主题：血清

　　说起“民海血清”，普通人可能很陌生，但在人用、兽用疫苗血清市场上，却是一个响当当的品牌，也是业内对牛血清产品的爱称。

　　要在兰州国家高新区这么大的区域内找到民海生物工程有限公司，可不容易。在高新区管委会工作人员的带领下，在一栋不起眼的办公楼上，记者才看到民海生物“细胞”形状的企业LOGO标志。

　　不大的办公区，简单的会议室，古典沉稳的木质装修……构成了看似规模不是很大的民海生物工程有限公司。然而，从2000年成立至今,这样一个从最初10来人曾加到30余人员工的企业，创造了数个“第一”，并且成长为国内动物血清行业的龙头企业和国内最大的牛血清生产企业。在国内兽用疫苗血清市场上，民海已经占据了40%以上的份额。企业产值从2001年的380万达到现在的3800万，累计销售2亿，上缴利税约3800万。

　　这样的骄人成绩，民海生物又是如何取得的?当记者见到生物工程与技术国家民委重点实验室、甘肃省动物细胞工程技术研究中心主任、兰州民海生物工程有限公司总经理、西北民族大学生命科学与工程学院副院长马忠仁先生之后，这个“小巨人企业”的谜底被一一揭开。 记者 唐华伟

　　“刚开始连简单的办证都不知道去哪儿办”

　　“我生长在草场资源丰富的甘南藏族自治州，那里水草丰美，是远离污染的一片净土。”在民海公司不大的办公室，一身正装的马忠仁透出企业家的睿智和学者的儒雅，马经理一开始并没有直奔采访主题，而是向记者讲起了他的家乡——草原。

　　“在甘南这片美丽的草原上，存活着一种尕里巴小牛，它是天然牧场放牧的牦牛和黄牛杂交二代产物，这种小牛一出生就被淘汰。马忠仁介绍，以甘南州合作社为中心方圆50公里每年有4万头小牛被淘汰。如果能将这些丰富的尕里巴小牛资源利用起来，不仅能改变这种原始的淘汰习惯，还能给广大牧民带来不菲的经济收入。由此，在甘南草原土生土长，同时又在西北民族大学从事动物科学研究的马忠仁教授，于1996年在甘肃省科技厅陈继处长的支持下，开展了一个名为“新生小牛资源的开发与利用”专门研究牛血清生产的项目。

　　1999年，美国海克隆实验室公司驻北京办事处的主任潘东博士得知国内有从事牛血清研发的项目，因此专程赶往兰州与马忠仁见面。潘东博士在表达了海克隆实验室与西北民族大学合作在国内生产牛血清的意愿后，双方一拍即合。随后美国海克隆实验室公司总裁Leland Foster专程来兰州与西北民族大学商谈合作事宜。Leland Foster同时邀请，西北民族大学校长和科技处处长去美国考察，为公司成立做准备。最初公司注册资本830万元人民币，美方以35.8万美元的设备入股，兰州民海生物工程就此诞生。

　　和很多企业一样，民海生物工程的发展并不是一帆风顺。在进入公司之前，马忠仁对外的职务多和动物细胞工程技术、生命科学与工程有联系，属于纯研究领域学者，对市场一窍不通。

　　“别说选厂址、建厂房、拿批文、调试设备，就连简单的办证都不知道去哪儿办。”面对这些，对没有任何经营公司经验的马忠仁来说确实有难度，但凭着迎难而上的韧劲，让公司就这样建起来了。

　　创立牛血清生产成熟工艺

　　公司成立后，经过详细了解研究，马忠仁相当看好民海生物的未来前景：主攻研发并规模生产各种规格高品质动物血清系列产品的任务由西北民族大学生命科学与工程学院、甘肃省动物细胞工程技术研究中心及民海生物工程有限公司承担，发挥动物医学、动物科学、食品科学与工程专业的学科优势，同时以企业、科研平台为基础，以教学和科研促进产业发展，形成产学研结合的特有模式与规范体制必将产生良好的经济效益和社会效益。

　　但同时，马忠仁也清楚地认识到当时公司在市场操作上的不足：民海生物工程创建初期几乎全部是清一色的科研、生产人员，既没有专业的营销人员，也没有像样的市场体系，这势必会极大影响产品的销售，而在市场培育不足的情况下，产业化进度也过于冒进。

　　除此之外，由于中美两国在许多方面存在差异，美方的设备、工艺在进入中国后完全发挥不了原来的作用。2001年1月21日，民海生物第一个批号的新生牛血清生产出来，在试生产中，马忠仁发现美方的工艺与中国的实际有出入，很显然，照搬美国的一套是根本行不通的。因此尽快建立一套生产牛血清的成熟工艺成为摆在马忠仁和公司科研人员面前的一道难题。在这种情况下，马忠仁带着大家反复修改、验证工艺，历经多少个不眠之夜，终于确立了一套成熟的血清生产工艺。

　　“回想起来，除了在产品质量和服务质量上下功夫，民海生物科研人员的执著是我们保持市场优势的关键。”马忠仁告诉记者，当时公司科研人员全上，试用中方自己的工艺生产，经过不断修改调整，终于用有了一套自主的牛血清生产成熟工艺。自此，兰州民海生物公司正式走上了在血清行业中摸爬滚打的道路。

　　“公司成立是时候，也是国内血清市场还不成熟的阶段，牛血清生产厂商可以说是散、乱、差，甚至是鱼目混珠， 能够规范生产牛血清厂商不多。”马忠仁经理介绍，在这种情况下，公司对牛血清的生产提出了更严格的要求，一定要生产出高品质的牛血清产品。

　　同时，随着生产工艺的成熟，一个大胆的想法在公司领导层形成——制定严格的企业标准。企业标准不仅对公司生产过程控制有着积极的意义，而且也是提高产量保证质量的最佳办法。由此，公司决定将这个艰巨的任务交到质量检验部负责人乔自林的手中。

　　建立公司质量管理体系

　　2002年民海生物质量检验部负责人乔自林开始着手起草公司的企业标准。2005年，甘肃省质量技术监督局标准化处、兰州市质量技术监督局标准化处会同省内有关专家，对公司的企业标准《动物血清》进行审定，随之即作为甘肃省企业产品标准备案登记。民海公司严格按照公司的企业标准生产，产品质量受到客户的肯定。

　　随后，兰州民海生物工程有限公司通过了中国生物技术协会专家组的考核和现场抽样检查，取得了《牛血清生产企业达标合格证书》，成为第一批获得此证书的企业。只有取得了该证书的企业才能向人用疫苗生产厂家提供血清，使用于人用疫苗生产的血清，在质量上有着更高的要求。

　　同时，由侯兰新教授负责建立了公司的质量管理体系，顺利通过中国质量认证中心专家的全面审核，在国内成为首家通过ISO9001质量管理体系认证的动物血清生产厂家。公司质检部负责人乔自林经过多次试验，建立了公司的检验体系。公司的销售网络东起上海、江浙，西至乌鲁木齐，南到海南、两广，北达东三省，在兽用疫苗血清市场已经占据了40%以上的份额。

