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中科院青岛能源所发明拉曼激活单细胞液滴分选技术

单个细胞是地球上细胞生命体功能和进化的基本单元。单细胞精度的高通量功能分选是解析生命体系异质性机制、探索自然界微生物暗物质的重要工具。单细胞拉曼光谱(SCRS)能够在无标记、无损的前提下揭示细胞固...即将发布

日期:2017年11月18日 - 来自[技术要闻]栏目
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青岛能源所发明简易高效的单细胞分选与测序对接技术

 为了满足考察自然界中细胞“原位功能”这一共性科学需求,“现场”、“实时”的单细胞分选与测序已成为生命科学装备研制领域的一个重要发展趋势。尽管第三代测序技术已实现仪器微型化,但与测序对接的单细胞精准分选装备却仍然相当笨重和昂贵,难以支撑各种科学考察中针对微生物组功能的现场分析。最近,中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心研究员马波带领的微流控系统团队,通过设计简易高效的单细胞分选与测序对接装置,实现了每个试管有且只有一个细胞(One-Cell-One-Tube),有望服务于“现场”、“实时”乃至“便携式”的单细胞分选与测序。

与人体和高等动植物细胞相比,微生物细胞通常更小(0.1-10 微米),更加难于精准操纵,因此分离获取目标单细胞、并且实现测序反应要求的“One-Cell-One-Tube”是一个关键难点。目前的自动单细胞分离方法大多依赖于昂贵且体积庞大的荧光流式细胞分选仪(FACS),而现有的手动单细胞分离和测序方案在依赖于操作人员熟练程度的同时,同样需要显微单细胞移液平台、激光光镊等同样难以随身携带的大中型仪器。此外,单细胞分选及核酸制备过程极易受到环境中飘浮微生物及其DNA的污染,而且这种污染通常难以在测序数据处理环节完全去除。因此,尽管目前MinION等第三代测序仪已经实现了便携化,微生物单细胞分选和测序仍然操作繁琐、污染干扰严重,难以满足要求。

针对上述挑战,青岛能源所单细胞中心张强和王婷婷等发明了一种名为“FOCOT”(Facile One-Cell-One-Tube的缩写)的方法,能够精确、高速、低成本地分离、获取与分装单个微生物细胞,从而与单细胞测序直接对接。该方法具体为:首先,通过微流控技术,将细胞分散包裹在数十微米直径的油包水微液滴中;其次,基于液滴显微光学成像识别技术,分选出单细胞包裹液滴;第三,将单细胞包裹液滴顺序分布于系列试管中,从而快速实现单个细胞的分离,以及每个试管有且只有一个细胞,以实现与单细胞全基因组扩增与测序的直接对接。

FOCOT平台主要有三个特色。第一,在简易方便方面,FOCOT平台除自行设计的芯片之外,仅需要电磁阀、平板电脑和普通光学显微镜,不需外接任何高成本商品化仪器平台,具有易获取、易替换、低成本等优势。同时,模块化、小型化、操作简便的设计使得该装置适合在自然环境实地采样条件下的携带、装配和使用,也几乎不需要额外的人员培训和技术维护,因此尤其适用于面向各种极端自然环境的科学考察,也有利于在普通实验室的推广应用。第二,在分选高效方面,FOCOT平台通过显微镜下对包裹有单个细胞的液滴的准确识别和分选,能有效避免假阳性;而且其20秒/个的分选速度,与显微单细胞移液、激光光镊等现有的商品化分选装备相比具有明显优势。同时,单细胞获取率高于90%,培养成功比例至少80%,证明该方法能有效避免芯片表面吸附所导致的输运过程中细胞流失,而且对细胞活性没有或较小损伤。第三,在污染控制方面,FOCOT平台涉及部件少,体积小型化,相对封闭,因此在实验过程中能够方便地实现超洁净环境空间控制、芯片消毒等操作,严格控制环境DNA的污染。对分离获取的单个酵母细胞进行全基因组扩增与测序后结果显示,99%的有效序列可以与参考基因组匹配,表明该方法能有效避免环境中微生物带来的DNA污染,平均基因组覆盖率达到43.3%,与在昂贵的超净空间设施中采用FACS等大型仪器系统分离获取单细胞所获得的测序结果相当。

