主题：衍生

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乳制品中L-羟脯氨酸的检测

1 前言

“皮革奶”添加物的主要成分是皮革水解蛋白（即动物皮毛，含大量角质蛋白质），其中劣质水解蛋白的生产原料主要来自制革工厂的边角废料，制革边角废料中含有重铬酸钾和重铬酸钠，用这种原料生产水解蛋白，重铬酸钾和重铬酸钠自然就被带入产品中，被人体吸收。食品专家介绍，皮革水解物主要添加的食品是乳与乳制品及含乳饮料，作用是增加蛋白质含量。主要检测方法是检查牛奶中是否含有L-羟脯氨酸，这是动物胶原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦验出，则可认为含有皮革水解蛋白。本实验提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法，采用DNFB柱前衍生法进行分析测定。

2 仪器配置与试剂

2.1 仪器、前处理设备及试剂盒配置

表1 L-羟脯氨酸检测标准配置

序号	名称	订货号
1	P1201 高压二元梯度系统
2	氨基酸分析专用色谱柱	31110091
3	氨基酸专用保护柱
4	氨基酸试剂盒	31990001
5	L-羟脯氨酸标准品

表2 氨基酸试剂盒组分表

序号	名称
1	氨基酸衍生化溶液
2	衍生缓冲固体组分A
3	衍生缓冲固体组分B
4	平衡缓冲固体组分A
5	平衡缓冲固体组分B
6	流动相B固体组分

表3 前处理设备配置

序号	名称
1	恒温水浴锅
2	氮吹仪
3	溶剂过滤装置
4	流动相超声装置
5	烘箱
6	0.45μm针孔式微孔滤膜
7	5mL水解用安瓿瓶
8	封口膜

2.2 其他

25mL棕色容量瓶、50mL棕色容量瓶、移液枪、移液枪枪头、一次性PVC手套、一次性口罩、氮气瓶、2mL塑料离心管、进样针等。

2.3 试剂及相关溶液配制

2.3.1 衍生缓冲溶液

称取衍生缓冲液固体组分A 1.24g，固体组分B 7.63g，加入至500mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.2 平衡缓冲溶液

称取平衡缓冲液固体组分A 0.91g，固体组分B 3.58g，加入至250mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.3 羟脯氨酸标准溶液

将羟脯氨酸标准品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中，备用。

2.3.4 流动相A

乙腈-水（1:1），相同体积的乙腈与水混合，超声脱气10～15min。

2.3.5流动相B

称取流动相B 固体成分4.1g加水约950mL，用冰醋酸调pH至6.4~6.8，加10mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000mL，摇匀后静置片刻，用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气10～15min。

3 实验方法

3.1 样品水解

准确称取适量样品于5mL安瓿瓶中，精确到0.0001g(使试样中蛋白质含量在10～20mg范围内)，加入3mL 6mol/L盐酸。含水量高的样品如牛奶，可加入等体积的浓盐酸。酒精灯高温拉丝封口,放入烘箱中110℃ 水解24h。水解液氮气吹干，用衍生缓冲溶液多次洗涤安瓿瓶，合并洗涤液转移至25mL容量瓶中，并用衍生缓冲溶液定容，备用。

3.2 衍生方法

3.2.1 样品水解液衍生

取已过滤的样品液10mL至50mL棕色试剂瓶中，加入衍生试剂5mL，混匀。放入60℃水浴中，暗处反应60min。反应完毕，取出冷却至室温，加入平衡缓冲溶液稀释到刻度，静置15min，用0.45μm滤膜过滤，取10μL进样分析。

3.2.2 L-羟脯氨酸标准溶液衍生

移取10.0mL L-羟脯氨酸溶液，加入50mL棕色容量瓶中，再加入5.0mL衍生化溶液。用封口膜封口，放入60℃水浴中，暗处反应60min。取出，冷却至室温，用平衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min，取10μL进样分析。

3.3 色谱条件

色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS色谱柱；柱温：27℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表1所示；流动相总流量为1.2mL/min；检测波长：360nm；进样体积：10μL。表1 梯度曲线

时间(min)	流动相A(%)	流动相B(%)
0	16	84
0.3	16	84
4	31	69
9.5	36	64
17	55	45
28	65	35
34	100	0
36	100	0
38	16	84

4 分离谱图

图1 19种氨基酸标准品典型分离谱图 1. Asp 天冬氨酸； 2. Glu 谷氨酸； 3. Hpy 羟脯氨酸；4. Ser 丝氨酸； 5. DNP-OH 2,4-二硝基苯酚； 6. Arg 精氨酸； 7. Gly 甘氨酸； 8. Thr 苏氨酸； 9.Pro 脯氨酸； 10. Ala 丙氨酸； 11. Val 缬氨酸； 12. Met 蛋氨酸； 13.Cys 半胱氨酸； 14. Ile 异亮氨酸； 15. Leu 亮氨酸； 16. Trp 色酸； 17. Phe 苯丙氨酸； 18. His 组氨酸； 19. DNFB 2,4-二硝基苯；20. Lys 赖氨酸；21. Tyr 酪氨酸

