主题：异黄酮

　来源：中国色谱技术网

　　摘要：采用高效液相色谱法对葛属植物野葛和粉葛块根的主要药用成分异黄酮化合物的指纹图谱进行了研究。结果表明，以乙腈-0.5%乙酸为流动相，采用梯度洗脱的方法，葛根异黄酮化合物的各种组分可得到良好的分离；通过对10批次野葛药材HPLC图谱的检测，共确定了15个色谱峰作为野葛的共有指纹峰，根据中药指纹图谱技术的基本原则和方法，建立了野葛的HPLC指纹图谱；与不同产地野葛的HPLC图谱的比较，供试样品的指纹图谱基本一致；而与粉葛样品的HPLC图谱存在较大的差异；表明得到的色谱图可以作为野葛药材专属性的指纹图谱，为葛根的药材鉴别和质量控制提供了实验依据。

　　关键词：葛根；异黄酮；指纹图谱；高效液相色谱

　　葛属植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi.]和粉葛（P.thomsoniiBenth.）广泛分布于亚洲东南部、马来西亚、印度尼西亚和美洲大陆等湿润热带和亚热带地区，它的块根常作药用，其主要生物活性成分为葛根素（puerarin）、大豆甙（daidzin）、大豆甙元（daidzein）和3'-甲氧基葛根素（3'-methoxypuerarin）等异黄酮类化合物。全世界已知的葛属植物大约有18种，我国是葛属植物的原产地之一，分布极其广泛。吴德邻等通过野外考察，对我国葛属植物腊叶标本、同工酶和染色体组进行了研究，将中国葛属植物划分为9个种和2个变种，其中7种与药用有关。顾志平等测定了不同葛属植物中异黄酮及其组分的含量，研究结果表明，不同葛属植物中药用成分异黄酮含量和组分差异显著，以野葛和粉葛为高；而有些葛属植物（如云南葛藤）则具有毒性。由于葛属植物大多具块根，外形相似，易造成葛根药材流通和利用过程中的混杂，并且不同葛属植物和不同产地葛根药材的有效成分含量差异显著；从而给用药安全和药材质量带来影响。中药提取物与化学合成药的最根本区别在于它是多种化学成分的混合体。经过长期的植物化学和药理药效研究，人们越来越认识到中药的药效不是来自任何单一的活性成分，而基本上是多种活性成分。因此，采用任何单一的活性成份或指标成份都难以准确地评判中药的真伪和优劣，这给传统的中药质量评价方法即采用单一的化学成分定性和定量的有效性和专属性提出了质疑。采用色谱指纹图谱技术（在固定的实验条件和实验方法下，得到同种药材不同批次样品的色谱图谱，经对比分析，得到能够确定该药材的共有峰的图谱信息，作为同种药材之共性以鉴别药材的品质），有望显著改善中药质量的可控性，提高中药产品的现代化内涵和生产现代化程度。美国FDA草药保健品的申报资料、WHO草药评价指导原则和欧共体草药质量指南等均认可色谱指纹图谱作为中药鉴别和质量评价的重要方法。因此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）对野葛、粉葛块根中异黄酮指纹图谱进行了研究，为葛根的药材鉴别和质量控制提供实验依据。

　　1、材料与方法

　　1.1材料

　　供试野葛药材分别取自安徽舒城、九华山、金寨、歙县和陕西关中，粉葛药材取自安徽泾县。

　　1.2方法

　　1.2.1仪器与试剂Waters600型高效液相色谱仪，7725i进样阀，SGE25μL微量进样针（Australia），2847双波长紫外检测器，Millinum32软件，T6328B型万分之一电子天平（上海）。乙腈和乙酸为色谱纯（TEDIA公司），葛根素购于中国药品生物制品检定所，大豆甙、大豆甙元和3'-甲氧基葛根素为供定性分析用的化学对照品；水为去离子石英双重蒸馏0.45μm膜过滤水，其他试剂为国产分析纯。

　　1.2.2色谱条件色谱柱HypersilODS250mm×4.6mmC18柱，吸附剂颗粒直径5μm，柱温（25±1）℃；流动相为乙腈（A相）和0.5%乙酸（B相），梯度洗脱，0.40minA相0%～30%，B相100%～70%，40～60minA相30%～40%，B相70%～60%，流速1mL/min；检测波长为250nm，检测时间为20min，进样量10μL。

