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日本称实施世界首例iPS细胞“异体移植”手术

日本一个研究小组为眼疾患者成功移植了由他人的诱导多能干细胞(iPS细胞)培养而成的视网膜细胞。研究小组称,这是世界首例iPS细胞“异体移植”手术,与利用患者本人的iPS细胞相比费用和时间都大幅减少。日...即将发布

日期:2017年3月31日 - 来自[技术要闻]栏目
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同种异体来源的CAR-T机遇与挑战


表1:目前供体来源的CAR-T细胞的临床试验

嵌合抗原受体(CARs)改造的T细胞已进入临床试验并取得了可喜的成果,应用于同种异体情况下可能存在的影响,正逐渐成为一个重要考虑因素。这篇综述讨论了在使用同种异体CAR-T细胞治疗中,CAR-T细胞上T细胞受体(TCR)信号传导可能造成的影响,以及通过敲除TCR来生产通用型制品的可能性。

最新发现

大部分关于同种异体T细胞的临床前和临床数据都侧重于关注使用的安全性,即导入CAR-T细胞的T细胞受体可能会介导移植物抗宿主病(GVHD)。近期应用于临床的供体来源的CAR-T细胞都需经过严格的病例筛选或T细胞筛选(如病毒特异性T细胞富集)。尽管没有GVHD发生的报道,但仍然需要对同种异体CAR的疗效进行优化。一些临床前试验通过记忆T细胞选择,病毒特异性T细胞,基因编辑技术或自杀基因工程技术来限制同种异体CAR介导的GVHD。

摘要

在同种异体环境中,使用供体来源的CAR-T细胞,CAR上的TCR信号传导作用可能对临床应答产生潜在的影响。更好地理解使用供体来源的T细胞治疗的作用机理对发展通用型CAR-T治疗至关重要。

关键词

过继免疫治疗,异基因造血干细胞移植,嵌合抗原受体,供体来源,移植物抗宿主病

前言

自上世纪70年代,同种异体造血干细胞移植已作为急性白血病的有效治疗手段。现在大家公认,同种异体造血干细胞移植的疗效部分依赖于从供体移植的异体细胞抗白血病作用,也被称为移植物抗白血病(GVL)效应。大部分GVL效应都是包括供体来源在内的T细胞介导的,也可以看出随后的供体T细胞输注[供体淋巴细胞输注(DLI)],可能会诱导缓解同种异体造血干细胞移植后受体体内仍然存在的或复发的造血系统恶性肿瘤。所期望的GVL效应通常被拮抗,因为同种异体T细胞会对正常组织进行攻击,被称为移植物抗宿主(GVH)反应。此外,GVL作用效力通常不能完全根除恶性肿瘤,特别是在淋巴细胞恶性肿瘤的情况下。一些方案试图加强异体造血干细胞移植的GVL效应,同时尽量降低GVH作用以减少毒性反应并提高疗效,获得了不同程度的成功。基因改造的T细胞特异性重定向恶性细胞表达的抗原,具有产生非常专一GVL响应的潜力。

第二代和第三代嵌合抗原受体(CARs),是由单克隆抗体与T细胞受体的活化区的可变区,附加T细胞共刺激信号域(即CD28, 4-1BB, Ox40)融合构建。一旦抗体与受体结合,被CARs便重定向和活化的T细胞可以作用于任何细胞表面分子,并且不受主要组织相容性复合体(MHC)限制。在近期B细胞恶性肿瘤治疗的临床试验中,抗CD19-CAR修饰的T细胞取得了很大的成功。在B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)中,复发性/难治性患者在接受抗CD19 CAR-T细胞治疗后,缓解率高达70-90%。接受CAR-T细胞治疗的患者大部分接受过同种异体造血干细胞移植,为接受CAR-T治疗,从供者体内采集T细胞用于CAR-T细胞制备。尽管如此,在CAR输注后没有发现移植物抗宿主病(GVHD),也许是因为移植受体已经耐受了之前采集的细胞。尽管目前同种异体造血干细胞移植接受者没有出现GVHD,接受过同种异体造血干细胞移植的患者出现的应答似乎要逊色于接受自体CAR-T细胞治疗的患者。响应的差异可能是因为化疗方案之前采集的淋巴细胞数量低或质量差,或者是在接受者体内再造的同种异体T细胞质量低下,或者两种情况都存在。供体“健康”T细胞具有的潜能是同种异体造血干细胞移植相关平台的潜在机遇。

尽管CAR-T细胞常被认为通过CAR受体具有重定向的特异性(如定向CD19),由于内源性T细胞受体的存在(TCR),也许这应该被更恰当地描述为额外的特异性。在同种异体干细胞移植下,特异于同种异体抗原(肿瘤抗原、正常抗原、病毒抗原)的T细胞的祖细胞频率具有相对较高的潜力,尤其是使用供体来源的T细胞,这些T细胞在受体体内不会产生耐受。当TCR抗原和CAR抗原都递呈给CAR-T细胞时,我们不知道哪个受体将成为主导,也不知道内源性TCR信号传导会如何影响基因改造的CAR受体的效力。此外,还可能存在旁观者效应,即同种异体反应性T细胞可能影响T细胞功能,T细胞对同种异体抗原不具有特异性但确实表达了CAR。因此,使用同种异体CAR的T细胞,特别是健康供体来源的CAR T细胞,需要对同种异体的CAR-T细胞功能有深入理解。

临床中供体来源的CARs

众所周知,人CAR-T细胞在免疫缺陷小鼠中可引起异种移植物抗宿主病。然而在临床前实验中提示,在免疫正常小鼠模型中使用供体来源的同种异体CAR-T细胞具有良好的耐受,具体表现为低GVHD发生率。目前,还没有针对GVHD的风险和供体来源的CAR-T细胞活性的临床文献报告。Kochenderfer等曾报道了一些在同种异体造血干细胞移植后使用供体来源的CD19 CAR-T细胞治疗复发性恶性血液疾病的小型样本。所有患者至少进行了1次供体淋巴细胞输注,既没有出现GVHD,或者1级急性GVHD,也没有出现慢性轻度GVHD。这个样本中在输注CD19 CAR-T细胞中没有出现GVHD,10例患者中只有3例对CAR-T细胞产生应答。值得注意的是,此项试验中患者在输注CAR-T细胞之前没有接受淋巴细胞删除性化疗,已知淋巴细胞删除性化疗在T细胞过继免疫治疗中效果显著,尽管缺乏相关数据。虽说如此,在这一小样本中,就如在输注前进行淋巴细胞删除的自体CAR治疗报道中一样,很难得出有效的结论。

第二份供体来源的同种异体CAR-T细胞治疗报告中,采用病毒特异性T细胞(VST)以降低GVHD风险。VSTs通过T细胞体外抗原刺激扩增来筛选,并用于同种异体造血干细胞移植后病毒诱发的并发症。VSTs由于携有特异于病毒抗原的内源性TCR,和额外特异于肿瘤靶点的CAR,其已成为不同CAR-T细胞(CD30, GD2, CD19等)的中坚力量。已有报道在数量有限的患者中使用供体来源的CD19 CAR VST没有发生移植物抗宿主病或细胞因子释放综合征。在此本文原创编译Paul认为,CAR-T的扩增是由于病毒感染或再激活,这表明TCR的活化能增强CAR-T细胞的扩增。然而,CAR-T细胞扩增的增强并没有使正常或恶性B细胞数量减少,这提示当内源性TCR的活化时CAR-T功能可能会受损。

目前,在clinicaltrials.gov上已有6项临床试验在对使用同种异体供体来源的CAR-T细胞进行评估(2015年6月30号,表1),以摘要的形式列出了一些初步数据。MD Anderson组进行的一项试验,对12例患者在同种异体造血干细胞移植后利用供体来源的睡美人转座子CD19 CAR进行抢占式供体淋巴细胞输注。3例均为急性淋巴细胞白血病患者全部健在并持续缓解。

使用未经处理的多克隆供体来源的T细胞和VST-CAR T细胞之间的一个区别是,基于之前同种异体特异性TCRs报道的次数,在同种异体受体体内多克隆来源的T细胞被预测遭遇TCR抗原的几率会小的多。使用VST-CAR-T细胞,在病毒感染或再激活的情况下,输注的每个T细胞都可能同时遭遇TCR或CAR抗原。使用VST-CAR-T细胞如果一个受体比另一个更有优势,那么将预示它会产生更显著的影响。与仅通过刺激CAR相比,VST-CAR T持续扩增得到增强似乎受益于通过由病毒抗原刺激TCR,但这种扩增不一定与CAR效力相关,这表明TCR的激活会产生干扰。为了更深入的了解使用同种异体CAR-T细胞欠佳结果的因素,以及在未来对这种方法进行改良,需要更好地了解在同种异体环境中T细胞的基础免疫学和CAR与TCR的相互作用。