图2 20μg/mL L-羟脯氨酸标准品色谱图

图3 奶粉样品色谱图

图4 奶粉中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱图

图5 牛奶样品色谱图

图6 牛奶中添加20μg/mL L-羟脯氨酸色谱

日期：2011年5月27日 - 来自[色谱分析实例]栏目

巴西乙醇衍生品市场现发展迅猛

              美国增长咨询公司弗若斯特沙利文(Frost  &  Sullivan)最新发表的研究报告认为，巴西生物乙醇衍生化学品市场目前发展迅猛，需求剧增，虽然短期来看生产成本较高且政府的扶持力度不够，但由于原料充足，技术不断进步，未来乙醇衍生品的生产成本将下降。2010～2015年，乙醇衍生化学品的乙醇消耗量年增长率将达35.7%。到2015年，巴西乙醇衍生化学品产量将占化学品总产量的7%。
                得益于强劲的全球市场需求，2010年巴西化工行业逐渐从经济衰退造成的低迷中恢复过来。在巴西，乙醇主要用来生产乙酸乙酯，也可以用来生产醋酸和乙二醇。巴西乙醇衍生化学品2009年的乙醇消耗量为14.2万吨。得益于巴西化学公司（Braskem）绿色聚乙烯项目投产，2010年该数字估计为47.7万吨。2013年苏威巴西公司的生物聚氯乙烯项目投产后，乙醇需求量将达63.5万吨。
                目前巴西市场上的主要乙醇衍生物厂商有罗地亚巴西公司、奥克斯腾（Oxiteno）公司、巴西化学公司、苏威巴西公司等等。罗地亚巴西公司生产的乙酸乙酯是通过醋酸和乙醇的醚化反应得到的，而其生产的醋酸是通过甘蔗乙醇生产。奥克斯腾是拉丁美洲环氧乙烷的主要生产厂家，是巴西仅有的乙基乙二醇公司，产能达到65000吨/年。巴西化学公司2007年就生产出第一个生物原料产品绿色聚乙烯，并将于今年实现商业化生产。苏威巴西公司计划在2012年用甘蔗乙烯生产聚氯乙烯。
                巴西是世界上最大的甘蔗生产国，其发展乙醇衍生化学品最大的竞争优势是原料成本全球最低。另外，投资大型化工项目也有助于降低单位产品的生产成本，比如巴西化学公司20万吨绿色聚乙烯就可大幅降低生产成本。消费者对减少碳排放的关注也将增加巴西对乙醇衍生品的需求，巴西乙醇的生产主要以甘蔗为原料，而种植甘蔗能通过光合作用吸收清理排放到海洋、森林中的二氧化碳气体，与传统的化石原料相比，可以减少碳排放。此外，新技术的发展也将推动乙醇衍生品市场需求，生产商已经意识到生物原料使用的趋势，并且正在开发新的技术。
                不过，巴西乙醇衍生物市场发展也面临着重重阻力。一是糖价格的浮动。虽然不受制于石油价格涨跌，但生物乙醇价格同样也被世界糖的价格所控制。根据目前巴西的商业模式，几乎没有政策来保护乙醇的价格稳定性。二是政府扶持措施少。虽然在世界上许多国家，可再生原料是政府扶持的对象，但巴西却没有紧跟世界步伐。因为缺少政府支持，巴西可降解材料以及可再生原料的需求目前仍然不大。三是消费者对可再生原料的认知度较低。虽然在巴西，乙醇衍生品市场已经有所发展，但是消费者对于可再生原料的认知度还较低。一般消费者不愿多花钱来购买绿色产品。四是与传统的方式比，生物乙醇生产乙烯成本更高，因此生物乙烯市场被目前的价格水平所限制。

日期：2011年2月28日 - 来自[生物能源]栏目

柱前衍生化高效液相色谱法拆分人体血浆和尿液中阿替洛尔对映体的研究

摘要高效液相色谱法分离和测定人体血浆和尿液中S(-)-和R(+)-阿替洛尔对映体。选用盐酸甲氧胺为内标，R(+)-苯乙基异氰酸酯为衍生化试剂，ODS为固定相，流动相为水-甲醇-异丙醇-二氯甲烷（53.2∶41.6∶4.8∶0.4），荧光检测波长235/300nm(Ex/Em)。血、尿样品经碱化后乙酸乙酯提取，并用氯仿2次抽提。S(-)-和R(+)-阿替洛尔对映体血、尿样品的线性范围分别为10～1000ng/mL和25～1500ng/mL，绝对回收率均在84%以上，RSD均小于6.0%。此法已经用于阿替洛尔对映体的药代动力学和药效学研究。

　　关键词：阿替洛尔对映体高效液相色谱法衍生化法

　　阿替洛尔(Atenolol,AT)为选择性β1受体阻滞剂，存在着对映异构体(enantiomers)，目前临床上使用的制剂均以S和R对映体各半混合的外消旋体(racemate)形式给药。2种对映体不仅在药理作用的类型、强度而且在生物体内的吸收、分布、代谢等方面都存在显著差异。因此，分离和测定生物体液中的AT对映体十分必要和具有重要意义。为了研究AT对映体的药代动力学和药效学，本文采用苯乙基异氰酸酯作为衍生化试剂，建立了柱前衍生化HPLC法，用于拆分人体血浆和尿液中的AT对映体。

　　1、试药与仪器

　　S(-)-AT和R(+)-AT购自Aldrich公司，内标盐酸甲氧胺(MethoxamineHCl)标准品购自Sigma公司。消旋AT标准品，含量＞99%，由天津中央药厂提供。盐酸阿替洛尔片：50mg/片，为市售药品。手性衍生化试剂R(+)-苯乙基异氰酸酯（R(+)-1-Phenylethylisocyanate,R(+)-PEIC）购自Fluka公司。水为三蒸水。其它试剂均为国产分析纯。

　　高效液相色谱仪(美国惠普公司)，包括HP1050泵、1046A荧光检测器、ODSHypersil（250mm×4mm,5μm）色谱柱和1050色谱工作站。

　　2、实验方法

　　2.1 标准液的配制盐酸甲氧胺、消旋AT、S(-)-AT和R(+)-AT分别用甲醇配制成储备液，贮存于4℃冰箱，每次使用前再以甲醇稀释成各种浓度的工作液。手性衍生化试剂R(+)-PEIC避光贮存于冰箱，临用前以氯仿稀释（1∶400）。

　　2.2 HPLC色谱条件流动相：水-甲醇-异丙醇-二氯甲烷（53.2∶41.6∶4.8∶0.4）；流速1.0mL/min，柱温25℃；检测波长：λEx＝235nm，λEm＝300nm。进样量：20μL。

　　2.3 血、尿标本的提取和衍生化取血浆0.5mL或尿液0.2mL，加入内标溶液（100ng/μL）8μL，尿液样品再加三蒸水稀释5倍至总体积为1mL。混匀后各加1mol/L氢氧化钠溶液0.1mL碱化样品，振荡10s，再加入乙酸乙酯3mL，异丙醇0.15mL，水平振荡5min，2000r/min离心5min,取上层有机溶液40℃水浴氮气流下挥干。残渣加入浓氨水2μL及0.25%R(+)-PEIC氯仿液0.2mL，旋涡振荡30s，4℃冰箱放置15min，室温氮气挥干有机溶液后，加入水0.5mL，氯仿2mL，用于提取、纯化衍生化反应物，振摇30s后，1500r/min离心3min，40℃水浴氮气流下挥干有机溶液，残渣用60μL流动相溶解，待测。

　　3、结果

　　3.1 内标亦为对映体化合物，在相同的色谱衍生条件下发生不完全分离。AT对映体拆分完全，峰形对称，与内标有很好的分离且无杂质干扰。

　　3.2 线性关系

　　3.2.1 血浆精取S(-)-AT和R(+)-AT标准储备液配制成浓度为10、50、100、250、500、1000ng/mL的AT对映体的血浆样品，余下按样品提取和衍生化处理操作。以浓度(X)为横坐标，以S(-)-AT、R(+)-AT与内标的峰面积之比(Y)为纵坐标，得血浆中S(-)-AT、R(+)-AT标准曲线的回归方程分别为：