　　1.2.3供试样品溶液的制备分别取适量采集的野葛和粉葛材料，清水洗净，切片，60℃烘干，粉碎备用。测试前将样品60℃再烘至恒重，精密称取野葛样品粉末0.1g，粉葛样品0.2g，精确加入体积分数70%乙醇20mL，超声处理60min，自然冷却，加体积分数70%乙醇补足损失的质量，静置浸提48h；取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，再用超纯水将滤液稀释10倍，即得供试样品溶液。不立即分析的样品溶液可暂时放于4℃冰箱保存。

　　1.2.4对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品25mg，加甲醇定容至25mL，配制成质量浓度为1mg/mL的贮备母液。精密移取贮备母液2mL置10mL容量瓶中，超纯水定容至10mL，摇匀，即得葛根素质量浓度为0.2mg/mL的对照品溶液。以同法配制大豆甙、大豆甙元和3'!甲氧基葛根素对照品溶液。

　　1.2.5检测方法取对照品溶液、野葛和粉葛供试样品溶液各10μL进样分析，记录60min的色谱图；采用Millinum32软件分析，获取谱图中各峰的保留时间和峰面积数值。以葛根素对照品的色谱峰来确定供试样品溶液中的葛根素的色谱峰（S峰），以供试样品S峰的保留时间为1计算各峰相对保留时间，以供试样品S峰面积为1计算各峰面积的比值。

　　2、结果与分析

　　2.1检测方法的检验

　　2.1.1精密度试验取同一供试样品溶液，分别连续进样5次，检测供试样品溶液的指纹图谱。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰峰面积的比值的相对标准偏差RSD（%）分别为0.00%～0.17%和0.00%～4.59%，符合指纹图谱的要求。

　　2.1.2稳定性试验取同一供试样品粉末，按供试样品溶液制备方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，16h检测指纹图。结果显示，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰峰面积的比值没有明显的变化。因此，低温保存下的葛根制备样品溶液稳定性较好。

　　2.1.3重现性试验取同一批号的供试样品粉末5份，按照供试品溶液的制备和检测方法制备样品溶液并进行检测。结果表明，各色谱峰相对保留时间的RSD（%）分别为0.00%～0.29%，各共有峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于10%总峰面积的色谱峰面积的比值基本一致，符合指纹图谱的要求。

　　2.2指纹图谱及技术参数

　　2.2.1指纹图谱及共有指纹峰的标定按照对照品和供试品溶液的制备和检测方法制备样品溶液，并对4种对照品和10批次野葛药材供试品的HPLC图谱进行了检测。结果表明，1，2，3，S，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14峰在10批次样品的色谱图中均出现；以葛根素对照品保留时间为参照，计算各共有指纹峰的相对保留时间；相对保留时间的RSD（%）为0.00%～0.16%（n=10）之间；其指纹峰面积之和占总峰面积比值均大于90%，因此标定此15个峰为共有指纹峰，并据此建立了野葛的HPLC指纹图谱。

　　2.2.2共有指纹峰面积与葛根素对照品峰面积的比值以葛根素对照品峰面积为参照，计算10批次药材供试品各共有指纹峰的峰面积比值及其差值；由表可见，各批次供试品指纹图谱的重现性较好，各共有指纹峰的面积比值相对固定，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）。

　　2.2.3非共有峰面积供试的10批次样品共有指纹峰面积之和占总峰面积比值平均为97.11%，则非共有峰面积占总峰面积的比值平均为2.89%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）。

　　2.3指纹图谱的检验

　　2.3.1不同产地野葛药材HPLC图谱的比较取5个不同产地野葛药材，按供试品及其溶液的制备法制备供试样品溶液并按供试品检测法进行检测，结果显示，野葛HPLC指纹图谱中标定的各指纹峰在不同产地野葛药材供试品HPLC图谱中均有良好的重现性。

　　2.3.2野葛与粉葛HPLC图谱的比较取野葛和粉葛药材，按供试品及其溶液的制备法制备供试样品溶液并按供试品检测法进行检测，结果表明，野葛和粉葛供试样品异黄酮化合物的HPLC图谱有较大的相似性，但粉葛缺少野葛5，9和12共3个指纹峰；同时，粉葛样品共有指纹峰的峰面积百分比与野葛样品相对应的色谱指纹峰的峰面积百分比有较大的差异。这表明得到的野葛HPLC色谱图可以作为野葛药材专属性的指纹图谱。