嵌合抗原受体VS T细胞受体:异基因接受者体内的免疫生物学

T细胞表面嵌合抗原受体以及靶抗原的丰度,对于CAR-T细胞治疗功能十分重要。然而CAR 丰度因CAR结构的区别而有所不同,并且因为基因修饰的T细胞表达CAR的方法不同而差异很大,而且在大部分CAR报道中没有典型的检测体系。T细胞表面TCR丰度已被广泛研究,在单个正常CD4+T细胞表面已发现约40000个分子。研究者还发现,在表面仅有500-1000个TCR分子的CD8+T细胞能够分泌细胞因子,但低受体水平影响T细胞的效力和杀伤活性。已有报道指出CAR-T的功效依赖于CAR表达水平和靶抗原的表达水平。在第二代CD20-CAR-T细胞中发现,裂解能力的活化要求有数百靶抗原的直接结合,以及在细胞因子分泌之前有数千抗原的相互作用。在特定的T细胞表面TCR可能比CAR更多,可能导致了TCR优势。在同种异体和VST-CARs中,TCR和CAR的相互作用和动态变化有着特殊的重要性,其中有可能相当比例的T细胞同时存在两种抗原。

B-ALL:B-系急性淋巴细胞白血病;CAR:嵌合抗原受体;CLL:慢性淋巴细胞白血病; NHL:非霍奇金淋巴瘤;VST:病毒特异性T细胞。

CAR的特异性结合通常源于单克隆抗体,亲和力的显著差异以及CAR或TCR与靶细胞之间亲和力的显著差异可能存在,从而影响任意受体介导T细胞。大多数通过胸腺选择的保持着高效价的TCR具有固有的低亲和力以保证足够的“离合率”。亲和力对CAR功能的重要性知之甚少。通过抗体,部分高亲和力结合可能不允许频繁的结合和脱离,从而影响了通过CD3ζ链的信号传导。因此,T细胞可能更倾向天然的TCR信号传导,并且赋予对TCR抗原比CAR抗原更高的响应。的确,研究者对T细胞转导的激活阈值进行了研究,这类似于TCR和CAR受体在表面表达,证明了在低抗原水平下TCR比转导的CAR活性更高。事实上,在低抗原密度情况下,通过刺激TCR分泌的γ-干扰素的最大量比刺激CAR分泌的要少50%。再次,这种差异在同种异体环境中更加突出,由于TCR和CAR抗原同时存在。TCR信号的主导地位可能导致增加抗移植物宿主病并削弱CAR介导的GVL,尽管这些尚未在上述讨论的数量十分有限的接受供体来源的CAR-T细胞治疗的患者身上体现。尽管如此,TCR和CAR之间的相互作用尚未有深入的研究,而这是CAR-T细胞在临床应用中优化的关键。

通过T细胞分选来改善来自供体的CARs

如今,许多大型制药公司投资用于研究和开发CAR-T细胞的设计与生产。在理想情况下,通用的现成的产品可抵消如今临床试验进行单个细胞制剂所需成本。这些产品可能类似于正在进行的数量有限的临床试验中,同种异体造血干细胞移植后给予的供体来源的CAR-T细胞。为了能制备现成的产品,可能将要在来源于同一供体的造血干细胞移植前对这些产品进行管理。为了实现这一目标,需要有尽可能降低受体的供体细胞排斥反应和降低产品潜在的同种异体反应活性的方法。这种现成产品的安全性和有效性还待系统测试。已经提出了一些来提高同种异体供体来源的CAR-T细胞疗效的方法以用来发展通用型产品,用来提供给那些因淋巴细胞数量较低或质量较差(以及体外扩增能力低)而没有机会进行自体细胞输注的患者。

利用病毒特异性T细胞制备CAR-T的首要目标之一是筛选不含有同种异体TCR的T细胞。病毒特异性TCR的CAR制品另外一个优势是可以在CAR-T细胞过继转运后使用疫苗(如水痘带状疱疹病毒疫苗)的方法刺激天然TCR以增强T细胞的扩增。目前已有针对这一方法的自体抗GD2 CAR T细胞临床试验(NCT01953900)。

富集非同种异体T细胞另一种方法是利用抗原刺激后的记忆T细胞进行CAR转导。这可以预见到大部分记忆T细胞群很可能已经接触了异体抗原,并且T细胞携带的TCR特异于同种异体抗原将保持其天然属性。因此,记忆细胞的筛选应充实非同种异体反应库。的确,在小鼠模型中,记忆T细胞被证明更低的GVHD发生率,部分原因是由于非同种异体反应性TCR富集,以及有证据表明记忆细胞不太可能流向GVHD靶组织,如消化道。从幼稚细胞中区分记忆细胞的一个标记是CD45RA。一些临床试验选用CD45RA-CD62L+ CD8+中央记忆T细胞或CD45RA-T细胞用于CAR生产。这2种技术都显示出良好的CAR转导,体外功能和体内作用。此外,记忆CAR-T细胞能维持抗白血病能力而不引起人T细胞治疗的免疫缺陷小鼠异体移植物抗宿主这一重大的生存率限制性。目前有几项临床试验使用自体中央记忆T细胞制备的抗CD19 CAR免疫治疗非霍奇金淋巴瘤或急性淋巴细胞白血病(NCT02051257,NCT01815749,NCT02146924,NCT2153580,NCT01318317),抗IL-13Ra2治疗脑胶质瘤(NCT02208362)。一项临床试验正在对同种异体移植后使用供体来源的中央记忆CD19 CAR-T细胞进行评价(NCT 01475058,表1)

另一个用于CAR免疫治疗来源的T细胞是γδT细胞系列。这类T细胞识别抗原不同于包括通过αβTCR识别异基因抗原的蛋白质衍生肽。因此,γδT具有较低的同种异体反应性但是显示出了介导抗肿瘤反应。尽管在外周血T细胞中含量较少,一种亚型(vδ2)可在T细胞采集前使用zolendronic acid刺激在体内扩增。MD Anderson的团队使用了不同的扩增方法:在体外将γδT在表达CD19抗原递呈层上扩增后转导CD19-CAR分子。扩增的γδT在小鼠模型中证明了体内和体外有效性,尽管效力不如免疫缺陷小鼠中αβ CAR-T细胞那么引人注目。有趣的是,CAR转导来自于诱导多能干细胞的T细胞(T细胞的初始诱导)与γδT细胞基因表达很类似,表现出通用的以及CAR特异性抗肿瘤反应。尽管热情不减,但最近发现表明,分泌IL-17型γδT细胞具有潜在的肿瘤促进作用。尽管如此,高效筛选分泌IFN-γ型γδT的方法需要研究,这些T细胞将成为CAR-T细胞制备的潜在的候选者。

除了T细胞,自然杀伤(NK)细胞也可以来制备CAR用于免疫治疗。NK细胞已被证明可以显著促进GVL效果,尤其是在单倍相合MHC不匹配/KIR不匹配情况下。通常与T细胞相比,NK细胞被认为具有较低的同种异体免疫原性;然而已有NK介导GVHD的报道,在临床前研究中NK-CAR细胞已显示出对多种肿瘤抗原的疗效。使用NK-CAR的主要挑战是NK细胞免疫持久性较低,以及复杂的细胞内信号传导机制在使用常规的T细胞活化结构域时,可能会产生不兼容或不是最优情况。目前临床前研究正在评估NK细胞特定的活化域如DAP12。

利用基因编辑改进供体来源的CARs

开发供体来源的T细胞而不带有TCR活化的效果,选择性删除内源性TCR只表达特异性CAR的CAR-T细胞。在目前的基因编辑技术中,内源性TCR可以通过核酸酶,如锌指核酸酶,转录激活因子样效应物核酸酶和CRISPR/ Cas9系统来敲除。内源性TCR的缺乏消除了GVHD的可能性以及潜在的TCR受体信号干扰。利用相同的技术,供体来源的MHC I类分子可以被敲除,避免转导的现成的T细胞出现排斥反应。尽管新的基因编辑工具可以防止GVHD和排斥,重大隐患仍有待全面测试。MHC的缺失可能会引起NK对同种异体T细胞的响应。同样,已经证明含有CD3ζ域的CAR的功能取决于其内源性TCR二聚化的能力,以便与TCR/ CD3复合物的相互作用来激活的下游通路。这些研究结果表明,利用核酸酶突变内源性TCR或MHC可使CAR-T活性和持久性降低。

最后增加自杀基因对于在同种异体CAR-T细胞输注后最小化GVHD风险率十分有利。可诱导性caspase 9 (iC9)是凋亡的内在活化剂,导入同种异体T细胞,在异体造血干细胞移植后使用可有效阻断GVHD的发生。临床前模型表明,在CAR治疗中激活iC9自杀基因使CD44v6-CAR模型中异种GVHD小鼠获救。正在进行的临床试验中,已经在CAR-T细胞制品中加入了iC9构造,以消除潜在的非肿瘤相关毒性(NCT02107963,NCT01822652,NCT02439788)。

