（图1a）。低剂量组肾皮质血管充血，少量近曲小管上皮细胞出现轻微肿胀，结构不清，细胞排列稍紊乱，上皮细胞间有淋巴细胞浸润（图1b）。中剂量组的部分肾小管管腔不规则，可见坏死物质；上皮细胞肿胀、变性，胞质疏松，染色浅淡，并出现核固缩，可见细胞空泡变性和嗜酸性变（图1c），并有大量淋巴细胞浸润，血管充血，但肾小球基本无损。高剂量组的远曲小管管腔内可见嗜酸性凝固坏死物填充，近曲小管上皮细胞游离面的刷状缘结构不清；上皮细胞排列凌乱，细胞界限不清（图1d），可见细胞呈空泡变性，胞质疏松，部分细胞质嗜酸性反应增强，有的细胞核固缩，形成凋亡小体。
a. 对照组 b.低剂量染镉组c. 中剂量染镉组d.高剂量染镉组
图1 镉对肾小管上皮形态结构的影响（HE染色，×400）
2.2 镉对Bcl2和Bax蛋白在肾小管上皮细胞上表达的影响 Bcl2和Bax均在肾小管上皮细胞的细胞质中表达。高、中、低剂量染镉组和对照组之间的Bcl2蛋白表达的平均光密度值差异有统计学意义（F=11.873,P＜0.01），Bax蛋白表达的平均光密度值也有统计学意义（F=18.734,P＜0.01），两两比较各组间均有显著性差异（表1）。本实验条件下，在1～4 mg/kg剂量范围内呈明显的剂量效应关系，表现出随着染镉剂量的加大，Bcl2蛋白表达降低（r=-0.697,P＜0.01），Bax蛋白的表达升高（r=0.698,P＜0.01）。表1 镉对小鼠肾小管上皮细胞Bcl2和Bax蛋白表达的影响注：*与对照组相比P＜0.01，△与低剂量组相比P＜0.01，※ 与中剂量组相比P＜0.01
3 讨论
镉可以经呼吸道和消化道被吸收入体内，一般吸收量为2％～3％，也有报道约5％～11％被吸收，而每天从体内排出的镉却极其微量［6］。镉进入人体后，主要与富含半胱氨酸的胞浆蛋白相结合，形成金属硫蛋白（MT）而存在，选择性地蓄积于肝、肾等器官中［7］。肾脏可吸收进入体内近1/3的镉，是镉的“靶器官”［8］。本实验主要观察镉对小鼠近曲小管和远曲小管形态结构的影响，发现随着染镉剂量的加大，肾小管上皮细胞肿胀、变性、脱落等形态学改变越明显，有的肾小管管腔内可见有坏死物填充。我们的实验结果与国内外研究结果基本一致［9～11］。
正常肾小管上皮细胞具有旺盛的代谢活性和潜在的增殖能力，并能分泌多种细胞因子；在疾病状态下，肾小管上皮细胞极易发生结构和功能损伤，缺血、中毒等各种触发细胞凋亡的因素均能触发肾小管上皮细胞凋亡，这种非致命性损害可致肾小管上皮细胞极性丧失，细胞与细胞间、细胞与基膜间的粘附能力下降，部分上皮细胞脱落，在管腔内形成管型［13，14］。镉所诱发的肾小管形态结构改变与肾小管上皮细胞发生凋亡有关［12］。我们研究发现，镉作用于肾小管上皮细胞后，可引起细胞内Bcl2蛋白表达量下降，呈明显的剂量效应关系（r=-0.697，P＜0.05）；也可引起Bax蛋白表达量增高，呈明显的剂量效应关系（r=0.698,P＜0.05）；结果提示镉可抑制Bcl2蛋白表达、促进Bax蛋白表达而引起肾小管上皮细胞的凋亡，可以使肾小管结构发生改变。
综上所述，镉具有明显的肾脏毒性，对小鼠肾脏皮质细胞的凋亡具有明确的诱导作用，并表现剂量效应关系，Bcl2表达水平与细胞凋亡呈负相关，Bax表达水平与细胞凋亡呈正相关；提示镉诱导细胞凋亡是其对肾小管上皮细胞毒性作用的分子学机制之一。然而，镉可通过多种途径引起细胞凋亡，如增强细胞内钙水平、诱导促进细胞凋亡的蛋白表达、引起氧化应激等，且各种途径之间又相互影响。因此对于镉在体内诱导细胞凋亡产生毒性作用的机制，还有待进一步研究。
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作者单位：滨州医学院组织学与胚胎学教研室 滨州市 256603
【关键词】 肾小管；酸中毒；误诊
肾小管酸中毒（renal tubular acidosis,RTA）是一组由不同原因引起的肾小管排泌H+和回吸收HCO-3发生障碍使尿酸化受损，以高氯性酸中毒为主要临床表现的疾病［1］。RTA在临床上并非罕见，但其缺乏特异性，易误诊。早期诊治可避免儿童由于反复发生代谢性酸中毒导致的生长发育迟缓、骨质疏松、骨骼畸形甚至骨折，肾钙化等严重并发症。我院1995年10月～2008年6月肾小管酸中毒误诊21例，分析如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 本组21例，男16例，女5例，年龄32天~12岁，其中0~1岁9例，1~3岁6例，3~6岁4例，6~12岁2例。起病年龄18天~11岁，病程最短12天，最长达8年。就诊至确诊时间最短23天，最长1年。临床表现生长落后18例，骨骼畸形11例，肌无力7例，骨折1例，恶心、呕吐、喂养困难6例，多饮多尿2例，心律失常2例。