　　3、讨论

　　采用HPLC技术对葛根药材中异黄酮化合物进行了检测，通过10批次野葛药材样品的色谱峰保留时间和峰面积百分比的比较和分析，对共有指纹峰进行了标定，并据此成功建立了野葛药材的HPLC指纹图谱。经与不同产地野葛样品和粉葛样品的HPLC图谱的比较，结果表明，实验获得的色谱指纹图谱在不同产地野葛样品中具有极大的相似性，并能据此与粉葛品种进行有效的区分；从而可以有效反映野葛药材成分特征的唯一性和同一物种个体间的相似性，可以作为野葛药材专属性的指纹图谱。全世界葛属植物大约有18种，而本实验仅选取了其中的2种（即野葛和粉葛）。以指纹图谱作为葛根的药材鉴别和质量评价的方法和依据，尚需结合其他葛属植物尤其是我国特有种的异黄酮组分检测及其指纹图谱分析，比较不同葛属植物间异黄酮组分指纹图谱的差异，并找出各自专属性的指纹图谱，提供更加全面、准确和典型的图谱信息；从而建立起符合现代化、国际化规范的葛根药材质量与安全性控制标准。

　　中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室药物化学成分研究组从红三叶中简便、高效提取异黄酮技术近日获得国家发明专利授权。据介绍，这为开发以异黄酮为有效成分的保健食品和医药品奠定了重要的技术基础。

【摘要】  目的 探讨大豆异黄酮的体外抗肿瘤作用。方法 MTT比色法测定大豆异黄酮对肿瘤细胞增殖反应的影响；观察SI对肿瘤细胞分裂和细胞凋亡的作用。结果 SI能明显抑制MCF-7细胞的体外增殖，即在较低浓度下即可抑制离体培养的MCF-7细胞的增殖能力，该作用呈明显的浓度依赖性（P<0.05），且具有一定的饱和性；SI的IC50为32.0μmol/L。96h时不同浓度SI作用于MCF-7细胞后均可最大抑制该细胞的分裂。结论 SI具有明显的体外抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制仍有待进一步深入探讨。

【关键词】  大豆异黄酮 体外 抗肿瘤

　Studies on anti-tumor effect of soybean isoflavone in vitro

    CHEN Jian, JIANG Sai-ping .The First Hospital Affiliated to Zhejiang University，Hangzhou 310003, China

    【Abstract】  Objective  To discuss the anti-tumor effect of soybean isoflavone （SI） in vitro. Methods  The effect of SI on proliferation of tumor cells was determined with MTT method, and the effects of SI on mitosis and apoptosis were observed. Results  SI could obviously inhibit the proliferation of MCF-7 cells even at a low concentration in vitro, and the effect depended on the concentration of SI （P<0.05）, but had a saturation character.The IC50 of SI was 32.0 μmol/L. Different concentration of SI added to MCF-7 cells could all largely inhibit mitosis of cells.Conclusion  SI has significant anti-tumor effect in vitro, and its mechanism need to be further explored.

    【Key words】  soybean isoflavone; in vitro; anti-tumor

    大豆异黄酮（soybean isoflavone，SI）是豆科植物大豆（Glycine maxL. Merr）的成熟种子［1］，是大豆生长过程中形成的一种次生代谢产物，也是一类重要的非营养素成分。它约占大豆干重的0.3%～1.4%，包括金雀异黄素（genistein，GEN）、大豆甙元（daidzein）及大豆黄素（glycitein）。其中，糖甙结合形式占SI的90%～95%，在体内经胃酸酸解或肠道细菌葡萄糖甙酶分解糖基部分，释放成游离形式发挥生物效应。大豆异黄酮具有广泛的生物效应，具有降低血脂、抗动脉粥样硬化、改善妇女更年期综合征、防止鼻出血、抗炎、改善骨质疏松等功效。近年来多项研究还发现，大豆异黄酮具有抗肿瘤作用，尤其对人类乳腺癌细胞株及前列腺癌细胞株均具有明显的体外抑制作用［2］。本文对从大豆中分离得到的大豆异黄酮的体外抗肿瘤活性及其对癌细胞增殖抑制作用进行了考察研究。

　　1  材料与方法

    1.1  试剂  RPMI1640、胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（1auryl sulfate sodium，SDS）购自Gibco公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）购自Sigma公司；酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司；大豆异黄酮购自Sigma公司，其中金雀异黄素（GEN）含量>98%。实验前用DMSO溶解配成母液（20mmo1/L），并用RPMI1640完全培养基稀释成系列浓度。

