【摘要】 目的 调查云南省啮齿动物汉坦病毒自然感染状况，为制定云南省肾综合征出血热的预防控制提供科学依据。 方法 用鼠笼和鼠夹在云南省11个县（市）进行捕鼠，捕获的啮齿动物进行分类鉴定并解剖取肺脏组织和用直接免疫荧光法检测汉坦病毒。 结果 在调查的11个县（市）共捕获5属8种啮齿动物1 303只，黄胸鼠和褐家鼠为居民区优势种，高山姬鼠和大绒鼠为野外优势种。调查县(市)汉坦病毒自然感染率范围为2.5%～7.1%；居民区黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠和大足鼠中汉坦病毒自然感染率分别为3.8％（24/637）、5.5％（15/274）、4.2％（2/47）和3.0％（3/100）；野外高山姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠和臭鼠[KG-*3〗句鼠[KG-*3〗青中汉坦病毒自然感染率分别为2.2％（3/139）、1.8％（3/163）、0（0/4）和14.3％（1/7）。 结论 云南省啮齿动物汉坦病毒自然感染普遍，存在以褐家鼠－黄胸鼠为主要宿主的汉城型病毒的循环形式和以高山姬鼠－大绒鼠为主要宿主的汉滩型病毒的循环形式。
【关键词】 啮齿动物 汉坦病毒 肾综合征出血热 自然感染
Investigation into the naturally infectius status of Hantaviruses in rodents in Yunnan Province, China.
ZHANG Yun-zhi, ZHANG Hai-lin, YANG Wei-hong, et al.
(Yunnan Provincial Institute of Endemic Diseases Control and Prevention, Dali 671000, Yunnan, P. R. China)
Abstract：Objective To investigate the situation of the natural infection of Hantaviruses (HV) in rodents and offer guidance for the control and prevention of hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Yunnan Province, China. Methods The rodents had been captured by a special trap, the lung tissues of the rodents was taken after identified and stored in -196℃ liquid Nitrogen. HV was detected by direct immunofluorescence assay (DIFA) from the lung tissues of the rodents. Results The 1 303 rodents belonging to 8 species of 5 Genera were captured in 11 counties or cities in Yunnan. Rattus flavipetus and Rattus norvegicus were the dominant species in the residential areas and Apodemus chevrieri and Eothnomys melanogaster were the dominant species in the field. The total natural infection rates of HV in rodents in Xiangyun County, Longling County, Yongsheng County, Lancang County, Xundian County, Yulong County, Jingdong County, Luxi County,Yingjiang County, Dali City and Binchuan County were 7.1％（2/28），6.0％(5/84)，5.6％(9/162)，5.2％(5/96), 5.0％(9/181), 3.0％(3/100)，2.7％（8/291），2.7％(3/113)，2.6％（1/38）,2.5％(3/119)and 3.3％（3/91）respectively. The natural infection rate of HV in Rattus flavipetus, Rattus norvegicus, Mus musculus and Rattus nitidus was 3.8％（24/637）,5.5％（15/274）,4.2％（2/47）and 3.0％（3/100）respectively in the residential areas. The natural infection rate of HV in Apodemus chevrieri, Eothnomys melanogaster, Apodemus draco and Suncus murinus was 2.2％（3/139）,1.8％（3/163）,0.0％（0/4）and 14.3％（1/7）respectively in the field. Conclusion The rodents were infected naturally and generally by HV in Yunnan Province. There were two types of HV in Yunnan Province, genotype of Seoul circling in the main hosts of Rattus norvegicus and Rattus flavipetus and the genotype of Hantaan circling in the main hosts of Apodemus chevrieri and Eothnomys melanogaster. But, the major type in rodents was the genotype of Seoul circling in the main hosts of Rattus norvegicus and Rattus flavipetus, which were associated with the light and sporadic cases of HFRS in Yunnan Province.
Key words：Rodents; Hantaviruses; Hemorrhagic fever with renal syndrome; Natural infection
随着人类社会活动的日益频繁和生态环境的巨大变化，新发和再次发生的传染病在不断的危害着人类。汉坦病毒属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantavirus, HV)，啮齿动物为其自然宿主。迄今为止，HV主要引起人类发生肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）。HPS主要流行于美洲，我国流行的主要是HFRS。近年来，汉坦病毒在云南省的流行有扩大的趋势。为了解汉坦病毒在宿主动物中的自然感染状况，我们在肾综合征出血热监测的基础上，对啮齿动物中汉坦病毒自然感染状况进行了调查研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本采集 于2004年6～8月间，在云南省选择具有代表性的11个县（市）进行汉病毒的自然感染率调查。用鼠笼和鼠夹在调查的11个县（市）进行捕鼠，捕获的宿主动物进行分类鉴定并解剖取肺脏组织，放入塑料冻存管内。
1.1.2 采集标本的保存 采集的动物标本放置于-196℃液氮保存，并及时带回实验室进行汉坦病毒相关抗原检测。
1.2 方法
1.2.1 鼠肺组织标本抗原片制备 将鼠肺冰冻切片，刀台用 -35℃，刀用 -10℃，冷丙酮固定5～10min,7.2 PBS漂洗后，电扇吹干，-20℃保存。
1.2.2 直接免疫荧光法 直接荧光抗体购自浙江省疾病预防控制中心，按常规方法进行，将制备的抗原片吹干，加入异硫氰酸荧光素(FITCE)标记的HFRS抗体，工作浓度1：4，稀释用1：50 000的依维氏兰，每孔加0.025ml HV荧光抗体，以恰好将孔覆盖为宜；37℃ 湿盒孵育1h，7.2 PBS 振荡清洗3次，每次5min；吹干后，滴加90％的甘油，置荧光显微镜下观察。
1.2.3 自然感染率95％可信区间的计算 感染率的标准误 Sp=p(1-p)/n, 其中p为感染率，n为样本数；感染率95％可信区间为：p±1.96Sp［1］。
2 结果
2.1 宿主动物的组成 11个县（市）进行了宿主动物调查，结果共捕获宿主动物5属8种1303只，其中，居民区黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠和大足鼠分别占58.3％（646/1109）、28.3％（314/1109）、4.3％（48/1109）和9.1％（101/1109），黄胸鼠和褐家鼠为居民区优势种。野外高山姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠和臭鼠
表1 云南省11县（市）HFRS宿主动物种群构成情况（略）
注：括号内的数字为捕获数
2.2 汉坦病毒自然感染率 11个县（市）汉坦病毒总的自然感染率为3.9％（3.8％ 4.0％）(51/1303)，各县（市）汉坦病毒自然感染率最高为祥云县7.19%;最低为宾川县2.5%。居民区黄胸鼠、褐家鼠、小家鼠和大足鼠中汉坦病毒自然感染率分别为3.8％（24/637）、5.5％（15/274）、4.2％（2/47）和3.0％（3/100）；野外高山姬鼠、大绒鼠、中华姬鼠和臭鼠
表2 云南省11县（市）啮齿动物中汉坦病毒自然感染情况（略）
注:表示捕获数为0；表示分子为检测阳性数；分母为检测数
3 讨论
HFRS是一种由啮齿动物为主要宿主和传染源的自然疫源性疾病，可将疫区划分为姬鼠型疫区、家鼠型疫区和混合型疫区［2］。该调查表明云南省啮齿动物中，不管家鼠和野鼠肺脏组织内，皆检查出汉坦病毒，提示云南省普遍存在汉坦病毒自然感染，自然感染率一般在1％～10％之。以前研究认为，汉坦病毒在宿主动物中的自然感染率大小与当地HFRS的发病率呈正相关。其感染率大小可作为HFRS监测指标之一，也可作为HFRS流行的预警因素。这方面的研究有待于近一步的探讨。
HFRS在云南省广泛分布，以散发及轻型病例为主［3］。一般说来，进入家鼠型疫区，由家鼠汉坦病毒感染的病例，以轻型为主，临床上不易发现；而进入姬鼠型疫区，由姬鼠汉坦病毒感染的病例，以重型为主，临床上容易发现。该调查阐明云南省存在以褐家鼠－黄胸鼠为主要宿主动物的汉城型病毒的循环形式和以高山姬鼠－大绒鼠为主要宿主的汉滩型病毒的循环形式。其中，以褐家鼠－黄胸鼠为主要宿主动物的汉城型病毒的循环形式为主，这与云南省流行性出血热病例，从临床上以散发和轻型病例为主相符。
尽管汉坦病毒的型别具有宿主特异性，但也存在着感染病毒与宿主动物不一致而发生宿主“溢出”的现象［4,5］，这往往会导致两种结果的发生，其一这种感染可能只是暂时的，很快在动物体内得以清除，因此这种情况对病毒得以维持和进化无多大意义［6］；其二则是发生宿主转换,病毒能够较好地适应新的宿主动物，并加以进化［4,5］。比如，新近有研究者从爱沙尼亚黑线姬鼠分离出DOB型汉坦病毒（Saa株），而这种病毒与黄喉姬鼠来源的DOB型病毒无论是病毒核苷酸序列上，还是从中和试验上均明显不同，这提示黄喉姬鼠型毒株可能发生了宿主转换，传给黑线姬鼠并与之进化，产生了新的汉坦病毒进化分支［7］；在HPS相关病毒与鹿鼠和白足鼠之间的进化关系中，也提示存在着这种宿主动物的转换［8］；而中国的NC167株也被认为是HTN型病毒从黑线姬鼠转移至社鼠后进化而来［9］。该研究从臭鼠[KG-*3〗句鼠[KG-*3〗青(Suncus murinus)的标本中，也检测出汉坦病毒感染，而臭鼠[KG-*3〗句鼠[KG-*3〗青为食虫类动物，说明其对汉坦病毒的感染也可能存在着宿主动物的“溢出”现象，或可能臭鼠[KG-*3〗句鼠[KG-*3〗青感染汉坦病毒为偶然感染，其作为汉坦病毒的宿主地位有待于进一步的探讨。
【参考文献】
［1］ 倪宗瓒.卫生统计学［M］.第4版.北京：人民卫生出版社，2001,1：76～79.
