2011年第四季度，中药注射剂银杏内酯注射液获得SFDA批准上市，引发药企及市场的极大关注。银杏叶是最古老的中生代孑遗植物银杏的干燥叶。由于发现其所含的主要成分黄酮苷能有效地清除体内有毒过氧自由基的作用；银杏内酯具有高度的专属性抗血小板活化因子（PFA）的作用而成为国际植物药研究的热点课题。最新研究发现银杏内酯中银杏内酯B的活性生理活性最强，是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂。
德国威玛舒培博士药厂于2001年将银杏叶提取物注射剂引入中国，开始了我国银杏叶类注射液的仿制和创新。目前我国银杏叶类注射剂的临床及市场情况：
表1：银杏叶类注射剂的生产及研发情况
银杏叶的化学成分十分复杂，但其中最重要的活性成分是黄酮类化合物和银杏内酯。黄酮类化合物在银杏叶提取物中的含量约占5.91%，包括单黄酮、双黄酮、黄酮苷和儿茶素类；银杏内酯包括银杏内酯A、B、C、J和白果内酯，银杏内酯属二萜类内酯。几种注射剂由于所含成分和所申报的类别不同，其临床功效也略有差异。 表2：银杏叶类注射剂所含成分及功效 根据中成药临床终端竞争格局栏目数据显示，在心血管疾病用药竞争格局中，银杏叶注射剂的市场份额最大，占16.77%，市场份额大幅领先其他中药注射剂品种。 图1：2010年心血管疾病用药中成药竞争格局
油菜素内酯是1979年发现的，是被发现的已知主要类别植物激素当中的最后一类(go.nature.com/a6BRYi)。以前，类固醇激素只在动物和真菌中被发现。在这项研究中，Zhi-Yong Wang及其同事发现，油菜素内酯负调控气孔发育，从而揭示了一种植物激素对发育与光合作用的要素进行协调、来促进最佳植物生长的一个机制。
近日国内市场研究机构西美国际发布了最新的《中国葡萄糖酸内酯市场研究与预测报告》，报告主要研究了2006-2010年葡萄糖酸内酯行业的发展趋势、生产情况出口分析、技术分析、消费领域，预测了葡萄糖酸内酯在不同领域的供需形势。
报告指出，中国是世界上重要的葡萄糖酸内酯生产国之一。2010年GDL生产产量约16，000吨，从2007年到2011年，年复合增长率约为1%.在此期间，由于全球金融危机的影响，以及生产成本有所上升，2010年产量比2009年略有下降。
目前，全国范围内，有大约10个葡萄糖酸内酯生产商。安徽省兴宙医药食品有限公司是最大的葡萄糖酸内酯生产企业，2010年该公司生产GDL约4，800吨，占全国总产量的30%.
在中国，用葡萄糖或玉米淀粉为原料的发酵法生产技术已经很成熟。同时，主要有两种不同的发酵方法，其一是钙盐法，另一种是钠盐的方法。虽然发酵方法是相对化学方法更生态环保，但仍对环境有污染。由于国内日益严格的环保政策，生产成本预计将增加。
研究表明：中国是世界上重要的GDL出口国。2010年国内GDL出口量约2，700吨。此外，2011年上半年，出口量上升到约2，100吨，比2010年上半年增长了68%.2010年，埃及，德国和韩国是中国GDL出口的前三位国家。
2010年，GDL不同的下游产业共消耗13，000多吨，如食品，药品等。食品行业消费占总消费量的93%，在食品工业中，豆腐是GDL最大的消费领域。国内食品行业的快速发展，以及人们对无害的食品添加剂的需求，GDL在国内的需求将在未来会不断增加。
西美国际研究员张超认为：随着国外经济的复苏，以及国内食品行业的快速发展，人们食品安全意识不断增强，作为一种对人体无害的食品添加剂，GDL的使用范围会变得更广，GDL的生产与需求在未来也会逐步增加。
【摘要】 目的 建立用HPLC法测定乌药中异乌药内酯含量的方法。方法 色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40℃;流速：1ml/min。结果 异乌药内酯的进样量在0.15～1.52μg(r=0.9997，n=6)的范围内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率为98.81%，RSD为1.52%。结论 该法简单、可靠，可作为控制乌药药材质量的参考标准。
【关键词】 乌药;异乌药内酯;高效液相色谱法
【Abstract】 Objective To establish a method for determination of isolinderalactone in Radix linderae by RP-HPLC.Methods The sample was separated on Kromasil C18 (250mm×4.6mm，5μm) column.The mobile phase was ethanol-acetonitrile -water (35∶25∶40,v/v) at a flow rate of 1.0 ml/min and the detection wavelength was 235 nm and the column temperature was 40 ℃.Results The calibration carves were linear in the range of 0.15～1.52μg (r=0.9997,n=6).The average recoveries of isolinderalactone were 98.81% ，RSD were 1.52%.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible and can offer referenees for the quality control of Radix linderae.
