1990～1997年云南IDUs HIV-1 B亚型分离株膜蛋白V3环顶端四肽基因序列的变化趋势
中华微生物学和免疫学杂志 2000年第5期第20卷 病毒学
作者：吴虹 王斌 方荣 路永波 钱冬萌 曾毅
单位：吴虹 王斌 方荣 路永波 钱冬萌（青岛大学医学院分子病毒学实验室）；曾毅（中国预防医学科学院病毒学研究所）
关键词：人类免疫缺陷病毒1型；药瘾；V3环顶端四肽基因序列
【 摘要 】 目的 观察云南静脉药瘾(IDUs) HIV-1分离株env基因V3环顶端四肽氨基酸和相应核苷酸序列随时间推移的变化。 方法 根据1990～1997年间62株HIV-1分离株env基因C2-V3区DNA序列，对HIV-1膜蛋白V3环顶端四肽基因序列(基序)及其编码核苷酸进行分析，并探讨其随时间推移的变化趋势。 结果 1990～1997年间62株HIV-1毒株膜蛋白V3环顶端四肽基序有程度不同的氨基酸变异，主要表现在第四位氨基酸的改变，变异呈现一定的趋向性。62株云南标本中有46例（74.2%）为GPGR，10例（16.1%）为GPGQ，4例（6.4%)为GPGK，另有2例(3.3%)为GPER且四肽基序编码核苷酸的变异主要表现为A→G的改变。 结论 1990～1997年这一时期内，云南IDUs特定感染者范围内HIV-1分离株膜蛋白V3环顶端四肽序列已表现出较大的趋向性，符合HIV-1国际B亚型SF2株的GPGR模式。
Variation trend of the tetrapeptide on the tip of V3 loop of 62 HIV-1 strains isolated in IDU of Yunnan from 1990 to 1997
WU Hong, WANG Bin, FANG Rong，et al.
（Department of Molecular Virology， Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, P.R.China）
【 Abstract 】 Objective To investigate the variation trend of the amino acid and the corresponding nucleotide sequences of the tetrapeptide on the tip of the V3 loop of HIV-1 strains from intravenous drug users (IDUs) in Yunnan as time goes by. Methods According to the nucleotide sequences of the C2-V3 region of 62 HIV-1 strains isolated from intravenous drug users (IDUs) of Yunnan from 1990 to 1997, the nucleotide sequences of the tetrapeptide on the tip of the V3 loop of HIV-1 envelope protein were analysed. The variation trends with time were discussed. Results The tetrapeptides on the tip of the V3 loop of 62 Yunnan HIV-1 strains showed different amino acid variation with the major one at the fourth amino acid. Moreover, the variation tend to be in a similar pattern. Among the 62 isolated strains, 46 (74.2%) showed the GPGR tetrapeptide motif, 10 (16.1 %) GPER motif, 4 (6.4%) GPGK motif and 2 (3.3%) GPER motif respectively. The variation at corresponding nucleotide sequence of the tetrapeptide motif was A→G. Conclusion In the period of 1990-1997，the tetrapeptides on the tip of the V3 loop of the HIV-1 strains from infected IDUs people in Yunnan are similar, and the results conform to the GPGR motif pattern of the international B subtype HIV-1SF2 strain.