    1.2  细胞培养  雌激素敏感的人乳腺癌细胞株MCF-7细胞由上海细胞生物所提供。以含10％新生牛血清的RPMI 1640（含青霉素100g/ml和链霉素100g/ml）为培养基，在37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，隔日换液，待细胞进入对数生长期后，弃去上清液，磷酸盐缓冲液冲洗2遍，以0.25％的胰蛋白酶消化（悬浮生长的细胞直接收集），再用磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.4）冲洗2遍。最后用RPMI 1640完全培养基将之稀释至浓度为5×104个/ml的细胞悬液备用。

    1.3  SI对肿瘤细胞的体外抑制考察  将培养健康的MCF-7细胞株悬液接种于96孔培养板（美国Costar公司），每孔100μl（含1×104个细胞）。细胞接种24h后加入不同浓度的受试物（每组分别加入终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmo1/L、40μmo1/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），每组5个平行孔，将96孔板移入37℃、5%CO2孵箱培养。72h后用MTT比色法测各孔光密度值。于培养结束前4h各培养孔加入四氮唑蓝（MTT）10μl，培养结束后，离心弃去上清，每孔加入15％ SDS 100μl，过夜。次日用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度（OD）值（测定波长=490nm，参考波长=570nm），计算细胞抑制率。计算公式为：细胞抑制率（％）=（对照组OD值－实验组OD值）/（对照组OD值）×100％。以细胞抑制率对SI剂量作图，绘制剂量效应曲线，并用作图法求出IC50。

    1.4  SI对肿瘤细胞有丝分裂影响的考察  将处于对数生长期的细胞常规消化，以5×104个/ml的密度接种于事先放有小盖玻片的24孔培养板内，同时加入各受试物（每组分别加入终浓度10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），各组设5个平行孔。将24孔板移入37℃、5%CO2孵箱内培养1～5天，每隔24h取5孔，甲醇5ml固定10min，姬姆萨应用液（Giemsa）染色5min，流水冲洗，晾干后封片镜检，各取细胞数多、中、少三个区域观察，每片计数1000个细胞中的分裂相细胞，并计算分裂指数平均值。

    1.5  SI对肿瘤细胞凋亡影响的考察  将处于对数生长期细胞常规消化，以5×104个/ml的密度接种于事先放有盖玻片的24孔培养板内，同时加入各受试物（每组分别加入终浓度10μmo1/L、30μmol/L、100μmol/L的SI溶液），同时设空白对照（培养基）及溶剂对照（2.5%DMSO），各组设5个平行孔。将24孔板移入37℃、5%CO2孵箱内培养48h及96h后，用磷酸盐缓冲液浸洗两次，甲醇5ml固定10 min，弃去固定液，用姬姆萨应用液染色10min。流水缓慢冲去染液，空气干燥，二甲苯透明，树胶封固，光镜下观察细胞形态。光镜下每片计数1000个细胞中的凋亡小体表达细胞数，按下式计算凋亡指数（AI）：AI（‰）=（凋亡细胞数）/（计数细胞数）×1000。

    1.6  统计学分析  数据用均数±标准差（〖x〗±s）表示，两组间用t检验，多组间数据用单因素方差分析。

　　2  结果

    2.1  SI对肿瘤细胞MCF-7的体外抑制  SI对MCF-7细胞增殖影响的量效关系见图1。由图1可见，SI对MCF-7具有明显的抑制作用。随着SI浓度的提高，体外抑制率也随之提高，但提高趋势逐渐缓慢，说明SI对MCF-7细胞的抑制作用有浓度依赖性（rs=0.983，P=0.001），且具有一定的饱和性。从图1可知SI的IC50约为32.0μmol/L。

　　2.2  SI对MCF-7细胞有丝分裂的影响  不同浓度SI对MCF-7细胞有丝分裂的影响情况见图2。由图2可见，MCF细胞有丝分裂指数随着时间的延长而提高，在96h处达到高峰，之后呈下降趋势。并且随着SI浓度提高，MCF-7细胞有丝分裂指数降低，说明高、中、低三个浓度的SI作用于MCF-7细胞后，对该细胞的有丝分裂具有明显的抑制作用，且具有浓度依赖性，SI浓度越高，抑制细胞有丝分裂作用越强。