结论

CAR-T细胞是目前过继免疫治疗令人振奋的成就之一,在临床治疗ALL上取得了显著成功。目前,通常因为之前的化疗或造血干细胞移植而T细胞缺损,许多患者可能遇到疗效降低的情况。使用供体来源的细胞,尤其是现成的T细胞,需要进行评估。目前,为解决安全问题的研究很多,采用多种技术以避免出现GVHD。鲜为人知的是TCR/CAR相互作用和TCR信号转导对治疗结果的影响。在我们判定对CAR-T治疗中内源性TCR敲除是否会获益之前,对CAR和TCR的信号传导与功能进行更好的理解是必要的。总而言之,解决同种异体CAR-T的MHC匹配这一挑战,将会为使用现成的通用型CAR-T细胞铺平道路。

日期:2015年10月16日 - 来自[技术要闻]栏目

异体骨与自体骨一期植骨治疗四肢粉碎骨折临床研究

【摘要】  目的 观察异体骨一期植骨和自体骨一期植骨在四肢粉碎骨折治疗中的疗效及优缺点。方法 2006年12月-2008年4月,对127例经内固定后仍不能消除断端间隙的四肢粉碎骨折,随机分为2组,均常规固定稳定骨折后,试验组采用异体骨一期植骨,对照组取髂骨一期植骨,经过6~24个月随访,观察骨折愈合情况。结果 两组手术时间、住院费用比较差异有显著性(P<0.05),住院时间、骨折临床愈合时间、骨性愈合时间差异无显著性(P>0.05)。结论 异体骨和自体骨一期植骨,在对粉碎性骨折的治疗方面作用相同。

【关键词】  异体骨;自体骨;骨移植;骨折

 [Abstract] Objective To observe the advantages and the efficacy of treatment about the allogeneic bone graft and an autologous bone graft in comminuted fracture of the limbs.Methods From December 2006 to April 2008,127 cases of internal fixation can’t eliminate the gap ends comminuted fracture of the limbs,were randomly divided into two groups,both convertional fixed stable fracture,the experimental group were treated with allogeneic bone,the control group taking a graft iliac,followed-up the sracture healing after 6 to 24 month.Results The mean operating time,hospital costs shows a difference(P<0.05).Hospitalization days, fracture healing time, bone healing time was no difference(P>0.05).Conclusion The effect of allogeneic bone and autologous bone graft in the treatment of comminuted fractures are same.

  [Key words] allogeneic bone;autologous bone;bone graft; fracture

  骨折后骨延迟愈合及骨不连是常见并发症,原因种种,其中术中不重视消除骨折端之间的裂隙是重要原因之一,为解决这一难题,笔者通过2006年12月-2008年4月我院收治的四肢粉碎性骨折术中骨折间隙大于0.5cm的患者,采用随机对照试验,观察不同植骨材料对骨折愈合的影响。

  1 资料与方法

  1.1 研究对象

  我院自2006年12月-2008年4月收治的127例四肢粉碎性骨折患者。

  1.1.1 纳入标准

  (1)具备切开复位内固定手术指征。(2)术中骨折间隙大于0.5cm,经内固定后仍不能消除断端间隙。(3)无植骨禁忌证。

  1.1.2 排除标准

  (1)无切开复位内固定手术指征。(2)存在严重内科系统并发症,显著影响术后骨折愈合,或患者无法配合术后功能锻炼者。(3)有植骨禁忌证者。

  1.1.3 试验分组

  纳入病例127例,随机分为试验组和对照组,试验组:术中在断端植入天津中津生物发展有限公司提供的金世植骨灵骨折间隙植骨,对照组采用自体髂骨植骨。纳入病例见表1。表1 两组纳入病例分配表

  1.2 研究内容与方法

  1.2.1 手术方法

  所有纳入病例均采用常规手术入路,显露主骨折断端并将主骨折断端复位后采用解剖钢板、动力加压钢板、有限接触动力加压钢板或交锁髓内钉等内固定固定,再将各碎骨块固定,若不能完全消除骨折间隙者则不再强求解剖复位。试验组:将异体骨骨块嵌入骨折间隙及骨折间隙周围,常规关闭切口。对照组:术中取患者髂骨植入骨折间隙,均常规关闭切口。

  1.2.2 观察指标

  通过盲法评定手术时间、住院时间,住院费用,达到临床愈合时间、骨性愈合时间。(1)骨折临床愈合标准和骨性愈合标准如下:①局部无压痛及纵向叩击痛;②局部无异常活动(自动的或被动);③X线片显示骨折线模糊,有连续性骨痂通过骨折线;④外固定解除后,伤肢能满足以下要求:上肢:向前平举1kg重量达1min。下肢:不拄拐在平地行走3min,并不少于30步。⑤连续观察2周,骨折处不变形。(2)骨性愈合标准如下:①具备临床愈合标准。②X线片显示骨痂通过骨折线,骨折线消失或接近消失。

  1.2.3 随访

  所有患者均随访至达到骨性愈合标准,随访8个月~2年。

  1.3 统计分析

  数据均运用SPSS13.0统计学软件,定量资料采用t检验进行统计学分析。

  1.4 质量控制

  (1)所有纳入病例均经科室讨论,确定手术方案,并经副主任以上职称的有经验的骨科医师完成;(2)试验分组采取随机分组原则;(3)术后结果评定通过盲法评定;(4)术后均常规使用抗生素3~5天,其他特殊干预措施相同。

  2 结果

  详见表2。表2 两组研究对象各项研究结果比较

  3 讨论

  在骨折的治疗中AO原则强调骨折的解剖对位,且愈合有赖于骨折的稳定性及骨折断端间的接触加压,在这一原则下内固定绝对稳定的标志和早期AO技术成为骨科医生追求的目标,并取得了一些令人鼓舞的效果,但也陆续发现了一些致命的缺点和问题,特别是粉碎性骨折经钢板螺钉固定后的应力遮挡作用和常出现的再骨折现象使人们对一期愈合理论进行了反思,提出质疑。AO学派强调坚强的内固定既来自固定物本身的性能和固定技术,同时也必须恢复骨折部的稳定性,即“骨骼的连续性和力学的完整性”受到挑战[1],骨科医生提出了不牺牲骨折的血供尤其是粉碎骨折片的血供的BO原则,但因骨折断端对位不佳骨不愈合或延迟愈合现象依旧。由于损伤机制和致伤能量的不同,造成骨折程度不一,且现有内固定器材尚不能完全适合所有患者的骨骼解剖外形,当内固定塑形不十分贴切时,容易在钢板对侧出现裂隙。所以临床上对估计难以通过再塑形或通过再塑形仍无法消除的裂隙,则不应一味强求“精确复位”,而应采用植骨处理。近年来,术中一期自身骨移植重又得到重视,但是常规的髂骨移植,需要增加手术步骤,也难免带来并发症。尤其是部分病例术前估计不足,没有对供区作充分严格的皮肤准备,可引起感染、对开放性骨折更不主张一期髂骨移植;或对术中的细小裂隙往往期望通过术后石膏等辅助得以牢固固定。但是,骨折间隙的存在难以通过外固定抵消其应力。尤其在钢板对侧骨皮质,由于力臂的延长产生的力矩更大,石膏对采用拉力螺钉固定的骨折没有保护作用。临床上往往就因为对这一微小裂隙的处理不慎导致内固定失败[2]。因此作为新的一种移植材料,异体骨再次受到重视,一方面随着临床经验的不断积累,一些大样本回顾性研究报告显示异体骨移植的临床效果并不亚于自体骨,并可与自体骨媲美,另一方面它来源广泛,作为支架材料具有良好的结构和强度,比较容易被塑形和植入,如果移植成功便永远成为宿主机制的一部分[3]。但是经过冷冻等处理仍具有一定的免疫性,其免疫适应不仅会始终无法与自体骨相提并论,降低移植骨再血管化及爬行替代的速度,而且也很可能是引起移植骨骨折和骨不连等并发症的原因。尽管存在免疫排斥,异体骨仍是一种低毒且较易被耐受的移植材料,随着对移植骨和宿主骨交界处细胞和分子水平相互作用机制的研究,可减低异体骨免疫反应。另一方面,术后晚期深部感染成为异体骨移植最主要的并发症,预防感染仍是异体骨移植研究的重点。此外,为了提高移植骨的诱导成骨活性,近年来,rhBMP应用受到重视,rhBMP与各种异体骨材料构成复合异体骨已应用于临床[4],本组病例金世植骨灵异体骨复合材料植骨与自体骨植入在临床预后方面相同,且减少手术时间,为临床治疗粉碎性骨折提供了一个有效的方法。

【参考文献】
   1 荣国威,翟桂华,刘诉,等.骨科内固定,第3版.北京:人民卫生出版社,1995:18.