【 Subject words 】 Human immunodeficiency virus type 1; Drug users; Tetrapeptide on tip of the V3 loop
基因的多样性是HIV-1在遗传学上的一个重要特征，以膜蛋白的变异程度最高〔1〕，HIV-1毒株间的区别都可被归结为env基因的变异，其核苷酸在同一亚型中变异率为7%～15%，不同亚型间变异可达30%〔2〕。不同亚型间膜蛋白V3区氨基酸序列的变异率可达50%以上〔3〕 。虽然V3区是高度变异的，但它也有相对的保守性。在构成V3环的34～36个氨基酸中，位于环基底部位的氨基酸一般保守性较高，而环顶端的氨基酸较易变异。V3区氨基酸的替代只涉及有限数量的氨基酸。据AIDS 1995年的数据库与Los Alamos Human Retrovirus一致资料发现，HIV-1国际B亚型膜蛋白V3环顶端保守的重要免疫原性四肽以GPGR，GPGK，GPGG，GPGS常见。
从1990年起，我们对云南静脉药瘾人群的HIV-1分离毒株进行序列测定和分析 ，并将前后所得HIV-1膜蛋白V3环顶端四肽基序进行分析比较。探究V3环顶端四肽基因序列演变的趋势。
材料与方法 HIV-1病毒C2-V3的DNA序列测定：使用Promega公司的DNA提取试剂盒（Wizard genomic DNA purification Kit）从云南IDUs中无症状HIV-1感染者全血中提取前病毒DNA，进行HIV-1膜蛋白C2-V3区目的基因的套式PCR扩增，构建测序克隆。使用赛百盛公司737型DNA自动测序分析仪进行测序。有关的DNA序列测定结果已报道〔4-7〕。
HIV-1分离株膜蛋白V3环顶端四肽基序分析：根据有关的DNA序列测定结果〔4-7〕，分析62株HIV-1分离株膜蛋白V3环顶端四肽的氨基酸序列特征及其第四位氨基酸编码核苷酸的出现频率，将所得资料依照时间顺序分为1990、1993、1994、1997四组，来分析V3环顶端四肽基序随时间变迁的漂移趋向。并进一步探讨V3环顶端四肽基序编码核苷酸的变异规律及其形成原因。
结果
1. 62株云南省HIV-1分离株env基因V3环顶端四肽序列分析：基因序列分析表明在这一时期云南省IDUs HIV-1分离株V3环顶端四肽基序以带有GPGR这一典型欧美B亚型特征的毒株为主，为46例，另有10例标本HIV-1表现为GPGQ，与泰国HIV-1毒株B亚型同源；同时，我们还发现4例分离株的四肽基序为GPGK；2例分离株的四肽基序为GPER，见表1。
2. 62株HIV-1分离株V3环顶端四肽基序随时间变迁的漂移：现有资料统计显示，1990～1994年由典型的HIV-1国际B亚型GPGQ序列向HIV-1泰国B亚型的GPGQ序列转变，并出现GPGK的变异倾向，变异集中在V3环顶端四肽基序的第四位氨基酸；1994～1997年又出现V3环顶端四肽基序向GPGR返转集中的变异倾向。同时在2株HIV分离株上发现第三位氨基酸出现变异，即发现2例V3环顶端四肽基序为GPER的HIV-1分离株，见表2。
表1 62株云南省HIV-1毒株V3环顶端四肽基序特征
Table 1. The tetrapeptides on tip of the V3 loop of 62 Yunnan HIV-1 strains
| Tetrapeptide | Codon | No. | Total | Remark |
| GPGR | AGA |
40（64.5%） |
46（74.2%） |
|
| CGA | 6（ 9.7%） | |||
| GPGQ | CAA | 6（ 9.7%） | 10（16.1%） | |
| CAG | 4（ 6.4%） | |||
| GPGK | AAA | 3（ 4.8%） | 4（ 6.4%） | |
| AAG | 1（ 1.6%） | |||
| GPER | GAA | 1（ 1.65%） | 2（ 3.3%） | Lack of base A at 8253 |
| GAG | 1（ 1.65%） | Lack of base
A at 8253 |
表2 云南省HIV-1毒株V3环顶端四肽随时间变迁的漂移
Table 2. Shift of the tetrapeptides on tip of the V3 loop of Yunnan HIV strains with times