　　企业的发展外部环境非常重要。不可否认，兰州民海今天的成就除了自己的努力之外，与高新区和创业服务中心的鼎立支持是分不开的。从企业成立之初，高新区和创业服务中心就竭尽全力为民海争取优惠政策，时刻关注民海的每一步，相伴民海一起走到了今天。经过十一年的发展，现在，兰州生物工程有限公司不仅成为行业龙头，而且成为国内最大的牛血清生产企业，产品遍布全国，拥有客户200多家。注册资本由成立之初的830万增加到1480万。员工由以前的10来人增加到现在的30多人。员工中65%以上都拥有本科学历，年产量由以前设计的3万升扩展到现在的15万升。产值从2001年的380万达到现在的3800万，公司累计销售2亿，累计上缴利税约3800万。由于民海每年要从内蒙、宁夏、陕西、甘肃等地采集约15万头小牛的血液，使牛血资源变废为宝，带动了这些地方的发展，使农牧民收入年增5000多万元。

　　在创造经济价值的同时实现企业社会效益

　　在交谈中，记者发现马忠仁经理对于血清技术谈论的并不多，在他看来血清技术在全国来说相对成熟，更多看重的是通过办企业，将实践教学、技术创新、产学研结合，在创造经济价值和社会效益的同时，有效地推动学科建设和产学研平台建设：西北民族大学生命科学与工程学院的科研团队，通过对兰州民海生物工程有限公司的组建、运行、管理及科研平台建设，对教育教学有了更加深入的认识和理解;通过整合教学资源、科研团队建设、教学实习基地建设等一系列措施，组建新型教学团队;建设并充实专业实验室，突出教学计划和教学大纲内容的实践性环节，对培养基础扎实、实践能力强的应用技术型人才奠定了坚实基础。

　　如果说在企业发展初期，马忠仁想的更多的是如何从推动产品销售的角度来促进企业发展的话，此时，经过多年的沉淀摸索，他开始思考民海生物更深层的战略决策问题。

　　“在四周虎视眈眈的监视之下，我们必须做好每一点，否则一不小心就会招来问题。这种情况，相当于一个高手给你陪练，你必须不断完善自己，提高自己，才有机会活下去。”而且，马忠仁对企业经营的认识也在这个过程中得到升华，“原来可能都不会想到企业的社会价值、企业文化、企业价值观建设等问题，至少不会上升到现在的高度来考虑问题。但现在，这些让我开始思索更多。”

　　“生物制药与传统销售是完全不同的两个领域，要找到合适的渠道途径。”马忠仁从市场培育的基础层面着手解决公司的长远发展问题，“我分析外企的市场策略，发现有一个做法跟我们不同。外企医药产品上市后，非常重视市场培育，做很多细致的、渗透性的工作，让市场各方充分了解产品。但国内的企业做法恰恰相反，今天产品上市，明天就必须赚钱，赚不了钱就要完蛋。这实际上是一种杀鸡取卵的思路，如果是这样，我们的企业怎么成长，怎么沉淀，如何在实现经济价值的同时实现社会价值?”

　　民海公司的建立同时也是产学研结合的一个典范。公司为学生将理论与实践相结合提供了一个平台，每年民海都接受学生来民海实习。同时民海也利用现有的客户群，推荐学生就业，缓解西北民族大学生科院学生的就业压力。

　　同时，兰州民海生物工程有限公司、西北民族大学和兰州高新技术产业开发区合作建立生物医药技术平台。平台面向兰州高新技术产业开发区所属的生物、医药技术相关企事业单位、项目组开放，以免费共享平台资源、委托检测、委托技术开发、合作技术开发、生物材料供应等多种形式相结合的方式，充分利用组建生物医药技术平台的优势和成立“甘肃省动物细胞工程技术研究中心”的契机，为生命科学研究提供标准细胞株和动物细胞资源、动物细胞生物反应器的推广应用等及相关技术服务，进行生物技术产品的创新、开发、转化以及推广应用。