  2 Hsu WK,Anderson PA.Odontoid Fractures:Updates on management.J Am Acad Orthop Surg,2010,18(7):383-394.

  3 Khan SN,Cammisa FP Jr,Sandhu HS,et al.The biology of bone grafting.Am acad orthop surg,2005,13(1):77-86.

  4 刘延青,娄思权.骨髓基质中的骨源性干细胞.中华骨科杂志,2002,20(2):114-116.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2011年第8卷第2期]栏目
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研究异体修复周围神经损伤成为可能

  四肢周围神经不幸损伤后,通过植入来自异体的神经材料“神桥”,将可以很好地修复神经损伤,并且没有排异性。这是中山大学科研人员4日发布的一项863科研成果。目前,相关的材料已经通过国家相关部门证实其安全性,并已经运用到临床试验。

  中华医学会显微外科学会常务委员、中山大学医学博士顾立强介绍,随着工农业、交通和社会建设发展,周围神经损伤的发病率也在不断上升。“四肢神经损伤后不及时修复,可能终身遗留肢体瘫痪、肌肉萎缩、麻木、无力等残疾。”

  顾立强介绍,在以往的周围神经损伤的治疗中,通常采用从自体取神经接到患处进行修复,也就是“拆东墙补西墙”。例如,一位病患因车祸导致上肢神经损伤后,往往从其小腿部位取出神经,接到患处。“这样做尽管没有免疫排斥,但通常造成小腿麻木或取完后神经痛。此外,因为神经再生速度慢,从肩膀部位到手指尖的长度,需要成长两年多,期间,前臂因为神经不够长,很可能萎缩或纤维化。”

  最近,中山大学针对神经创伤的一项国家863课题《组织工程神经及其支架材料的研制与应用》已结题。作为该课题组成员,顾立强向记者介绍了一种取名为“神桥”的材料——去细胞同种异体神经修复材料。有别于自体神经,这种材料取自肢体捐赠和截肢,并去除了异体的细胞以保证安全、无免疫排斥、不带病毒。目前,该材料已经通过中国药品生物制品检定所认证,从基础研究转入临床应用研究状态。

  课题组另一成员朱庆棠副教授介绍,早在三年前,课题组已经完成第一代的“神桥”研究。实验证明,来自异体的“神桥”接到猕猴体内后,效果良好,无排异;第二代“神桥”研究中,为其加入了生长因子和干细胞,可使神经再生得更快更好;第三代“神桥”研究将解决未来异体神经来源的问题,因为仅靠捐赠和截肢是远远不够的。

  在国外,类似“神桥”的产品于2008年运用于临床,但是价格非常昂贵。朱庆棠透露,该课题成果从2009年3月用于临床试验后,经过国家相关部门认证其安全性和有效性,已在国内多家大型医院进行临床验证,用于修复成年人上肢神经损伤获得良好效果。预期中国第一代“神桥”材料明年可以广泛运用于临床。

日期:2010年7月14日 - 来自[神经科]栏目

“异体修复”周围神经损伤成为可能

        四肢周围神经不幸损伤后,通过植入来自异体的神经材料“神桥”,将可以很好地修复神经损伤,并且没有排异性。这是中山大学科研人员4日发布的一项863科研成果。目前,相关的材料已经通过国家相关部门证实其安全性,并已经运用到临床试验。  
        中华医学会显微外科学会常务委员、中山大学医学博士顾立强介绍,随着工农业、交通和社会建设发展,周围神经损伤的发病率也在不断上升。“四肢神经损伤后不及时修复,可能终身遗留肢体瘫痪、肌肉萎缩、麻木、无力等残疾。”  
        顾立强介绍,在以往的周围神经损伤的治疗中,通常采用从自体取神经接到患处进行修复,也就是“拆东墙补西墙”。例如,一位病患因车祸导致上肢神经损伤后,往往从其小腿部位取出神经,接到患处。“这样做尽管没有免疫排斥,但通常造成小腿麻木或取完后神经痛。此外,因为神经再生速度慢,从肩膀部位到手指尖的长度,需要成长两年多,期间,前臂因为神经不够长,很可能萎缩或纤维化。”  
        最近,中山大学针对神经创伤的一项国家863课题《组织工程神经及其支架材料的研制与应用》已结题。作为该课题组成员,顾立强向记者介绍了一种取名为“神桥”的材料——去细胞同种异体神经修复材料。有别于自体神经,这种材料取自肢体捐赠和截肢,并去除了异体的细胞以保证安全、无免疫排斥、不带病毒。目前,该材料已经通过中国药品生物制品检定所认证,从基础研究转入临床应用研究状态。  
        课题组另一成员朱庆棠副教授介绍,早在三年前,课题组已经完成第一代的“神桥”研究。实验证明,来自异体的“神桥”接到猕猴体内后,效果良好,无排异;第二代“神桥”研究中,为其加入了生长因子和干细胞,可使神经再生得更快更好;第三代“神桥”研究将解决未来异体神经来源的问题,因为仅靠捐赠和截肢是远远不够的。  
        在国外,类似“神桥”的产品于2008年运用于临床,但是价格非常昂贵。朱庆棠透露,该课题成果从2009年3月用于临床试验后,经过国家相关部门认证其安全性和有效性,已在国内多家大型医院进行临床验证,用于修复成年人上肢神经损伤获得良好效果。预期中国第一代“神桥”材料明年可以广泛运用于临床。
日期:2010年7月5日 - 来自[神经科]栏目
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玻璃化法保存异体肌腱移植的组织学研究

【摘要】  :[目的]对玻璃化法与程序冷冻法保存异体肌腱移植后的组织学演变及特性进行观察、分析,以了解其临床应用的可行性及影响因素。[方法]家兔36只,平均分为A组为新鲜自体肌腱移植组,B组为玻璃化法保存异体肌腱移植组,C组为程序冷冻法保存异体肌腱移植组,对术前、术后3、8、12周异体肌腱的形态学、组织学演变进行观察。[结果]玻璃化法保存肌腱完整率高于程序冷冻法,差异有显著性。A、B组移植后较C组粘连轻,光泽好。新生血管、腱细胞成熟早,愈合进程快。[结论]玻璃化法较好地保存了肌腱的细胞外结构,玻璃化法保存异体肌腱移植具有接近正常肌腱的组织学特性,其效果优于程序冷冻法。

关键词:

【关键词】  玻璃化 程序冷冻 肌腱 异体移植

  Morphologic study on cryopreservation of tendoh allograft by vitrification

  WU Fuzhang,BU Haifu,ZHAO Gang,et al.

  Department of Orthopedics,Anhui Provincial Corps Hospital,Chinese People's Armed Police Force,Hefei,Anhui 230041,China

     Abstract:[Objective]To analyze the histological changes and mechanical characteristics after vitrification and slowfreeing method for tendon allograft.[Method]Thirtysix rabbits were divided into 3 groups: Group A  (fresh tendon autograft ),Group B(vitrified tendon allograft),Group C (slowfreezing tendon allograft).The morphologic changes of tenddonial grafts were observed microscopically and histologically at 0,3,8,and 12 weeks.[Result]Before transplantation,the integrated rate of Group B was 92.4%,which was significantly better than that of Group C (54.2%,P<0.01).Aftertransplantation,Group C was more heavy adhesion around tendon than that of Group A or B.In  Group A and B,new  collagen  fibers  and  significantly increased  and  reconstructed than that of Group C.[Conclusion]The tendon extracellular matrix could be preserved perfectly,and the tendon allograft can be preserved by vitrification.It is more applicable clinically than slowfreezing tendon allograft.

     Key words:vitrification;  slowfreezing;  tendon;  allograft

  临床常用的程序低温冷冻法保存的异体肌腱是肌腱替代品的主要来源,但其操作费时复杂费用高,不可避免地会形成细胞内外大量冰晶,导致所保存的肌腱活性有限。新近出现的玻璃化法克服了上述缺点,其已在多细胞保存中获得成功,但对组织的保存则刚刚起步。国、内外对异体肌腱玻璃化法保存后的形态学、组织学特性研究尚无报道。本实验旨在研究玻璃化法保存肌腱的可行性和异体移植的有效性。

  1  材料与方法

  1.1  动物

     新西兰兔60只,普通级(安徽医科大学动物实验中心),体重(2.0±0.5)kg,雌雄不限。24只双侧跟腱作为移植材料,36只作为移植对象。

  1.2 仪器和试剂
   
  体视显微镜(奥林巴斯KWO-B,日本)、-80℃低温冰箱(Formascientific),DCS-25T电子万能实验机(深圳新三思)、二甲基亚砜(DMSO)、乙酰胺、丙二醇(PF)、程序冷冻仪(Linkam TMS94型)、37℃恒温水浴箱。

