主题:胶体金

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ELISA法与胶体金试纸条检测HBsAg差异分析

【摘要】  目的 探究胶体金试纸条与ELISA法检测HBsAg临床应用价值。 方法 分别用胶体金试纸条与ELISA法检测360份标本中的HBsAg,并对阳性率进行比较,然后将强阳性的10份标本做倍比稀释,观察两种检测方法灵敏度的差异。 结果 两种方法的阳性率之间差异无显著性,ELISA法灵敏度较胶体金试纸条灵敏度高。 结论 两种方法皆是检测HBsAg的良好方法,胶体金试纸条法操作简便、快速,适用于急诊及健康人群的筛查,ELISA法适用于常规检测。

【关键词】  HBsAg;胶体金试纸条;酶联免疫吸附试验

An analysis of the differences between ELISA and gold dipstick on testing the HBsAg

  ZHANG Xiao-jun.The Second People’s Hospital of Taixing City, Jiangsu, 225411

  【Abstract】 Objective To explore the cost of clinical application between ELISA and gold dipstick on testing HBsAg. Methods The test was conducted with 360 samples and compared the positive rate of the samples,then diluted 10 positivest samples with the multiple proportions to show the differences about the test sensitivity.Results There was significat difference between the two methods on the positive rate. ELISA had a higher sensitivity. Conclusion The two methods of testing the HBsAg both are good. Gold dipstick is simple, easy and good for screening with the emergeny call and healthies. ELISA is good for routine examination.

  【Key words】 HBsAg; gold dipstick; ELISA

  我国是乙型肝炎的高发地区,乙肝病毒人群携带率大约为10%,乙型肝炎是目前流行最广泛、危害最严重的病毒性肝炎之一,乙肝病毒主要通过血液传播、性传播及非消化道传播。我院通过对辖区内乙肝病毒携带情况的筛查,对未感染者实施预防接种,以降低人群发病率。笔者应用胶体金试纸条对辖区内人群进行筛查,并与ELISA法进行比较,分析二者在结果上有何差异,然后将强阳性的10份标本做倍比稀释分析二者灵敏度的差异。

  1 材料与方法

  1.1 材料 胶体金试纸条为艾康生物技术(杭州)有限公司乙肝病毒表面抗原(HBsAg)胶体金法诊断试剂,酶联免疫吸附试验试剂为上海荣盛生物技术有限公司乙肝病毒表面抗原诊断试剂,所有试剂均在有效期内。

  1.2 标本来源 本院所属辖区内的各类人群共360例,分别采集末梢血与静脉血。取HBsAg强阳性样品10例,分离血清1ml,再用生理盐水做倍比稀释(原液1:1,1:2,1:4至1:512)[1]。

  1.3 方法 两种方法均严格按照试剂说明书进行操作。

  1.4 结果判断 (1)胶体金试纸条:试纸条在检测线和对照线位置出现两条紫红色线结果为阳性,仅在对照线位置出现紫红色线结果为阴性,试纸条上对照线位置未出现紫红色结果为无效。(2)ELISA法:样品A值 S/CO≥1.0者HBsAg为阳性。

  1.5 统计学处理 表1结果采用χ2 检验,表2结果采用配对t检验。

  2 结果

  2.1 人群筛查结果 见表1。从表1可看出,360例人群用ELISA法检测HBsAg,其中阳性34例,阳性率9.44%;胶体金试纸条检测HBsAg,其中阳性32例,阳性率8.89%, 两法结果经χ2检验,P>0.05,结果显示两种方法测定的HBsAg结果间差异无显著性。表1 人群筛查结果 注:两种方法检测结果比较,P>0.05

  2.2 将倍比稀释后的标本分别用ELISA法和胶体金试纸条检测HBsAg结果 见表2,两法结果经配对t检验,ELISA法与胶体金试纸条比较灵敏度差异有显著性(P<0.001)。表2 将倍比稀释后的标本分别用ELISA法和胶体金试纸条检测HBsAg结果注:两种方法检测结果比较,P<0.001