［2］ 宋干.流行性出血热防治手册［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，1998,9:268～269.
［3］ 自登云，候宗柳，米竹青,等.云南肾综合征出血热宿主动物及病毒生物学形状的研究［J］.中国鼠类防治杂志,1988,(增刊）：317～321.
［4］ Mills JN, Ksiazek TG. A survey of hantavirus antibody in small-mammal populations in selected United States national parks［J］. Am J Trop Med Hyg,1998,58:525～532.
［5］ Monroe MC, Johnson Am. Genetic diversity and distribution of Permyscus-borne hantaviruses in North America［J］.Emerg Infect Dis, 1999, 5:75～86.
［6］ Mifang Lang,Li DX, Xiao SY,et al. Antigenic and molecular characterization of hantavirus isolates from China［J］.Virus Research, 1994,31:219～233.
［7］ Nemirov K, Henttonen H, Vaheri A,et al. Phylogenetic evidence for host switching in the evolution of hantaviruses carried by Apodemus mice［J］.Virus Res, 2002, 90(1-2):207～215.
［8］ Martha CM, Sergey PM,Angela MJ,et al.Genetic diversity and distribution of Peromuscus- Borne Hantaviruses in North America［J］. Emerg. Infect. Dis,1999, 5(1):75.
［9］ Hua wang, Kumiko Y, Hideki E,et al. Genetic diversity of hantaviruses isolated in China and characterization of Novel Hantaviruses isolated from Niviventer con fucianus and Rattus rattu［J］. Virology,2000,278:332～345.
作者单位：云南省地方病防治所，云南 大理 671000.
【摘要】 汉坦病毒所引起的出血热肾综合征和汉坦病毒肺综合征是一类以发热、出血、肾损害或肺水肿为主要临床特征的急性传染病。该病的疫源地遍及世界各地，我国是世界上受其危害最严重的国家，在我国流行的主要为HTN和SEO两型。目前对该病毒所致疾病仍无特效疗法，因此及时发现和诊断汉坦病毒感染显得尤为重要。本文对汉坦病毒感染的实验诊断研究进展作一简要综述。
【关键词】 汉坦病毒感染;实验诊断
Advance in experimental diagnosis of Hantovirus infection.
LU Xiang-bin, ZHUGE Hong-xiang.
（Department of Pathogen and Biology, Suzhou University, Suzhou 215123, Jiangsu, P. R. China）
汉坦病毒是引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）的病原体,属于布尼亚病毒科。HV在全球分布广泛，中国是受HV危害最严重的国家，历年报告的HFRS病例数约占世界病例总数的90％左右。汉坦病毒为单股负链RNA病毒，其基因组由大（L），中（M），小（S）3个片段组成，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶，包膜糖蛋白（GP）G1和G2，及核衣壳蛋白（NP）。GP位于病毒外层包膜，其表面有血凝素抗原和中和抗原位点；NP则位于核心,无中和抗原位点,但能诱导强烈的体液免疫和细胞免疫［1］。根据HV血清学和基因组信息，HV可分为近30种血清型/基因型［2,3］。目前以明确HTNV，SEOV，DOBV，THAV及PUUV为HFRS的病原，主要流行于欧亚等地［4,5］；SNV及相关的病毒为HPS的病原，其主要流行于北美等地［6］，而PHV及TPMV等对人的致病作用尚不清楚。虽然近年HFRS发病率明显下降，但疫区却在不断扩大，值得引起人们的重视。这是因为汉坦病毒（HV）引起的HFRS和HPS临床表现相对较重，病死率较高（但PUUV引起的HFRS临床表现较轻）。因此，预防该病毒的感染和及时诊断就显得尤为重要，本文仅对汉坦病毒感染的实验诊断研究进展做一综述。
1 病毒分离
病毒分离是病毒性疾病诊断的“金标准”，通常采用细胞培养和动物敏感接种试验。最初发现人肺癌细胞株（A549）对本病毒敏感，相继有发现非洲绿猴肾细胞（VERO-E6），人胚肺细胞（2BS）等正常组织或传代细胞对汉坦病毒均敏感。敏感动物常选用褐家鼠、大白鼠、豚鼠等［7］。但由于汉坦病毒在培养的细胞中复制较为缓慢且毒力强要求实验室达P3或P4级［8］。显然不适合临床实验诊断，仅作为基础实验研究用。
2 血清学诊断
自从HV成功分离以后，对汉坦病毒感染的特异性诊断方法就迅速建立起来，主要包括免疫荧光测定、PRNT、血凝抑制试验（HI）和ELISA等。
2.1 免疫荧光测定（IFA） 将汉坦病毒感染的组织细胞固定在玻片上与待检测的血清标本结合后，再用荧光标记的抗人球抗体与之作用，在荧光显微镜下观察是否有相应的抗原抗体复合物。李镐汪等人就是利用IFA技术从黑线姬鼠肺内检测到HA抗原，并从朝鲜出血热病人和野鼠血清中检测到相应抗体，已广泛应用于病毒学、血清流行病学和汉坦及相关病毒发病机理研究。该技术只需要荧光镜等设备，操作者要有经验，以排除非特异荧光，这限制了其在临床诊断中的应用。同时，可直接用荧光标记针对该病毒单克隆抗体来检测患者血清和组织中的病毒抗原。
2.2 空斑减少中和试验和血凝抑制试验 主要用来检测中和抗体和证实HFRS的诊断［9］，是Ft.Detric地区所使用的最特异的血清学方法，它对于抗原性密切相关的汉坦病毒不同株之间的分型诊断极有用。该试验操作繁琐、所需时间也较长，无法满足肾综合征出血热临床及时诊断及分型的需要；之后人们利用HA包膜糖蛋白所具有的血凝活性，建立了血凝抑制试验（HI），敏感特异，操作简单，但是HV核酸变异较大有时在混合疫区或病毒发生了变异地区也无法用于鉴定和分型诊断。
2．3 酶联免疫吸附试验（ELISA） 主要用于检测特异的IgG,IgM。常用夹心法和抗人u链捕获法，一般检测双份血清IGG抗体，恢复期超过4倍以上表示新近感染，而单份IgG检测只能作为血清流行病学调察，只有IgM单份抗体阳性也表示患者新近感染过病毒。ELISA方法具有较高的特异性和敏感性，且操作简便，结果可靠，适用于早期诊断和流行病学调查。由于上述血清学试验所用抗原多数来自于病毒感染的鼠脑或培养细胞［10］，在制备诊断用抗原时存在着生物安全问题。近年来基于分子生物学的进步，如逆转录和重组蛋白的表达等，提高了HFRS诊断的特异性和敏感性。人们纷纷转向于用HV的重组结构蛋白进行实验诊断研究。
2.4 重组抗原在血清学诊断中的应用 Padula等［11］应用阿根廷HPS的主要病原Andes病毒重组的核衣壳蛋白作抗原，采用固相酶免疫试验检测特异性IgG 和IgA，应用捕获ELISA 法检测IgM, 对135例RT-PCR认可的HPS病例，77例其他呼吸道感染的病例和957例来自疫区和非疫区的健康居民进行检查，结果HPS的早期患者均有很强的特异性lgM、IgG和IgA反应，IgM 最早出现在发生症状后第1d，IgG在第7d，IgA在第1d。IgM 抗体在所有病人的第一次标本中均阳性。IgM 和IgG的特异性和敏感性均为100％。特异性IgA抗体也在急性HPS病人的唾液中检出。Araki等［12］将应用杆状病毒表达系统表达HTNV 、SEOV 、DOBV 、PUUV的核蛋白全长和截短的片段作为诊断抗原应用于ELISA，并分别用四型病毒的兔免疫血清和人阳性血清（已用PRNT 明确分型）进行了初步试验，发现全长rNP ELISA只能够将PUUV感染与其它三型病毒感染区分开来。但三型病毒感染却因都有交叉反应而无法区分；而rNP50 ELISA则能够对三型病毒感染进行明确地区分，与同型血清的OD值可达到与异型血清OD值的2倍以上。并且与原分型结果一致，同时对49份已用PRNT明确分型的病人阳性血清进行了分型比较（17份HTNV型血清、12份SEOV型血清、20份DOBV 型血清），分型标准为：如果单份血清与SEOV或DOBV rNP50反应的OD 值和与HTNVrNP50反应的OD值之比<0．7，则判为HTNV 型血清，反之亦然。结果共确定16份为HTNV 型血清、12份为SEOV 型血清、19份为DOBV型血清，与PRNT分型的符合率分别达到了94％ 、100％ 和95％。荷兰学者HUJAKKA等［13］应用杆状病毒表达系统表达了HTNV，SEOV，DOBV和PUUV NP,并应用表达抗原建立了一种新的血清学诊断技术—免疫色谱快诊试验（Immunochromatographic rapid test）,能在20min内得到检测结果。据报道该方法简便,快速,敏感而特异,已试用于HV感染血清学分型快诊研究，即为一种快速检测IGM抗体的免疫层析方法,分别采用一种特异性抗原或多种抗原联合检测。前者在DOBV,HTNV、PUUV抗原检测中的特异性和敏感度96%～100%;后者的特异性均为96%,敏感度则在80%～93%。DOBV与HTNV之间的交叉反应较常发生,HTNV与PUUV或DOBV与PUUV之间交叉反应较少发生。前一种方法的敏感度显著高于后者,但是,后者更适合于在混合感染型疫区使用。朱函坪等［6,24］先后从汉坦病毒疫苗Z10株中克隆汉坦病毒糖蛋白，核蛋白基因，应用杆状病毒-昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达，制成抗原片建立了重组抗原免疫荧光法，用于检测血清中汉坦病毒抗体与传统的抗原片（Z10株感染Vero-E6细胞制成的抗原片）比较，阳性符合率分别为95%，100％。认为简单方便可以作为临床诊断用。