　　Y＝0.00140X＋0.03914r＝0.9915

　　Y＝0.00151X＋0.04123r＝0.9937

　　3.2.2 尿液取S(-)-AT和R(+)-AT标准储备液配制成浓度为25、50、750、1000、1500ng/mL的标准溶液，以下步骤同尿液样品处理。以浓度(X)为横坐标，以S(-)-AT、R(+)-AT与内标的峰面积之比(Y)为纵坐标，得尿液中S(-)-AT、R(+)-AT标准曲线回归方程分别为：

　　Y＝0.00034X＋0.03553r＝0.9952

　　Y＝0.00036X＋0.02630r＝0.9963

　　3.3 回收率用正常人空白血浆和尿液分别配制成浓度为10、200、1000ng/mL血浆和浓度分别为25、750、1500ng/mL的尿液标准样品，依样品提取与衍生化操作，得到血浆和尿液AT对映体的提取液，将提取处理后进行衍生化反应与未提取直接衍生化所得的色谱峰面积比较，计算绝对回收率。血浆标本：S(-)-AT回收率＞85.7%；R(+)-AT回收率＞86.3%。尿液标本：S(-)-AT回收率＞84.8%；R(+)-AT回收率＞85.5%。

　　3.4 精密度试验

　　3.4.1 血浆标本1天内提取回收3种浓度(10、200、1000ng/mL)的S(-)-AT和R(+)-AT，在上述色谱条件下测定4次，计算日内误差，RSD范围：S(-)-AT为1.7%～4.3%；R(+)-AT为1.3%～3.8%。3种浓度分散于3个月内各测定5次，计算日间误差，RSD范围：S(-)-AT为2.8%～5.0%；R(+)-AT为2.9%～4.6%。

　　3.4.2 尿液标本用3种不同浓度(25、750、1500ng/mL)的尿液样品，每种浓度1天内连续进样4次，得日内误差，RSD范围：S(-)-AT为0.6%～2.0%；R(+)-AT为0.8%～1.9%。3种浓度分散于3个月内各测定5次，得日间误差，RSD范围：S(-)-AT为1.0%～2.4%；R(+)-AT为1.0%～2.0%。

　　4、方法的应用

　　12名健康男性志愿者单次口服盐酸阿替洛尔片2片(即AT为100mg)后，于服药前和服药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、9、12、24h取外周静脉血以及服药后分段收集0～3、3～6、6～9、9～12、12～24h的尿液，采用本法分别测定血浆和尿液AT对映体的浓度C。结果显示血浆R(+)-AT浓度较S(-)-AT显著升高，S(-)-AT的AUC为(2.44±0.59)(μg/mL)*h，R(+)-AT为(2.64±0.61(μg/mL)*h(P＜0.05)，两对映体的消除半衰期(T1/2)基本相近，S(-)-AT为(5.78±0.70)h，R(+)-AT为(6.03±0.71)h(P＞0.05)；而尿液S(-)-AT肾清除率(Cl)显著大于R(+)-AT，S(-)-AT为(115.69±19.40)mL/min，R(+)-AT为(108.91±21.26)mL/min(P＜0.05)。尿液计算的两对映体的T1/2也基本相近，S(-)型为(6.35±2.98)h，R(-)型为(6.96±4.22)h(P＞0.05)，结果显示，AT对映体人体药代动力学过程存在立体选择性差异。

　　5、讨论

　　5.1 本研究通过改变流动相的组成和极性，发现在流动相中加入异丙醇能明显缩短保留时间，加入少量二氯甲烷能消除拖尾，提高分离度。提取方法上考虑到乙酸乙酯提取回收率高但杂质峰较多，因此采用氯仿进行第二次抽提和纯化。在此条件下，S(-)-AT和R(+)-AT衍生物分离良好且无杂质峰干扰，保留时间小于15min。

　　5.2 R(+)-PEIC的含量影响衍生化反应。本实验曾选用0.008%～0.5%不同浓度的R(+)-PEIC氯仿液进行衍生化，结果显示R(+)-PEIC浓度太低时，样品衍生化不完全，但随着浓度增加，S(-)-AT和R(+)-AT衍生物相应增加，溶剂峰也随之明显增多，当R(+)-PEIC增加到一定浓度(0.5%)时，衍生化反应趋于饱和状态，再增加R(+)-PEIC含量时，衍生物的生成并不增加。R(+)-PEIC活性较强，如温度过高或暴露于空气之中易于氧化，因此AT的衍生化反应在4℃冰箱放置15min，这样不仅避免了R(+)-PEIC的氧化代谢，而且能得到单一、稳定、具有很强荧光的酰脲衍生物，此衍生物于室温放置至少48h无变化。

　　5.3 手性衍生化反应给内标的选择带来了一定的困难。我们选择盐酸甲氧胺作为内标，因为其为拟肾上腺素类药，结构与AT相似，其与R(+)-PEIC衍生化反应后荧光光谱响应类似AT，因此同样色谱条件下也分出2个洗脱峰（即对映体)，取两对映体峰面积之和作为内标计算值。

　　5.4 采用柱前衍生化方法测定血浆和尿液中AT对映体需较纯的提取物，以减少杂质峰的干扰。另外，碱化样品能增加回收率，但碱性过高，杂峰也随之增多。本法采用1mol/L氢氧化钠溶液0.1mL碱化血浆和尿液，使pH高于ATpKa1～2单位，并于乙酸乙酯中加入少量异丙醇能显著提高回收率。

　　5.5 AT为水溶性药物，吸收后几乎全部以原形从尿液排出，故尿液中药物浓度高。另外，考虑到衍生剂的量足以使衍生化反应完全，因此作尿液药物分析时，样品均先稀释5～30倍，然后进行提取和衍生化反应。

　　5.6 实验精密度表明，本法测定结果稳定，具有良好的重现性，生成的酰脲衍生物单一、稳定，具有很强荧光。实际应用证明，本法能够满足血药浓度监测和药代动力学研究的需要。