目前,通过耦合FOCOT与中心前期开发的单细胞拉曼成像、拉曼流式细胞分选等技术,单细胞中心正在构建一个服务于岸基、船基乃至手基等不同需求的非标记式单细胞分析装备体系,以服务于能源、环境、健康、海洋、土壤等诸多微生物组应用领域。

相关研究论文发表在《科学报告》上。研究工作由单细胞中心马波和徐健共同主持完成,获得了国家基金委科学仪器基础研究专项、面上项目和中科院生物高通量分析技术服务网络(STS)等项目的支持。

论文信息:Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192。

FOCOT方法示意图


日期:2017年2月6日 - 来自[产业要闻]栏目

中科院青岛能源所发明简易高效单细胞分选与测序对接技术

 

本报讯 最近,中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心马波、徐健共同主持完成的一项成果,通过设计简易高效的单细胞分选与测序对接装置,实现了每个试管有且只有一个细胞,有望服务于“现场”“实时”乃至“便携式”的单细胞分选与测序。相关论文发表于《科学报告》。

尽管第三代测序技术已实现仪器微型化,但与测序对接的单细胞精准分选装备却仍然相当笨重和昂贵,难以支撑各种科学考察中针对微生物组功能的现场分析。与人体和高等动植物细胞相比,微生物细胞通常更小(0.1~10 微米),更加难于精准操纵,因此分离获取目标单细胞并且实现测序反应要求的“每个试管有且只有一个细胞”是一个关键难点。

对此,单细胞中心张强和王婷婷等发明了一种名为“FOCOT”的方法,能精确、高速、低成本地分离、获取与分装单个微生物细胞,从而与单细胞测序直接对接。该方法具体为:首先,通过微流控技术,将细胞分散包裹在数十微米直径的油包水微液滴中;其次,基于液滴显微光学成像识别技术分选出单细胞包裹液滴;最后,将单细胞包裹液滴顺序分布于系列试管中,从而快速实现单个细胞的分离以及每个试管有且只有一个细胞,以实现与单细胞全基因组扩增与测序的直接对接。

FOCOT平台主要有三个特色:简易方便;分选高效;在污染控制方面,能方便地实现超洁净环境空间控制、芯片消毒等操作,严格控制环境DNA的污染。(晋楠)

《中国科学报》 (2017-02-06 第4版 综合)

日期:2017年2月6日 - 来自[产业要闻]栏目
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青岛能源所单细胞拉曼流式分选技术研究获进展


(A)基于阵列介电单细胞捕获/释放单细胞拉曼分选示意图;(B)基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Cover Article)。

日前,中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心在基于微流控的单细胞拉曼流式分选技术研究中取得新进展,相关成果于2月5日在线发表在Analytical Chemistry (Zhang PR, et al, Anal Chem, 2015)。

单细胞拉曼分选(RACS)是一种极具潜力的活体细胞功能分选技术。与目前通用的荧光激活细胞分选(FACS)相比,RACS具有直接基于细胞功能分选、无需标记、不需预知生物标识物的关键优势,因此在海洋资源挖掘、生物能源种质筛选、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等诸多领域具有广阔应用前景。但由于细胞固有拉曼信号弱所导致的细胞分选通量低这一问题限制了其应用与推广。开发高速流动细胞拉曼信号的快速采集和识别已经成为发展高通量拉曼流式细胞分选的关键技术挑战之一。

由研究员徐健和马波领导的研究团队针对上述瓶颈开发了一种基于阵列介电单细胞捕获/释放的快速拉曼识别技术。通过对高速流动单细胞的介电操控,实现了单细胞流在电极上的捕获/释放,并在细胞捕获期间(毫秒-秒)完成拉曼信号的采集识别(下图A)。通过耦合该团队同期建立的基于电磁阀吸吮的微流控细胞分离技术(Zhang Q, et al., Lab on a Chip 2014, Cover page, 2014 HOT Articles;下图B),实现了产色素工程酵母和普通酵母细胞的拉曼流式分选。前述工作首次建立起基于介电单细胞捕获/释放的单细胞拉曼流式分选原理和装置,为下一步发展高通量拉曼流式细胞分选仪器奠定了原理和关键技术基础。