3 分子生物学诊断
自从二十世纪八十年代中期美国Cetus公司人类遗传室Mullis发明PCR以来，这一技术很快就渗透到分子生物学的各个领域，广泛应用于基因分离，核酸序列分析，突变体和重组体的构建等，从而为临床病原感染性疾病的诊断提供了新的方法和途径。目前，人们主要采用RT-PCR以及在此基础上建立的检测HV RNA的一系列基因分型方法。这些方法都是根据HV RNA的M和（或）S片段的核酸序列设计引物，通过扩增来检测病毒的核酸，与血清学诊断法一起从不同侧面诊断汉坦病毒感染与否，同时还有分型诊断能力。
3．1 RT-PCR Nicol［16］等人首次使用RT-PCR技术对在美国西南爆发的一种急性严重呼吸急迫综合征患者的肺组织细胞中病毒核酸进行鉴定，得出是一新型汉坦病毒所致。人们越来越多地使用这一技术对病毒进行基因诊断和急性流行病的回顾性诊断［17,18］。但是该病毒核酸序列易发生变异，人们不能对汉坦病毒流行地区的基因分型诊断。为此有人［19］采用RT-PCR结合限制性长度多态性分析法（RFLP）和构建系统进化树法对毒株进行分型诊断研究。RALUE［20］等人就曾用这一方法对南美等地鼠科啮齿类动物汉坦属组内的变异型汉坦病毒进行分析，这是因为RFLP与血清学方法的结果一样，不能区分亲缘关系较为接近的毒株型别；而系统进化树分析方法通过RT-PCR扩增汉坦病毒M节段的全长序列及对其中部分基因序列分析，然后与代表株序列进行系统发生分析，从而确定毒株间的进化关系。这类试验条件要求较高，试剂昂贵，操作复杂，不易在基层展开。
3．2 NEST-PCR NEST-PCR（巢式-PCR）通过设计两组引物，一组为外引物，多为病毒属引物；另一为内引物，多为特异性引物；先用外引物扩增出特定区段的核酸片断为模板，再分别用不同型别的内引物进行扩增和分型。HTN型内引物仅能扩增病毒HTN型基因片断，不能扩增SEO片段，反之亦然。国外有人采用这样的基因分型方法研究了PUUV感染和DOBV感染者体内的汉坦病毒的核酸，发现仅有2/3和1/2的检出率，这说明了该法尽管其敏感性很高，但在技术上还有些问题［21］。
3．3 PCR-ELISA PCR扩增产物一般通过凝胶电泳来检测。自从1997年Niemeyer提出所谓的免疫-PCR和PCR-ELISA检测，即用ELISA方法来检测并定量PCR产物以来，国内外就开始有人使用这一技术对汉坦病毒的核酸和胞膜抗原进行检测。该法先用单对寡核苷酸引物在地高辛标记的dUTP存在的情况下被扩增，然后用rTthDNA聚合酶进行PCR，地高辛标记的PCR产物与病毒型特异性的生物素标记的探针在液相杂交，捕获于链卵白素包被的微孔板，用过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和色素底物进行检测。A. Dekonenko a, M.S. Ibrahim［22］等人对来源于欧亚和北美的9种18株汉坦病毒核酸进行分型检测，发现该法能正确区分同源的病毒型别，其检测下限大约15PFU或50个基因拷贝。方法简单，适于自动化，特异性高，用于诊断和分型比较准确。
3．4 实时荧光定量PCR技术在检测HV中的应用 该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其避免了传统PCR方法以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的可重复性。AITICHOU M等［23］报道，采用一步法实时定量PCR，对DOBV、HTNV、PUUV、SEOV 4种血清型进行检测，特异性分别为100% 、100% 、100% 、98% ，敏感度分别为98%、98%、95%、92%、 94%、 96%。该方法的特异性和敏感度高、可重复性好，对HFRS的诊断和汉坦病毒的基因分型有重要价值。
3．5 DNA微阵列技术在检测HV基因中的应用 DNA微阵列技术就是通过特殊的微加工技术在固体支持物表面固定大量不同种类的DNA探针和样品DNA分子进行特异的核酸分子杂交来检测样品中基因信息。Henrik Nordstrm［24］等人利用6种12株不同的汉坦病毒CDNA片段设计的特异HV微阵列技术对瑞典北方地区感染有汉坦病毒的野鼠肺组织经过PT-PCR扩增的产物进行分析，发现该技术能精确的鉴定出鼠肺组织中的HV病毒基因信息，甚至对同源性达90%同种不同株的病毒都能准确分析出，尤其适用于变异型较多的病原基因分型诊断。
4 结语
综上所述，在所有诊断汉坦病毒感染的实验方法中，ELISA方法简便，结果可靠，费用低廉，便于基层实验室展开诊断和进行流行病学调查。特别是随着分子生物学和基因工程的进步，人类获得汉坦病毒重组抗原和抗体更具有特异性，使得ELISA方法具有极为广泛的应用价值。同时，随着生物传感器技术和流式细胞术在HV感染诊断中的应用和深入发展［25～28］，人们将会更及时有效地作出诊断，指导临床尽早实施抗病毒治疗、进行预后评估，对减轻患者临床症状、改变病程甚至降低死亡率都有极其重要的意义。
【参考文献】
［1］ 李家亮，李德新．汉坦病毒的病原学研究进展［J］.中华实验和临床病毒学杂志,2005,19（2）:198～200.
［2］ Plyuanin A.Virus evaluation and genetic diveraity of hantaan．viruses and their rodent hosts［J］. Curr Top Microbiol Immunol,2001,256：47.
［3］ 金光香，王世文． 汉坦病毒基因分型研究进展［J］．中国地方病防治杂志，2003,18（3）：158～160.
［4］ Olli Vapalahti, ukka Mustonen. Hantavirus infections in Europe［J］. Lancet Infect Dis, 2003, 3:653～661.
［5］ L. LLEDO, M. I. GEGU NDEZ, J. V. Serological study of hantavirus in man in the Autonomous Community of Madrid［J］. Spain J Med Microbiol, 2002,51：861～865.
［6］ C. McCAUGHEY ， C. A. HART hantaan viruses［J］. J Med. Microbiol, 2000,49: 587～599.
［7］ Angela J. Sanchez. Genetic identification and characterization of limestone canyon virus,a unique peromyscus-borne hantavirus［J］. Virology, 2001, 286: 345～353.
［8］ US Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories fourth［R］. National Institutes of Health, 1999.
［9］ Niklasson, B. Jonsson, A. Lundkvist, J.， et al. Comparison of European isolates of viruses causing hemorrhagic fever with renal syndrome by a neutralization test［J］. Am. J. Trop. Med. Hyg,1991, 45:660～665.
［10］ J. Clement, P. Mckenna, J. Groen, et al. Epidemiology and laboratory diagnosis of Hantavirus （htv） infections, Acta Clin［J］. Belg, 1995,50：9～19.
［11］ Padula PJ,Ro L CM. Developmemt and evaluation of a solid - phase enzyme immunoassay based on Andes hantavirus recombinant nucleiprotein［J］. Med Microbiol，2000,49：149～155.
［12］ Araki K，Yoshimatsu K，Ogino M，et al. Truncated Hantavirus nucleocapsidproteins for serotyping Hantaan，Seoul，and Dobrava hantaviruses infections［J］．J Clin Microbiol，2001，39（7）：2397～2404.