  3 讨论

  ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点,可以在酶免疫分析仪上做批量检测,是目前实验最常用的检测HBsAg的方法,但是该方法易受加样、反应温度、反应时间、洗涤彻底性等诸多因素的影响,而且操作步骤较多,整个实验过程至少需要2h左右,因此不适用于急诊及无偿献血现场筛查。胶体金试纸条法是在ELISA法基础上发展起来的一种检测技术,由于其具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点,也广泛应用于临床对HBsAg进行初筛,对急诊及无偿献血的现场的筛查有其实用价值,可避免无效采血所造成的浪费,节省了大量的人力、物力[2],目前,国产的HBsAg胶体金试纸条检测灵敏度已达到1ng/ml。但是胶体金试纸条在HBsAg检测中也有一定的欠缺。由于胶体金显色需要较高浓度的标记物,故其灵敏度会受到一定限制,在HBsAg浓度较低时易出现假阴性,因此,尽管该操作简便、快速、无需特殊设备,肉眼可以直接观察结果,但对于低滴度HBsAg感染者极易造成漏检[3],为避免假阴性的产生最好用ELISA法进行HBsAg测定,另外溶血标本尤其是大量溶血标本用胶体金试纸条检测HBsAg对检测结果有显著影响,应避免用胶体金试纸条对溶血标本进行HBsAg检测。

  ELISA法与胶体金试纸条法各自具有一定的优缺点,在临床检验工作中,应根据具体情况选择合适的方法。

【参考文献】
    1 叶应妩,王毓三,申子瑜. 全国临床检验操作规程, 第3版.南京:东南大学出版社,2006,618-621.

  2 邢培清,温涛,方建华,等.胶体金免疫层析法检测HBsAg在无偿献血中的应用研究.河南医学院研究,2003,(121):17-19.

  3 庄昕,姚宗蓓,杨兰萍,等. 胶体金免疫分析法检测HBsAg效果评估. 上海预防医学杂志,2004,(5):234.

  

日期:2011年6月29日 - 来自[2009年第8卷第12期]栏目
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胶体金免疫层析法快速检测腹泻性贝毒软海绵酸的研究

胶体金免疫层析法快速检测腹泻性贝毒软海绵酸的研究

  刘仁沿1 , 梁玉波3 1 , 陈 媛2 , 许道艳1 , 陈冰君1 , 刘永健1

  (1. 国家海洋环境监测中心,辽宁大连116023 ;

  2. 江西中德生物工程有限公司,江西南昌330029)

  摘 要:腹泻性贝毒是一类分布较广的赤潮毒素,严重威胁到人类的健康和安全。本文用胶体金标记利用细胞融合技术制备的抗软海绵酸单克隆抗体,使用卵清蛋白合成高偶联比的包被抗原,以硝酸纤维素膜为载体,利用免疫层析技术原理,建立了快速检测软海绵酸的免疫层析试纸条方法。方法检出限12 ng/ mL (0. 96 纳克/ 条) 。

  关键词:软海绵酸;单克隆抗体;免疫层析;胶体金

  中图分类号:O658. 1+ 1   文献标识码:A   文章编号:100626144(2010) 0120031204

  近年有毒赤潮频发,对我国海洋生态和渔业资源造成了巨大损害,赤潮毒素对海水养殖业及人体健康构成了严重威胁。腹泻性贝毒(Diarrhetic Shellfish Poisoning ,DSP) 是由有毒赤潮藻类鳍藻属( Di2nop hysis) 和原甲藻属( Prorocent rum) 产生的一类脂溶性多环醚类天然化合物,主要成分是软海绵酸(Okadaic Acid ,OA) 及其衍生物,能引起食用者腹泻、恶心等。腹泻性贝毒能激发磷酸化来控制大肠细胞内钠的分泌,是蛋白磷酸酶PP1A 和PP2A 的强烈抑制剂,也是一种很强的促癌剂,能引起消化道肿瘤的发生[ 1 ] 。我国海产品特别是贝类受腹泻性贝毒沾污越来越严重[223 ] 。目前,腹泻性贝毒的分析方法主要有小鼠生物法、高效液相色谱法以及一些免疫化学方法。小鼠生物法简便易行,适合于大规模、批量样品的检测,但不能区别毒素的种类和结构,干扰大、不精确。高效液相色谱法( HPLC) ,特别是液2质联用技术,可准确分析毒素的含量和种类,检出限可低至ng/ g ,但样品前处理繁琐费时,且仪器昂贵[ 4 ] 。