1.2 辅助检查 代谢性酸中毒19例，均为阴离子间隙(AG)正常的高氯性代谢性酸中毒。pH失代偿（<7.35）18例，代偿于正常范围（7.35~7.45）3例。低血钾18例，低血钠2例，血糖、血肌酐及尿素氮正常，尿pH5.5~8.0(18例尿pH>6.0)，肾脏超声17例中发现肾结石2例，肾钙化2例，肾实质回声增强4例。骨骼X线摄片11例中佝偻病活动期征象9例，骨龄落后7例，病理性骨折3例。
1.3 误诊疾病 因骨痛、骨骼畸形误诊佝偻病7例，因乏力、四肢软瘫误诊周期性低钾麻痹3例，格林-巴利综合征1例，因生长缓慢误诊营养不良3例，呕吐、腹胀误诊巨结肠1例，呕吐、腹泻误诊腹泻病并电解质紊乱4例，呕吐、喂养困难误诊胃食管反流1例，幽门痉挛1例，多饮、多尿误诊尿崩症1例，糖尿病1例。
1.4 治疗及转归 均接受碳酸氢钠静脉补碱纠酸，口服10%枸橼酸钠钾合剂，合并佝偻病时加用维生素D及钙剂，经过治疗血电解质及酸碱平衡紊乱均得到不同程度好转，临床症状缓解。
2 讨论
2.1 临床特点 肾小管酸中毒是以肾小管酸化功能障碍为主的肾脏疾病，分原发性和继发性两大类，儿童以原发性肾小管酸中毒多见，认为与遗传因素有关，主要见于常染色体显性遗传，其次为常染色体隐性遗传或散发起病［2］。按受累的部位和主要特点分四类［1］：Ⅰ型即远端肾小管泌H+障碍，尿pH>6，持续性高氯性酸中毒，血钾多<3 mmol/L。多有生长障碍和佝偻病体征，病程长的部分患儿可继发肾脏微细结石症或肾钙化。Ⅱ型即近端肾小管再吸收HCO-3障碍，表现高氯性酸中毒，低血钾，碳酸氢钠负荷试验>15%；有生长缓慢、酸中毒症状、肌无力，还可有多尿、脱水症状，一般无骨骼改变，亦不出现肾钙化。Ⅲ型即混合型，近端和远端肾小管均受损，同时具有Ⅰ型和Ⅱ型的表现。Ⅳ型为远端肾小管泌H+、泌K+障碍，临床表现肾小管酸中毒和高血钾。本组病例以原发性远端肾小管酸中毒为多数，符合儿科特点。
2.2 误诊原因 （1）医师缺乏对本病的认识。本病临床表现多样化，且缺乏特异性，易被临床忽视，诊断时过多考虑常见病、多发病。如生长缓慢多误诊为营养不良并电解质紊乱、佝偻病。（2）不重视尿常规与分析的检查，未能将尿pH值与血气分析pH值对照，酸中毒患儿合并碱性尿未能仔细分析。如本组1例患儿因腹泻病入院，发现合并严重酸中毒，血pH 7.26而尿pH 6.8未引起重视，因酸中毒难以纠正，住院25天后确诊为Ⅰ型肾小管酸中毒。（3）对电解质紊乱仅对症治疗，未能认真思维，鉴别诊断。如本组3例患儿四肢乏力就诊，血生化检查发现低钾血症，接受补钾治疗症状好转，但反复发作，诊断周期性低钾麻痹。工作中未能对低钾的原因认真思维，低钾麻痹是由于钾离子分布异常所致，而肾小管酸中毒时Na和水的重吸收减少，细胞外液容量减缩，刺激肾素-血管紧张素-醛固酮系统的分泌和活性增加，促进Na-K交换，尿排钾增多，导致低钾血症。（4）多饮多尿患儿考虑内分泌及代谢紊乱，未能考虑肾脏功能障碍伴发多尿。（5）对佝偻病未能进行鉴别诊断。
2.3 误诊预防 对有下列表现者应警惕肾小管酸中毒可能，注意检查肾小管功能，对疑似病例可做氯化铵负荷试验，必要时可做碳酸氢钠负荷试验协助诊断［2］。（1）原因不明的代谢性酸中毒，特别是较为难治或停用碱剂后见酸中毒加重的病例；（2）原因不明烦渴、多饮多尿，并排除尿崩症者，尿糖阳性而血糖正常伴酸中毒者；（3）生长发育落后或营养不良不能用其他原因解释者；（4）不明原因四肢乏力、腹胀、精神萎靡、嗜睡、便秘呕吐或低血钾者；（5）顽固的活动性佝偻病合并消化功能不良厌食、呕吐者。
【参考文献】
1 胡亚美，江载芳.诸福棠实用儿科学,第7版.北京：人民卫生出版社，2002,2165-2170.
2 沈惟堂.肾小管酸中毒的诊断和治疗.中国实用儿科杂志，2000，15（2）：77-79.
作者单位：湖南娄底,娄底市中心医院