稻米是人类的主要食粮之一，如今它又有了另一个作用：我国科学家已成功研制出运用稻米生产一种关键的人体血液成分的技术。这种血液成分叫“人血清白蛋白”（HSA），在临床上用于治疗由于严重烧伤、肝硬化等原因造成的失血过多的状况，也用于药物和疫苗的生产，是全球重要而紧缺的资源。
现行获取HSA的方式来自人捐献的血浆，我国杨代常教授团队的研究却为人们昭示着一个美好的前景：通过转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白。他们究竟是怎么做到的？从实验室到市场，还有多远的路要走？
策划：赵洁  采写：许珍  
图片：Gettyimages（署名除外）
稻米所造HSA与血浆所造等同
所谓“种瓜得瓜，种豆得豆”，谁能想到稻米竟能种出人的血液成分来？然而，科学就是这么神奇。
武汉大学生命科学学院教授杨代常带领研究组经过六年的艰苦研究，在植物源替代血浆来源的人血清白蛋白的研发上终于取得了突破性进展。2011年10月31日，他们的研究成果在线发表于《美国科学院院报》（PNAS）上。这篇题为《转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白》的论文一经发表，立刻引起了包括《自然》杂志在线新闻版，以及《洛杉矶时报》、《时代周刊》等知名媒体的关注。
目前，常见的人血清白蛋白大多数从人的血浆中提取，这样的生产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还具有携带病毒传播的高风险性。国际上以重组人血清白蛋白替代血源产品的应用已成为趋势，国内市场需求也逐年扩大。然而，高纯度重组人血清白蛋白的规模化生产技术和质量控制技术却是世界性难题。杨代常及其同事研发出的转基因稻米所生产的HSA，经实验证明，和来自人血浆的HSA是等同的。
这种等同，不仅是化学和物理特性上相同，而且在医学和免疫反应实验中的表现也极其相似。在对患有肝硬化的大鼠所进行的实验中，无论来自人的血浆还是稻米的HSA都证明同样能有效缓解和肝硬化相关的症状。而且，使用稻米来源的HSA比使用血浆来源的HSA显示出更好的安全性。
HSA与血是不同的概念
“论文之所以会受到国际媒体的广泛关注，我认为最大亮点是用充分的科学证据证明了植物源的重组人血清白蛋白与临床使用的血浆源血清白蛋白具有高度的等同性，并且其具备的大规模生产工艺有重大的现实意义。这为日益紧张的血浆供应提供了确实可信的解决方案，这不仅是科技上的创新，  而且是经济上的革新。”杨代常教授在接受本报专访时表示。
国外各大媒体竞相报道了这项创新性研究，标题普遍耸动醒目。例如，美国“探索”频道在线新闻的标题为：“血来自石头吗？不。血来自大米？当然。”《时代周刊》的标题则为：“从一粒大米中挤出血来？”但是，在杨教授看来，严格来说，人血清白蛋白与血是两个完全不同的概念，人血清白蛋白是从血中提取的一个蛋白成分，不是血。“因而，用稻米生产人血清白蛋白不能理解为用稻米造血。”他表示。
一亩转基因水稻相当于200人献血
科学家之所以要耗时耗力开展寻求人血清白蛋白替代来源的研究，和人血清白蛋白特殊的功效以及如今临床应用面临的供需矛盾密切相关。
人血清白蛋白是人体内一种重要的蛋白质，约占健康人血液总量的30%。医用人血清白蛋白注射剂为黏稠的淡黄色液体，被称为“救命药”，被广泛地用于失血、创伤及烧伤等外科手术前后血浆容量不足而引起的休克，以及脑水肿、肝硬化、肾病综合征、腹水等各种原因引起的低蛋白血症。另外，人血清白蛋白作为人工血浆替代物，  能大量补充在战场、外科手术以及意外事故中的大量失血。此外，人血清白蛋白还用于疫苗的生产。
目前，全球人血清白蛋白的供求矛盾日益显著。杨教授介绍，我国人血清白蛋白的临床应用为120吨左右，疫苗生产约为30～40吨，加起来全年总需求量为150～160吨。全球每年的需求量则高达500吨。随着我国大力推进预防为主的方针，在疫苗生产方面的需求可能要增加15～20吨。据调查，我国原有从血浆提取人血清白蛋白的生产线只有1／3血浆供应，造成我国白蛋白的供应紧张局面。
如果利用植物生产出人类所需的人血清白蛋白，势必为缓解这种供需矛盾开辟一条康庄大道。从杨代常研究组目前收获的“产品”来看，一粒稻米种子中的血清白蛋白含量占可溶解蛋白质的10%以上，每公斤稻米中可提取2.75克血清白蛋白，这个产量在业内被认为具有非常可观的经济价值。照此估计，大约每亩水稻可以产生1公斤白蛋白。如果说一个人一次能献血200ml，一亩转基因水稻产出的人血清白蛋白量相当于200人的献血。
原理  将稻米变为蛋白“生产车间”
稻米为什么能生产出人所需的血清白蛋白呢？
简单而言，就是将人的血清白蛋白基因转入水稻中，使转基因水稻作为“生物反应器”生产出可供人类使用的人血清白蛋白。在这里，转基因水稻仅仅是借用的“生产场所”而已。
“生物反应器可以通俗地理解为‘生产车间’，就是利用某个物种的细胞作为‘蛋白质生产车间’生产人类或其他物种的蛋白质。”杨教授形象地介绍说。
更具体地说，就是将人血清白蛋白的基因通过遗传工程的技术，使其插入水稻某个染色体位置，形成一个新的水稻品种。在这种水稻的生长过程中，这个外源基因就利用水稻细胞的“原料和机器”生产这种蛋白质。在水稻成熟的过程中，人血清白蛋白不断地被合成、积累在大米的胚乳里。“我们的水稻就是将人的血清白蛋白基因通过这种方式导入水稻细胞中，利用水稻种子来生产人血清白蛋白。”杨教授说。
然而，稻米是否生产人血清白蛋白的唯一入选的植物呢？
杨教授说并非如此。理论上讲，植物细胞均可用作“生物反应器”来生产，但在遗传转化技术、生物安全性等方面，以水稻最佳。
此外，“利用动物细胞作为生物反应器也可以，但只是生产成本相对较高，规模化没有水稻那么容易而已。”杨教授表示。
此前，大米的胚乳已经用于制造其他人类的蛋白质，包括溶解酵素和铁传递蛋白，这些蛋白质存在于乳汁、唾液等人体的液体中。但是，用稻米造血清白蛋白还属首次。
而且，若最终被证实可行，用稻米制造血清白蛋白比采集血浆提取更高效、更安全。“用转基因植物生产人血清白蛋白，可以规避输血中的污染和通过血液传输病毒的风险。但利用重组DNA技术生产人血清白蛋白产量低，成本高，难以规模化，这是制约工业化生产白蛋白的三个难题。”杨教授说。
总的来说，稻米可能是目前为止最好的重组蛋白质的“工厂”。
争议：用转基因技术安全吗？
用水稻“种”出人血清白蛋白，因为涉及转基因，有人担心这种专用来造蛋白质的稻米会进入生物链及食物链，危及生态及人身安全。但杨教授认为，我国对于转基因生物的安全性具有一系列完备的评价和监管体系。目前他们已按照我国相关法规的要求进行小面积种植，在严格隔离的同时，建立较为完善的防止进入食物链的措施。另外，就如何控制花粉传播的问题，研究小组按照国家规定采取了严格的地理隔离保证其绝对安全。
“任何科学技术和安全评价都是利弊的平衡。我们的数据证明，由转基因水稻产生的人血清白蛋白是经高度纯化后产生的人体蛋白质，比其他方式生产的蛋白质具有更高的安全性，不会对人体和食品安全产生其他影响。”杨教授表示。
未来：惠及百姓路仍漫长
杨教授说，研发这项技术目前面临的最大困难是人们对这项技术的怀疑。“要使这项技术惠及老百姓还有漫长的路要走。由于技术太新，不易被人接受。”
接下来，杨代常研究组希望在临床上试验这种源自转基因稻米的蛋白质，他们正在进行相关研究，当完成后，将向美国食品及药品管理局提交临床试验的申请。杨教授介绍，从研究到临床应用还有很多工作有待完成，从科学层面上，主要是针对植物体系的杂质的安全评价，从产业化层面，这项国际领先技术在工艺规模化方面没任何参考。
另外，从药品审批层面上，我国对应的生产标准和审批的法规尚不健全，获得批号尚待时日。因此，“要完成各种相关的研究，预计进入临床研究需要两年或更长的时间来完成，获得批号可能需要5年或更长的时间。”杨教授表示。

12月14日，芬兰国家技术研究中心发表新闻公报说，由该中心和芬兰东部大学共同完成的研究发现，一种指示组织缺氧和磷酸戊糖途径的分子信号，是阿尔茨海默氏症的前兆。
所谓磷酸戊糖途径，是葡萄糖氧化分解的一种方式。由于阿尔茨海默氏症（早老性痴呆症）目前无法治愈，因此尽早检测和及早治疗非常重要。芬兰研究人员最近发现，可以通过检测血清在症状出现前数月甚至数年就查出这种疾病。
公报说，研究人员分别采集阿尔茨海默氏症患者、轻度认知障碍患者及健康对照组的血清样本，并对他们进行跟踪观察。27个月内，143名轻度认知障碍患者中的52人患上阿尔茨海默氏症。这52人的血清样本中均可检测到一种指示组织缺氧和磷酸戊糖途径的分子信号。通过对代谢途径的数据分析，研究人员发现磷酸戊糖途径与阿尔茨海默氏症的病变有关，组织缺氧和氧化应激是早期病变的反映。
芬兰国家技术研究中心指出，医生评估患者的神经认知功能时可以配合这种血清检测方法，来辨别需要接受综合治疗的高危患者。
阿尔茨海默氏症是一种脑部病变，发病原因尚不明确。临床症状表现为认知、记忆和语言功能障碍等。目前还没有有效的治愈疗法，现有药物只能缓解症状和减缓病程的进展。