| Tetrapeptides | Statistic for the fourth amino acid of tetrakpeptides | |||||||||||
| 1990（10）* | 1993（21）* | 1994（16）* | 1997（15）* | |||||||||
| Codon | No. | Total | Codon | No. | Total | Codon | No. | Total | Codon | No. | Total | |
| GPGR | AGA | 7 | 8（80%） | AGA | 7 | 12（57.1%） | AGA | 13 | 13（81.3%） | AGA | 13 | 13(86.7%) |
| CGA | 1 | CGA | 5 | |||||||||
| GPGQ | CAA | 1 | 1（10%） | CAA | 5 | 7（33.3%） | ||||||
| CAG | 2 | CAG | 2 | 2（12.5%） | ||||||||
| GPGK | AAA | 1 | 1（10%） | AAA | 2 | 2（9.5%） | ||||||
| AAG | 1 | 1(6.2%) | ||||||||||
*: DNA sequences of 62 Yunnan HIV strains during 1990 to 1997 (62) 3. 62株HIV-1分离株V3环顶端四肽基序编码核苷酸的变异分析：对62例标本V3环顶端四肽基序编码核苷酸分析发现，在46例GPGQ序列分离株中，第四位精氨酸（R）由AGA编码的为40例（64.5%），CGA编码的为6例（9.67%）；在10例GPGQ序列分离株中，其谷氨酰胺（Q）由CAA编码的为6例（9.67%），由CAG编码的为4例（6.4%），在4例GPGK序列分离株中，也存在着编码赖氨酸（K）的AAA（3例，4.8%）与AAG（1例，1.6%）的变异；在最近发现的2例GPER序列分离株中，第三位谷氨酸（E）被GAA和GAG两种密码子所编码，且伴随着HIV-1分离株V3环侧翼8252位核苷酸A的缺失。以上这些氨基酸变异其编码核苷酸的改变集中发生在单个核苷酸A→G的互换改变。
讨论
本文通过对1990～1997年间采自云南省的62例IDUs HIV-1感染者分离株V3环顶端四肽的氨基酸序列及相应的核苷酸序列进行横向和纵向的分析比较，了解V3环顶端保守四肽的变化特征。结果显示，云南IDUs HIV-1毒株的V3环顶端四肽基序以GPGR为主，在传播过程中，其毒株V3环顶端的四肽基序经历了1990～1994年间由欧美B亚型的GPGR向泰国B亚型GPGQ的漂移；再于1994～1997年间返回GPGR的过程。同时1990～1994年间还有4例（6.4%）GPGK序列的改变。此现象虽与以往国内报道〔8〕有所出入，但在泰国却有类似报道〔9〕。据泰国的流行病学资料，B亚型与IDUs人群的关系非常密切，GPGR为IDUs中流行的HIV国际B亚型V3环四肽基序，而在异性性乱人群中流行的HIV-1A/E亚型的V3环四肽基序为GPGQ〔9〕。
HIV-1外膜糖蛋白gp120的V3环是基因变异程度最高的区域，但它也有相对的保守性。同一毒株在不同的个体中免疫选择的压力下发生的变异是有限度的〔10〕。就HIV-1病毒而言，V3区在一定范围内的变异不会对病毒自身的生存造成威胁，选择压力的存在使得超出病毒允许范围变异的毒株不能生存。作为V3环顶端保守的重要免疫原性四肽，V3环顶端四肽基序的任一个氨基酸的改变都可显著减少抗体的结合〔11〕，本研究所测的标本均来自云南省的局部偏远区域，人口流动性差，传染源单一，传播方式相同且遗传背景相近， HIV-1病毒宿主之间的HLA抗原相似〔12〕，对病毒变异的免疫压力具有选择取向。GPGR为HIV-1国际B亚型的典型四肽基序，长期在IDUs这一特定人群中传播，虽然也出现向GPGQ、GPGK的变异，但最终还是趋于GPGR的稳定四肽基序。进一步分析编码GPGR的第四位精氨酸密码子发现，CGA与AGA比例，在1993年上升之后又显著下降，CGA较AGA更接近谷氨酰胺（Q）密码子CAA，为AGA与CAA之间的过渡。CGA出现机率的增高，是CAA→CGA，AGA→CGA双向变异的结果。同时，在整个变异过程中单个碱基A→G的反复出现提示，某种抗原漂移趋势与宿主的选择压力及病毒本身的变异趋向有关。尤为值得一提的是，1994～1997年间发现2例毒株（3.3%）的V3环顶端的四肽基序为GPER，提示在第四位氨基酸稳定为精氨酸后，第3位氨基酸也开始发生变异，这种变异与V3环侧链的8252位碱基缺失有关。同时，在四肽基序之后的第二个氨基酸都发生了相同的F→L的置换，因而组成了新的六肽序GPERAL。GPER是以往资料HIV-1B亚型从未出现的一种四肽基序，此种变化可能预示某种新的变异趋向，会影响中和性抗体的作用〔11〕。这对今后疫苗策略、诊断试剂研制都有重要价值。