    2.3  SI对MCF-7细胞凋亡的影响  光镜下观察经SI处理的MCF-7细胞，可见明显的凋亡形态改变：细胞皱缩，染色质聚集，并沿核周呈块状分布，细胞周围可见多个完整膜包裹的凋亡小体。相同处理时间内凋亡指数随SI浓度的增加而增加（rs=0.972，P=0.001），但是在不同处理时间内（即分别处理48h及96h后），相同剂量组凋亡指数并无明显增加（P>0.05），结果见图3。 图2  不同浓度SI对MCF-7细胞有丝分裂指数的影响

　　3  讨论

　　目前，食物中非营养素成分的抗肿瘤作用研究越来越受到重视，其中大豆异黄酮防治肿瘤作用备受关注。大豆异黄酮是大豆中重要的非营养素成分，近年来研究显示其具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管和防治骨质疏松等作用。1990年6月美国国家癌症研究院组织全美著名学者研讨了大豆的抗癌防癌效果，肯定大豆异黄酮是最佳的天然物质。通过流行病学调查表明，乳腺癌在经常食用大豆的日本发病率是美国的1/4，妇女更年期综合征的发病率为美国的1/3［3］。所以对大豆异黄酮的抗肿瘤作用研究有很实际的意义。本研究采用人乳腺癌细胞MCF-7进行，结果表明，SI能明显抑制MCF-7细胞的体外增殖，即使在较低浓度下亦可明显抑制离体培养的MCF-7细胞的增殖。该作用具有明显的浓度依赖性（P<0.05），且具有一定的饱和性。SI的IC50约为32.0 μmol/L。细胞有丝分裂指数实验也更直观地反映出该抑制作用，高、中、低三个浓度的SI作用于MCF-7细胞后均可抑制该细胞的有丝分裂，96h达峰值。浓度越高，有丝分裂指数越低，同样具有浓度依赖性。不同浓度SI对MCF-7细胞凋亡指数影响表现在随着SI浓度的提高，细胞的凋亡指数越高，但是在不同处理时间内（即分别处理48h及96h后），相同剂量组凋亡指数并无明显改变（P>0.05），其中的具体机制还有待进一步分析考察。虽然大多数文献报道SI具有明显的抗肿瘤特性，然而却有少量文献报道［4］，SI有时具有促进肿瘤增殖的作用。所以SI的抗肿瘤机制和特性仍有待进一步深入考察研究，进而研制开发出有针对性的异黄酮类抗肿瘤药物。

【参考文献】
  1 李琳，钱忠明.大豆异黄酮的药理学作用和保健功能的研究进展.中国药学杂志，2002，37（10）：724-726.

2 This P，Rochefordiere A，Clough K，et al.Phytestrogens after breast cancer. Cancer，2001，8（18）：129-134.

3 Hom Ross PL，John EM，Lee M，et al.Phytoestrogen consumption and breast cancer risk in a multiethnic population：the Bay Area Breast Cancer Study. Am J Epidemiol，2001，154（5）：434.

4 Wietrzyk J，Mazurkiewicz M，Madej J，et al．Genistein alone or combined with cyclophosphamide may stimulate 16/C transplantable mouse mammary cancer growth. Med Sci Monit Br，2004，10（11）：414.

作者单位：310003 浙江杭州，浙江大学附属第一医院

　　怀孕是女性一生中相当独特的经历，因此育龄女性的健康管理相当重要。在准备怀孕前最好能确认自己的健康状况，包括接受妇科检查，确认是否有疾病或受到感染，并把握激素的分泌状态，以便顺利怀孕，孕育出健康的宝宝。 
 
 
　　当然“女性激素”也像世界上所有的事物一样，都像把双刃剑，有利也有弊，它也与妇科癌症子宫肌瘤等女性疾病有关。虽然食用雌激素的健康食品，通常没有太大的问题，不过最好还是先征询妇科医生的意见。

　　大豆异黄酮

　　市面上调节“女性激素”的健康食品的成分多是植物性雌激素（Phytoestrogen），指的是大豆里的异黄酮（lsoflavone）或亚麻子中的木酚素（Lignans）。

　　异黄酮富含于发芽大豆的胚芽里，是植物性多酚的一种，在化学结构上跟“女性激素”十分相似，在体内也具有“女性激素”的效果，但是效能只有“女性激素”的千分之一到万分之一。因此，它也可调节女性生理结构，女性体型与美化肌肤，抑制骨骼内钙的流失，防止动脉硬化及高胆固醇血症。