  1.3 标本制作

     24只家兔以3%戊巴比妥钠2 ml/mg行耳缘静脉麻醉,无菌条件下切取双侧跟腱,长度约3~4 cm。冲洗后放入EC液中备用。

  1.4  方法

  1.4.1  玻璃化法保存 

  上述肌腱在4℃条件下经3个梯度玻璃化液(主要由20%DMSO、2.5 mol/L乙酰胺、5%PF组成)平衡30 min后,直接投入液氮中保存2周以上。

  1.4.2  程序冷冻法保存 

  上述肌腱在4℃条件下浸入盛有程序冷冻液(主要由15%DMSO)冷存管中平衡30 min后放入程序冷冻仪,以2℃/min速度降温至-6℃植冰,平衡30 min后以0.5℃/min的速度降温至-50℃,平衡30 min后以1 ℃/min的速度至深低温-80℃,平衡60 min,投入液氮中保存2周以上。

  1.4.3 肌腱移植 

  移植分3组(每组12只家兔,双侧24条肌腱),A组:新鲜自体肌腱移植组;B组:玻璃化法保存的异体移植组;C组:程序冷冻法保存的异体移植组;移植后分别于3、8、12周处死动物,每组每个时间点各取材6条肌腱观察。3%戊巴比妥钠2 ml/kg行兔耳缘静脉麻醉,随机选择实验侧。保留深部1股跟腱组织,切断浅部2股造成1.5 cm的缺损,选择相同长度及粗细的肌腱移植,8/0线行改良Kessler法吻合。对侧跟腱切断后原位吻合,作为自体对照。不作外固定。

  1.4.4  形态组织学观察
 
  (1)大体:观察肌腱的形态、色泽、弹性、韧性和完整程度;(2)光镜:HE染色,观察肌腱缝合点愈合情况,免疫反应程度,新血管长入,腱细胞、胶原(CF)成熟度。

  1.4.5  统计学处理

  肌腱完整率比较,采用x2检验。

  2  结 果

  2.1  移植前形态学、组织学观察

  2.1.1  大体观察 

  新鲜肌腱:兔跟腱为乳白色长索状组织,表面光滑,横截面为椭圆形,长径约1.5~2.5 mm,短径约0.5~1 mm,弹性韧性良好,所有肌腱均完整。

    玻璃化肌腱:大体形态同新鲜肌腱,弹性韧性良好,有断裂现象。玻璃化法保存肌腱完整率为92.64%;

    程序低温冷冻肌腱:肌腱为乳白色长索状组织,表面光洁度、弹性韧性稍差于新鲜肌腱,程序冷冻法保存的肌腱完整率为56.17%。

     将玻璃化法和程序低温冷冻法保存的肌腱完整率进行比较,经x2检验,统计结果显示两者之间的差异有统计学意义(P<0.01)。

  2.1.2  光镜观察 

  新鲜肌腱:肌腱表面光滑,其内可见粗大的CF沿纵轴平行分布,排列规整,相互间有交叉,肌腱细胞数量少,沿CF周围纵向分布,排列呈串珠状,核呈椭圆形(图1)。
   
  玻璃化肌腱:与新鲜肌腱的镜下结构基本一致,可见小部分CF断裂,CF间隙较新鲜组宽。肌腱细胞数量较新鲜组稍少(图2)。   
       
  程序低温冷冻肌腱:肌腱表面光滑,粗大的CF沿纵轴平行分布,排列较新鲜组稍欠规整,相互间有交叉,但CF间隙较玻璃化腱组宽,CF断裂较多。肌腱细胞数量较新鲜腱、玻璃化腱组少,沿CF周围纵向分布,排列呈串珠状,核呈椭圆形(图3)。

  2.2  移植后形态学、组织学观察

  2.2.1 大体观察 

  新鲜自体肌腱:3周时肌腱周围组织炎性反应轻,无明显充血、水肿,肌腱与周围组织间轻度粘连,粘连带主要集中在远近端吻合口处,肌腱完整易于分离,肌腱吻合部梭形膨大,吻合口已基本愈合;8周时肌腱周围组织无炎性反应,肌腱与周围组织间中度粘连,远近端吻合口处有较松的粘连带,肌腱完整与周围组织界线清楚,能够锐性分离,移植肌腱较正常肌腱韧性差。肌腱吻合部梭形膨大变小,吻合口愈合良好;12周时肌腱周围组织无炎性反应,与周围组织间轻度粘连,粘连较8周时减轻,移植肌腱中段表面较光滑,远近端吻合口处有松弛,吻合口部梭形膨大逐渐变小,移植肌腱与正常肌腱韧性相似(图4~6)。   
   
  玻璃化异体肌腱:3周时肌腱周围组织炎性反应较轻,无明显充血、水肿,肌腱与周围组织间轻度粘连,粘连带主要集中在远近端吻合口处,肌腱完整易于分离,吻合部梭形膨大,吻合口已基本愈合;8周时肌腱周围组织无炎性反应,粘连中度,远近端吻合口处有较松弛的粘连带,肌腱能够锐性分离,移植肌腱较正常肌腱韧性差。吻合部梭形膨大变小;12周时肌腱周围组织无炎性反应,与周围组织间轻度粘连,粘连较8周时减轻,移植肌腱中段表面较光滑,远近端吻合口处有较松弛粘连带,吻合口部梭形膨大逐渐变小,吻合口愈合良好,移植肌腱与正常肌腱韧性相似(图4~6)。
     
  程序冷冻异体肌腱:3周时肌腱周围组织炎性反应轻,无明显充血、水肿,肌腱与周围组织间轻度粘连,粘连带主要集中在远近端吻合口处,肌腱完整易于分离,吻合部梭形膨大,吻合口已基本愈合;8周时肌腱周围组织炎性反应较重,肌腱与周围组织间中度粘连,远近端吻合口处粘连最重,肌腱完整与周围组织界线欠清楚,但能够锐性分离,吻合口部梭形膨大,吻合口已愈合,移植肌腱较正常肌腱韧性差;12周时肌腱周围组织无炎性反应,与周围组织间中度粘连,粘连较8周时减轻,移植肌腱中段表面较光滑,远近端吻合口处有较致密的粘连带,吻合部梭形膨大逐渐变小,吻合口愈合良好,移植肌腱与正常肌腱韧性相似。3~8周时炎性反应较新鲜自体肌腱、玻璃化肌腱重(图4~6)。

     2.2.2  镜下观察     

  新鲜自体肌腱:3周时移植肌腱吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充,其内有较多血管浸入,细胞间有大量细CF,排列不规整,连接于吻合的肌腱间,缝线周围可见炎性细胞浸润;8周时移植肌腱吻合口处与周围粘连稍重,其间有大量血管浸入,细CF较3周时增多,细CF趋向于连接成束,成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少,缝线周围可见少量炎性细胞浸润。吻合口处表面光滑,其内仍有较多血管,细CF连结成束,粗大CF四周向中心逐渐替代细CF,淋巴细胞与炎性细胞消失。12周时移植肌腱部分的变化与8周相似,但胶原的替代进程稍快,吻合口处表面光滑,粗大CF与细CF相间排列,成纤维细胞数量减少,正大量演变成肌腱细胞,CF替代由肌腱端向吻合口中心进行(图7、10、13)。
       
  玻璃化肌腱:3周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似,吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充,其内有较多血管浸入,细胞间有大量细CF,排列不规整,连接于吻合的肌腱间,缝线周围可见炎性细胞浸润;8周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似,吻合口处与周围粘连较重,其间有大量血管浸入,细CF较3周时增多,细CF趋向于连接成束,成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少,缝线周围可见少量炎性细胞浸润。移植肌腱内肌腱细胞数目略少于新鲜自体肌腱,CF的替代过程稍慢;吻合口处表面较自体肌腱稍欠光滑,其内仍有较多血管,粗大CF四周向中心逐渐替代细CF,替代进程稍慢于自体肌腱,淋巴细胞与炎性细胞消失;12周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似,但胶原的替代进程稍慢于新鲜自体肌腱,吻合口处表面较光滑,粗大CF与细CF相间排列,成纤维细胞数量减少,正逐渐演变成肌腱细胞,CF替代由肌腱端向吻合口中心进行,但替代进程稍慢于新鲜自体肌腱(图8、11、14)。
       
  程序冷冻肌腱:3周时移植肌腱部分与新鲜自体肌腱相似,吻合口处可见大量成纤维细胞与少量淋巴细胞填充,其内有较多血管浸入,其间有大量细CF与较致密的结缔组织,排列紊乱,连接于吻合的肌腱间,缝线周围可见炎性细胞浸润;8周时移植肌腱部分的变化与新鲜自体肌腱相似,吻合口处与周围粘连较重,其间有大量血管浸入,细CF量较新鲜自体肌腱少,排列紊乱,成纤维细胞与淋巴细胞较3周时减少,缝线周围可见少量炎性细胞浸润;肌腱内细胞数目接近正常肌腱,部分细胞核形态介于肌腱细胞与成纤维细胞之间,正常肌腱细胞少于玻璃化肌腱组,CF较玻璃化肌腱细小,排列欠规整,CF未完全连结成束,CF间交联密集;吻合口处表面欠光滑,细CF趋于连结成束,较粗大CF由四周向中心逐渐替代细CF与结缔组织,但替代进程落后于玻璃化肌腱,成纤维细胞逐渐演变成肌腱细胞:12周时移植肌腱部分的变化与玻璃化肌腱相似,但演变进程稍慢于玻璃化肌腱,吻合口处仍有较多血管浸入,粗大CF与细CF相间排列,成纤维细胞数量减少,正逐渐演变成肌腱细胞,CF替代由肌腱端向吻合口中心进行,但替代进程稍慢于新鲜自体肌腱和玻璃化异体肌腱(图9、12、15)。