  因此,建立快速、灵敏的赤潮毒素检测方法,有利于开展大规模水产养殖区和生物样品监测计划,对推动贝类毒素研究和保障人体健康十分重要。

  免疫化学方法是基于抗体对抗原的特异性结合的一种分析方法,具有灵敏度高,特异性强,器设备简单,方法易掌握,样品前处理相对简单等优点,适于现场监测和大量样本快速筛查,因而,近年在分析化学领域受到极大的重视且发展迅速[526 ] 。现已有售德国、日本等公司生产的EL ISA 检测DSP 的试剂盒。

  国内已有关于OA 抗体制备和EL ISA 检测方法的报道[729 ] ,有关腹泻性贝毒胶体金检测方法的研究也有报道[ 10 ] 。国内尚未见应用免疫层析技术用于分析DSP 的报道。本文用胶体金标记抗体,通过竞争免疫反应,研制快速检测OA 的免疫层析试纸条技术,为我国腹泻性贝毒监测提供快速分析方法。

  1  实验部分

  1. 1  主要仪器、试剂与材料

  BIODOT 切割机,XYZ23000 喷点仪购自Biodot公司;JASCO V2550 紫外/ 可见分光光度计;恒温干燥箱、真空干燥箱、切刀、玻璃器皿、试纸条模具均为国产。

  胶体金检测用样本垫(玻璃纤维素膜,10 ×300 mm) 、胶金垫(玻璃纤维素膜,8 ×300 mm) 吸水纸(14×300 mm) 均购自Millipore 公司;硝酸纤维素膜(NC 膜,25 ×300 mm) 购自Sartorius 公司。40 nm 胶体金,用1 %柠檬酸三钠水溶液烧制还原0. 01 %氯金酸水溶液,批量制备紫红色的胶体金溶液,最大吸收波长538 nm ,其它试剂均为分析纯。

  1. 3  实验方法

  1. 3. 1  抗软海绵酸单克隆抗体及包被抗原的制备 本室自制OA2OVA 偶联抗原(4. 65 mg/ mL) 和抗OA2KL H 单克隆抗体腹水,制备方法和性质鉴定见参考文献[9 ] 。

  1. 3. 2  单克隆抗体腹水的纯化 用辛酸硫酸胺方法纯化得到粗抗体,再用0. 01 mmol/ L 的磷酸盐缓冲液( PBS ,p H = 7. 4) 透析4~5 d。用分光光度计测得抗体蛋白浓度为1. 78 mg/ mL 。

  1. 3. 3  包被抗原浓度筛选 OA2OVA 偶联抗原用PBS 稀释,稀释倍数分别为原液、稀释2 倍、稀释4 倍,稀释后点在NC 膜上,37 ℃干燥1 h 备用。

  抗原喷NC 膜:抗原用PBS 稀释4 倍后用XYZ23000 喷点仪喷NC 膜,喷量为:0. 74 μL/ cm , Y = 16cm ,37 ℃干燥过夜,备用。

  1. 3. 4  金标抗体的制备 抗体标记量为20μg/ mL 。先取20 mL 40 nm 的胶体金于干净的烧杯中,用1 mmol/ L的NaOH调节其p H 值为8. 2 ,加入抗体,使其在胶体金中浓度为20μg/ mL ,搅拌1 h ,加入胶体金1/ 10 体积的10 %牛血清白蛋白溶液,搅拌30 min ,5 000 r/ min 离心30 min ,取沉淀,用PBS 复溶,约加入4 mL 缓冲液,用紫外分光光度计扫描胶体金特征吸收峰,确定胶体金OD 值后用PBS 缓冲液稀释,使其OD 值为5 ,分成100μL/ 管,插入点好各种抗原浓度的NC 膜,观察NC 膜显色情况,确定用稀释4 倍的抗原筛选抗体标记浓度。