日期：2010年7月15日 - 来自[色谱分析实例]栏目

烟草植物衍生的酶可有效而低成本地使生物质水解

纤维素乙醇低成本生产的障碍之一是没有足够的技术能有效而经济地可从纤维素生物质中解离出可发酵的糖类。一些公司如诺维信已工作了好几年，为这类应用使其酶能降低成本和提高效率。
截至2010年2月19日，美国佛罗里达中部大学宣布，业已开发出烟草植物衍生的酶混合物，可从过滤器废纸、松木木质或柑橘属果树皮产生较多的（高达3,625%）的葡萄糖。这一成果已发布在《植物生物技术杂志（Plant Biotechnology Journal）》上。

日期：2010年2月22日 - 来自[生物能源]栏目

衍生化反相高效液相色谱法测定黄杨宁片中环维黄杨星D的含量

　　【摘要】 　　目的建立反相高效液相色谱法（RP－HPLC）测定黄杨宁片中环维黄杨星Ｄ的含量。方法环维黄杨星Ｄ与异氰酸苯酯反应后,用RP-HPLC测定,色谱柱为ODS-C18柱;流动相为甲醇－水(84∶16);检测波长：234 nm。结果衍生化反应在23.03~53.73 μg·ml-1浓度范围内线性良好，r=0.999 8（n＝5）,回收率均值96.1％,重复性好。结论该法准确,可靠，专属性强,可用于黄杨宁片中环维黄杨星Ｄ的质量控制。

　　【关键词】 黄杨宁片环维黄杨星Ｄ异氰酸苯酯反相高效液相色谱法衍生作用

　　Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for quantitative determination of Cyclovirobuxine D in HuangYangNing tablets. MethodsCyclovirobuxine D reacted with a derivative reagent phenyl isocyanate in chloroform.The analysis was carried out on C18 column,the mobile phase was methanol-water(86∶14),and the detection wavelength was at 234 nm.ResultsGood linearity was obtained from 23.03 μg·ml-1 to 53.73 μg·ml-1 of cyclovirobuxine D derivatives with a correlation coefficient of 0.999 8.The average recovery was 96.1%,RSD=1.5%.ConclusionThe method is accurate,reliable and specific and can be used for the quality control of Huangyangning tablets.

　　Key words：Huangyangning Tablets; Cyclovirobuxine D; Phenylisocyanate; RP-HPLC; Derivatization

　　黄杨宁片中主要成分为环维黄杨星Ｄ，环维黄杨星Ｄ系从黄杨科植物小叶黄杨Buxus minrophlla Sieb. et Zucc. var.SincaRehd. et Wils.及其同属植物中提取精制所得,主要用于冠心病及心绞痛的治疗。由于本品系从植物中经多次提取制备,原料中含有一定量的结构相似生物碱,《中国药典》原料用非水滴定法,片剂用酸性染料比色法, 测定的均为总生物碱,专属性差。根据其结构含仲氨基的特点,本文用异氰酸苯酯为衍生化［1］试剂,用高效液相紫外检测器方法测定黄杨宁片中环维黄杨星D的含量,现报道如下。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器岛津UV-2401紫外可见分光光度计；Agilent1100高效液相色谱仪系统，包括四元泵系统，紫外检测器，色谱数据化学工作站。

　　1.2 制剂及对照品环维黄杨星D对照品，中国药品生物制品检定所提供，批号110888-200202；黄杨宁片，江苏苏中药业集团股份有限公司生产（规格：1mg/片；批号060404，060406，060407），衍生化试剂异氰酸苯酯为Acros Organics，Belguim产品，色谱用水为蒸馏水，甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件色谱柱为岛津ODS C18柱(150 mm×4.6 mm)；流动相为甲醇-水(84∶16)；流速1.0 ml/min；检测波长234 nm；柱温为室温；进样量20 μl。

　　2.2 测定方法

　　2.2.1 衍生化试剂的配制精密吸取异氰酸苯酯20 μl，置10 ml量瓶中，加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.2.2 对照品溶液的制备取环维黄杨星D对照品10 mg，精密称定，置25 ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.2.3 供试品溶液的制备取本品20片精密称定，研成细粉，精密称取适量（约相当于环维黄杨星D10 mg），置具塞锥形瓶中，加0.5％冰醋酸溶液40 ml，50℃加热超声（250 W，40 kHz）2 h，取出，放冷，离心6 min（3 000 r/min），小心倾取上清液，残渣加适量0.5％冰醋酸溶液充分洗涤，离心6 min（3 000 r/min），合并上清液及洗液，用氨水调pH值至9.0，转移至分液漏斗中，加三氯甲烷50ml振摇2 min，待溶液完全分层后，分取三氯甲烷层，用三氯甲烷湿润的试纸滤入圆底烧瓶中，再用三氯甲烷萃取3次（40，30，30 ml），分取三氯甲烷层，依次滤入烧瓶中，并用三氯甲烷洗涤滤纸，滤入烧瓶中，回收三氯甲烷至适量，转移至25 ml量瓶中，用三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml，置10ml量瓶中，加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.2.4 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

　　2.2.5 测定波长的选择取对照品衍生化后，在200～400 nm波长范围内扫描，可见本品在230～240 nm波长范围内有较大吸收，且差异不大；最终采用234 nm作为本品含量测定的检测波长。

　　2.3 线性范围测定精密称取环维黄杨星D对照品10 mg，置25 ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，置10 ml量瓶中，各加衍生化试剂0.2 ml，摇匀，室温放置30 min，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取上述供试品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，测定线性范围，结果本品线性方程为：A= 94.933C+ 52.419，r=0.999 8（n＝5）。表明环维黄杨星D在 23.03～53.73μg·ml-1的浓度范围内，样品浓度（C）与峰面积（A）呈良好的线性关系。

　　2.4 重复性实验称取同一批号样品6份，照上述供试品溶液制备的方法制备6份，按上述色谱方法分别测定含量，结果RSD＝1.9％，重复性良好。

　　2.5 中间精密度取黄杨宁片，照上述供试液的制备方法，由3人，分3 d，分别在不同仪器上测定同一批样品含量，结果RSD＝1.5％，精密度良好。

　　2.6 稳定性实验精密吸取上述供试品溶液20 μl，分别于0，1，2，4，6，24 h时精密吸取溶液20 μl，按上述色谱方法测定含量，结果RSD＝0.5％，供试品溶液在24 h内稳定。

　　2.7 加样回收率实验精密称取同一批已知含量的黄杨宁片样品5份适量，分别加入等量的环维黄杨星D对照品，按供试品溶液制备方法制样，照上述色谱方法测定含量，根据加入量和回收量计算回收率。结果见表1。