　　注意 当“女性激素”过多时，异黄酮会争夺“女性激素”的受体，而抑制“女性激素”的作用。

　　适合人群

　　1.更年期障碍女性：医师通常会建议有更年期障碍的女性服用大豆异黄酮来减轻更年期症状。

　　2.孕前、孕后的女性：可以利用异黄酮来帮助调节女性生理。

　　3.减肥过度的女性：会造成“女性激素”的不足，可以多补充大豆异黄酮。

　　4.预防骨质疏松症：有研究指出若要预防骨质疏松症，应该在进入更年期前积极摄取大豆等相关食物。

　　选购异黄酮产品

　　重点1.剂量

　　异黄酮每天的建议摄取量为40毫克。很多产品会配合女性特有的各种症状，添加不同成分，因此异黄酮的含量比例也有所不同，购买前必须仔细确认。

　　重点2.原料

　　黑豆（黑大豆，扁豆）是有黑色种皮的大豆，与黄豆在分类学上同归豆科的大豆属。

　　重点3.可利用性

　　从大豆中萃取出来的异黄酮，通常是含有醣基的配醣体，这种异黄酮的分子量大，而且亲水性较强，在小肠中的吸收率比较低（只有13%～25%）。如果经过酶转换去除醣基，人体吸收率可提高至80%～95%，因此最好选择去醣基的大豆异黄酮。

　　r-次亚麻油酸：制造前列腺素

　　r-次亚麻油酸（Di-homo-r-linolenic acid）的功能虽然与”女性激素”不同，但它是制造前列腺素的原料。

　　易有经前症候群

　　当前列腺素缺乏时，会出现激素失调及子宫内膜无法正常运作等症状，如经前会感到焦虚不安、头痛等不舒服症状的经前症候群，就是前列腺素缺乏所引起的，给予r-次亚麻油酸后多能明显缓解症状。