  抗体标记量的选择:按照金标抗体的制备方法,标记不同浓度的抗体量,分别为20 、15 、10 、5μg/ mL ,配制适当浓度,使其OD 值为5 ,用XYZ23000 喷点仪将金标抗体喷在胶金垫上,喷金量分别为10 、8 、6 、4μL/ cm ,真空干燥2 h ,备用,抗体共计16 个梯度条件。

  1. 3. 5  贝类样品处理方法 贝类样品的测定:取新鲜的扇贝,去壳,匀浆,取少许匀浆,加入OA 标准品,使其含量为20μg/ 100 g ,取加标匀浆,用4 倍体积(m∶V = 1∶4) 的80 %甲醇2水超声萃取5 min ,离心,上清液用PBS 稀释3 倍,在96 孔加样板上,加80μL/ 孔,另加80μL/ 孔PBS 为对照。

  2  结果与讨论

  2. 1  检测原理和条件

  腹泻性贝毒免疫层析快速检测技术应用了竞争抑制免疫层析的原理,样本中软海绵酸OA 在流动过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合,抑制了抗体和NC 膜检测线上OA2OVA 偶联抗原的结合。

  如果样本中OA 含量大于12 ng/ mL ,检测线不显颜色,结果为阳性;反之,检测线显红色,结果为阴性。16 个抗体条件的金垫,分别和稀释4 倍的NC 膜组装成试纸条,用PBS 检验显色程度。结果显色均很深。降低抗体标记量,用稀释4 倍的NC 膜检测和调节抗体标记量,经过细微摸索抗原浓度,最后确定用PBS 稀释8 倍的检测抗原制备NC 膜,0. 74μL/ cm。

  降低标记量为5、4、3、2μg/ mL , 调制OD 值为4、5、6 , 喷金量为2、2. 5、3、3. 5、4、6、8μL/ cm ,共84 个金标抗体条件和稀释8 倍的包被抗原NC 膜组装,分别用空白(0. 01 mmol/ L PBS) 、PBS 稀释的软海绵酸OA 标准品20、15、12、10 ng/ mL 检测显色程度和阳

  性抑制浓度。加样量为80μL/ 孔,判断时间为15 min。最终选择标记量为:2μg/ mL ,OD 为5 ,喷3μL/ cm ,组装双金垫,NC 膜为原液稀释8 倍的抗原条件组装成试纸条,检出限为12 ng/ mL 。

  重复性实验:按照上述实验条件,重新标记抗体并喷抗原,组装条件一致的试纸条,检测结果和原条件实验一致(图1) ,空白液显色一般(0 号卡) ,阳性12 ng/ mL 完全抑制无条带出现(8号卡) 。

  贝类DSP 毒素提取需要80 %的甲醇2水溶液,有机溶剂会干扰抗原抗体反应,因此在PBS 缓冲液中添加不同浓度甲醇实验,结果表明:检测样本中含30 %以下甲醇对免疫学反应无影响。小鼠法阴性样品验证了此结果(图2) 。小鼠法阳性样品有部分抑制,条带颜色比空白浅(图3) 。

  对于加标贝样萃取液的测定结果表明,15 min 内空白对照显红色条带,而贝样的萃取液(含OA 16. 7ng/ mL) 无颜色条带出现。当贝类匀浆用5 倍体积的80 %甲醇2水萃取时(含OA 13. 3 ng/ mL) ,实验结果在15 min 内无颜色条带出现,但放置长时间(大于2 h) 后,会出现极浅的条带印迹。因此对于OA 含量稍高于或接近于检出限12 ng/ mL 的样品,一定要严格控制检测时间,在15 min 内,与空白对照,得出结果,当时间过长,可能会由于极少量的金标抗体抗原复合物的长时间附着积累,以及其他一些非特异性吸附反应等的作用,而干扰试验结果的判断。

  2. 2  检出限与食品安全阈值

  一些国家规定的贝类组织中腹泻性贝毒安全阈值是20μg OA 等价物/ 100 g 贝肉,我国《有毒赤潮监测崭行规范》推荐20μg OA 等价物/ 100 g 贝肉的限定值。

  应用研制的灵敏专一的抗软海绵酸单克隆抗体,研究建立的贝类腹泻性贝毒主要成份软海酸的免疫快速检测卡(检出限12 ng/ mL ,时间15 min) ,不需要任何仪器设备,完全满足该规定阈值,应用于贝类样品中软海绵酸的检测。