单细胞中心前期建立的单细胞弹射分选方法(Wang Y, et al, Anal Chem, 2013)适用于贴壁生长的细胞、微生物生物膜等固相细胞的分选。而该研究开发的单细胞流式分选方法针对于流动相细胞的分选。这两种方法学的建立和相互结合,为研制广谱性适用于自然界各种细胞存在状态的单细胞拉曼分选装备提供了可行性。

该研究得到了科技部创新方法专项、国家自然科学基金面上项目、微进化重大研究计划及中科院重点部署方向项目等的支持。

日期:2015年2月10日 - 来自[生物能源]栏目

Nature子刊发布新型单细胞分选系统

科学家们开发了一种与电子芯片类似的新装置,可以对大量活细胞进行快速的单细胞分选、储存和回收。该系统与随机存储芯片非常类似,只不过在其中移动的是细胞。这一成果于五月十四日发表在Nature Communications杂志上。

美国Duke大学和韩国Daegu Gyeongbuk科学技术院(DGIST)的研究人员指出,这种装置能够快速有效的分离和控制单个细胞,将不同的细胞分开储存,随后人们可以以回收目的细胞进行进一步的分析。研究人员希望这种细胞分选系统能够为相关领域带来彻底的改变。

“大多数细胞实验是在群体中分析基因活性,并没有关注细胞之间的个体差异,”Duke大学的副教授Benjamin Yellen说。“这就如同拿房间里所有人的眼睛颜色进行平均,然后得出眼睛平均为灰色,但实际上可能房间里根本就没有人是灰眼睛。因此,理解和重视细胞群体中的个体差异是很有必要的。”

Yellen和DGIST的Cheol Gi Kim将薄薄的电磁元件印在玻片上,构建出磁性轨道和类似开关、晶体管和二极管的结构。这种装置可以引导磁珠和标记有磁性纳米颗粒的单个细胞在其中流动。

据介绍,装置上有着一系列微小的传送带,局部旋转磁场可以使磁珠和细胞沿轨道朝特定的方向移动,而内置开关可以引导它们进入特定的存储位点。这就像是一个控制着微小磁性目标的集成电路。

“筛选表现出罕见行为的细胞,有点像是大海捞针,这时我们需要用特殊设备对成千上万的细胞进行控制”Yellen说。在这一新技术的基础上,人们可以给细胞标记上磁性颗粒,引导它们到达不同的小室,进而实现单细胞分离、分选、储存和回收。

以HIV和癌症研究为例,这两种疾病中的大多数患病细胞是活跃的,能够被药物定向攻击。然而还有少数细胞一直保持休眠状态,这些细胞可以规避药物的破坏作用,并在一段时间之后重新活化导致疾病复发。

研究人员指出,他们开发的新装置可以对大量细胞进行单细胞分选,帮助人们找出那些休眠的细胞,并快速将其回收用于基因活性分析。“也许这能帮助人们找到靶标休眠细胞的方法,”Yellen说。

Kim补充道,“这项研究为人们提供了新的工具,可以帮助人们在单细胞水平上进一步理解癌转移和癌细胞的应答机制,测试基因递送的效果,分析代谢物的转运情况。”

现在,研究人员正计划扩展这种分选系统,增加其上的小室数量。“这个技术的理念非常简单,”Kim说。“由于整个系统很类似电子芯片,应该很容易走向商业化。”

日期:2014年5月16日 - 来自[技术要闻]栏目
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青岛能源所首台“活体单细胞拉曼分选仪”样机通过验收