［13］ Hujakka H，Koistinen V，Kutonen l，et al．Diagnostic rapid tests for acute hantavirus infections：specific tests for Hantaan， Dobrava and Puumala viruses versus a hantavirus combination test［J］．J Virol Methods，2003,108（1）：117～122.
［14］ 朱函坪, 姚苹苹 ,徐芳，等.汉坦病毒核蛋白在免疫荧光诊断技术中的应用［J］.浙江预防医学,2006,8:4～5.
［15］ 朱国献，朱函坪.汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用［J］.中国媒介生物学及控制杂志，2005，16：199～201.
［16］ Nichol ST, Spiropoulou CF, Morzunov S, et al. Genetic identification of a hantanvirus associated with an outbreak of a cute respiratory illness［J］. Science, 1993,262:914～917.
［17］ Weidmann, Manfred. Identification of genetic evidence for dobrava virus spillover in rodents by nested reverse transcription （RT）-PCR and TaqMan RT-PCR［J］.Journal of clinical Microbiology, 2005,43（2）:808～812.
［18］ Papa A，Johnson AM，Stockton PC, et al．Retrospective semiocal and genetic study of the distribution of hantaviruses in Greece［J］．J Med Virol，1998,55（4）：321～327.
［19］ AhnC.Cho JT. Hantaan and Seoul viruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism （RFLP）in renal syndrome patients with hemorrhagic fever［J］． Clin Nephrol，2000,53 （2）：79～89.
［20］ Ra ul E. A contribution to the subgeneric systematics of Oligoryzomys （Rodentia, Muridae） from Argentina by means of PCR–RFLP patterns of mitochondrial DNA［J］. Biochemical Systematics and Ecology, 2002, 30：23～33.
［21］ Plyusnin A, Mustonen J,Asikainin K, et al．Analysis of Puuma1ahantavims genome in patients with nephropathia epidmica and rodent carriers from the sites of infection［J］．J Med Virol,1999,59（3）：397～405.
［22］ A.Dekonenko, M.S. Ibrahim. A colorimetric PCR-enzyme immunoassay to identify［J］. Hantaviruses clinical and diagnostic virology, 1997,8:113～121.
［23］ Aitichou M，Saleh S S，Mcelroy A K，et al． Identification of Dobrava， Hantaan， Seoul and Puumala virus by one-step real-time R rI PCR［J］．J Virol Methods,2005,124（1-2）：21～26.
［24］ Henrik Nordstrm, Patrik Johansson. Microarray Technology for Identification and Distinction of Hantaviruses［J］. Med Virol，2004,72:646～655.
［25］ Srinivas Vetcha a, Ebtisam Wilkins，et al. Rapid and sensitive handheld biosensor for detection of hantanvirus antibodies in wild mouse blood samples under field conditions［J］. Talanta, 2002,58：517～528.
［26］ MaW H，XuCH，Fan J，et al．The use of flow cytometry for the detection of CMV in recipients of transplantation［J］.Chin J Lab Med，2002，25：20～22.
［27］ Zoeteweij J， Eyes S L， Orenstein J M，et al．Identification and rapid quantification of early-and late-lytic human herpesvirus infection in single cells of flow cytometrics analysis：characterization of antiherpesvirus agents［J］．J Virol，1999，73：5894～5902.
［28］ 王卫华,王峰.流式细胞术检测汉坦病毒抗原血症的临床应用［J］.中国病毒学,2006,21（3）：298～300.
作者单位：苏州大学独墅湖校区病原生物学教研室,江苏 苏州 215123.
人源性汉坦病毒噬菌体抗体基因的筛选、测序和表达
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第1期第19卷 出血热
作者：侯颖春 杨为松 白雪帆 许国双 李光玉
单位：侯颖春（710032 西安，第四军医大学西京医院老年病科）；杨为松 白雪帆 许国双 李光玉（第四军医大学唐都医院传染病科）
关键词：噬菌体；抗体；汉坦病毒；DNA；单链；免疫球蛋白可变区
【 摘要 】 目的 为了获取人源性HFRS基因工程抗体。方法 直接从人体PBL构建人全套ScFv、VH噬菌体表面呈现文库，以panning方法筛至四级文库，以ELISA方法鉴定各克隆抗汉坦病毒活性。结果 获得了14个ScFv阳性克隆和11个VH阳性克隆。其中ScFv最高阳性克隆A410值为0.44, VH最高阳性克隆A410值为0.50。对最高阳性克隆进行了测序分析，证明连接和克隆正确，获得了抗HTV人源性ScFv和VH抗体的基因片段。克隆再转化于HB2151 菌株，成功地进行了分泌型抗体片段的表达。结论 采用噬菌体抗体库技术直接从人体克隆人源性汉坦病毒噬菌体抗体可行，对HFRS的防治有一定的实际意义。
Selecting, sequencing and expressing of the human phage antibody fragments against HTV HOU Yingchun*, YANG Weisong, BAI Xuefan, et al.*Department of Geriatrics, Xijing Hospital, Xi'an 710032
【 Abstract 】 Objective To obtain the genetic engineering antibody against HFRS virus.Methods Repertoires of human ScFv and VH displayed on pHEN1 have been generated directly from human PBL. The two repertoires were panned into grade-4 repertoires. The activity of each clone to bind HTV was examined by using ELISA.Results 14 positive ScFv clones and 11 positive VH clones have been found . The highest value of A410 in positive ScFv clones was 0.44, and in positive VH clones was 0.50. The two clones were sequenced, and the sequencing results demonstrated that the genes of ScFv and VH were the human antibody genes, and the gene ligating, cloning and screening were correct and successful. The secretory expression of ScFv and VH were also carried out.Conclusions The experimental results suggest that the skills used in the paper are good to obtain the genetic engineering antibedy against HFRS.And the antibody could be used for prevention and treatment of HFRS.
【 Subject words 】 Phage antibody Hantavirus Single chain Fv Variable region of antibody
有关汉坦病毒（Hantavirus, HV）的抗体曾有较多报道，但都为鼠源性抗体或者非真正意义上的基因工程抗体（即没有绕过杂交瘤和人工免疫技术而制备的基因工程抗体）。这些抗体有许多众所周知的不足因而使它们在临床的应用受到限制。噬菌体全套抗体库技术可以绕过杂交瘤和免疫技术而制备真正意义上的人源性基因工程抗体，为基因工程抗体研究开避了广阔的前景。
我们从本院收治的来自不同疫区的10 例肾综合征出血热（HFRS）病人的外周血淋巴细胞（PBL）提取RNA, 以Oligod(T)15 为引物合成cDNA第一链，以自行设计的数对人抗体V区通用引物扩增出了人抗体VH、Vκ、Vλ基因，以自行设计的linker引物扩增了linker, 并通过SOE反应（splicing by overlap extension）构建了单链抗体基因（ScFv）。以载体pHEN1与ScFv 、VH重组，转化大肠杆菌菌株TG1，经过M13KO7的超感染，成功地构建了人源性全套ScFv(VH -linker-Vκ)和VH噬菌体表面呈现文库〔1〕。本文将就该两种文库的筛选、抗体活性鉴定、序列测定以及分泌型表达等方面作一报道。