     3 讨 论
     
  玻璃化法又称为无冰晶技术。其本质是液体在冷冻过程中,连续地固化形成无完形的玻璃体,达到高度黏稠状态,而其内部无晶体或仅少量结晶形成。玻璃化技术采用高浓度冷冻保护剂(CPA)和单步快速降温,可以同时防止细胞内、外冰晶的形成,其实质是细胞内、外玻璃化,因而可以避免冰晶所造成的挤压损伤和冻融效应[1]。
     
  程序冷冻法采用低浓度CPA,先使样品缓慢降温,细胞外水结冰,导致细胞外CPA浓度升高,细胞脱水,细胞内CPA浓度随之升高,然后将样品没入液氮进行快速降温,以减少细胞内冰晶的形成,其实质是细胞内玻璃化。但必将形成大量的细胞外冰晶,对细胞造成致命伤害。冷冻过程复杂,影响因素较多。

     本实验中,经玻璃化法和程序冷冻法保存的肌腱具有与新鲜肌腱相似的形状、色泽、弹性和韧性。镜下观察玻璃化法较程序冷冻能够更好保存肌腱的形态结构,玻璃化腱完整率远高于程序冷冻腱,与新鲜肌腱的显微结构无明显差异。Kuleshova通过比较细胞活性,认为玻璃化法优于程序冷冻法[2]。玻璃化腱内细胞虽然有损伤现象,但是较程序冷冻腱损伤要轻,尤其是细胞外基质获得较好的保存。贾晓明证实:组织内部细胞间连接以及细胞与细胞外基质的连接对组织冷冻损伤有重要影响,其存在直接影响细胞的活力[3]。Jomha观察到低浓度CPA中基质含量明显低于高浓度CPA中基质含量,而且基质结构破坏更严重[4]。自体移植组肌腱细胞活性、胶原结构保存最好,无免疫排斥,在移植后早期能够继续分泌胶原蛋白,积极参与肌腱的修复重建,因此,移植后肌腱细胞与CF修复重建快,吻合口部的愈合好、粘连较轻,功能恢复好。玻璃化肌腱在冷冻保存过程中,肌腱细胞活性得以良好保存的同时,肌腱细胞外基质及胶原结构损伤也较轻微,因此,移植后肌腱细胞在早期能够继续分泌胶原蛋白,参与肌腱的修复重建,同时良好的细胞外基质及胶原结构,为随后肌腱细胞与胶原的替代提供良好生长支架,使降解与替代重建同步进行,肌腱修复效果与新鲜自体肌腱相似,但修复重建时间较自体组稍长。程序冷冻肌腱在保存过程中,肌腱细胞虽有部分保留,但细胞外基质及胶原结构损伤较重,移植后肌腱细胞与胶原修复重建时间延长,肌腱粘连较重,肌腱移植效果较玻璃化肌腱差。

     肌腱移植后吻合口部的愈合与粘连情况,直接影响术后的效果。Pegg认为:组织是细胞和细胞间连接组合在一起的功能整体,程序冷冻法对组织整体结构损伤较大,细胞外基质损伤严重,细胞不能发挥各自作用,导致肌腱移植后效果不好[5]。程序冷冻这种有明显创伤的处理使腱抗张强度显著降低,且因腱细胞失活不能产生内源性愈合过程,完全依赖于外源性愈合,易产生严重粘连[6],远未达到异体移植的理想要求[7]。新鲜自体肌腱移植后3周时,吻合口部内由大量成纤维细胞及其分泌的细CF填充,8周时成纤维细胞减少,细CF趋向于连接成束,部分细CF连结成束,由四周向中心逐渐替代细CF,成纤维细胞逐渐演变成肌腱细胞,12周时粗大CF与细CF相间排列,CF替代仍在继续。玻璃化异体肌腱吻合口部的愈合与胶原的替代时间较自体肌腱稍晚,进程也较慢,局部粘连也稍重,替代后的CF排列也较自体组欠规整。而程序冷冻肌腱的替代过程较新鲜组与玻璃化组更慢,局部粘连也更重,替代后的胶原结构也更差。通过3组肌腱移植后愈合进程的动态观察与比较,可以看出新鲜自体肌腱移植效果优于玻璃化异体肌腱,而玻璃化异体肌腱又优于程序冷冻异体肌腱。

【参考文献】
    [1]Duquesnoy RJ,李幼平,主编.移植免疫生物学[M].北京:科学出版社,2000,141-153.

  [2] Kuleshova LL,Lopata A.Vitrification can be more favorable than slow cooling[J].Fertile Sterile,2002,3:449-454.

  [3]贾晓明,纪晓峰,Yang H,等.细胞连接对组织冷冻损伤的作用[J].中华外科杂志,2001,12:954-957.

  [4]Jomha NM,Anoop PC,Mcgann LE.Intramatrix events during cryopreservation of porcine articular cartilage using rapid cooling[J].J Orthop Res,2004,1:152-157.

  [5]Pegg DE.The current status of tissue cryopreservation[J].CryoLetters,2001,2:105-112.

  [6]徐红立,王爱民.肌腱愈合早期血管内皮生长因子及其受体的表达[J].中国矫形外科杂志,2004,12:842-844.

  [7]唐林俊,程国良,方光荣,等.反复冻融及超深低温处理的异体肌腱移植实验研究[J]. 中国修复重建外科杂志,1998,4:241-244.


作者单位:1.武警安徽省总队医院骨科,合肥 230041;2.安徽医科大学第一附属医院骨科, 合肥 230041;3.中国科学技术大学低温生物力学实验室,合肥 230041;基金项目:国家自然科学基金(编号:50506029)和安徽省自然科学基金(编号:070413099)资助

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第20期]栏目

同种异体骨的易感疾病风险与控制

【摘要】  本文回顾了历史上因应用同种异体骨植入材料导致疾病感染的病例,并分析了原因。介绍了供体血液筛选过程中应注意的问题,较全面地描述了国内外在加工同种异体骨的过程中所采用的病毒灭活方法及其效果,对同种异休骨的风险控制有一定参考意义。

【关键词】  同种异体骨; 风险控制

Risk management of infective diseases of allograft∥LIU Bin.Medical Devices Center,State Food and Drug Administration,Beijing 100044, China

  Abstract:The article reviewed the infected cases by implanting bone allografts in history and analyzed the reasons which resulted in the infections. The article also pay attention in the methods of serologic selection of donors, and emphatically introduced the processing of viral Inactivation and their effects, it has some significance to control the risk of hone allografts.

  Key words:allograft; risk management

  同种异体骨与自体骨相比较,具有不需切取病人自体骨使手术过程简单化并因此没有供区并发症发生、植入物能与受区相匹配等优点,目前仍然是最有实用价值的自体骨替代材料。然而,该材料的应用是否会导致传染病的传播是医生、病人和主管部门关注的重要问题。本文对使用该植入材料所潜在的易感疾病传染风险和灭活控制方法进行综述。

  1 同种异体骨的易感微生物

  1.1 乙型肝炎病毒

  近几十年来,按照规范的供体筛选和某些微生物灭活技术处理的同种异体骨,应用在临床没有发生乙型肝炎感染的报道。供体的血清学筛选常规检测HBsAg,HBsAg阳性供体有传染性。HBs-Ag(-),但HBc-Ab(+),HBs-Ab(-)者,也可能有传染性,除非有效的PCR检查为阴性[1]。

  1.2 丙型肝炎病毒

  有报道未经过清除骨髓等处理的深低温骨致丙型肝炎传播,而同一供体骨组织经过了冷冻干燥或冷藏同时辐照处理后应用,未发生受体HCV感染[2]。

  1.3 艾滋病病毒

  艾滋病是严重危害人群健康的疾病之一,自1981年美国首次报道艾滋病以来,该疾病已迅速传播。截至2000年底全球HIV感染者总数已超过5 310万人,平均每天新增HIV感染者1.5万人。而且95%以上的感染者集中在发展中国家[4]。