　　表1 黄杨宁片加样回收率实验结果（略）

　　结果表明：此方法回收率良好，符合测试要求。

　　2.8 3批样品含量测定结果取3批样品，分别按上述供试品溶液制备方法制备，照上述色谱方法测定含量，结果见表2。

　　表2 3批样品含量测定结果（略）

　　3 讨论

　　3.1 衍生化反应条件的选择在实验过程中，对衍生化试剂用量、反应时间、反应温度进行了考察。结果表明衍生化试剂用量在0.15 ml以后，峰面积不再增加；反应30 min后，峰面积也不再增加，反应温度基本无影响，故最终选择加入0.2 ml衍生化试剂，于室温反应30 min，作为衍生化反应的条件。

　　3.2 黄杨宁片供试品溶液处理方法筛选根据本品环维黄杨星D溶解度项下，及本品原料提取工艺，通过实际试验，选择多种方法提取环维黄杨星D，结果表明，直接用甲醇或氯仿提取效率较低，而采用0.5％冰醋酸水溶液加热超声提取，然后用氨水调节pH值，用三氯甲烷多次萃取，效果较好。结合本品回收率实验，精密度实验，本法能满足本品含量测定要求。

　　本高效液相色谱法方法学研究表明，采用柱前衍生化方法，用紫外检测器即能准确测定本品含量，方法可靠，专属性强，便于控制质量。本品比色法含量测定结果和高效液相色谱法测定结果相差较大，结合本品原料含量测定结果可见，由于本品原料中含有一定量的结构相似生物碱，用非水滴定法含量达100.1％，而液相法测定含量仅为81.6％，可见本品非水滴定法不能完全反应本品原料中环维黄杨星D（C26H46N2O）的真实含量；而本品片剂采用酸性染料［2］比色法，测定的也为总生物碱，专属性不强，导致测定结果也不能反映环维黄杨星D的真实含量。

　　【参考文献】
　　［1］许新军，张正行，盛龙生，等.柱前荧光衍生化RP-HPLC测定环维黄杨星D含量［J］.药学学报，2002，37（5）：359.

　　［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：591.

日期：2009年10月27日 - 来自[色谱论文]栏目

柱前衍生化毛细管气相色谱法测定土壤中井冈霉素A残留

　　【摘要】 建立了土壤中井冈霉素A残留的柱前衍生化气相色谱分析方法。每10　g土壤样品使用40　mＬ 10%氨水振荡提取60　min，不需要其它净化处理。浓缩吹干后采用N,O双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSA）对井冈霉素A衍生化反应并进行毛细管气相色谱（FID）分析。井冈霉素A衍生物在4.4～71 mg／L范围内呈良好的线性关系(r=0.9983)；方法的添加回收率在94.８％～101.６%之间；相对标准偏差为1.1％～2.9%；方法的最小检出浓度为0.20 mg／kg。

　　【关键词】 井冈霉素，残留分析，土壤，气相色谱，衍生化

　　1 引言

　　井冈霉素是吸水链霉菌井冈变种产生的水溶性农用抗生素，是1973年上海农药研究所从江西井冈山地区土壤中分离得到的，化学名称为葡萄糖井冈羟胺或N[（1S）1,4,6/53羟甲基4,5,6三羟基2环己烯基][OβD吡喃葡萄糖基（1→3）]1S（1,2,4/3,5）2,3,4三羟基5羟甲基环己胺（jinggangmycin），有A～F ６种结构。其中井冈霉素A（validamycin A）是最有活性的物质[1]，主要用于防治水稻纹枯病菌，对丝核菌亦有良好生物活性，具有强内吸性，兼具保护和治疗作用，此药耐雨水冲刷，药效可持续15～20 d。目前已成为我国生产量最大的农用抗生素[2]。

　　张存政等[3]对水稻叶片中井冈霉素残留量的测定。有关井冈霉素在作物和土壤中的残留分析方法鲜有报道。因为井冈霉素A是氨基糖苷类化合物，分子中含多个极性基团，难于气化，不能直接进行气相色谱分析。对井冈霉素A原药和制剂的分析多采用高效液相色谱法[4]、毛细管电泳法[5，6]、离子交换色谱法[7]、薄层荧光法[8] 及填充柱气相色谱衍生化方法 [9] 等。

　　井冈霉素A在210　nm处有最大紫外吸收，目前多采用高效液相色谱带紫外检测器进行检测分析，但由于大多数物质在210 nm下均有较强的吸收，在进行液相色谱分析时受到土壤基质中的许多杂质干扰，采用多种净化方法如液液分配、固相萃取等均不能将杂质有效去除。本实验建立了井冈霉素A柱前衍生化毛细管气相色谱分析的方法，可以避开杂质的干扰。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　6890N气相色谱仪(氢火焰检测器，美国Agilent Technologies)带有7683自动进样器，分流/不分流进样口； HP5MS熔融石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm, 0.25μm, 美国Agilent Technologies）； BF2000氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）； 20200AB台式电热干燥箱（中国天津泰斯特仪器有限公司）； Sartorius AG百分之一天平；HZQC空气浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）； EYELA N1000型旋转蒸发仪（日本）；布氏漏斗及抽滤瓶； 7 cm定性滤纸；100 mL具塞三角瓶；100 mL鸡心瓶；防溅球； 1 mL注射器； 0.22 μm水系滤膜等。

　　井冈霉素A标准品（93.6%，上海农药研究所提供），用超纯水配制成71.00 mg/L的标准贮备溶液置于4 ℃冰箱中备用；N,O双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSA，分析纯，阿法埃莎公司）；吡啶（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三甲基氯硅烷（TMCS，化学纯，国药集团化学试剂有限公司）；氨水（分析纯，Ammonia Solution 25%，北京北化精细化学品有限责任公司），配制成Ｖ（氨水）∶Ｖ（水）=1∶9的提取液；甲醇（色谱纯, SK Chemicals, Korea）。

　　2.2 色谱分析条件

　　载气：高纯氮气，补充气（氮气）：30.0 mＬ／min；空气：300.0 mＬ／min；氢气：30.0 mＬ／min；柱流速： 1 mＬ／min；进样量：2 μＬ，不分流进样；进样口温度： 240 ℃；检测器温度：280 ℃；柱初始温度80 ℃（1 min）30 ℃/min280 ℃（10 min）。