材料与方法
1.PBL分离和处理、RNA提取、cDNA第一链合成、引物设计、PCR方法、SOE反应、M13KO7超感染以及文库的获得：均参见文献〔1〕。
2.文库的panning筛选：以Chen、R22、76-118、Seoul等 4株HV（鼠脑浸出物）混合物对倍稀释后包被90mm聚苯乙烯平皿，将文库倾至平皿上（10ml/皿），37℃置3小时，弃液体，以PBS-0.05%Tween 20洗皿20 次。以来自M9平板并经扩大培养的TG1菌液（10ml／皿）覆盖平皿，37℃置2小时,收液体，37℃摇床培养1小时，离心后沉淀以2×YTAG (含100μg/ml氨苄青霉素、2%葡萄糖的2×YT)10ml重悬，37℃摇床培养过夜。给过夜培养物中加入4×1010PFU的M13KO7，37℃摇床1小时，离心弃上清。沉淀以2×YTAK(含氨苄青霉素、卡那霉素各100μg/ml的2×YT)重悬，37℃摇床培养过夜，4℃、4000r/min离心10分钟，收集上清即为次级文库。上述包被、吸附、洗脱、再感染、扩大培养（扩增）、超感染、获次级库的全过程称之为panning。本研究做了3轮panning至获得四级文库。
3．单克隆化及克隆抗体活性鉴定：单克隆化以SOBAG(含100μg/ml氨苄青霉素、2%葡萄糖的SOB)平板铺板培养的方法进行，获得各克隆含重组pHEN1的上清。各克隆抗体抗HV活性鉴定以常规ELISA方法进行，其中包被抗原用Chen、R22、76-118、Seoul等4株病毒鼠脑浸出混合物。二抗用羊抗M13抗体（Pharmacia出品），酶标抗体用驴抗羊-HRP（华美公司出品）。阴性对照孔以0.5% BSA包被，阳性对照孔以羊抗M13抗体包被，底物为OPD（华美公司提供），测A410值。
4．最高A410值克隆抗体基因序列测定 参照Sambrook等所述制备单链测序模板〔2〕，按载体pHEN1克隆位点双侧序列设计测序引物，送北京赛百盛（美国）生物工程公司以双脱氧末端终止法在全自动测序仪进行测序。
5．分泌（可溶）型表达：将上述测序证实后的克隆重提重组子，转化大肠杆菌HB2151菌株，在IPTG诱导下进行分泌型表达，分别从培养上清和细菌周质中收获可溶性抗体片段。
结 果
1．文库的panning筛选：ScFv文库和VH文库的库容以建库用PBL衡量均为106 PBL，以建库后其噬斑形成单位（PFU）衡量均约为5.5×1012PFU〔2〕。经过3轮panning筛选，获得四级文库，ScFv四级文库和VH四级文库库容分别约为2.5×1012 PFU和3.5×1012PFU。
2．单个克隆化及各克隆抗体活性鉴定结果：四级文库菌种经100∶1和1000∶1稀释后在SOBAG琼脂板上铺板培养，共收集了180个ScFv菌落和200个VH菌落。经扩大培养及M13KO7超感染，获得了380个克隆的含融合表达产物的重组子的上清。以4株HTV混合物包被96孔板，以抗M13抗体为二抗，以驴抗羊-HRP为酶标抗体，做常规ELISA检测。结果获得14个ScFv阳性克隆和11个VH阳性克隆，A410值见表1和表2。最高A410值克隆分别是BS22 (0.44)和AV7(0.50)。
表1 ScFv融合表达阳性克隆ELISA检测结果
Table 1. Result of ELISA examining for positive clones of ScFv
| Numbers of
positive clones |
AS4 | BS12 | BS22 | CS4 | CS10 | CS12 | DS5 | ES1 | ES6 | ES8 | ES9 | FS2 | GS4 | HS6 |
| Value of A410 | 0.36 | 0.34 | 0.44 | 0.40 | 0.29 | 0.33 | 0.31 | 0.40 | 0.41 | 0.43 | 0.29 | 0.36 | 0.37 | 0.31 |
表2 VH融合表达阳性克隆ELISA检测结果
Table 2. Result of ELISA examining for positive clones of VH
| Numbers of positive clones | AV2 | AV7 | AV8 | AV9 | AV12 | CV8 | DV12 | EV3 | GV7 | GV9 | HV8 |
| Value of A410 | 0.41 | 0.50 | 0.40 | 0.42 | 0.39 | 0.34 | 0.33 | 0.31 | 0.49 | 0.48 | 0.28 |
3．最高A410值阳性克隆测序分析: 两次小量制备单链测序模板每种约10μg 。ScFv (700～750bp)测序用长胶，VH(300～370bp)测序用短胶。测序结果如图1、2。将序列测定结果推导成多肽链序列，则如图3，图4。
图1 ScFv-BS22序列测定结果
Fig 1. The sequencing result of ScFv-BS22 clone
The sequence before linker is VH, the one after linker is Vκ
图2 VH-AV7序列测定结果
Fig 2. The sequencing result of VH-AV7 clone
图3 ScFv-BS22多肽链序列推译
Fig 3. The inference of polypeptide sequence for ScFv-BS22
The sequence before linker is VH, the one after linker is Vκ
图4 VH-AV7多肽链序列推译
Fig 4. The inference of polypeptide sequence for VH-AV7
以上DNA 序列经与gene-bank中抗体基因家族以及文献资料比较分析，发现各FR区均符合人抗体相应FR区特征，提示均为人抗体基因，证明基因的拼接、克隆、筛选均获成功。
4．抗体片段的分泌型表达（可溶性表达）：将ScFv-BS22和VH-AV7克隆的宿主菌由TG1更换为HB2151后，在IPTG诱导下进行分泌型表达。来自培养上清和细菌周质的可溶性表达产物均经三蒸水透析48小时。聚丙烯酰胺凝胶电泳测定ScFv-BS22和VH-AV7可溶性表达产物相对分子质量分别约为31×103和15×103，与预期相符。
讨 论
噬菌体抗体库技术属于目前分子生物学和分子免疫学的新技术，该技术的主要优点有：①大大提高了抗体基因文库的筛选效率；②绕过了杂交瘤和免疫技术而制备抗体；③模拟了天然抗体库〔3～5〕。
本研究直接从人PBL 构建了人源性全套ScFv(VH-linker-Vκ)和VH噬菌体表面呈现文库，由于使用了通用引物，采血对象是来自不同疫区的特异性IgG阳性的HFRS恢复期患者、构建ScFv时基因可再自由配对，所以，对于筛选抗HV抗体来说，该库库容（106 PBL）已足够大。
文献一般对所建文库panning 两次至三级文库用作克隆筛选，我们为了随后克隆筛选的便利，对两个文库panning了3次，获得四级文库，文库中目的重组子克隆所占比重（相对）已足够大。
共筛出了14个ScFv 和11个VH 抗HTV阳性克隆，其中ScFv-BS22和VH-AV7是各自阳性克隆群中活性较高者（为了下一步表达产物活性较高并最终获得活性较高抗体，这里特选A410值最高者），其序列经与gene bank中人抗体基因家族成员以及文献资料〔3，4〕比较分析，发现各片段FR区均符合人抗体各相应FR区特征。随后进行的分泌型表达产物的分子量的测定也与预期分子量相符。以上结果提示所获基因片段均为人抗体基因片段，表明基因的拼接、克隆、筛选是成功的。
ScFv和VH片段均无Fc区，故以M13抗体对融合表达产物进行ELISA检测，因此种表达产物是抗体片段与噬菌体外壳蛋白（CPⅢ）的融合表达产物。这种检测方法有一定误差，由于国内实验条件所限，目前尚无更好的方法。0.44和0.50这样水平的活性指标，显然不够理想，有待于以分子生物学方法（如点突变法等）进一步提高其活性。
在汉坦病毒(HV)抗体方面，以往的研究尚未脱离杂交瘤技术。采用噬菌体抗体库技术直接从人体克隆人源性抗HV的基因工程抗体，获得了有一定HV结合活性的ScFv(VH -linker-Vκ)和VH 2种抗体片段，进一步对表达产物特性进行研究对HFRS的防治将有一定的理论及实际价值。
本课题受两项国家自然科学基金（39370619，39400117）资助
参考文献
[1]侯颖春，白雪帆，杨为松，等.出血热恢复期患者全套噬菌体抗体库的构建.细胞与分子免疫学杂志，1997，13(4)∶7-12.
[2]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning-a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，576-847.
[3]Marks JD, Hoogenboom HR, Bonnert TP, et al. By-passing immunization: human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. J Mol Biol，1991， 222∶581-597.
[4]McCafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature， 1990，348∶552-554.
[5]Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, et al. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature, 1991, 352∶624-628.
(收稿：1997-08-06 修回：1998-01-15)
摘要:目的 调查云南省兰坪县人、鼠间肾综合征出血热（HFRS）的感染情况，为HFRS预防控制提供指导。方法 鼠类肺脏组织中汉坦病毒抗原检测采用直接免疫荧光法，人和鼠血清中汉坦病毒抗体检测采用间接免疫荧光法。 结果 兰坪县3个乡镇共捕获5属158只啮齿动物，其中居民区中褐家鼠的构成比为91.09%，为优势种;野外高山姬鼠的构成比为63.16%，为优势种。3个乡镇中仅见中排乡捕获的褐家鼠（Rattus norvegicus）汉坦病毒抗原的感染率为7.69%（5/65），臭鼠句鼠青（Suncus murinus）为25.00%（1/4），其他捕获的动物中未查出汉坦病毒抗原;宿主动物血清中汉坦病毒IgG抗体阳性率为12.20%（5/41），其中褐家鼠的阳性率为12.50%（5/40）;人群中汉坦病毒IgG抗体阳性率为7.00%（3/43）。 结论 从兰坪县人群血清中查到汉坦病毒抗体，在宿主动物肺脏组织检测出汉坦病毒抗原，血清中查出汉坦病毒抗体，首次证实云南省兰坪县存在肾综合征出血热自然疫源地，为肾综合征出血热在该地区的预防控制提供了科学依据。
关键词:肾综合征出血热;汉坦病毒;调查;云南兰坪
Survey of hemorrhagic fever with renal syndrome in Lanping County of Yunnan Province.
ZHANG Yun-zhi，MI Zu-qing，YANG Wei-hong，et al.