【Key words】 Radix linderae; isolinderalactone; high performance liquid chromatography
乌药为樟科植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根[1]，为常用的理气药。其现代研究多注重于生药的化学成分及药理作用的研究[2～4]，目前有关乌药含量测定的文献报道甚少[5，6]，而药材中异乌药内酯含量测定的方法目前尚无报道。为了更加有效地控制乌药药材质量，笔者首次建立了测定乌药中异乌药内酯的RP- HPLC含量测定方法，并在此基础上对不同产地的乌药药材的含量进行了比较。
1 实验材料
1.1 仪器 Agilent110高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司);分析天平DT-100(北京光学仪器厂);电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂);不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);KQ-600型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂)。
1.2 药品与试剂 异乌药内酯 [上海顺勃生物工程技术(云南)公司，供含量测定用，纯度为99.9%，200711];甲醇(色谱纯，天津市密欧化学试剂有限公司，20080129);乙腈(色谱纯，天津市密欧化学试剂开发中心，20051012);其余试剂均为分析纯，水为注射用水。乌药药材采于湖南省邵东以及安徽等地，经湖南中医药大学第一附属医院药检室鉴定为樟科植物乌药Lindera aggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根。
2 异乌药内酯的含量测定
2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18 柱(250 mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-乙腈-水(35:25:40,v/v);检测波长:235nm;柱温：40℃;流速：1ml/min。
2.2 对照品的制备 精密称定异乌药内酯对照品0.0019g,置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。(每1ml中含异乌药内酯76μg)
2.3 样品制备 取供试品，将其粉碎成细粉，取1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声15min(功率250W，频率20kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，备用。
2.4 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积，以峰面积值Y为纵坐标，以对照品的进样量X(mg)为横坐标进行线性回归，回归方程为：Y=384.6900X+4.9856，r2=0.9993。
结果表明异乌药内酯的进样量在0.15～1.52μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 精密度实验 分别精密吸取对照品溶液10μl,重复进样6次。其异乌药内酯峰面积的RSD为1.88%。
2.6 稳定性试验 取当日配制的供试品溶液，于0、1、2、4、8、24h分别进样10μl，测定样品中异乌药内酯峰面积的RSD值为2.30%。试验结果表明，供试液在24h内稳定性良好。
2.7 重复性试验 取同一批供试品，按2.3项下方法，分别制备供试液6份，每份进样10μl，测定峰面积并计算含量，异乌药内酯的平均含量为3.16mg/g，RSD值分别为1.89%。
2.8 加样回收率 称取已知含量的供试品(含12.00%的水分，异乌药内酯含量3.16mg/g)约0.5g 6份，精密称定，分别置50ml锥形瓶中，精密加入一定量的对照品，加甲醇50ml，称重，按2.3项下操作，分别制得供试液，以上述色谱条件测定含量，平均回收率为98.81%，RSD为1.52%。结果见表1。表1 异乌药内酯的加样回收率试验
2.9 样品测定 取不同产地批次(分别来源于安徽，湖南邵东市售及自采)的供试品，按“2.3”项下的操作，进行测定，结果见表2(按干燥品计算),色谱图见图1。表2 乌药供试品测定
3 讨论
通过考察不同提取溶媒、不同提取方法、不同浸泡时间及不同提取时间对异乌药内酯提取效率的影响，最终选择甲醇作为提取溶媒;同时因为超声提取效率较高，且方法简便，所以采用该法为提取方法;考察震摇10min、超声15、30、60、90min，最终确定提取时间为超声15min;考察浸泡0、1、4、8、24h，因为差异无显著性，最终确定无需浸泡。
实验先后选择了甲醇-水(45∶55)、乙腈-水(45∶55，v/v)、甲醇-乙腈-水(35∶15∶40，v/v)为流动相，从分离情况和峰形等综合分析，认为甲醇-乙腈-水(35∶15∶40，v/v)作为流动相条件时分离效果较为理想。 A B
A 乌药供试品(sample of Radix Linderae);B异乌药内酯对照品(isolindetalactone
reference substances);1 异乌药内酯(isolindetalactone)
图1 高效液相色谱图
Fig 1 HPLC chromatograma
本实验首次建立了异乌药内酯的含量测定方法，应用反相高效液相色谱法，以甲醇-乙腈-水作为流动相，可使乌药中的异乌药内酯较好的分离出来，该方法具有简单、稳定、可靠的特点。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社,2005：53.
2 谷丽华，吴纲，张紫佳，等.应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等三种中药的抗氧化活性.药学学报,2006,41(10):956-962.
3 Wang N,Minatoguchi S,Arai M,et al. Lindera strychnifolia is protective against post-ischemic myocardial dysfunction through scavenging hydroxyl radicals and opening the mitochondrial KATP channels in isolated rat hearts. Am J Chin Med,2004,32(4):587.