日前,受科技部条财司委托,中国21世纪议程管理中心在北京组织专家对中国科学院青岛生物能源与过程研究所功能基因组团队与北京惟馨雨生物科技公司联合承担的科技部创新方法工作专项“拉曼光钳筛选新方法在活体单细胞高通量分离中的应用”项目进行验收,标志着研究所基于自主技术开发的首台“活体单细胞拉曼分选仪”通过科技部验收。

验收专家听取了项目组的工作总结汇报、审查了验收材料,认为项目组基于自主开发的“活体单细胞拉曼分选仪”开展的各项工作完全符合任务书下达的全部考核指标,一致同意项目通过验收。

在项目实施过程中,项目组成功研制开发了“活体单细胞拉曼分选仪”(“Raman-Activated Cell Sorter”,简称RACS),并在中科院青岛能源所成功搭建了首台样机。该样机(编号RACS-1)由激光器、拉曼光谱仪、落射荧光显微镜、细胞分选系统以及自动控制系统组成,是目前已公开文献报道的首台基于细胞拉曼指纹图谱的细胞手动和自动分选仪器。目前,RACS-1已可实现的功能包括:单细胞拉曼图谱快速采集,并首次将单细胞的拉曼信号采集时间缩短到1-100ms;基于拉曼图谱的细胞种类及生长状态快速鉴别;拉曼-落射荧光不可培养功能微生物鉴定;拉曼光钳单细胞操纵;基于拉曼信号的单细胞计数;单细胞拉曼数据库系统;拉曼激活单细胞分选等。

与现有的基于细胞荧光信号的荧光流式细胞分选仪(“Fluorescence-Activated Cell Sorter”,简称 FACS)原理和方法均不同,RACS是基于对单个细胞的拉曼化学指纹图谱(细胞生化信息)的获取并与参照细胞拉曼数据库比对,从而原位、不依赖于培养、高通量地分选具有特定(或指定)生化状态的单细胞。与FACS相比,RACS的核心优势在于:对细胞生化信息及其变化敏感、不需预知生物标识物、不需标记细胞、原位和非侵害性的活体检测等。因此,RACS可有效克服“细胞功能异质性”、“尚不可培养微生物”、“探测未知的细胞表型”等三个共性科学与技术瓶颈。

此外,项目组利用RACS-1在光合产油微藻生理状态识别、多环芳烃降解微生物分离等方面研究取得了初步示范成果,并建立起应用示范技术参照方法和数据分析流程,为未来对细胞表型鉴定及功能微生物筛选奠定了基础。

目前该仪器已服务于国内外多个科研团队在海洋资源挖掘、生物燃料和生物材料、生物能源种质筛选、食品微生物检测、药物研究、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等领域开展创新性研究。

日期:2013年5月31日 - 来自[生物能源]栏目

细胞内小RNA的分选机制

近日,美国冷泉港实验室(CSHL)的研究人员确定了一套层次分明的标准,可以解释细胞机器如何对参与基因调控的小RNA分子前体进行分选。这项研究报告发表在《Molecular  Cell》杂志上。
CSHL的Benjamin  Czech提出一个疑问:双链RNA是否可通过不同途径进入RNAi通路?RNAi即RNA干扰,是由双链RNA介导的,由特定酶参与的特异性基因沉默现象,在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi现象在生物体内普遍存在。
长的双链RNA分子被Dicer酶剪切成小的双链RNA分子,随后,研究人员发现了一个可控制RNAi通路的规则,即双链RNA分子被分选到Argonautes蛋白上,该蛋白是RISC复合体(the  RNA-Induced  Silencing  Complex)的核心部分。
研究人员利用模式生物发现,当RNA双链中只有一条链被选择时,将可决定小片段RNA的下一步走向,如调控基因、或是保护细胞免于病毒的入侵。

日期:2010年1月8日 - 来自[RNA研究]栏目
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流式细胞术

  流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中,包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴,形成包含单个细胞的液滴,在激光束的照射下,这些细胞发出散射光和荧光,经探测器检测,转换为电信号,送入计算机处理,输出统计结果,并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群,分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液,所用仪器称为流式细胞计(flowcytometer)。

用流式细胞计分选细胞

日期:2007年9月25日 - 来自[细胞学技术]栏目
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