　　2.3 实验方法

　　2.3.1 土壤样品前处理采集北京周边地区农田中未施药的空白土壤，采集深度10 cm，充分混匀，保存于4 ℃冰箱中备用。

　　准确称取10 g土壤于100 mＬ具塞三角瓶中，加入40 mＬ 10%氨水提取液，于20 ℃振荡箱中振荡1 h，振速约130 r/min。将土壤提取液减压过滤，以6 mL 10%氨水溶液分３次洗涤锥形瓶并转入布氏漏斗淋洗土壤，待提取液抽干后，将抽滤瓶中的滤液转入鸡心瓶，再用4 mL 10%氨水溶液分两次洗涤抽滤瓶，一并转入鸡心瓶，于60 ℃水浴下旋转蒸发浓缩。60 ℃容易导致提取液沸腾，旋转蒸发时要接防溅球，浓缩到近干，将最后一滴氨水转入1 mL注射器，再用0.8 mL甲醇洗鸡心瓶，一并转入注射器，经0.22 μm滤膜过滤于色谱进样瓶中，氮气吹干仪吹干，待衍生化。

　　2.3.2 衍生化反应用移液枪依次取0.1 mL N,O双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSA）、0.1 mL三甲基氯硅烷（TMCS）、0.2 mL吡啶加入经氮气吹干的进样瓶，试剂加入过程有白色气体冒出，迅速将进样瓶瓶盖旋紧，充分振摇后置于80 ℃电热恒温箱中反应30 min，30 min内取出小瓶振摇２～3次，待反应完全后供气相色谱分析。标准样品以同样方法衍生化。

　　3 结果与讨论

　　3.1 线性关系的测定

　　将71.00 mg/L井冈霉素A标准溶液用超纯水梯度稀释配得71.00 、35.50、17.75、8.88和4.44 mg／L系列标准溶液。5个浓度的标准溶液各取400 μＬ分别装于色谱进样瓶中，氮气吹干水后进行衍生化反应并进行气相色谱测定，以井冈霉素A标准溶液浓度与衍生物峰面积作标准曲线，线性关系良好。线性方程为：Y=0.4633X－1.4183，其中Y为井冈霉素A衍生物峰面积，X为标准溶液浓度，相关系数为r=0.9983。

　　在2.2色谱条件下，井冈霉素A衍生物的相对保留时间为12.2　min。以信噪比S/N=3作为仪器检出限时，此条件下仪器的最低检出浓度为4.4 mg／L，井冈霉素A标准品衍生物色谱图与仪器的最低检出浓度色谱图见图1。

　　图1 井冈霉素A标准品衍生物色谱图（71.00 mg／L）(a)和仪器最小检出浓度色谱图（4.44 mg／L）(b)（略）

　　3.2 提取条件的选择

　　井冈霉素是强极性化合物，极易溶于水，在甲醇中也有很好的溶解度。实验对比了甲醇、V(甲醇)∶V(H2O)=9∶1、纯水3种溶剂对土壤中井冈霉素进行提取，结果显示，使用3种提取液都不能将土壤中的井冈霉素提取出来，而且使用甲醇作提取溶剂气相色谱分析时有一较大的杂质峰干扰，而使用纯水提取没有此杂质干扰(如图2)。

　　图2 标准溶液(a)、甲醇提取（b）和纯水提取(c)的色谱图（略）

　　常规溶剂并不能有效地从土壤中提取井冈霉素，原因可能是土壤对其存在轭合作用，这就是常说的结合残留。国际原子能利用委员会(IAEA)于1986年确定“用甲醇连续萃取24 h后仍残存于样品中的农药残留物为结合残留” [10]。本实验采取甲醇提取24 h后，井冈霉素仍未见检出，属于结合残留的范畴。农药可通过多种化学键与土壤组分发生吸附、络合或固定作用，结合残留主要存在于样品的具有多种官能基团的网状结构组分中[11]。土壤作为一种胶体状物质，疏松多孔，井冈霉素分子本身是一个多羟基糖苷类化合物，极易与土壤形成氢键结合残留。文献报道土壤中结合残留的释放方法有多种，如高温分解法和高温蒸馏法、酸碱水解法、超临界流体萃取法、化学释放法及微生物释放法等等[12]。本实验使用可加热的磁力搅拌器，分别采用甲醇和纯水对土壤进行4 h的沸腾回流提取，仍旧未能提取成功。

　　近年来大量研究表明，土壤中的结合残留主要分布在土壤腐殖质中，主要有胡敏酸、富里酸和胡敏素。关于土壤有机质组分的萃取分离多采用碱提取、酸沉淀等方法来释放结合残留。井冈霉素的稳定pH范围是4～10，本实验采取10%的氨水（pH=9）作为提取溶剂，室温振荡1 h，提取回收率接近100%，土壤空白及添加回收色谱图见图3，说明碱液提取是最佳提取方法。实验了用40 mL提取液分别对10、20和30 g土壤进行提取，结果表明，40 mL提取液只能对10 g土壤中的井冈霉素完全提取；20 g土壤中提取回收率较低；30　g土壤中完全不能提取出来。故确定了10%氨水溶液为提取溶剂以及提取溶剂用量为40 mＬ/10 g土壤。

　　图3 土壤空白(a)、标准溶液(50.00 mg／kg)（b）和土壤添加回收(添加量2.00 mg/kg)(c)的色谱图（略）

　　3.3 衍生化试剂的选择

　　最常用的气相色谱衍生化方法有硅烷化、酯化和酰化等。此外，烷基化、裂解、缩合和成环反应也是常用反应方法。根据糖类化合物多羟基的特点，采用硅烷化试剂衍生，硅烷化反应常用于含有ROH、RCOOH、RNHR等质子性基团的物质，原理是硅烷化试剂的强电负性原子与质子性基团的氢原子形成共价化合物而脱去，反应式如下：

　　R3Si—X＋H—R′R3Si—R′+HX

　　最常用的硅烷化试剂有三甲基硅烷（TMS）、三乙基硅烷（TES）、三甲基氯硅烷（TMCS）、 N,N二乙氨基二甲基硅烷（DADS）及叔丁基甲氧基苯基硅烷（TBMPS）等。硅烷化反应通常在密闭的小瓶中进行，因为所有硅烷化试剂及其衍生物都易受潮气的水解作用，整个反应过程要求严格的无水环境。在大多数情况下，试剂本身就是很好的溶剂，需要溶剂时应避免使用含有活泼氢的溶剂，吡啶是最合适的溶剂。此外，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜和四氢呋喃等也能做硅烷化反应的介质[13]。本方法使用三甲基氯硅烷（TMCS）做硅烷化反应的催化剂， N,O双（三甲基硅烷基）乙酰胺（BSA）作硅烷化试剂，吡啶作反应溶剂对井冈霉素A进行了定量分析。