　　月见草种子

　　市售的r-次亚麻油酸多是从月见草的种子中萃取的，因为r-次亚麻油酸在天然植物中含量很少，但是在月见草种子的脂肪酸中占7.5%的含量。

　　维生素E 3大功能

　　【帮助代谢】维生素E对于“女性激素”的代谢也很重要，它参与固醇类激素的代谢，包括男性及“女性激素”。

　　【减轻更年期症状】有临床研究发现，更年期体内维生素E的浓度也会降低，而补充维生素E能够减轻更年期症状。

　　【不孕症治疗】维生素E对于不孕症的治疗也有帮助，因为它能帮助胎盘产生一种助孕蛋白质，治疗不孕症时与促排卵药共同食用，更能够提高受孕几率。

　　小叮咛：市面上的维生素E有天然萃取的，也有合成的。最好选择天然的维生素E，人体吸收利用率较好。

　　药膳：轻松补充女性激素

　　中药里能够补充激素的药物，多属于补肾药与补血药。一般中医师用来治疗不孕症及更年期障碍的药物，在临床上都有调节女性生殖生理的功能。

　　1. 肉苁蓉、补骨脂、淫羊藿：常常用来治疗不孕症。

　　2. 莬丝子、杜仲：具有补肾安胎的效果。

　　3．阿胶、山药、益母草：可以调经。

　　4.　地黄、山药：多用于治疗更年期障碍。以下提供4道简单的药膳，可让孕前、孕后女性补充“女性激素”。

　　1.菟丝子炖排骨

　　材料：菟丝子9克、枸杞子9克，准山药15克，排骨250克。

　　做法：菟丝子因为药材细小，最好请药店以纱布包好，连同枸杞子、山药及氽烫过的排骨一起放入炖锅中，水淹过所有材料，大火滚后转小火，炖煮40分钟，以盐调味后即可食用。

　　2.羊肉补血汤

　　材料：杜仲15克，当归9克、熟地9克，羊肉250克，葱、姜、盐适量即可。

　　做法：羊肉洗净切小块与药材、葱、姜放入锅中，加水淹过所有材料，大火煮滚，转小火炖煮至羊肉软烂，加盐调味即可。

　　3.山药苹果牛奶

　　材料：生山药、苹果、牛奶、蜂蜜、冰块适量。

　　做法：将所有材料放入果汁机内，搅打均匀后倒出，即可饮用。

　　4.益母草炖瘦肉

　　材料：益母草12克，瘦肉200克，红枣5颗，盐适量。

　　做法：瘦肉洗净切块，加入益母草、红枣，加水淹过所有材料，大火煮滚，转小火 炖煮60分钟，加盐调味即可食用。

【摘要】  目的 对大豆异黄酮片的处方组成和质量标准进行了研究。方法 采用正交试验方法优选制剂处方，采用HPLC方法对大豆异黄酮片的主要功效成分大豆苷元和染料木素进行了定量测定。结果 优选后的制剂处方为每千克大豆异黄酮片中，乳糖的用量为200g，10％淀粉浆的用量为20 ml，十二烷基硫酸钠的用量为12 g，硬脂酸镁的用量为10 g，HPLC方法可准确测定大豆异黄酮片中大豆苷元和染料木素的含量。结论 本研究建立的大豆异黄酮片制备方法操作方便，稳定可靠，质量稳定，可控性强。

【关键词】  大豆异黄酮片 处方筛选 质量标准 高效液相色谱 溶出度

    Study on prescription and quality standard of soybean isoflavones tablets

    SHANG Hong，LING Jing-hua，YU Sheng-li.Tianjiao Pharmaceutical Limited Company，Tianjin 300163，China

    ［Abstract］  Objective  To study the prescription and quality standard of soybean isoflavones tablets.Methods  The orthogonal experiment was used to optimize the prescription.The daidzein and genistein in soybean isoflavones tablets were detected by HPLC.Results  The optimum prescription was shown as follows：the usage of lactose was 200 g，the usage of 10% starch paste was 20 ml，the usage of sodium dodecylsulfate was 12 g,the usage of magnesium stearate was 10 g.The HPLC method is easy and precise to determine the content of daidzein and genistein in soybean isoflavones tablets.Conclusion  The preparation is practical and reasonable.It is suitable for manufacturing industry.

    ［Key words］  soybean isoflavones tablet；prescription；quality standard；HPLC；dissolution rate

    大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮的一种，同时它也是一类具有广泛营养学价值、健康保护和治疗学意义的非固醇类物质［1］。由于老年人内分泌功能衰退，性腺分泌下降，而使性激素分泌减少，造成骨骼中钙的流失。因大豆异黄酮具有雌激素样作用，能促进骨细胞蛋白质的合成和成骨细胞的增殖，抑制破骨细胞增殖，抑制骨钙丢失，促进骨的生成，从而提高骨组织钙磷的含量，增加骨密度。大豆异黄酮可增加骨细胞合成，促进蛋白质合成来促进骨细胞的骨合成［2］。因此，大豆异黄酮对骨质疏松与其他雌激素依赖症等的预防和治疗具有重要作用［3］。

    本研究以大豆异黄酮为原料，采用正交试验方法对大豆异黄酮片的处方进行了筛选，并采用HPLC方法测定了其主要活性成分大豆苷元和染料木素的含量。

    1  仪器与材料

    1.1  仪器  Dionex高效液相系统，Chlomelon色谱数据工作站；YP-1.5型台式电动连续单冲压片机，南通市华宇制药机械有限公司生产；ZRS-8G智能溶出试验仪，天津天大天发科技有限公司生产。

    1.2  材料  大豆苷元和染料木素对照品，购自sigma公司，含量大于99％；大豆异黄酮提取物，异黄酮纯度>90%，购自北京华清美恒公司；十二烷基硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司生产）；乳糖（湖州食品化工公司生产）；硬脂酸镁（上海药用辅料厂生产）。

    2   方法与结果

    2.1  大豆异黄酮片处方筛选

    2.1.1  正交试验筛选处方  在预试验基础上，以乳糖为填充剂，10%淀粉浆为黏合剂，硬脂酸镁为润滑剂，十二烷基硫酸钠为崩解剂。选定1000片中，乳糖的用量、10%淀粉浆用量、硬脂酸镁用量、十二烷基硫酸钠用量等4个因素，每个因素取3个水平，以溶出度考查指标，采用正交表L9（34）进行试验（表1），优化处方。 表1  因素水平表

    2.1.2  制备工艺  将原辅料分别过100目筛备用。称取处方量的大豆异黄酮、乳糖、十二烷基硫酸钠混合均匀。用适量黏合剂制软材，过16目尼龙筛，湿颗粒于60 ℃干燥60 min，干颗粒过14目尼龙筛，整粒后加入硬脂酸镁混合均匀．压制成直径为8 mm，片重为500 mg的片剂，硬度控制在（3.5±0.5）kg/mm2。