基金项目：卫生部科研基金资助项目(961353)；山东省优秀中青年科学家奖励基金资助项目(97314432)
参考文献
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(收稿日期：1999-06-21)
| 中药名称 | 拨云退翳丸 |
| 拼音名 | Boyun Tuiyi Wan |
| 性状 | 本品为黑褐色至黑色的大蜜丸；气芳香，味苦。 |
| 鉴别 | 取本品，置显微镜下观察：花粉粒类圆形，直径24～30μm,外壁有剌，长3～5μm,具3 个萌发孔。 宿萼表皮非腺毛2～3细胞，顶端细胞的基部稍粗，壁有疣状突起。 星状毛基部2 细胞，单列，顶端2 细胞各2 分叉，成4 叉状，每分叉长250～500μm 。 内果皮石细胞淡黄棕色，表面观形状不规则，垂周壁波状弯曲。 果皮纤维上下层纵横交错排列。 草酸钙簇晶直径12～24μm,存在于果皮细胞中。 纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维。 纤维束鲜黄色，壁稍厚，纹孔明显。 果皮细胞长方形，壁厚，密波状弯曲，内含砂粒状硅酸盐结晶；气孔特异，保卫细胞壁放射状增厚。 具缘纹孔导管大，多破碎，有的具缘纹孔六角形或斜方形，排列紧密。 几丁质皮壳碎片淡黄棕色，半透明，密布乳头状或短刺状突起。 |
| 处方 | 密蒙花80g 蒺藜 (盐炒)60g 菊花 20g 木贼80g 蛇蜕 12g蝉蜕 20g 荆芥穗 40g 蔓荆子80g 薄荷20g 当归 60g川芎 60g 黄连 20g 地骨皮40g 花椒28g 楮实子20g天花粉24g 甘草 12g |
| 制法 | 以上十七味，粉碎成细粉，过筛，混匀。 每100g粉末加炼蜜140 ～160g制成大蜜丸，即得。 |
| 检查 | 应符合丸剂项下有关的各项规定（附录Ⅰ A）。 |
| 功能与主治 | 散风明目，消障退翳。 用于目翳外障，视物不清，隐痛流泪。 |
| 用法与用量 | 口服，一次1 丸，一日2 次。 |
| 注意 | 忌食辛辣物。 |
| 规格 | 每丸重9g |
| 贮藏 | 密封。 |
剪刀七
此药为百合科植物七筋姑(Clintonis udensis)的全草。因其叶顶端骤尖，形如锐利的剪刀尖，故而得名，其叶椭圆形，纸质，这些特征又与竹叶颇像，所以又有“竹叶七”之别名c
七筋姑为多年生草本。根状茎短，上有须根多数，顶端残存纤维状的枯死鞘叶,叶3—4枚，基生j椭圆形，顶端骤尖，基部下延成鞘状抱茎。花茎从基部抽出，直立细长，密被白色短柔毛，上有花5~12朵，花白色，漏斗状。浆果球形，熟时蓝色。5—7月开花，6—8月结果。分布于老君山、宋洛、板仓、田家山、红花、小干家坪、大神农架、小神农架、大九湖等地。生长于海拔1100—2800米的山坡或沟谷林荫下。
该药具有散瘀止痛的功效。用于跃打损伤、疡伤腰痛、风湿疼痛等。
瓶耳小草
瓶耳小草
Herba Ophioglossi
(英)Adder's Tongue Herb
别名 独叶一枝枪、矛盾草、蛇咬子。
来源 为瓶尔小草科植物瓶尔小草Ophioglossum vulgatum L.的小草。
植物形态 多年生小型草本，高达20cm。根茎短，肉质，直立，圆柱形，簇生黄色肉质的根。叶异型，常单生；总叶柄由根茎顶端抽出，长5～15cm，下部深埋土内；不育叶从总叶柄基部以锐尖或钝圆，基部长楔形，全缘，无柄，微肉质，肉状叶脉明显。孢子囊重自总柄顶端生出，柄长6～17cm，穗长2.5～4cm，狭条形，宽2～3mm，顶端有小突尖，孢子惠成熟时横裂为2瓣；孢子近平滑。
生于林下、泥沼划地。分布于长江下游、西南以及湖北、陕西、台湾。
采制 夏、秋季采收，晒干或鲜用。
化学成分 含一枝箭三糖甙（3-O-methyl-quercetin-7-O-diglucoside-4'-O-glucoside）。
性味 性凉，味微甘、酸。
功能主治 清热解毒，止咳。用于毒蛇咬伤、疔疮肿毒、感冒发热、肺炎、胃痛。