  2. 3  免疫层析检测与酶联免疫检测方法的比较

  免疫层析与酶联免疫分析方法具有相似的原理,都是基于抗原抗体的特异性结合反应而建立的免疫检测技术。使用同一种抗体建立的酶联免疫检测方法比免疫层析检测方法灵敏度高,但分析步骤多,反应时间长(2. 5 h) ,定量检测需使用酶标仪完成;而免疫层析快速检测方法虽然灵敏度低,但只使用一种试剂,一步操作,可在室温长期保存,具有简单、快速、准确、无污染、不需任何检测仪器的优点,特别适用于现场监测筛选阳性样品,然后使用色谱等仪器方法验证鉴定。对于半定量的快速现场筛选具有其他方法不可比拟的优点。

  2. 4  建立免疫层析快速检测技术的关键因素

  本研究组曾制备抗OA2BSA 单克隆抗体,由于特异性不高,最大抑制率只有30 % ,建立的免疫层析检测方法灵敏度低,不具有可用于实际样品检测的使用价值[11 ] ;而本研究中使用的抗OA2KL H 单克隆抗体,特异性高,最大抑制率可达到90 %以上,因此使用其建立的免疫层析检测方法灵敏度高,能够满足实际样品安全规定值的检测需要,建立的分析方法具有实用价值。

  结合率高的包被抗原。因为OA 是小分子,不能直接吸附到硝酸纤维膜上,必需偶联到大分子蛋白载体上。偶联的分子比是影响检测方法成功的关键因素之一。喷点在检测线上的包被抗原 OA2OVA ,必需具有较高的OA 结合比,才能够使得竞争结合的金标记抗体的量能够产生肉眼可识别的颜色变化,而达到检测的目的。

  建立一种物质的胶体金免疫层析快速检测方法的影响因素非常多。尽管在理论上已经很成熟,可实际中成功率并不高,尤其对于小分子的间接竞争方法,困难更多。这是一个复杂的实验过程,涉及到众多的条件因素。除了上述因素外,胶体金颗粒粒径的大小范围,以及颗粒的均一性、都会影响检测的灵敏度;硝酸纤维素膜的质量,特别是其孔径的大小和均匀度,会影响可供抗体蛋白质结合的表面积以及样本通过的毛细流速,从而影响灵敏度;吸水纸等材料的性能,金标抗体的浓度、用量,所加的各种稳定剂、调节剂的种类和量,保存条件等都会严重影响测试结果。所以,必须经过大量的实验工作摸索,严格操作,才能保证试纸条的批间差异小于要求值。

日期:2010年8月23日 - 来自[色谱论文]栏目

免疫金银染色法检测自身免疫性疾病患者抗核抗体研究

【摘要】  目的 探讨免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)对自身免疫性疾病患者的诊断价值。 方法 采用免疫金银染色法(IGSS)和间接免疫荧光法(IIF)检测自身免疫性疾病患者血清中ANA。 结果 80例自身免疫性疾病患者血清免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)阳性率97.3%,间接免疫荧光法检测抗核抗体(ANA)阳性率98.2%, χ2=1.006,P=0.316>0.05)。两种方法结果有良好一致性。 结论 IGSS可用于检测自身免疫性疾病患者血清抗核抗体(ANA)。

【关键词】  自身免疫性疾病 抗核抗体 免疫金银染色

抗核抗体(ANA)是自身免疫性疾病非常重要的实验诊断指标。间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence IIF)是检测抗核抗体(ANA)最有效的方法和金标准[1]。但间接免疫荧光法需要特殊设备(如高质量荧光显微镜),限制了抗核抗体(ANA)检测技术在基层医院实验室的开展,造成许多自身免疫性疾病在基层医院漏诊、误诊。为使基层医院提高对自身免疫性疾病诊断的准确性,我们借鉴免疫金银染色在病理学诊断中的高敏感性和高特异性[1~3],建立了利用普通光学显微镜检测血清抗核抗体的免疫金银染色法(Immunogold silverstaining,IGSS),取得满意效果,报告如下。