  上世纪80年代,有应用骨、骨髓、肌腱传播HIV的报道,但是近些年因认识提高和采取可靠控制方法而未见报道。美国曾经有一供体提供的58件组织和器官中,心、肝和双肾在切取24 h内移植,4个器官移植和3个新鲜冷藏骨移植受体感染HIV;另34个组织受体未感染HIV,其中1例接受清除了骨髓的冷藏骨移植;25例接受了清除骨髓、冷冻干燥和酒精处理的骨移植;3例接受了同样处理的筋膜和肌腱移植;3例接受了经辐照的硬脑膜移植;2例接受了未经处理的角膜(无血管组织)移植。该事件虽然教训深刻,但另一方面说明采用适当的病毒清除和灭活技术可阻止HIV的传播,并突出采用可靠的病毒灭活技术在防止易感疾病传播方面的重要性[3]。Malhotra将888个供体来源的2 000件同种异体骨移植到1 500个病人,没有1例HIV感染。合格供体骨均经过清除骨髓,97%的酒精浸泡20 min,2.5 Mrads剂量的辐照才应用于临床[4]。

  对供体的筛选,如果活供体的医学史不明确,要等待180 d后复查供体的HIV和HCV抗体,结果阴性方可不经灭活处理应用该组织。180 d后复查活供体或者同一供体的器官移植受体血清,可以避免遗漏处于HIV和HCV窗口期的供体。美国组织库协会(AATB)建议6个月复查活供体或者同一供体的器官移植受体血清,而欧洲骨组织协会则规定3个月复查[1]。

  PCR(polymerase chain reaction)检测有很高的特异性(100%)和敏感性,能够早期诊断艾滋病,但有可能出现假阳性。所采集的血液如果发生溶血,HBsAg和HIV p24抗原可能出现假阳性结果,而HIV和HCV的PCR结果可出现假阴性。因此,艾滋病诊断的金标准仍然是HIV-Ab,HIV的PCR检测的临床意义包括预测疾病进程、提供开始抗病毒治疗依据、评估治疗效果、指导治疗方案调整,也可作为HIV感染早期诊断的参考指标[5]。HIV的PCR的检测需在有相关资质的实验室进行,我国目前尚未开展这方面工作。因而HIV-Ab检测筛选供体结合可靠的病毒灭活技术处理同种异体骨可使风险性降低。

  2 易感病原体的灭活

  HIV等易感病毒在骨髓和血液中的浓度较高,通过彻底的清除骨组织中的骨髓和血液可清除其中的病毒,降低感染的风险。同时,这些易感病毒往往可通过化学或者物理的方法灭活。

  2.1 化学灭活

  HIV在外界环境中的生存能力较弱,对物理因素和化学因素的抵抗力较低。因此,对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。70%酒精1 min、30%酒精溶液5 min、20%酒精溶液10 min可灭活HIV[5]。酒精可灭活HIV、HBV和HCV,其他病毒和某些细菌,但不能灭活那些没有脂溶性包裹的微小病毒和HAV病毒。

  过乙酸-酒精证实是可靠的病毒灭活溶液,可使骨中的HIV-2,脊髓灰质炎病毒(PV-1),类狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和牛腹泻病毒(BVDV)滴度下降41og(10)以上,但是对HAV的灭活效果较差,需要结合脱脂过程才能有效的灭活[6、7]。

  Swenson CL通过类似HIV的FeLV(猫科白细胞病毒)来验证脱钙对HIV的灭活效果,经细胞和动物内植入,检测FeLV p2抗原、病毒核酸和抗体等方法证实脱钙过程能灭活皮质骨中的HIV病毒。研究显示同种异体骨脱钙过程能使所有人体易感染病毒[HIV,鸭HBV,牛腹泻病毒(BVDV)类似HCV,巨细胞病毒和脊髓灰质炎病毒类似HAV]灭活,达到10-6的灭菌保证水平(SAL),对脊髓灰质炎病毒的灭活可以达到10-12水平,该实验按照标准的确认过程进行[8]。而且,脱钙可以使同种异体骨有骨诱导作用的蛋白暴露,刺激受区间充质细胞增生、分化形成新骨[9]。

  同时,有报道环氧乙烷可灭活病毒[10]。

  2.2 辐照灭菌

  国际原子能机构对医用产品的伽马射线推荐灭菌剂量为2.5 Mrads,但是一般可根据产品的生物负载调整剂量,冷藏同种异体骨中的HIV灭活剂量一直未确定。因此,防止因骨移植导致的HIV传播不能仅依赖伽马射线的灭菌,而应依赖于严格的血清学筛选和其他的加工方法灭活[11]。急性感染期的早期HIV的含量最高,预计1.2 Mrads剂量可灭活最高含量的HIV病毒,另外加1.2 Mrads剂量使总量达到2.4 Mrads,使发现单一病毒活体的机率降低到百万分之一[12]。

  2.3 热灭活

  Hofmann认为热消毒系统的应用,可以大大提高产品的安全性,动物及临床研究证实用65℃热处理同种异体骨不影响骨的愈合,传统处理的同种异体骨并发症的发生率为10.7%;热处理的为11.4%[13]。56℃30 min能灭活血液中的HIV,60℃证实灭活骨中的HIV,并且对骨的力学特征和成骨能力没有影响。Marthy将艾滋病患者的骨组织冷藏在-80℃,1~12周后用p24抗原检测仍为阳性,说明冷藏过程不能灭活HIV[14]。

  目前全球同种异体骨在医疗上的应用远大于其他组织和器官的总和,美国同种异体骨的应用一直呈现明显上升趋势,每年有百万病例应用同种异体骨,Osteotech等大型专业公司累计加工同种异体骨已达几百万件,临床应用无疾病传播。说明只要按照国际上公认的标准选择供体,并且清除骨髓和采用适当的微生物灭活技术,因同种异体骨的植入导致易感疾病的传播可以得到控制。近几年国家食品药品监督管理局在支持企业开展这项工作、为临床病人服务的同时,非常关注该材料安全性方面的监管工作,在行业标准制定、产品注册和日常监管等方面都体现了对这方面工作的重视,以使这项工作能在我国健康发展,造福广大患者。

【参考文献】
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作者单位:国家食品药品监督管理局医疗器械审评中心,北京 100044

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第15期]栏目
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同种异体骨软骨移植修复软骨损伤的研究进展

【摘要】  关节软骨损伤的治疗是骨科领域一个难题,同种异体骨软骨移植是修复全层软骨损伤的有效方法。文中综述了同种异体骨软骨移植修复软骨损伤的研究进展,包括该方法的适应证和禁忌证,目前在临床的应用情况及治疗效果,并进一步探讨了同种异体骨软骨移植中的3个热点话题,如疾病传播、免疫排斥和移植物的保存。这些文献综述显示同种异体骨软骨移植修复关节软骨损伤具有特定优势,但进一步推广该方法仍有一些需要解决的问题。

【关键词】  同种异体骨; 移植; 软骨损伤

 Osteochondral allografts in articular cartilage repair∥LI Haipeng,LIU Yujie,LIU Zhi.Department of Orthopaedics,General Hospital of Beijing Military Command,Beijing 100700,China

    Abstract:Articular cartilage injury is a problem in the field of orthopedics,osteochondral allografis transplantation is an effective way in the treatment of articular cartilage injuries.The article summarizes the research advances of osteochondral allograft transplantation,including the indication and contraindication of the methods,currently application in clinical treatment,and further exploring three hot topics in the osteochondral allograft transplantation,such as the spread of diseases,immune rejection and graft preservation.These literature review showed that osteochondral allograft transplantation to repair cartilage damage has a specific advantage,but still has some problems for further promoting.

    Key words:allografts;     transplantation;     articular injury

   关节软骨损伤的治疗是骨科领域一个难题,目前软骨损伤的治疗方法有关节镜下清理成形、钻孔微骨折、自体骨软骨移植、同种异体骨软骨移植、软骨细胞移植及组织工程,不同方法各有优缺点,其中同种异体骨软骨移植经长期随访被证实是修复全层软骨损伤的有效方法[1,2],且相对于其他治疗方法可获得与损伤区完全匹配的骨软骨,具有与损伤区软骨相似的生物学特性,在组织的面积匹配上有更加广泛的选择,避免了供区继发损伤[3,4]。本文将对同种异体骨软骨移植的相关进展进行综述。

    同种异体骨软骨移植的个案报道最早可追溯到几个世纪以前,但是正式系列采用这种方法的是Lexer,有人称其为“同种异体骨软骨移植之父”。Lexer 在1908年开始临床应用同种异体骨软骨移植的方法,1925年报道了治疗结果,成功率达50%。同种异体骨软骨移植早期多用于治疗骨肿瘤或肢体骨缺损,认为可取代截肢术,不久这种方法被用于其他疾病的治疗 。1970年有人将这种方法应用到创伤性软骨或骨缺损的治疗,使其成为胫骨平台或股骨髁等关节周围骨折后膝关节重建的重要手段之一,尤其对于年轻患者甚至替代了人工关节置换手术。然而盲目扩大适应证导致了较高的失败率以及疾病传播等问题,至20世纪80年代末同种异体骨软骨移植方法的应用几乎停止[1]。随着对传播疾病筛选能力的加强以及文献报道同种异体骨软骨移植治疗孤立性软骨损伤方面的长期满意疗效,同种异体骨软骨移植再次引起了人们的兴趣。