　　将人类基因通过遗传载体整合到水稻基因组内，形成新的水稻品种，最终在大米的胚乳中合成人血清白蛋白，弥补人类血浆的缺乏——理论上可行，但选择水稻为载体颇多争议
　　□  本刊记者  崔筝  |  文  
　　武汉大学生命科学院实验室里，明亮的日光灯下摆着一排培养皿，里面一棵棵水稻苗刚刚长出细长的嫩叶。旁边一个实验台上，武汉大学教授杨代常拿起一个装着半瓶淡黄色大米的玻璃瓶。在这看似普通的粳米粒的胚乳中，正蕴含着宝贵的人血清白蛋白。
　　2011年10月31日，美国科学院院刊发表了杨代常课题组的研究论文“转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白”。文中描述了美好的前景：在稻田里种植出转基因水稻，可以在其胚乳细胞中生产重组人血清白蛋白——这是目前只能从人类血浆中提取的紧缺物质。
　　这个消息迅速占领了包括《自然》《科学》杂志等科学媒体的新闻版，随即登陆世界各大新闻媒体。其中《时代》周刊相关报道的标题赫然：从大米中挤出人血来？
　　白蛋白告急
　　人血清白蛋白是人体内一种重要的蛋白质，约占健康人血液总量的30%。在医院的药房，医用人血清白蛋白注射剂为粘稠的淡黄色液体，被称为“救命药”，常用于失血、烧伤引起的休克，以及肝腹水、癌症等危重病症的救治。在低蛋白血症的治疗中，每支5g/20ml人血清白蛋白试剂可维持机体渗透压的能力，相当于100毫升血浆或200毫升全血。此外，作为稳定剂，人血清白蛋白也广泛应用于疫苗等医药生产中。
　　据粗略估算，中国每年临床和疫苗辅料需要150吨-170吨人血清白蛋白。而目前，全世界几乎所有的人血清白蛋白都从人类血浆中提取。在中国，为生产人血清白蛋白所需要的血浆量，就相当于2亿人年均献血100毫升。
　　现实中，血浆供应远远达不到生产需求，人血清白蛋白经常告急。原料紧缺也是自2006年整治非法采血、血浆供应减少以来，不少白蛋白生产厂家的普遍现状。
　　国家发改委对限价药品的定价中，每支10克、50毫升/瓶的人血清白蛋白的价格应为360元。由于供不应求，其黑市价格往往翻倍。巨大的利益空间吸引了制假者。
　　2007年，央视“每周质量报告”曾曝光，2000多瓶假冒人血清白蛋白制剂流入市场，甚至出现在吉林省的一些公立医院的药架上。随后，国家食品药品监督管理局在全国开展人血清白蛋白专项整治，在吉林、山西、青海、湖北、山东、辽宁、重庆、新疆等多个省份查获了假冒人血清白蛋白。
　　直到2008年，仍有新闻报道，江苏的数名患者因注射用蜂胶兑水制成的假冒人血清白蛋白致死。
　　“种”出白蛋白
　　当混入重症病房的假冒白蛋白使得人心惶惶时，武汉大学教授杨代常开始在稻田里“种植”人血清白蛋白的实验。现在，他手中的玻璃瓶中装着的呈淡黄色的大米，其中就蕴含着人血清白蛋白。
　　这些大米采用转基因技术培育，其中植入了人类生产血清白蛋白的基因。但与逐渐被大众熟知的转基因粮食作物不同的是，在这个过程中，被改造的水稻并不再作为食用产品，而只是作为生产人血清白蛋白的生物反应器。
　　在转基因技术的发展中，第一、二代转基因产品着重于提高粮食作物的抗虫、抗病特性和增加营养、改善口感，而类似“造血大米”这样的作为工业、医药和生物反应器等的第三代转基因产品，目前正成为国际上基因工程研究的热点。
　　杨代常教授从事通过水稻表达特定蛋白质的研究已经多年。他之所以选择水稻，是因为中国率先完成了水稻基因组的测序，生物学背景清晰，为重组蛋白的高效表达和纯化技术提供了技术支撑。再者，水稻的转基因技术已经很成熟，作为自花授粉的植物，生物安全性较好。而且水稻繁殖系数高，更容易实现规模化。
　　“技术并不复杂。”杨代常对《新世纪(13.44,-0.57,-4.07%)》说，研究团队将特定的人类基因通过遗传载体，整合到一个水稻基因组内，形成一个新的水稻品种。在这种水稻的生长过程中，通过该基因的转录及翻译，将指定蛋白表达在水稻种子中。即在水稻成熟的过程中，人血清白蛋白不断地被合成、积累在大米的胚乳里。
　　“等水稻种子成熟后，就可以从中大量提取人血清白蛋白了。”杨代常说。作为学者的他同时还是武汉禾元生物科技有限公司(下称禾元公司)的董事长。在公司位于武汉郊区的厂房，几个不锈钢容器中，白蛋白正从成熟的大米中分离出来，经过提纯，成为最终的产品。
　　杨代常表示，通过基因工程生产人血清白蛋白并非是他首创，用转基因细菌生产白蛋白的尝试早在1987年就有先例。“后来用酵母、转基因牛的哺乳细胞等，都没有太好的结果。”用植物细胞表达白蛋白也已经有相关研究，在美国和加拿大，有研究人员成功地从马铃薯中“种”出白蛋白。
　　“由于产量上不来，这些研究都仅限于在实验室里做，不能满足产业生产。”杨代常说，“理论上说，用转基因植物生产人血清白蛋白，可以规避输血中的污染和通过血液传输病毒的风险，但产量低、成本高、难以规模化，是制约工业化生产白蛋白的三个难题。”
　　不过，这些问题在杨代常的研究中似乎已经解决。《自然》杂志报道称，美国内布拉斯加大学林肯分校的基因工程疗法专家威廉·维兰德(William  Velander)表示，和利用人血浆制造白蛋白相比，杨的方法在大规模生产上、安全性上都做得更好，而且更具成本效益。
　　用这种方法种出的每公斤大米，可以生产2.75克人血清白蛋白制剂成品，这个产量在业内被认为具有非常可观的经济价值。
　　禾元公司在湖北某农村租种的30亩土地中，今年收获的“造血大米”已经收割完毕；在实验室中，他们正在对稻种做进一步改良。
　　杨代常说，“我们的稻谷种子在常温下放置三年活性无变化，而且在种子中的表达量可以维持七代或更长的稳定性。”
　　杨代常介绍，用转基因植物生产的医药，已经有八十多种，目前有十多种进入了临床二期、三期。又据《自然》杂志报道，杨代常也已经向美国食品药品管理局递交了第一份临床试验申请，希望在两年内在临床上测试从大米中种出来的人血清白蛋白的安全性。  
　　杨代常表示，用水稻成功大规模生产白蛋白另一方面的意义，在于做出了植物表达人体蛋白的先例，开辟出一条通路。医学上，人血清白蛋白的使用量通常以克计算，当人血清白蛋白的表达得以实现后，一些其他用量更小，达到毫克、微克级的蛋白，如抗体、因子等，更能够轻易地实现量产。
　　“为什么我选这么难的课题来做？只要这个做通了，能够实现大规模生产，植物这条路就通了。”杨代常透露，他的课题组还在研究通过植物生产其他的药品，例如胰岛素。
　　“造血”路漫漫
　　杨代常的办公室位于武汉大学校内一座二层小楼上，楼前是一小片用铁丝网笼罩着的试验田。深秋时节，尚未收割的水稻摇曳着金黄的稻穗。
　　杨代常告诉财新记者，他的30亩试验田几近苛刻地遵守着国家关于转基因作物种植的要求。一般的转基因作物周围100米不得有同类作物，而他的试验田五公里之内没有其他水稻。农业部一年来两次进行现场监察，禾元公司还购置了专门的收割机、烘干机等。“每块田地边都建了缓冲带，即使有人偶尔在田埂上想拿都拿不到⋯⋯种多少我们回收多少，1克都不流出去。”
　　中间试验、环境释放，以及随后的生产性试验，是农业部规定的转基因作物获得商业化种植安全证书之前的必经阶段。一个转基因品种通过这些阶段后，是否能够拿到安全证书，还是一个问号。
　　目前，中国仅发放了两种转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”的安全证书。这两种水稻从开始试验到最终拿到安全证书，经历了漫长的11年。
　　据一位不愿具名的转基因水稻研究专家表示，即使2009年拿到安全证书后，在社会舆论的争议风潮中，这两种已近成熟的水稻至今尚未开始商业化推广。
　　杨代常也深知如此超前研究获得安全证书的难度。“我们现在想做生产性实验，但是我们国家在这一块的法规是没有的。”
　　杨代常透露，他了解到有关部门正在做相关产品的审批制度研究。作为医用和工业的转基因产品的评价审批，目前参照农业的安全证书制度，获得证书之后要经过一系列程序，最终经过种子公司推广。“我们的产品不需要推广，种多少，收多少，不进入市场，不进入食物链。”  
　　对于杨代常的研究，一位水稻专家表示，用植物表达人血清白蛋白在理论上完全行得通，但选择水稻这一中国大多数人的主粮做生物反应器的做法值得商榷。
　　“并不是说，含有人血清白蛋白的转基因大米是有害的。这个蛋白是没问题的，人吃一吃也没什么。但如果一旦水稻成为生物反应器的主体，去表达其他的东西的话，一旦流入食物链，后果是挺可怕的。”
　　“我想有关部门在审批的时候也会很慎重。”该专家称，中国的转基因生物管理制度非常完善，甚至比美国、欧盟更严格，但在实际执行上却并不完美。例如此前引起巨大争议的违法耕种转基因稻种，并不是研究者故意流出的，而是具体执行中出了问题。水稻是繁殖率很高的植物，一旦种子不小心流出，很难控制不进入食物链。
　　“毕竟，从外观上来看，你完全没有办法分辨出来。”这位水稻专家说。