  1  材料和方法

  1.1  抗原  欧蒙德国医学实验诊断公司,订货号FA 1510-1003-1靶抗原基质人HEp-2细胞,猴肝切片(每个反应区2张生物薄片)

  1.2  待检血清  自身免疫性疾病患者血清 为2002年以来本院血清库收集的新乡市各医院送检的自身免疫性疾病患者血清(其中系统性红斑狼疮25例,干燥综合征20例,系统性硬化症15例,混合结缔组织病20例),所有患者均符合1982年美国风湿病协会诊断标准。正常对照血清为新乡市中心血站无偿献血员血清,共46份。

  1.3  金标记羊抗人IgG

  1.3.1  亲合层析提纯羊抗人IgG为华美生物工程公司产品。

  1.3.2  胶体金溶液  由本实验室参考全国临床检验操作规程[1]通过鞣酸—枸橼酸钠还原法制备直径为5nm的胶体金溶液。

  1.3.3  待标记蛋白溶液的制备  将待标记蛋白羊抗人IgG预先于0.005mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g 4℃离心1h,去除聚合物。

  1.3.4  待标胶体金溶液的准备  以0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调胶体金液的pH值至9.0。

  1.3.5  胶体金与标记蛋白用量之比的确定  将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。将标记蛋白羊抗人IgG以0.005mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5~50μg/ml,分别取1ml,加入上列胶体金溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。结果观察,以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量。

  1.3.6  胶体金与羊抗人IgG的结合  将胶体金和羊抗人IgG溶液分别以0.1mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌羊抗人IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入5%BSA作为稳定剂,防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀,溶液终浓度为1%。

  1.3.7  胶体金标记蛋白的纯化  先低速离心1 800r/min 20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PBS液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。在结合物内加50%甘油贮存于-70℃可保存一年以上。

  1.3.8  金标抗人IgG的质量鉴定  胶体金颗粒在波长510~550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02mol/L pH8.2 PBS液(含1%BSA,0.02%NaN3)将胶体金蛋白试剂作1:20稀释,在721分光光度计上测OD520=0.26,符合要求。(一般应用液的OD520应为0.2~0.4)。

  1.4  银染液配制  采用本实验室[4]配方液,A液:0.22%乙酸银溶液。B液: 50%阿拉伯树胶,去离子水溶解,每天摇动,5d后取滤液使用;C液:1%对苯二酚溶液,500mg对苯二酚溶于30ml 0.05mol/L pH3.8柠檬酸盐缓冲液中。D液:在C液中加入10~40ml B液。银染液:将A液和D液等量混合即成(临用前配)。

  1.5  稀释液及洗液  pH7.2,0.01M PBS-Tween20缓冲液。

  1.6  检测流程  ①稀释:用稀释液稀释血清。 ②加样:将加样板放在泡沫板上,按顺序分别滴加25μl稀释后的血清至加样板的反应区中,避免产生气泡。③第一次温育:将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里,反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触,且标本间互不接触。室温温育30min。 ④清洗:用烧杯盛PBS-Tween洗涤液,流水冲洗载片1s然后立即(不要吹干)将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1min。⑤加样:滴加25μl 1∶20稀释的金标记羊抗人IgG至洁净加样板的反应区中。⑥第二次温育:从PBS洗涤液中取出载片(抗原片),5s内用吸水纸擦一下背面和边缘后,立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里。检查生物薄片是否与液滴接触良好,然后继续下一张。室温温育30min。⑦清洗:用烧杯盛PBS洗涤液流水冲洗载片1s,然后立即将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1min。再将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少1min 2次,浸入双蒸水的小杯中浸洗至少1min 1次。⑧银染:滴加25μl 混合后的银染液至洁净加样板的反应区中加混合后的银染液, 从双蒸水的小杯中取出载片(抗原片),5s内用吸水纸擦一下背面和边缘后,立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下,盖在加样板的凹槽里。注意:为防止破坏基质,不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片(抗原片)是否与液滴接触良好,然后继续下一张。室温温育10min。⑨清洗:用烧杯盛去离子水流水冲洗载片1s(注意水流不要太急,不要直接对着基质冲),然后立即将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少1min 3次。⑩镜检:晾干后光学显微镜10×40下观察细胞核着色情况。ANA阳性反应为细胞核内结构被染成黑色,阴性为核区不着色,在浅灰色的背景下呈白色空泡状; ANA血清滴度≥1∶20为阳性。