4 刘卫东，温中京，郭伟娣，等.乌药提取物抗疲劳作用的实验研究,浙江中医杂志，2006，41(7):428-429.
5 程显隆,魏锋,冯玉飞,等.RP-HPLC法测定乌药中乌药醚内酯和乌药内酯的含量,药物分析杂志， 2003，23(3)：225-227.
6 蔡立红,俞桂新,王峥涛,等.高效液相色谱法测定乌药中乌药醚内酯的含量,中国中药杂志，2004，29(7)：657-659.
来源：中国色谱技术网
摘要：本文根据中草药有效成分含量低、超临界稀溶液特点及溶剂提取技术原理，以银杏叶粗提物为原料，通过单因素实验的方法，探讨液固比、浸提温度、浸提时间、提取次数对超临界CO2萃取结晶银杏萜内酯前处理工艺的影响。实验结果表明：在45℃水浴条件下，以20倍银杏叶粗提物体积的混合溶剂(40％丙酮一6O％石油醚)，浸提2次，每次4h，银杏萜内酯前处理效果较佳，萜内酯浸出率在95％以上，浸出物内酯含量在16％以上。采用高效液相色谱法测定银杏内酯含量准确，重现性好。
关键词：超临界CO2：银杏内酯：萃取结晶:浸提
我国自古以来就有以银杏(ginkgobilobaL．)为药的记载。银杏中主要存在两类活性物质：萜内酯类化合物(ginkgolidesandbilobalide)和黄酮苷类化合物(flavonoidglycosides)。银杏叶中所含萜内酯主要是银杏内酯(Ginkgolide)A、B、C(简写GA、GB、GC)和白果内酯(Bilobalide，简写BB)。银杏内酯是一种血小板活化因子(PAF)的特效拮抗剂，而PAF是引起哮喘等许多疾病的重要因素，运用高纯银杏内酯可研制出治疗心脑血管病、哮喘等疾病的银杏类新药。
自60年代起，德、日、法等国家对银杏叶的提取工艺、化学成分进行了大量的研究工作。从近十几年的CA报道来看，欧、美、日等国的研究渐趋单一总提取物的提纯，如总内酯，总黄酮苷的精制纯化。为了提高萜内酯分离效率和产品纯度，作者拟采用超临界流体萃取结晶技术，对含量较高的银杏内酯进行高效分离纯化研究。由于银杏叶粗提物(GBE)中银杏内酯含量较低，直接采用超临界技术将形成超临界稀溶液，严重影响超临界流体萃取结晶技术的分离纯化质量和效率。本文报道超临界CO2萃取结晶银杏萜内酯的前处理技术，进一步完善超临界萃取结晶技术的生产工艺。
1、实验部分
1．1主要材料
银杏叶粗提物(GBE)购于江苏邳州，经HPLC分析银杏内酯含量为6.02％：银杏内酯单体标准品GA、GB、GC：购于中国药品生物制品检定所。
1-2主要设备、仪器
高效液相色谱仪：Waters公司515型HPLC；示差折光检测器：国产旋转蒸发仪。
1-3萜内酯含量的测定
HPLC色谱分析条件
色谱柱为SYMMETRY-C18柱3.9mm×150mm(Waters)，柱温30℃，流动相为甲醇-水(40—60，V／V)，流速lml／min。
标准曲线的制备
定量准确称取对照品GA、GB、GC各2mg，分别置于l0ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到三种对照品溶液(浓度为0.2mg／m1)。将浓度为0.2mg／ml的混合标准溶液以l、2、5、10、15、20μ1按所选择的色谱条件进样，进样量范围为0.2～4μg，测定进样量与峰面积之间的关系，得到GA、GB、GC、GJ、BB的线形方程及相关系数。
样品溶液的制备与测定精确取样品2～4ml于25ml小烧杯，真空干燥，用流动相溶解，置于10ml容量瓶，并定容至10ml，进量5μl，以外标法计算内酯含量。
选择上述实验结果作工艺设计参数，为建立超临界流体萃取结晶技术开发高纯度银杏萜内酯中试生产线奠定基础。
总投资达1.4亿元研发的一类新药“银杏内酯B注射液”已经完成Ⅲ期临床试验，预计今年上半年可取得新药证书正式上市。该药是广州市花城制药厂与中国人民解放军总医院、合肥工业大学共同研发拥有自主知识产权的新药。
据介绍，银杏内酯B注射液是广东省重点创新项目程。银杏是我国特有的树种，自上世纪90年代起，银杏制剂一直是人们治疗脑血管疾病的首选天然药物。银杏内酯B单体对治疗心血管疾病、脑缺血、脑老化、老年痴呆症及哮喘有独特的疗效。然而，银杏内酯B提纯不易，工业化生产更难，我国将银杏叶作为药物研发起步比国外晚了20多年。