　　美国大众科学网站近日报道，法国巴黎皮埃尔与玛丽·居里大学的卢茨·杜艾团队首次将用干细胞培育的血液输入人体，并取得成功。
　　杜艾团队首先从一位志愿者的骨髓里抽取造血干细胞，经过一番“加工”后，又将这些细胞注射回捐献者体内，当然这些细胞都已做过标记可以追踪。追踪结果显示，26天后，41%~63%的血细胞仍然存活，与天然血液的存活率相似，而且人造血细胞同样能有效地将氧气输送至全身。
　　难道真如刊载这篇报道的媒体所言，生产“人造血”可以取代献血了吗？
　　转基因蛋白含人类基因
　　最近，《美国科学院院报》中刊载了武汉大学杨代常教授团队关于重组人血清白蛋白的文章，他和他的团队正在研制一种具有特殊品质的转基因稻谷，从这种稻米中可以提炼出一种特殊的蛋白质血清白蛋白，其中含有人类基因。这些蛋白质可以被用于医院烧伤或失血过多病患的临床救治工作。
　　“重组人血清白蛋白还在研究阶段，实验数据无法确定小麦的基因已完全剔除干净，还不能进行临床试验。”杨代常告诉记者，早在几年前他的研究就已开始应用了，主要是在生物制药、转基因动物试验等方面。由于这种蛋白中可能残存小麦基因，对人体造成影响，所以在临床上用于人体还需要很长的时间。
　　杨代常介绍说，血清白蛋白是一种提取物，也就不存在血型配对等问题，同时也能避免由于输入他人的血液而导致感染艾滋病或肝炎等疾病的风险。
　　用转基因手法提取“人血清白蛋白”
　　据了解，国际上大多数医疗机构收集来人们捐献的血液后，一般会将这些血液进行离心分离，得到三种主要物质：红细胞（也就是红血球）、帮助人体血液凝结的血小板、血浆。
　　但是除此以外，血液中还有白蛋白、球蛋白、凝血因子以及各种蛋白酶等多种成分，野战输血研究所血液生物制品研究室主任章金刚研究员解释说，将一份全血分解开来，不同成分用于不同患者，可以降低救治成本，也能避免血液的浪费。目前在美国可以从全血中分离出20多种血液成分，而在我国分离的成分还不足7种。
　　“人血清白蛋白”是血浆的主要成分，它是一种蛋白质。杨代常团队进行的实验，是通过转基因的方法提取出血清白蛋白，它是人体血液中含量最高的蛋白质，承担着将荷尔蒙和矿物质元素运抵全身各处、从血液中清除有毒物质并帮助维持正常血压等重要功能。“据估计，全球每年对人血清白蛋白的需求超过500吨，目前对这种物质的生产必须依赖对人体血浆的收集。通过转基因水稻提取合成的人血清白蛋白，可以解决供应量不足的问题，同时也避免了传染疾病的风险。”
　　杨代常表示，现在已经可以做到让稻米中可溶解蛋白质成分中的10%成为人血清白蛋白，未来这一产品将可以成为人体血制品的安全替代品，缓解医院用血紧张的局面。
　　血液替代品的含氧量很重要
　　“广义的血液代用品包括血浆代用品和血细胞代用品。”前中国医学科学院输血研究所杨成民教授解释，10个输血的病人中，7个都是输红细胞。红细胞没有细胞核，主要是携带氧气到各组织，如果没有氧气就会死亡。也有部分学者认为血液代用品就是红细胞代用品。
　　现在世界上很多国家都在进行相关研究，美国有家名为Northfield的公司花了20年开发的血液代用品，结果不幸因此倒闭。但是Northfield的失败并没有影响各国科学家对人造血的热情。
　　据杨成民介绍，红细胞代用品大致可以分成三种，其中之一是氟碳化合物乳剂，它配合使用输氧设备，可以让血液携带比普通情况多得多的氧气。氟碳化合物在代谢后可以以原形由肺排出。
　　另外一种是修饰的血红蛋白。没有细胞膜保护的血红蛋白分解速度飞快，直接注射到人体后，可能导致肾脏严重损伤。于是科学家从过期的人血或动物血等多种材料中分离纯化血红蛋白，将其修饰后制成更坚固的改进型，避免它快速分解对人造成危害。
　　基因重组也是血液替代品的研究方向
　　最后要提到的，就是重组人血红蛋白。随着基因重组技术的发展，重组人和动物血红蛋白的研究成为热点之一。现在科学家已能在大肠杆菌、昆虫、转基因动植物中表达出天然人的血红蛋白。另有法国科学家从转基因的烟草中提取功能性人血红蛋白，杨代常教授的研究也属于这一类。但同时，杨成民也表示这类技术面临不少问题，比如产品的数量能否满足大规模商业化生产要求、提取出的物质能否与微生物或动植物完全分离等。
　　Northfield公司耗资10亿美元研究的产品遭到FDA的否决，也是因为该机构评审认为，其临床使用风险超过它的好处，存在毒副作用。在20世纪八九十年代一些贸然的临床试验导致受验者出现心肌梗塞症状。
　　由于血液的成分和功能极其复杂，短时间内人造血还难以和人类经过漫长进化形成的天然血液媲美。
　　人造血的终极猜想
　　奶粉状：英国的一位科学家曾试图研发血液“奶粉”，平时把粉末存储在一个小袋中，用时与盐溶液再水合，护理人员可将其带到事故现场，立刻开始输血。
　　糨糊状：另一些科学家希望能把人造血设计成厚厚的糨糊状存储，使用之前将其在水中溶解。这种人造血由塑料分子制成，也像血红蛋白一样，能够在身体内传输氧气。
　　解救人类：美剧《真爱如血》展示了人造血的特殊前景：2019年人类因为得了血液病，大部分人都变成了吸血鬼，不少幸存的人类被捕捉饲养起来提供给吸血鬼血液。后来，日本人发明了名叫“真血”的人造血，能满足吸血鬼的需要，继而解救了人类，两者终于可以相安无事地共生了。