　　3.4 方法的添加回收率实验

　　在空白土壤中添加井冈霉素A标准溶液，分别进行0.20、2.00 mg／kg两个浓度的添加回收率实验，每个浓度重复5次，按上述方法进行提取和气相色谱衍生化分析，测得结果列于表1。样品的平均回收率和相对标准偏差均令人满意。

　　表1 井冈霉素A在土壤中的添加回收率（略）

　　在最优色谱条件下, 方法的检出量为4×10－10 g,最低检出浓度为0.20 mg/kg。本方法操作简便，符合农药残留检测要求。

　　【参考文献】

　　1 Han XiＬai（韩熹莱）. Agricultural Encyclopedia, Volume of Pesticide（农业百科全书，农药卷）. Agricultural Press（农业出版社）, 1993: 145～146

　　2 Zhu YongＨe（朱永和）, Wang ZhenＲong（王振荣）, Li BuＱing（李布清）. Thesaurus of Pesticide（农药大典）. China Sanxia Press（中国三峡出版社）,　2006:607～608

　　3 Zhang CunＺheng（张存政）,　He DanＪun（何丹军）, Luo AiＬan（骆爱兰）, Liu XianＪin（刘贤进）, Liu Min（刘敏）, Ji LiＬi（季丽莉）. Journal of Nanjing Agricultural University（南京农业大学学报）， 2005, 28(2):107～１１０

　　4 Hu DeＹu（胡德禹）, Song BaoＡn（宋宝安）, Fang Tao（房涛）. Chinese Journal of Pesticides（农药）， 1998, 37（7）: 22～23

　　5 Hsiao ＹＭ, Lo ＣＣ. J. Agric. Food Chem.， 1999, 47： 3723～3726

　　6 He J, Chen S W, Ruan L F, Cao L L, Yao J, Yu Z N. J. Agric. Food Chem.， 2003, 51： 7523～7527

　　7 Fredenhagen Ａ. J. Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2004：２６１（２）：　249～253

　　8 Xu Hui（徐辉）. Journal of Shanghai Agricultural College(上海农学院学报)， 1998, 16(2): 148～151

　　9 Yao JunＱing（姚君卿）. Chinese Journal of pesticides（农药）， 1984, 03: 42

　　10 Ou XiaoＭing（欧晓明）, Fan DeＦang（樊德方）. Chinese Journal of pesticides（农药）， 2006，　４５：　１０

　　11 Lu Yi－Ｔong（陆贻通）,　Zhu　Jiang（朱江）,　Zhou Pei（周培）.　Bulletin of Science And Technology（科技通报）, 2005，２１：３

　　12 Guo JiangＦeng （郭江峰）, Sun HeＪin（孙锦荷）. Agroenvironmental protection（农业环境保护）， 1996, 15（6）: 270～273

　　13 Sun YuＱing（孙毓庆）. Modern Chromatography and Its Application for Pharmaceutical Analysis（现代色谱法及其在药物分析中的应用）. Beijing(北京): Science Press（科学出版社）, 2005: 558

日期：2009年7月25日 - 来自[色谱论文]栏目

柱前衍生高效液相色谱法测定猪肉中5种青霉素残留量

　　摘要：样品采用乙腈直接提取,离心分离及用液2液分配和固相萃取(C18柱) 净化方式,经衍生后,用液相色谱紫外检测器测定猪肉中5 种青霉素残留量。使用的分离柱是Nova Pak C18柱,流动相为乙腈和磷酸盐混合液。方法检出限0. 02 mg/ kg ,回收率为70. 9 %～96. 5 % ,相对标准偏差为3. 10 %～6. 71 %。

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日期：2009年7月25日 - 来自[色谱论文]栏目

高效液相色谱柱后衍生测定鸡组织中甲基盐霉素残留量

　　【摘要】 建立了鸡组织中甲基盐霉素的高效液相色谱柱后衍生化分析方法。样品经异辛烷提取，离心后上层有机相过硅胶固相萃取小柱，洗脱液浓缩后用V(甲醇)∶V(水)=90∶10混合液溶解。采用Inertsil ODS3 C18柱，以V(甲醇): V(乙酸)∶V(水)=94∶3∶3为流动相，香草醛为衍生剂进行高效液相色谱柱后衍生分析，520 nm检测，外标法定量。方法检出限为6 μg/kg; 定量限为20 μg/kg; 添加浓度在20~1800 μg/kg范围内，平均添加回收率为764%~931%; 批内相对标准偏差(RSD)在26%~89%之间; 批间相对标准偏差(RSD)在47%~97%之间。样品浓度在０．０7~10．0 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，r>09993。

　　【关键词】 鸡组织，固相萃取，甲基盐霉素，柱后衍生，残留

　　Determination of Narasin in Chicken Tissues by High Performance　Liquid Chromatography with Postcolumn Derivatization

　　WU YinLiang, WANG LiJun, YANG Ting, ZHAO Jian, HUANGFU WeiGuo

　　(The Supervision, Inspection & Testing Center Of Agricultural Products Quality ＆ Security，Ministry of Agriculture, Ningbo 315040)

　　Abstract A method was developed for determining residual narasin in chicken tissues by HPLC with postcolumn derivatization. The samples were extracted with isooctane. Further cleanup was performed on LCsi cartridge after centrifugation. Then the eluent was dried by nitrogen and residues were dissolved in methanol, water mixture (90∶10 v/v). The samples were analyzed on an Inertsil ODS3 C18 column with a mixture of methanolacetic acidwater as the mobile phase and vanillin as the derivatization reagent. The detection wavelength was 520 nm. The samples were quantified with the external standard calibration curve method. The limit of detection and the limit of quantification for narasin in chicken tissues were 60 μg/kg and 20 μg/kg, respectively. The average recoveries of narasin in chicken tissues were 764 %－931 %, the intraassay relative standard deviations were 26 %－89% and the interassay relative standard deviations were 47%－97% at spiked levels of 20－1800 μg/kg. There was a good linear correlation (the calibration coefficient is above 09993) between the peak areas and concentration of narasin in the range of 70－10000 μg/L.