（Yunnan Provincial Institute of Endemic Diseases，Dali671000，Yunan，P.R.China）
Abstract:Objective T survey the infectious status of hemorrhagic fever with renal syndrome（HFRS）in Lanping County，Yunnan Province and offer guidance for prevention and control of the disease. Methods Pulmonary tissue taken from rodents and the hattanvirus was detected with direct immunofluorescence assay，while antibody to Hattavirus in human and rodent indirect im-munofluorescent assay. Results There158rodents belonged to3genus in three townships of Lanping County were captured and Rattus norvegicus caught in residential areas accounted for90.09%.Apodemus agrariuswas predominant in the field accounted for63.16%.The infectious rates of Hattanvirus in Rattus norvegicus and Suncus murinus were7.69%and25.00%，respectively.Hattanvirus was not detected from other animals.The IgG antibody positive rate to Hattanvirus in the serum of hosts of rodents and human population were12.20%and7.00%. Conclusion There antibody to Hattanvirus has been detected from human serum and Hattanvirus and antibody have been detected from the lung tissue of rodent host，firstly showing that there is natural infectious area of HFRS in Lanping County that has provided scientific evidence for prevention and control of the disase.
Key words:Hemorrhagic fever with renal syndrome;Hattanvirus;Survey;Lanping County of Yunnan Province
肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）由布尼亚病毒科汉坦病毒属（Hattanvirus，HV）中不同型病毒引起经啮齿动物传播的一类自然疫源性疾病。临床HFRS病人主要以发热、出血和肾脏损伤为主的症候群表现。兰坪县地处金沙江、澜沧江、怒江流域的中心地带，地理和交通呈星型向“三江并流”世界自然遗产风景名胜区的周边各县辐射，是滇西旅游环线的中心节点和南部入口，客观地成为三江并流区旅游通道的中心驿站，所以被称为“三江之门”。面积4455km 2 ，辖3镇、5乡、104村民委员会，人口19万人。2005年2月兰坪县中排乡有3例HFRS病例报道，为了进一步了解兰坪县HFRS自然疫源地和人间、鼠间的感染情况，于2005年4月对疫情发生的兰坪县进行HFRS调查，现将调查结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 调查地点的选择 选择疫情报告的中排乡，离疫情报告邻近的营盘镇和离疫情报告较远的河西乡3个乡镇进行调查。
1.2 宿主动物调查 在上述的3个乡镇捕鼠。居民区用鼠笼，布笼于室内和院内，野外用夹夜法布夹。所捕获的鼠类经分类鉴定、登记后，解剖取鼠肺，放冻存管，液氮冻存待检。活鼠则需股动脉放血，分离血清，低温保存待检。
1.3 人间调查 在中排乡和河西乡随机抽取健康人全血，分离血清，低温保存待检。
1.4 检测方法及试剂 人血清和鼠血清用间接免疫荧光试验（IFA）检测HV病毒特异性IgG抗体;鼠肺标本制成冰冻切片，刀用-20℃，刀台用-30℃，以直接免疫荧光法（DFA）检测HV抗原。检测所用细胞抗原片，直接法荧光抗体试剂为浙江省疾病预防控制中心提供，抗人和抗鼠的IgG荧光抗体均购自华美公司。
2 结果
2.1 宿主动物种群组成 此次调查在3个乡镇共捕获5属158种宿主动物，分别为褐家鼠94只、黄胸鼠11只、高山姬鼠36只、中华姬鼠1只、大绒鼠4只、臭鼠句鼠青6只和树鼠句6只。居民区中褐家鼠的构成比为91.09%，为优势种。野外高山姬鼠的构成比为63.16%，为优势种（见表1）。
表1 云南省兰坪县调查点宿主动物种群构成（略）
注:*括号外的为构成比，括号内的为捕鼠只数。
2.2 鼠密度调查 居民区用鼠笼进行鼠密度调查，共放鼠笼1150个，捕获鼠类86只，总鼠密度为7.48%（86/1150），其中中排乡为9.81%（51/520），营盘镇为2.91%（12/410），河西乡为10.45%（23/220）;野外采用夹夜法布夹，共放鼠夹890个，捕获鼠类72只，总鼠密度为8.09%（72/890），其中中排乡为7.57%（56/740），河西乡为10.67%（16/150），见表2。
表2 云南省兰坪县肾综合征出血热调查点鼠密度（略）
2.3 宿主动物汉坦病毒感染调查 中排乡捕获的褐家鼠中汉坦病毒抗原的感染率为7.69%（5/65），臭鼠句鼠青为25.00%（1/4），其他捕获的动物中未查出汉坦病毒抗原。中排乡宿主动物血清中汉坦病毒抗体阳性率为12.20%（5/41），其中褐家鼠的阳性率为12.50%（5/40）。营盘镇和河西乡捕获的动物中未查出汉坦病毒抗原或抗体，见表3。
表3 云南省兰坪县调查点鼠血清中汉坦病毒IgG抗体检测结果（略）
2.4 人群血清中汉坦病毒抗体调查 中排乡人群中汉坦病毒ISG抗体阳性率为7.00%（3/43），河西乡人群血清中未查出汉坦病毒抗体，见表4。
3 讨论
1957年云南省首次有HFRS病例报道。1983年从血清学和病原学证实云南省存在HFRS自然疫源地和疫区 ［3］ 。从地理分布上看，主要分布在以昆明市为中心的200km范围内，其中昆明市是省内的高发地区，几乎所有区、县均有病例发生。
表4 云南省兰坪县调查点人群血清中汉坦病毒IgG抗体检测结果（略）
此次调查从兰坪县中排乡的人群血清中查到汉坦病毒抗体，同时从兰坪县中排乡宿主动物肺脏组织检测出汉坦病毒抗原，血清中查出汉坦病毒抗体，首次证实云南省怒江州存在流行性出血然病例和自然疫源地，为HPRS在本地区的预防控制提供科学依据。同时，也提示HFRS有向云南省滇西北扩散的趋势，应引起警觉。
以往的调查研究表明，云南省啮齿动物中普遍存在汉坦病毒自然感染，主要存在2种类型的汉坦病毒的循环形式，即以褐家鼠一黄胸鼠家鼠为主要宿主动物的汉城型病毒的循环形式，以高山姬鼠一大绒鼠野鼠为主要宿主动物的汉滩型病毒的循环形式。此次调查主要从褐家鼠中检查出汉坦病毒抗原和抗体，且褐家鼠为居民区的优势鼠种，揭示该地区主要存在褐家鼠为主要宿主动物的汉城型病毒的循环形式。而褐家鼠与人们的接触十分密切，容易引起人间HFRS疫情的暴发流行，应引起重视 ［4］ 。
近年来云南省兰坪县境内外来民工和采矿工人逐年增加，民工工地食宿条件较差，与鼠类接触密切，感染HFRS和引起该病暴发流行的危险性很大。因此应加强开展HFRS监测工作，特别是褐家鼠为主的调查和预防控制工作，严防人群中HFRS的暴发流行。
参考文献:
［1］Y.W.Tang，S.L.Ruo，et al.Hantavirus strains isolated from rodentia and insectivore in rural China differentiated by polymerase chain reaction assay［J］.Arch，Virol，1990，115:37～46.
［2］宋干.流行性出血热防治手册［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，1998，9:268～269.
［3］张海林，何建华，张云智.云南省流行性出血热流行病学分析［J］.云南预防医学杂志，2003，8（1）:4～7.
［4］自登云，陈伯权，俞永新.虫媒病毒与虫媒病毒病［M］.云南科技出版社，1994，292～315.
汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因组包括L、M、S 3个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒包括引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)、汉城病毒(Seoul virus,SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus,PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus,DOBV)，引起汉坦病毒肺综合征(HPS)的无名病毒(Sin Nombre virus,SNV)、纽约病毒(New York virus,NYV)、污黑小河沟病毒(Black Creek Canal virus,BCCNV)、牛轭湖病毒(Bayou virus,BAYV)、安第斯病毒(Andes virus,ANV)以及与人类疾病关系尚不清楚的一组病毒，如希望山病毒(Prospect Hill virus,PHV)、泰国病毒(Thailand virus,THAIV)、图拉病毒(Tula virus,TULV)、索托帕拉雅病毒(Thottapalayam virus,TPMV)、哈巴罗夫斯基病毒(Khabarovsk virus,KBRV)、El Moro Canyon病毒(ELMCV)、Rio Segundo病毒(RIOSV)、岛景病毒(Isla vista virus,ISLAV)、Muleshoe病毒(MULEV)、Bloodland lake病毒(BLLLV)、Rio Mamore病毒(RMV)、Topografov病毒(TOPV)等。近年来随着新技术的应用和新型病毒的发现，汉坦病毒及其相关疾病的研究得以飞速发展。1998年3月5～7日，第四届国际HFRS和汉坦病毒会议在美国亚特兰大市召开，与会的世界各国学者和专家交流了这一领域的最新研究方法和研究成果。现将会议资料综述如下：
1 实验诊断
汉坦病毒实验诊断方面的研究，主要集中于重组抗原的应用和实验诊断方法的快速、敏感和特异。F.Elgh等采用PUU病毒重组核蛋白作为抗原，与乳胶连接进行乳胶微粒凝集试验，用于汉坦病毒病的快速血清学诊断，与采用PUU病毒重组核蛋白作为抗原的ELISA相比，特异性为90%，敏感性为94%。Jiro Arikawa等将杆状病毒表达的HTN、SEO、PUU病毒核蛋白用于ELISA，至少应用2种重组抗原(HTN和PUU或SEO和PUU)，可以用于汉坦病毒感染的血清学监测。杆状病毒表达N端缺失的HTN或SEO病毒核蛋白作为免疫荧光试验(IFA)的抗原，可以区分HTN与SEO病毒感染。重组核蛋白和N端缺失的核蛋白用于ELISA和IFA，提供了针对汉坦病毒感染的快速、敏感、安全的诊断方法。H.Kallio-Kokko等将杆状病毒表达的PUU病毒核蛋白用于IgG和IgM检测，将大肠杆菌表达的PUU病毒核蛋白用于IgM检测，敏感性达100%，部分表达的核蛋白用于IgG检测，敏感性较低(70%)。他们还报道了在PUU病毒感染的急性病例中，2/3的病例可以采用RT-PCR试验，从病人的血或尿中检出病毒RNA。T.Tomiyama等将高密度正性颗粒包被纯化的汉坦病毒抗原，采用高密度颗粒凝集试验(HDPA)对病毒感染进行快速血清学诊断，对HTN病毒感染的检测有较高的敏感性和特异性，对PUU、SN病毒的感染也有低水平的交叉反应。HDPA与IFA比较，敏感性相近，但比IFA 更为简便快速。W.Irwin等报告了现场调查中免疫印迹试验在鼠类病毒抗体检测中的应用。邱建明等采用5’端生物素标记汉滩病毒特异性寡核苷酸探针，结合磁性分离技术及改进的异硫氰酸胍-酚一步法两种方法提取病毒RNA，进行反转录套式PCR，用于检测临床HFRS病人血清。在7d以内病人血清的阳性检出率为100%，8～14d病人血清的阳性检出率为57.14%，15d后病人血清仍能检测到22.73%阳性。扩增产物经打点杂交检测证实为特异性扩增，这为早期确诊HFRS病人提供了特异、敏感、快速、直接的诊断方法。
2 病毒与宿主动物的基因分析
各国学者采用病毒与宿主的基因分析方法，研究汉坦病毒分离株之间或宿主动物之间亲缘关系的远近，以及病毒与宿主动物的共演化。
2.1 汉坦病毒基因分析 J.W.Song等从韩国绒鼠(Eothenomys regulus)分离了两株PUU相关病毒，命名为Muju(MUJ)病毒。两株病毒G2基因241bp片段序列存在1.2%差异，G2基因241bp片段和S基因208bp片段与PUU病毒相应片段序列的同源性分别为79.5%～83.4%和80.3%～81.2%。L.Yashina等从俄罗斯远东鼠(Clethrionomys)、姬鼠(Apodemus)和HFRS病人分离的HTN病毒，M片段序列同源性86%～89%，从轻型HFRS病人分离的SEO病毒，M片段序列同源性97%。M.Drebot首次报告了加拿大草原田鼠携带PH样病毒。加拿大不同省份SN病毒M、S片段序列存在25%的差异，并且加拿大西部SN病毒株与加拿大东部SN病毒株相比，毒株间基因序列更为接近。Yong-Kyu Chu等报告来源于印尼板齿鼠的病毒株可被SEO型特异引物扩增，M片段290bp序列分析表明与SEO病毒有7%的差异；来源于泰国板齿鼠的病毒株中，2株为SEO病毒，另1株可被HTN型特异引物扩增，M片段290bp序列分析表明与THAI 749毒株有1%的差异。J.W.Song等将来自波兰的TUL病毒与俄罗斯中部和捷克斯洛伐克共和国的TUL病毒比较，核蛋白与G2糖蛋白氨基酸序列同源性大于96%，系统发生分析表明波兰的TUL病毒与俄罗斯中部TUL病毒最为接近，但也存在差异。C.Sibold等的另一项研究——对核蛋白编码基因进行系统发生分析表明，西斯洛伐克TUL病毒与捷克TUL病毒相近，东斯洛伐克TUL病毒与俄罗斯中部TUL病毒相近；而3’-NCR的系统发生分析表明，东斯洛伐克TUL病毒与西斯洛伐克和捷克的TUL病毒相近。作者认为，存在东斯洛伐克TUL病毒从中欧和俄罗斯TUL病毒重组的可能性。
2.2 宿主动物基因分析 多采用细胞色素B基因分析方法。W.C.Black IV等采用微卫星DNA分析确定鹿鼠之间的基因关系，并研究了鼠类窝内汉坦病毒传播的方式。
2.3 病毒与宿主动物的共演化 俄罗斯远东地区南部的7种宿主动物中存在4种汉坦病毒(HTN、PUU、SEO、KBR)。L.Minskaya等的研究表明，从非主要宿主动物分离的病毒与标准株抗原性接近，但在基因分子特征上与从主要宿主动物分离的病毒不同。A.Vaheri等的研究表明，西伯利亚旅鼠分离的TOP病毒与东方田鼠分离的KBR病毒S片段同源性核苷酸水平为82%，氨基酸水平为96%；与欧洲棕背分离的PUU病毒S片段同源性核苷酸水平为77%，氨基酸水平为87%。系统发生分析显示3种病毒具有共同的起源，与相应宿主动物细胞色素B基因系统发生分析结果相一致，表明3种病毒
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进化过程中有在宿主动物之间进行的水平传播。其中TOP病毒M、S片段3’-NCR最长，可能在3种汉坦病毒中起源最早。J.W.Song等报告韩国姬鼠来源的不同HTN病毒株，M基因324bp片段同源性95%～99%，姬鼠细胞色素B基因424bp和线粒体DNA D-环区序列差异性0%～3.1%，表明韩国不同地区姬鼠有相同的基因背景，HTN病毒具有相同的来源，在韩国没有发现HTN病毒株与其宿主动物共同发生较大变异的现象。Heiske A.等进行的系统发生分析表明，欧洲西部PUU病毒与瑞典、芬兰、俄罗斯的PUU病毒不同，同一分枝PUU病毒S片段开放读码框架基因差异性小于8%，不同分枝PUU病毒S片段开放读码框架基因差异大于14%。同一分枝PUU病毒核蛋白氨基酸序列差异0%～2%，不同分枝PUU病毒核蛋白氨基酸序列差异3%～5%。有资料表明，不同地区的欧洲棕背可以分为几个亚类，这一研究支持了PUU病毒与其宿主动物共演化的观点。L.Ivanov等对来源于俄罗斯远东地区东方田鼠的KBR病毒进行研究，结果表明不同KRB病毒株间存在0.5%～4.0%的基因差异，基因差异与捕鼠地区的关系大于与捕鼠年份的关系，表明KBR病毒与东方田鼠之间存在长期的共演化过程。
3 疫苗与抗病毒研究