　　PNAS杂志近期发表了一项最新研究成果——可以从水稻中获取大量人血清白蛋白（humanserumalbumin，HSA）的新方法，利用这种方法获取人血清白蛋白不仅有助于解决需求问题，而且能降低传播疾病的风险。The    Scientist杂志就这项成果也发表了题为“BloodProteinfromRice”介绍文章。
  
　　这项研究由武汉大学生命科学学院领导完成，其它研究单位包括加拿大国家研究委员会等，通讯作者是武汉大学生科院杨代常教授，杨代常教授主要从事植物胚乳细胞蛋白质转运的分子机理与分子农业医药研究。
　　来自英国华威大学，欧盟Pharma-Planta组织的Richard    Twyman教授点评这一成果道，“文章作者证明了所获得的产物能大量纯化，并具有人血清白蛋白的功能”，“他们为临床HSA供给提供了一种非常好的新方法”。
　　HSA是一种临床应用广泛的用剂，可以用于严重烧伤、肝硬化或者出血性休克，而且HSA还被广泛用于药物和疫苗的生产——作为疫苗和药物传递的载体，以及疫苗和药物生产中细胞培养需要的成分。
　　杨教授解释道，“血浆HSA需求量很高，但是确实也很紧缺”，目前HSA唯一的来源是从人血中提取，这种方法除了献血者了有限以外，“利用血浆HSA还会造成疾病传播高风险，比如AIDS，肝炎”，“我们认为植物来源的HSA更加可靠，也更加安全”。
　　这一研究组并不是首次尝试在其它物种中通过遗传工程获取人类HSA，他们在酵母，细菌，土豆，以及烟草等植物中都尝试过，但是这些都遇到了可行性的问题，“微生物中获得的HSA出现了少量微生物污染的问题……这是有害的，而且会引起人类的免疫反应，因此也就意味着这种产物需要更多的纯化，增加大量的成本”，Twyman说。而从土豆或者烟草中获得HSA虽然没有携带这些污染物，但是这些来源产量不高，划不来。
　　为了提高产量，研究人员转向了水稻，具体来说，他们靶向了水稻的食用部分：种子中的胚乳——这是一个天然的营养存储组织，是重组蛋白积累和长时间稳定储存的理想场所。研究人员在胚乳中表达了HSA基因，可以在每公斤水稻种子中获得2.74克纯HSA蛋白，这比同样重量的烟草叶中纯化的HSA高出了25倍。
　　除了高产量以外，水稻来源的HSA也具有与血来源的HSA，相同的分子重量，结晶结构，分子结合位点，以及其它生化特点，研究人员也证明了这两种来源的HSA具有相同的配基结合，对培养物中细胞生长的促进，以及对大鼠肝硬化模型中积水淤留相同的治疗能力。
　　水稻来源的HSA也具有与血浆来源的HSA相同的免疫原性，这也就是说，注射了水稻HSA，和血浆HSA的动物会出现相同的免疫反应。
　　华盛顿大学的Ditervon    Wettstein认为“从水稻中获取高纯度蛋白的化学，生物物理，免疫学特性……表明其在各方面与血浆中HSA相同。”
　　不过要将水稻来源的HSA用于人体，还需要大量的临床实验，而且为了迎合全球对于HSA的大量需求——大约一年500吨，这种HSA来源的产量还需要能扩大到开放性农场规模，这将会引起多方争论，因此当谈到水稻HSA的时候，Twyman表示，这种替代来源HSA的到来还需要时间。

　　编者按：2011年9月30日 ，国家药监局发布了《对化学性肝损伤有辅助保护功能的评价方法（修订稿）》，公开征求意见，截止日期为2011年10月29日。

关于征求《对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法（修订稿）》意见的涵

各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局），有关单位：

　　为贯彻落实《食品安全法》及其实施条例对保健食品实行严格监管的要求，严格保健食品准入管理，切实提高准入门槛，我司组织修订了对化学性肝损伤有辅助保护功能的评价方法。现公开征求意见，请将修改意见于2011年10月29日前反馈我司。

　　联 系 人：戎卫华
　　联系电话：010-88330866
　　传　　真：010-88374394
　　电子邮件：yuchao＠sda.gov.cn

　　附　　件：
　　对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法（修订稿）及修改说明

　　　　　　　　　　　　　　　　　　国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　二○一一年九月三十日

附件

 

对化学性肝损伤有辅助保护功能评价方法（修订稿）

保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定

Items, Principles and Result Assessment

 

 

1试验项目

动物实验分为方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）、方案二（急性酒精性肝损伤模型）和方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）三种

1.1 方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）

1.1.1体重

1.1.2血清中谷丙转氨酶（ALT）

1.1.3血清中谷草转氨酶（AST）

1.1.4血清中乳酸脱氢酶（LDH）

1.1.5 肝组织病理学检查

1.2 方案二（急性酒精性肝损伤模型）

1.2.1体重

1.2.2血清甘油三酯（TG）

1.2.3血清极低密度脂蛋白（VLDL）

1.2.4肝组织病理学检查

1.3 方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）

1.3.1体重

1.3.2血清中胆固醇（CHOL）

1.3.3血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)

1.3.4血清中胆红素（TBIL）

1.3.5肝组织病理学检查

 

2 试验原则

2.1所列指标均为必做项目。

2.2根据受试样品作用原理的不同，方案一、方案二和方案三任选其一进行动物实验。

 

3 结果判定

方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

方案二（急性酒精性肝损伤模型）：血清中TG、VLDL指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

方案三（亚急性酒精性肝损伤模型）：① 血清中CHOL、LDL和TBIL三项检测指标结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用；② 血清中CHOL、LDL和TBIL三项指标中任两项结果阳性，且肝脏病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能功能。

在急性或亚急性酒精性肝损伤结果判定中，任何一项方案为阳性时，可认为该受试物具有降低酒精性肝损伤危害功能。

 对化学性肝损伤有辅助保护功能检验方法

Method for the Assessment of Assisting the Protection Against Chemical Injury of Liver Function

 

1 方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）

1.1 原理

刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，它能在体外激活T细胞的丝裂原，进入循环后首先活化T淋巴细胞，继而激活肿瘤坏死因子（TNF）和白介素2等细胞因子，引发炎症反应，可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。

1.2实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。

1.3 实验方法

1.3.1 剂量和分组

至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)一个剂量（等效应剂量），另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。

1.3.2受试样品的给予

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。

1.3.3实验步骤

1.3.3.1造模方法

每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型组及各样品组于实验结束时一次尾静脉给予剂量为15～20mg/kg的刀豆蛋白A，小鼠10ml/kg BW，禁食8h后经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

1.3.3.2检测指标

体重、血清中谷丙转氨酶（ALT）、血清中谷草转氨酶（AST）、血清中乳酸脱氢酶（LDH）、肝脏病理组织学变化。

1.4 血清ALT、AST和LDH的测定

1.4.1检测方法

血清中ALT、 AST 推荐采用速率法，

LDH推荐采用乳酸为底物的速率法（LD-L法）。

血样离心（2500rpm）后取上清，血清中的ALT、AST和LDH的检测采用用全自动或半自动生化分析仪进行。

1.4.2 数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，各组均数间差异无显著性；F值＞F_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