　　Keywords Chicken tissues, solid phase extraction, narasin, postcolumn derivatization, residue

　　1 引言

　　甲基盐霉素(narasin)是金色链霉菌（streptomyces aureofaciens）的发酵产物，属于聚醚类抗生素，常作为药物添加剂混料饲喂来预防鸡球虫病[1]。但是这种用药方式易导致动物性食品中药物残留和球虫出现抗药性[2]，从而影响畜禽产品的质量安全和动物生产。我国已制定了甲基盐霉素在鸡组织中的最高残留限量，其中鸡肌肉、鸡皮/脂肪和鸡肝中最高残留限量分别为600、1200和1800 μg/kg。因此，有必要建立鸡组织中甲基盐霉素残留分析方法。

　　对莫能菌素和盐霉素这两种聚醚类抗生素的残留分析主要采用柱前衍生HPLC法[3]和柱后HPLC法[4~6]；而甲基盐霉素的残留量分析主要采用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）[7,8]、柱后HPLC法[9~11]、LC/MS法[12,13]和LC/MS/MS法[14~16]，涉及的对象有饲料、鸡肉、鸡内脏、鸡蛋和鱼组织等[7~16]。本实验根据甲基盐霉素的化学性质建立了柱后衍生分析方法，采用异辛烷为提取剂，步骤相对简单，提取液可直接过固相萃取小柱。本方法灵敏度高、准确且稳定。

　　2 实验部分

　　21 仪器与试剂

　　2690996高效液相色谱仪，配柱后衍生装置和二极管阵列检测器（Waters公司）；Inertsil ODS3 C18色谱柱(25 cm×46 mm，5μm)；离心机（Sigma公司）；UltraTyrrax T25型匀质器（德国）；硅胶SPE小柱（500 mg，3 mL）。甲基盐霉素标准品（Sigma 公司）。香草醛（Fluka公司）；衍生液配制：量取5 mL H2SO4，缓慢加入到250 mL甲醇中，置冰水浴中缓慢加入20 g香草醛，混匀，脱气5 min后避光保存，临用现配；异辛烷和甲醇均为色谱纯(Fisher公司)；乙酸和浓H2SO4为分析纯（北京化学试剂公司）。

　　22 色谱分离条件

　　流动相：V(甲醇)∶V(乙酸)∶V(水)=94∶3∶3；流速： 08 mL/min；衍生液流速：04 mL/min；反应温度： 95 ℃；检测波长： 520 nm；进样量： 100 μL；柱温： 30 ℃。

　　23 样品处理

　　231 样品中甲基盐霉素的提取

　　称取组织样品(50±005）g于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL蒸馏水，以10000 r/min以上的速度均质60 s，再加入10 mL异辛烷，旋涡混合3 min左右，以3000 r/min离心5 min，吸取上层有机相,备用。然后加入10 mL异辛烷，按上述步骤重复提取一次，取上层有机相,备用，合并两次离心后的有机相。

　　232 固相萃取净化

　　用5 mL异辛烷预洗硅胶小柱，不使流干，加入231所得的上清液，然后再用5 mL异辛烷淋洗，过柱流速控制在1~2 mL/min，然后抽干小柱，再用2 mL甲醇洗脱，于40℃水浴中氮气吹干后用10 mL V(甲醇)∶V(水)=90∶10混合液溶解，高效液相色谱仪测定。

　　24 线性实验

　　称取100 mg甲基盐霉素于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得100 mg/L甲基盐霉素标准储备液。吸取标准储备液10 mL于100 mL棕色容量瓶中，得10 mg/L标准工作液。将标准工作液用流动相稀释成70、250、500、1000和5000 μg/L的标准工作溶液和10 mg/L标准工作溶液一起进行HPLC分析。每个浓度进样6次，以标准工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

　　25 添加回收率实验

　　添加回收率实验添加浓度为20、100、300和600 μg/kg（鸡肉），20、100、600和1800 μg/kg（鸡肝），20、100、300和600 μg/kg（鸡肾）及20、100、600和1200 μg/kg（鸡脂肪）。称样后加入标准溶液，涡旋混匀放置05 h后进行样品处理，其它步骤同23。

　　3 结果与讨论

　　31 色谱条件的建立

　　本实验色谱条件基本参照文献[4]进行分析，其中4种组织的添加浓度均为20 μg/kg，所得图谱见图1。从图1可知，甲基盐霉素出峰时间为656 min，峰形较好，在空白组织中未见干扰。

　　32 提取和净化条件的选择

　　甲醇、乙睛、丙酮、异辛烷和正已烷可用于提取聚醚类药物，但为减少后续净化的压力，通常选择极性相对较低的异辛烷、氯仿、乙酸乙酯等。本实验对异辛烷的提取条件进行了优化，发现当鸡肉中添加浓度为5000 μg/kg时，提取两次（每次10 mL）直接进样扣除空白后的回收率>95%。通常，选择正相固相萃取净化动物组织中的聚醚类药物，有氧化铝小柱和硅胶小柱。本实验在参考文献[4]的净化方法和不影响方法灵敏度的基础上，将10 mL二氯甲烷洗涤液改为5 mL异辛烷，6 mL二氯甲烷/甲醇洗脱液改为2 mL甲醇，节约了溶剂，缩短了实验时间。33 衍生化条件的优化

　　固定流动相流速，以4种鸡组织样品为基质，考察衍生液的流速对信噪的影响。实验发现，当衍生液流速为01~04 mL/min时，各种组织的添加样品（浓度100 μg/kg）的信噪比逐步增加；流速为04~08 mL/min时，信噪比均无明显变化。实验选择衍生液的流速为04 mL/min。

　　34 线性实验

　　根据24线性实验方法，在07~100 mg/L范围内，以峰面积对甲基盐霉素浓度作图，所得标准曲线方程为y=1058x+105，相关系数均大于09993，说明本方法适用于甲基盐霉素的定量分析。

　　35 方法的检出限、回收率和精密度

　　采用在空白样品中添加标准溶液的方法，对4种鸡组织进行了4次添加回收率重复实验，每次每个浓度点进行5次重复实验，实验结果见表1。从表1可见，鸡组织中各浓度点平均添加回收率在764%~931%之间。批内相对标准偏差(RSD)在26%~89%之间，批间相对标准偏差(RSD)在47%~97%之间，可见本方法具有较好的准确性和稳定性。甲基盐霉素在4种鸡组织中的检出限均为60 μg/kg (S/N=3)，定量限均为200 μg/kg (S/N=10)。表1 鸡组织中甲基盐霉素的平均回收率和相对标准偏差（略）

　　36 方法应用

　　利用本方法对甲基盐霉素预混剂在鸡体内休药期进行了检测。休药0 h,鸡肉中含甲基盐霉素(852±26) μg/kg（n=3）;休药48 h后,鸡肉中未检出甲基盐霉素。

　　【参考文献】

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日期：2009年7月24日 - 来自[色谱论文]栏目

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