    1     同种异体骨软骨移植的适用证和禁忌证

    同种异体骨软骨移植主要用于修复存在临床症状的、局限性的、全层软骨损伤。由于可根据损伤的情况任意设计移植物的大小及形状,因此这种方法对不同解剖部位及不同大小的软骨损伤均适合[3]。虽然同种异体骨软骨移植可用于治疗任何大小的软骨损伤,但是对损伤面积在2 cm2以上,尤其是伴有软骨下骨缺损时更能够显示其优势[1,5]。其次采用同种异体骨软骨移植时需要考虑导致软骨损伤的原因,通常继发于创伤或剥脱性软骨炎的患者由于软骨缺损周围的组织相对正常,其疗效明显优于退行性变引起的软骨损伤。而继发缺血性坏死的软骨损伤由于软骨下骨同样存在坏死,因此骨软骨移植后软骨下骨的愈合存在障碍,临床疗效通常不满意。弥漫的退行性关节炎以及类风湿性关节炎是骨软骨移植的禁忌证[3]。

    此外采用同种异体骨软骨移植时还应该考虑到患者年龄、期望值及术后的康复条件等,患者年龄一般不应超过45岁。伴随有关节不稳、下肢力线不佳和半月板损伤时也会影响治疗效果。

    2     同种异体骨软骨移植的临床应用情况

    同种异体骨软骨移植治疗骨软骨缺损经长期随访临床效果比较满意,文献报道满意率为60%~95%[3]。多伦多大学是最早采用该方法的机构,于1972开始应用同种异体骨软骨移植治疗软骨损伤,在采用同种异体骨软骨移植进行创伤后的重建方面积累了丰富的经验。1985年报道了最初100例患者的治疗情况,其中股骨或胫骨损伤95例,髌骨损伤3例,距骨损伤2例。平均随访时间3.   8年,最短随访时间2年,成功率为56%。损伤的病因被认为是影响预后的主要因素,48例创伤导致的损伤成功率高达75%,而24例骨性关节炎患者中仅有10例获得成功[6]。Gross[4]为多伦多大学的学者,他随访了自1972~2007年采用该方法治疗的364例患者,骨软骨移植物的5、10、15年存活率分别为95%、80%和65%。作者还对部分患者的移植物进行了组织分析,结果发现移植术后25年骨软骨移植物仍存在有活性的软骨细胞。

    圣地哥大学也是较早采用骨软骨移植的机构之一,于1983年开始应用同种异体骨软骨移植,目前临床应用已经超过200例。Chu等[8]于1999年报道了211例继发于创伤、骨软骨炎的骨软骨损伤治疗结果,平均随访75个月(11~147个月)。对疼痛症状、活动度和负重功能等方面进行评价,优良率达84%。其中125例股骨髁患者移植成功116例(93%),40例胫股关节成功26例(65%)。胫股关节单侧损伤成功率为92%,髌股关节单侧成功率为86%,而相应部位双侧均存在损伤的成功率分别仅为69%、50%。由此认为对应部位双侧软骨损伤的治疗效果不如单侧损伤。

    除对膝关节骨软骨损伤采用同种异体骨软骨移植治疗外,许多学者也尝试对其他部位的软骨损伤采用该方法进行治疗。Raikin[9]对6例面积>3 cm2的距骨骨软骨缺损采用同种异体骨软骨移植进行治疗,平均随访23个月,根据美国足踝关节评分进行评价,术后平均改善44分,所有患者均对手术表示满意。Gross[10]曾对9例距骨软骨损伤的患者采取同种异体骨软骨移植进行治疗,随访12年时仍有6例患者的骨软骨移植物在位,并且患者的踝关节保持良好的功能,日常活动不受限制,均对手术表示满意。Meehan[11]报道了11例胫距关节骨性关节炎的患者采用骨软骨移植的临床经验,平均随访33个月,AOFAS评分平均从术前55分提高到73分。现在还有学者将同种异体骨软骨移植的方法应用到髋关节股骨头缺血性坏死、肩关节盂肱关节脱位导致的大面积骨软骨损伤以及肱骨头剥脱性骨软骨炎、骨坏死的治疗[12]。总之同种异体骨软骨移植的临床应用范围仍处于不断探索和扩展的过程。

    早期学者均采取新鲜骨软骨移植的方法以保持软骨细胞的活性,现在骨软骨保存技术的提高可以使移植物在28 d时仍保持80%的软骨细胞存活,临床应用也证实了经保存后的骨软骨移植也可获得满意的疗效,为推广这种方法提供了依据。Patrick C[13]对25例股骨髁软骨缺损的年轻患者采取经保存后的同种异体骨软骨移植进行治疗,移植物从切取到手术时间平均为24 d(15~43 d),并进行前瞻性的观察,平均随访35个月(24~67个月),Lysholm膝关节评分从术前39分提高到67分,IKDC评分从术前29分提高到58分,患者满意率高达84%,影像学检查有22例(88%)患者软骨下骨愈合良好。

    3     同种异体骨软骨移植的几个问题

    传播伴随疾病是同种异体骨软骨移植和其他异体组织移植一样存在的问题,早期骨软骨移植都在切取组织后1~2 d内进行以最大程度保证软骨细胞的存活,但是多数组织库对移植物的血清学及无菌检查时间为14 d,因此存在传播疾病的危险,被认为是这种方法的致命缺点,限制了该方法的推广应用。以现在的保存技术已经能够保证足够时间对移植物进行正规的消毒处理和严格的筛查,从而最大程度的减少传播伴随疾病的危险性,有报道认为经过严格筛选后传播AIDS、丙肝以及乙肝的危险性分别为1/493 000,1/103 000和1/63 000[4]。

    免疫排斥反应是同种异体骨软骨移植中面临的另一个重要问题。有人建议对软骨细胞进行组织配型,认为可以减轻免疫反应。然而关节软骨本身无血管、神经及淋巴供应,软骨细胞被基质包埋,基质对软骨细胞提供保护性免疫屏障,基质完整时软骨细胞不会与受体淋巴细胞及浆细胞接触,表现为低免疫性,通常称其为“免疫豁免器官”。因此临床上常规都不需要进行组织配型。实践证实患者即使接受大块移植物也不会影响到疗效[14]。

    同种异体骨软骨移植中还有一个重要的问题就是移植物的保存。保持软骨细胞存活使其不断分泌软骨基质,对于保持软骨基质的完整防止移植物随着时间的推移而退变十分重要。传统的异体骨软骨采用4°C乳酸林格氏液进行保存,由于不含维持软骨细胞新陈代谢所需要的营养物质,因此通常在2~7 d内可以确保软骨细胞的活性,然而7 d后软骨细胞的活性和代谢会明显下降。新鲜冰冻和冷冻干燥曾应用于骨软骨的保存,但是研究发现经保存后的移植物没有存活的软骨细胞。深低温冷藏方法虽然仅能够保存少量的软骨细胞,但临床应用效果差。Enneking报道采用深低温冷藏的骨软骨移植1年后关节软骨严重退变,到5年时全部退变。冷冻后软骨细胞存活率不理想的主要原因是软骨基质中80%以上是水,在冷冻过程中软骨基质起一种生理性溶剂作用,增加了溶剂效应损伤。有研究采用低温保护剂以保护细胞免受这一损伤。然而Seth K的研究发现即使是二甲亚砜保护后梯度降温深低温冷藏保存的骨软骨的软骨细胞活性也会全部或接近全部丧失[15]。

    现在许多组织库均采用组织培养液的方法保存骨软骨移植物。Scott T[16]对比了组织培养液和乳酸林格氏液保存的骨软骨块,发现28 d时乳酸林格氏液保存的骨软骨块其软骨细胞存活率为28.   9%,而组织培养液保存的存活率达83.   4%。Margie S[17]认为保存液的成分对软骨细胞的存活率有重要影响,他对比了乳酸钠林格液、DMEM以及加入胰岛素生长因子-1的DMEM对骨软骨移植物的保存情况,结果发现保存2周后软骨细胞的存活率分别为20.   4%、54.   8%、83.   6%。最近对移植物的组织学研究显示炎性细胞以及炎性疾病的相关因子对软骨细胞的存活有重要影响[4],还有学者的研究显示骨软骨移植物中的软骨细胞死亡与细胞凋亡和细胞程序性死亡相关[18],因此在保存液中加入减少炎性细胞产生和阻断凋亡程序的相关因子也许可提高软骨细胞的存活率。

    4     结     论

    同种异体骨软骨移植经过长期随访已经证实是一种有效治疗关节软骨缺损的方法。这种方法可以提供完整的软骨基质,不受缺损面积大小的限制,具有其他治疗方法所不能比拟的优势。骨软骨保存方法的改进使该方法的应用范围得到扩大,但仍有进一步完善的需要。

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作者单位:1.北京军区总医院骨科,北京东四南门仓5号 100700;2.解放军总医院骨科,北京复兴路28号 100853

日期:2009年8月24日 - 来自[2009年第17卷第12期]栏目
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