1.4.3 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清ALT、AST和LDH含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清ALT、AST和LDH含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），可分别判定ALT、AST和LDH指标结果阳性。

1.5 肝脏病理组织学检查

1.5.1 实验材料

取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规病理制片（石蜡包埋，HE染色）。

1.5.2镜检

从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片，可见肝脏多发的灶状、片状坏死。

1.5.3 评分标准

 

肝细胞坏死：

大致正常 偶见坏死细胞 坏死细胞小于整个视野的1/4 坏死细胞占整个视野的1/4～1/2 坏死细胞占整个视野的1/2～3/4	0分
	1分
	2分
	3分
	4分
坏死细胞弥漫整个视野	5分

1.5.4 数据处理

采用方差分析或秩和检验。但方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，各组均数间差异无显著性；F值＞F_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

1.5.5 病理结果判定

模型对照组与阴性对照组比较肝细胞坏死程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，肝细胞坏死程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。

1.6 结果判断

在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护功能。

 

 

2.方案二：急性酒精性肝损伤模型

2.1 原理

机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。乙醇通过增加甘油三酯合成，减少脂肪氧化，降低肝脏运出脂肪的功能，增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症。

2.2 实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。

2.3 实验方法

2.3.1 剂量和分组

至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。用无水乙醇（分析纯）造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％（以纯净水稀释），灌胃量12ml～14ml/kgBW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为4800～5600mg/kgBW）。

2.3.2 给予受试样品的途径和时间

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天.

2.3.3 实验步骤和造模方法

每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，按体重调整受试样品量。模型对照组和各样品组于实验结束时一次灌胃给予50%的乙醇，小鼠灌胃量12ml/kg BW，阴性对照组给予纯净水，禁食16h。动物腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

2.3.4 检测指标

体重 、血清中甘油三酯（TG）、血清中极低密度脂蛋白(VLDL)、肝组织病理学检查(肝细胞脂肪变性)。

2.4 血清中甘油三酯（TG）测定

2.4.1测定方法

推荐采用酶法（GPO-PAP法）。采用用全自动或半自动生化仪测定血清中TG的含量。

2.4.2 数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2.4.3 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较TG含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组TG含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。

2.5 血清中极低密度脂蛋白（VLDL）测定

2.5.1 测定方法

推荐采用ELISA法。采用极低密度脂蛋白ELISA试剂盒测定血清中的VLDL的含量。

2.5.2 数据处理

2.5.3 数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2.5.4 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清VLDL含量升高有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清VLDL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P＜0.05），判定该指标结果阳性。

2.6 肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定

2.6.1 实验材料

从小鼠肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹Ⅲ染色。

2.6.2镜检

从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用5倍物镜连续观察整张组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布范围和面积。

2.6.3评分标准

肝细胞内脂滴无或稀少。 含脂滴的肝细胞不超过1/4 含脂滴的肝细胞不超过1/2 含脂滴的肝细胞不超过3/4 肝组织几乎被脂滴代替	0分
	1分
	2分
	3分
	4分

2.6.4 数据处理

采用方差分析或秩和检验。方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F_0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值＞F_0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2.6.5 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较脂肪变性程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组比较，脂肪变性程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。

2.7 急性酒精性肝损伤的结果判断

在模型成立的前提下，血清中TG、VLDL两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定受试样品对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能。

 

 

3 方案三：亚急性酒精性肝损伤模型

3.1 原理

机体反复多次过量摄入乙醇后，乙醇可通过诱导CYP4502E1，引起氧化应激、脂质过氧化、代谢/营养的紊乱以及线粒体结构和功能的改变等一系列反应，导致肝细胞的功能损伤，进而引起肝组织中甘油三酯含量聚积，胆固醇合成加强，并引起相应载脂蛋白含量的改变。

3.2 实验动物

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠（180-220克），每组8-12只；小鼠（18－22克），每组10-15只。

3.3 实验方法

3.3.1 剂量和分组

至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量（以公斤计算）的30倍。

3.3.2受试样品的给予

经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。

3.3.3 实验步骤

3.3.3.1造模方法

每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型组和样品组于实验结束前14天每天经口灌胃给予30%的乙醇，小鼠灌胃量10ml/kg BW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为2400mg/kgBW）。样品灌胃后间隔4小时以上再给予乙醇。实验结束前禁食4h，经腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后，腹主动脉采血，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

3.3.3.2 血清生化指标检测

体重、血清中胆固醇（CHOL）、血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、血清中胆红素（TBIL）、肝组织病理学检查。

3.4 CHOL、LDL和TBIL测定

3.4.1测定方法

血清胆固醇（CHOL）推荐采用酶法（COD-PAP法），血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL)推荐采用匀相测定法，血清胆红素（TBIL）推荐采用改良J-G法。血样离心（2500rpm）后取上清，上全自动或半自动生化仪测定血清中CHOL、LDL和TBIL的含量。

3.4.2 数据处理

数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F值，F值< F0.05，各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.4.3 结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，血清CHOL、LDL和TBIL含量升高有统计学意义（P<0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品组血清CHOL、LDL和TBIL含量与模型对照组比较降低，差异有显著性（P<0.05），判定该指标结果阳性。

3.5 肝脏病理组织学变化、诊断标准和结果判定

3.5.1 实验材料

取小鼠肝脏左叶用10%福尔马林固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规制片，HE染色。

3.5.2 镜检

用5倍物镜连续观察整张组织切片，主要观察肝细胞变性（脂肪变性、水样变性、胞浆凝聚、气球样变）、肝细胞坏死和炎症改变等，并同时给予记录。2.5.3 评分标准

肝细胞气球样变：

无肝细胞气球样变 偶见肝细胞气球样变 气球样变的肝细胞占整个视野的1/3以内 气球样变的肝细胞占整个视野的1/3以上 肝细胞广泛的气球样变	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

肝细胞脂肪变性：

无肝细胞脂肪变性 偶见肝细胞脂肪变性 灶状肝细胞脂肪变性，占肝细胞总数1/3以内 脂肪变性肝细胞占1/3以上 肝细胞弥漫脂变	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

胞浆凝聚：

未见肝细胞胞浆凝聚 偶见肝细胞胞浆凝聚 胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的1/3以内 胞浆凝聚的肝细胞占整个视野的1/3以上 肝细胞广泛的胞浆凝聚	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

水样变性：

未见水样变性的肝细胞 偶见肝细胞水样变性 水样变性的肝细胞占整个视野的1/3以内 水样变性的肝细胞占整个视野的1/3以上 水样变性的肝细胞弥漫性存在占整个视野	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

炎症改变：

未见炎症改变 偶见小炎症灶 少数小炎症灶 多数小炎症灶 炎症灶广泛存在	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

肝细胞坏死：

无肝细胞坏死 单个肝细胞嗜酸性坏死或偶见小坏死灶 散在分布的小坏死灶 多数小坏死灶，无碎屑状坏死或桥接坏死 小坏死灶广泛存在伴碎屑状坏死或桥接坏死	0级    0分
	I级    1分
	II级   2分
	III级  3分
	IV级   4分

   