近年来HFRS疫苗的研制取得了较大的进展，有些类型的疫苗已经国家批准生产使用，有的已进入临床观察中，有的正在试验室研制和检测中。中国已经研制成功并试生产的3种单价灭活疫苗经大面积人群接种观察，安全性较好，并具有较好的血清学和流行病学效果。近期(基础免疫后1年)和中期(基础免疫后2年)平均保护率，Ⅱ型地鼠苗分别为97.81%、88.73%；Ⅰ型上海沙鼠苗分别为94.08%、91.72%；Ⅰ型天元沙鼠苗均为100.00%；Ⅰ型鼠脑苗分别为88.45%、100.00%。灭活双价沙鼠肾疫苗进行的Ⅱ期临床试验，总反应率为2.5%，3针后免疫荧光抗体阳转率100.00%，中和抗体阳转率87.6%(针对Ⅰ型病毒)和96.3%(针对Ⅱ型病毒)，单一血清型阳转率100.00%，两种血清型同时阳转率75.00%。韩国生产的汉坦病毒灭活鼠脑疫苗(Hantavax)的研究表明，基础免疫1年后免疫荧光试验和高密度颗粒凝集试验检测血清抗体阳性率分别为42.5%和45%，中和抗体阳性率13%。基础免疫1年时加强免疫后，血清抗体阳性率92%，中和抗体阳性率升高至80%。此外，D.Koletzki等构建了携带汉坦病毒核蛋白基因的乙肝病毒嵌合体，在使用和不使用佐剂的条件下免疫动物，都产生针对乙肝病毒和汉坦病毒的特异抗体。K.Kamrud等对裸病毒DNA和甲病毒表达的汉坦病毒进行了评价。采用噬菌体呈现技术，C.de Carvalho Nicacio等、Tuomas Heiskanen等和梁米芳等分别研制了抗汉坦病毒的重组抗体，为未来HFRS的免疫治疗开辟了前景。W.E.Severson等报告了病毒唑对汉坦病毒复制的影响。
4 分子生物学和细胞生物学
各国学者在多方面进行了汉坦病毒的分子生物学和细胞生物学研究。T.M.Welzel等和白雪帆等采用基因片段噬菌体表面呈现技术，研究了汉坦病毒单克隆抗体识别位点。E.Mackow等制备了针对杆状病毒表达的SN病毒核蛋白的单克隆抗体，用于HPS相关病毒的血清学分型研究，并通过NY-1病毒核蛋白突变研究了单克隆抗体的识别位点。J.W.Hooper等用含有汉坦病毒反基因组的质粒DNA转染Vero-E6细胞后，可以用免疫沉淀的方法检出所表达的NP和G1、G2糖蛋白，但不能用生化和功能分析检出聚合酶蛋白，也未检出感染性病毒。B.Anheier等的研究表明，汉坦病毒G1、G2聚合物在高尔基体的定位由G1蛋白引导，G2蛋白稳定分子定位，G1蛋白氨基酸的变化可能改变G1结构，进而影响聚合物的形成。E.V.Ravkov等的研究表明，BCC病毒核蛋白与肌动朊纤维相互作用，可能在汉坦病毒的装配和/或释放过程中起重要作用。B.J.Meyer等采用Northern杂交、RNase保护试验、RT-PCR、克隆测序等方法，对汉坦病毒在Vero-E6细胞内的持续感染进行了研究。
5 流行病学
智利1995年发现首例HPS病人，1995年10月至1997年7月发病仅8例，1997年10～12月发病20例，涉及全国11个地区，平均发病年龄29.7岁，病死率61%。病毒基因分析表明，发病主要由Andes病毒引起。作者认为，HPS病例的增加与当地汉坦病毒宿主动物数量的增加有关。俄罗斯1978～1996年共发生HFRS91 639例，分布于89个行政区中的61个，其中96.4%来自俄罗斯欧洲部分，3.6%来自亚洲部分，年平均死亡率分别为4.0/10万和0.6/10万。血清学和基因分型表明，俄罗斯至少存在6种血清型的汉坦病毒：HTN、PUU、SEO、TUL、KRB、TOP。比利时1995年10月至1996年12月发生HFRS 199例，季节分布表现为冬春季的小高峰和夏秋季的大高峰，病人主要为PUU血清型感染。加拿大截止1997年11月共发生HPS 21例，分布于3个西部省份，病死率33%，流行病学调查表明全国都有携带病毒的宿主动物分布，而HPS发病与接触鼠类的机会有关。日本从17个海港中的16个和3个飞机场中的2个检出宿主动物携带汉坦病毒，作者提出应建立监测体系并采取相应预防措施，检查人群病毒感染率。
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6 生态学
气候、鼠类栖息地条件、鼠类繁殖强度、种群构成等因素的变化影响鼠密度，而宿主动物病毒感染率随着时间和地点的不同不断发生变化。不同的鼠密度、宿主动物病毒感染率和与人群接触的机会，影响疾病的暴发或散发。T.S.Chiueh等对台湾进行的血清流行病学研究表明，当地虽然没有确诊的HFRS病人，在宿主动物中却存在汉坦病毒的感染，在与鼠类接触的职业人群和慢性肾衰及发热病人中，血清抗体阳性率较高。C.Ahlm等报告瑞典北部野生驼鹿具有较低的汉坦病毒感染率。Yun-Tai Lee等发现，韩国蝙蝠、棕头鸦雀携带PUU病毒。O.A.Alexeyev等的研究表明，在PUU抗体阳性欧洲棕背中，大部分(74%)不能检出病毒RNA或抗原，也不具有感染性。此外，为表示汉坦病毒株对Vero-E6细胞适应能力与宿主动物种类的关系，L.Ivanov等用鼠肺标本汉坦病毒抗原滴度、病毒分离成功率、病毒分离天数等计算适应指数，黑线姬鼠为0.32，大林姬鼠为0.17，东方田鼠为0.10，棕背为0.06。
7 临床
多项报告对HFRS和HPS的后遗症进行了调查，研究表明两种疾病的恢复病人与健康人比较，分别存在肾脏或肺功能的异常。M.Howard等对患有HPS的孕妇进行了调查，结果表明患有HPS的孕妇预后与其他HPS患者相同，患有HPS孕妇的胎儿与其他患有成人呼吸窘迫综合征的孕妇的胎儿差异不大，研究中没有发现SN病毒在人类垂直传播的现象。
8 病理与免疫反应
HL Van Epps等研究了针对HTN病毒感染的人T淋巴细胞的反应，包括针对核蛋白或G1蛋白的和 T细胞系，部分针对核蛋白的 T细胞系与无名病毒核蛋白有交叉反应，而针对核蛋白或G1蛋白的 T细胞系与无名病毒蛋白没有交叉反应。这种引起不同汉坦病毒病(HFRS和HPS)的毒株，人T细胞系的交叉反应在病理研究和疫苗研制中具有重要意义。F.A.Ennis等进行的另一项研究，从HPS病人血中分离和 T细胞系，有些细胞系识别的区域在不同汉坦病毒株间相对保守，但有些T细胞系不能识别汉坦病毒单一的氨基酸改变，另一些T细胞系能识别关系较远的分离株，如安第斯和普马拉病毒的相应区域。C.Mansilla等对安第斯病毒致死病人尸检结果表明，Andes-HPS和SNV-HPS引起的病理改变和病毒抗原分布相似，但Andes-HPS病例发现有充血性心肌炎和Ⅱ型肺单核细胞活性，并有较多的肝染色。M.Bharadwaj等从Andes-HPS病人气管中检出病毒RNA，认为安第斯病毒可能在人-人间传播。还有报告研究了血组胺和缓激肽、类脂过氧化物、血管加压素、溶酶体、红细胞膜腺苷三磷酸酶等在HFRS病理改变中的作用。S.C.St Jeor等研究了SN病毒在鹿鼠体内的持续感染，感染后几周至几个月内，随着抗体水平的增高，血清中病毒消失，其他组织中病毒减少。Karen L.Hutchinson等研究了BCC病毒在刺毛棉鼠体内的感染，感染后前几周，定量PCR在除血液外的各组织中检出病毒cRNA，以后病毒cRNA减少，感染5个月后只在脑内检出；感染后1周血液中存在感染性病毒，2周时达高峰，3周时显著减少；感染后5个月在肾上腺、肝、肾、睾丸仍可低水平检出感染性病毒；感染后70d内尿中可分离到病毒；感染14d后可检出BCC抗体。杨守敬等的研究表明，HFRS的休克和出血引起的局部缺血可以导致热休克反应，在病人组织中表达72KD和73KD的热休克蛋白，保护组织细胞免于损伤。他们的另一项研究，通过增生细胞核抗原以及细胞分裂中波形蛋白抗体的检测表明，在HFRS组织损伤过程中，存在细胞的再生和DNA的修复，修复程度与损伤的严重程度有关。
HFRS是严重危害我国人民健康的病毒性疾病之一。自80年代初成功分离病毒以来，HFRS和汉坦病毒的研究取得了大量成果，尤其近年来灭活疫苗的研制成功，为有效预防本病创造了条件。但我们在病原学、实验诊断、免疫病理和分子生物学等方面与国外研究尚有差距，仍存在许多有待解决的问题。随着今后研究的深入，对本病认识的逐步加深，才能最终有效控制本病在我国的流行。
据《全国第六次传染病与寄生虫病学术会议论文汇编》载 哈尔滨医科大学附属一院于丹萍介绍了国内外有关汉坦病毒的研究进展。
汉坦病毒可分为两种：一种引起汉坦病毒肺综合征(HPS)，另一种引起汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)。前者主要流行于美国，在阿根廷、巴西、巴拉圭、玻利维亚以及德国也发现了病例。我国虽未发现，但有发生的可能。主要临床表现为，在4日左右的发热、头痛等前驱期症状后，出现以非心源性肺水肿和高病死率(52.4％～78.0％)为特征的急性呼吸衰竭，重症患者3～7日死亡，生存者则很快恢复，无后遗症。后者即我国常见的肾综合征出血热，对其进行的分子生物学研究再一次证明其发病机制主要是病毒的直接致病作用，肾脏是早期原发性损伤器官，病毒是肾损伤的直接因素。
在治疗策略方面，作者介绍了1997年第五届全国HFRS学术会议上制定的治疗方案，方案突出以下原则：
1.早期抗病毒治疗 HFRS的发病主要是病毒直接作用所致，病毒血症及外周血单核细胞内病毒存在的时间一般为7～10日或更长，早期抗病毒治疗可阻断病理损伤、减轻病情、降低病死率。目前应用干扰素、利巴韦林，有肯定疗效。7病日以内均可应用，疗程5～7日。
2.合理的综合液体疗法是最重要的治疗措施 应强调预防性治疗，不同病期有不同的液体疗法原则。以平衡盐液为主，根据化验检查结果，适当调整其成分及用量。应积极纠正低蛋白血症。
3.早期预防肾脏损伤 发热期肾脏损伤程度较轻，由于多种因素，如血浆渗出、血液浓缩、血容量不足、合并DIC等而使肾损伤加重。故应针对上述因素，采取相应措施，这是改善本病转归的重要策略。
4.少尿期尿毒症以及各种并发症，如高血容量、高血压、心衰、肺水肿、腔道大出血、神经系统合并症及肾破裂是致死的五大因素，均发生于急性肾功能衰竭尿毒症期，血液透析是降低病死率的最重要的挽救生命的手段，应广泛应用。
赵金摘《感染专刊》