    2.1.3  实验结果与分析  实验结果见表2。 表2  处方筛选正交试验及结果

    最佳配方为A3B3C2D3，即每千克大豆异黄酮片中，乳糖的用量为200 g，10％淀粉浆的用量为20 ml，十二烷基硫酸钠的用量为12 g，硬脂酸镁的用量为10 g。四因素中对溶出度影响最大的是因素A，即乳糖的用量，其次是十二烷基硫酸钠的用量、硬脂酸镁的用量和淀粉浆的用量，即各因素的影响次序为A>C>D>B。

    2.2  含量测定

    2.2.1  色谱条件  色谱柱：Diamonsil TM C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：甲醇与0.1％磷酸之比为42∶58；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm。

    2.2.2  对照品溶液的制备  分别精确称取大豆苷元15 mg，染料木素20 mg，于同一容量瓶中，用无水乙醇定容至50 ml，即得对照品溶液。

    2.2.3  供试品溶液的制备  取大豆异黄酮片3片，粉碎后精密称取约0.6 g至100 ml量瓶中，加甲醇80 ml超声30 min，冷却后用甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

    2.2.4  线性关系考察  依次吸取2、4、6、8、10、12、14、16 μl大豆苷元和染料木素对照品溶液注入高效液相色谱仪，以进样量（c）为横坐标，色谱峰面积（A）为纵坐标，求得回归方程Y=43.665X-14.336，r=0.9995，结果表明，在6.0～48.0 μg/ml浓度范围内峰面积与大豆苷元浓度呈良好的线性关系；同时回归方程Y=55.378X-10.789，r=0.9996，结果表明，在8.0～64.0 μg/ml浓度范围内峰面积与染料木素浓度呈良好的线性关系。

    图1  大豆异黄酮片的HPLC图

    （A：对照品色谱图，B：大豆异黄酮片色谱图；1为大豆苷元，2为染料木素）

    2.2.5  精密度试验  取30.0 μg/ml大豆苷元对照品溶液和40.0 μg/ml染料木素对照品溶液10 μl，连续进样6次，测得大豆苷元和染料木素的峰面积RSD分别为0.86%和0.78%。

    2.2.6  稳定性试验  取同一浓度的供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h进样10 μl，测得大豆苷元和染料木素的峰面积RSD分别为1.641%和0.836%，表明供试品溶液在24 h内稳定。对照品和样品的HPLC图谱见图1。

    2.2.7  重复性试验  取同一批样品，按2.2.3项方法制得6份供试品溶液，精密量取10 μl，分别进样，测得大豆苷元和染料木素的含量RSD分别为1.03%和1.16%。

    2.2.8  回收率试验  取已知含量的样品6份，分别精密加入1.01 mg/ml的大豆苷元对照品溶液各1 ml，另取已知含量的样品6份，分别精密加入1.85 mg/ml染料木素对照品溶液各1 ml，按2.2.3项方法制得各供试品溶液，依次进样10 μl测定，计算得到大豆苷元和染料木素的回收率分别为98.3%和97.1%，RSD分别为1.45%和1.19％。

    2.2.9   成品的含量测定  分别称取不同批号的大豆异黄酮片配方颗粒约0.1 g，精密称定，按2.3.3项方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表3。表3  成品含量测定结果

    3  讨论

    优化后的大豆异黄酮片的处方为每千克大豆异黄酮片中，乳糖的用量为200 g，10％淀粉浆的用量为20 ml，十二烷基硫酸钠的用量为12 g，硬脂酸镁的用量为10 g，经放大生产，该条件可控性强，压出的片剂外表光滑，颜色均一，崩解迅速，口感较好。

    本文建立的HPLC法测定配方颗粒中大豆苷元和染料木素的含量，易于操作，重现性好，能有效控制大豆异黄酮片的质量。

    大豆苷元和染料木素是大豆异黄酮片中的主要活性成分，具有显著的预防和治疗骨质疏松作用。因此，以大豆苷元和染料木素的含量作为大豆异黄酮片的质量控制指标是合理可行的。

【参考文献】
  1 李琳，钱忠明.大豆异黄酮的药理学作用和保健功能的研究进展.中国药学杂志，2002，37（10）：724-726.

2 苗慧，赵海.大豆异黄酮的研究进展.国外医学·中医中药分册，2005，27（2）：86-90.

3 虞丹.植物雌激素—大豆异黄酮的药理作用研究概况.海峡药学，2007，19（2）：9-12.

（编辑：林剑雷）

作者单位：300163 天津，天津市天骄制药有限公司