3.5.4肝脏病变计分方法

将每只动物肝细胞各种病理变化得分相加，肝细胞坏死评分2倍计入，以总分进行统计分析。每只动物肝脏病变得分=肝细胞变性得分（气球样变得分+脂肪变性得分+胞浆凝聚得分+水样变性得分）×1+ 肝细胞炎症改变得分×1 + 肝细胞坏死得分×2

3.5.5数据处理

采用方差分析或秩和检验。方差分析需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，各组均数间差异无显著性；F值＞F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

3.5.6病理结果判定

模型对照组与阴性对照组比较，肝细胞病变程度与模型对照组比较明显加重，病变总分值增加且有统计学意义（P＜0.05），可判断模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与模型对照组之间，肝细胞病变程度明显减轻，病变总分值降低且有统计学意义（P＜0.05），可判断动物实验病理结果阳性。

3.6亚急性酒精性肝损伤结果判定

在模型成立的前提下，满足以下任一条件，可判定受试样品对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能。

3.6.1 血清中CHOL、LDL和TBIL三项检测指标结果阳性。

3.6.2 血清中CHOL、LDL和TBIL三项指标中任两项结果阳性和病理组织学检查结果阳性。

对化学性感损伤有辅助保护功能评价方法修改说明

 

一、承担单位

广东省疾病预防控制中心。

 

二、主要工作过程：

国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司（下称保化司）于2009年4月召开“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人，会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。广东省疾病预防控制中心成立了“对化学性肝损伤有辅助保护功能”修订的起草工作小组，经查阅国内外相关资料，参考保化司召开的工作会议的精神，咨询有关专家和实验室同行的意见和建议，形成了工作方案。经过起草工作小组开展的大量条件探索和实验方法研究，形成了修订初稿，起草工作小组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复修改，形成送审稿。方法验证工作由广东省疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心分别进行验证试验。在此基础上，征集、整理和归纳相关意见和建议形成送审稿。

保化司于2010年8月再次召开课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了进一步完善，并邀请北京市疾病预防控制中心进行部分项目的验证，综合了方法验证单位的意见后最终形成了送审稿。

2011年7月，保化司在北京召开“保健食品功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、广东省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家14人，会上对修订后的“有助于降低化学性肝损伤危害”的科学性、客观性和可操作性给予肯定，并提出修改意见，后经多次司务会研究做了进一步完善，形成本修订稿。

 

三、编制原则

1、总原则，提高保健食品“对化学性感损伤有辅助保护功能”检验方法的科学性、准确性和规范性，适应当前法规对保健食品实行严格监管的要求。

2、要符合当前化学性肝损伤研究的基础理论，既考虑原规范合理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的指标要在国内外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品的对化学性肝损伤的辅助保护功能。

3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。

 

四、确定相关技术内容及新旧技术规范的对比

本修订稿与原规范比较，具体修改部分见下表

编号	原方法		现方法		修订理由
	序号	内容	序号	内容
1	1	方案一：四氯化碳肝损伤模型		方案一：删除四氯化碳肝损伤模型，增加刀豆蛋白A急性肝损伤模型，并增加血清中乳酸脱氢酶指标	新增方法适用性强，并提高判定标准
2	2.1	原理	2.1	原理修改内容包括，增加“乙醇能增加甘油三酯的合成，减少脂肪的氧化，降低肝脏肝脏运出脂肪的功能，同时增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症”， 删除氧化还原的内容。	从脂质代谢紊乱的途径考虑急性酒精性肝损伤机理
3	2.3.1	剂量分组及受试样品给予时间	2.3.1	增加“乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为4800-5600mg/kgBW”	使得乙醇的摄入量更明确。吸收的酒精量=饮酒量×酒精度数×0.8
4	2.3.3	实验步骤	2.3.3	实验步骤和造模方法中增加“动物腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血”	推荐采血方法，减少溶血
5	2.3.4	检测指标	2.3.4	检测指标中增加体重、血清中甘油三酯（TG）、血清中极低密度脂蛋白(VLDL-C)，删去“肝匀浆中TG、MDA、GSH含量的测定”	通过文献和实验研究，确定敏感指标。
6	2.4、2.5、2.6	肝匀浆中MDA测定方法、肝匀浆中GSH测定方法、肝匀浆中TG测定方法	2.4、 2.5	删除肝匀浆中MDA测定方法、肝匀浆中GSH测定方法，增加血清中TG的测定方法、血清中极低密度脂蛋白（VLDL-C）测定方法	灵敏度和特异度差，增加血清中TG的测定和血清中极低密度脂蛋白（VLDL-C）测定，因该两种方法敏感性较高，特异度较好
7	2.7.4	数据处理和结果判定	2.6.4 结果判定	结果判定中增加乙醇模型对照组与阴性对照组比较脂肪变性程度加重有统计学意义（P＜0.05），表示模型成立。在模型成立的前提下，受试样品任何一个剂量组与乙醇模型对照组比较，脂肪变性程度减轻，有统计学意义（P＜0.05），可判断为阳性结果。	对结果判定内容进行细化，明确阳性判定的依据。
8	2.8	结果判定	2.7 急性酒精性肝损伤的结果判断	结果判断修改为血清中TG、VLDL-C指标阳性和病理组织学检查结果阳性，删除原来的结果判断。	急性酒精性肝损伤的原理部分是从大剂量的酒精短时间可引起急性酒精性脂肪肝和高脂血症进行阐述。
9			3	增加方案三亚急性酒精性肝损伤模型	针对部分人群小剂量，长期饮酒的模式增加该方案，建立亚急性酒精性肝损伤模型。
10				增加“有助于降低酒精性肝损伤危害结果判定“在急性酒精性肝损伤结果判定、亚急性酒精性肝损伤结果判定中，任何一项为阳性时，可判定该受试物具有有助于降低酒精性肝损伤危害功能”。	增加该项目，明确判定受试物阳性的依据。

        人们常用“愤怒得失去理智”来形容一个人发怒的样子，其实这时并不一定是其大脑中没有理智，而可能是大脑中负责理智的部分缺乏一种信号物质血清素的帮助，因此难以控制与愤怒相关的大脑部位活动。
　　英国剑桥大学等机构的研究人员在美国新一期《生物精神病学》杂志上报告了这项研究成果。专家解释说，神经细胞需借助血清素传递信息，人体通常用食物中的色氨酸来合成血清素。研究人员请一些志愿者在不同日子里分别进食富含或缺少色氨酸的食物，随后用一些图片来激起他们大脑中的愤怒情绪，用磁共振成像技术来观察大脑内部的反应。
　　结果显示，在缺少色氨酸并因此导致血清素含量较低时，大脑的愤怒反应更难被抑制。而对大脑活动的观察发现，在血清素含量低的时候，大脑中额叶部位和杏仁核部位之间的信号联系就会减少。杏仁核部位与愤怒情绪有关，而额叶部位发出的信号可以帮助控制这种愤怒。因此，在缺少作为“信使”的血清素时，“理智”的额叶就难以控制“愤怒”的杏仁核。
　　研究人员莫利·克罗克特说，以前研究者就知道血清素含量与愤怒情绪有关，但直到最近才有技术手段来探测大脑内部的相关活动特点，本次研究最终发现了血清素在负责理智和愤怒的大脑部位之间充当信使的机制。
　　因此，如果你是一个易于发怒的人，不妨在日常生活中多吃一些富含色氨酸的食物，以增加大脑中血清素的含量。通常蛋白质含量较高的食物中都含有不少色氨酸，如大豆、鸡蛋和鸡肉等。