  1.7  间接免疫荧光法检测试剂(ANA筛查试剂盒),欧蒙德国医学实验诊断公司,严格按说明书操作。用荧光显微镜10×40观察结果。

  2  结果

  2.1  免疫金银染色法与间接免疫荧光法检测ANA比较  免疫金银染色法(IGSS)与间接免疫荧光法(IIF)检测SLE患者ANA血清80份,结果见表1,符合率 98.8%,χ2=1.006,P=0.316>0.05。差异无统计学意义。

  2.2  重复性试验  ANA阳性、阴性血清各3份,同一批试验各做4份,结果阳性标本均阳性,阴性标本均阴性。

  2.3  其他标本检测  用IGSS法检测46份健康献血员血清,均为阴性。

  表1  免疫金银染色法与间接免疫荧光法(IIF)检测 ANA对比结果(略)

  Tab 1  Detection of ANA in 80 autoimmune disease serum with IGSS

  2.4  ANA滴度分布  每份血清均以1∶10开始倍比稀释。用两种方法同时检测,结果表明, IGSS法的平均滴度均高于IIF法(t=0.874,P=0.384>0.05)。差异无统计学意义。

  表2  80例自身免疫性疾病患者血清两种方法ANA阳性滴度分布(略)

  3  讨论
   
  ANA即抗细胞核成份的抗体,是所有抗核抗体的总称。到目前为止,至少发现有30种抗核成份的抗体,这些核抗原主要分布在细胞核内,但也有分布在核周的胞浆内。ANA最早用于诊断系统性红斑狼疮,目前作为系统性红斑狼疮和其他系统性风湿病的筛选试验诊断,具有很高的敏感性,但缺乏特异性。检测ANA的经典方法有间接免疫荧光和ELISA两种方法,在实验室操作和临床意义方面两者有差异。间接免疫荧光常用的底物为有核组织细胞,如猴肝、鼠肝或鼠肾组织细胞;也用肿瘤细胞株,如子宫颈癌细胞(Hela cell)或喉癌细胞(Hep-2 cell)。由于癌细胞的核更大,增殖活跃,细胞的分裂期明显,故更易观察和分析结果。依照细胞核染色的类型分为:斑点型(Speckled,S型)、均质型(Homogeneous,H型)、周边型(Peripheral,P型)、核仁型(Nucleolar,N型)和核浆点型或着丝点型(Antibody to centromere antigen,ACA)5型。
   
  依照抗原的生物化学特性将ANA分为4大类:抗DNA类、抗组蛋白(histone,H)类、抗非组蛋白类即抗可提取性核抗原(Extractable nuclear antigen,ENA)类和抗核仁类抗体。共有30余种抗体,其中临床常用10余种,构成ANA谱。根据各抗原特性,采用不同的试验方法检测相应的抗体。①抗ds-DNA抗体的检测:经典的试验方法间接免疫荧光法,用马疫锥虫或短膜虫作为反应底物,虽其特异性较高,但敏感性较低;放射免疫法(结合率≥20%为阳性)和金标抗体测定法其实验结果特异性相对较低。②抗组蛋白抗体的测定曾用肾脏组织细胞作为反应底物,应用免疫荧光法,由于此抗原的稳定性较差,其实验的敏感性较低,故现采用ELISA较多。③抗非组蛋白(ENA)抗体的测定以往常以粗提的多组份ENA抗原为反应底物,用对流免疫电泳法测定,也称第二筛选实验。然后琼脂免疫双扩散方法,以粗提的单组份抗原为底物分别对相应的抗体测定。近年来,免疫印迹(Western Blotting)技术应用于临床,给临床检测抗体带来了许多方便,但两种方法测定抗体的阳性率基本相同,只是免疫印迹技术更简便、更科学化。由于目前所应用的反应载体是硝酸纤维膜,反应底物为提纯的多组份ENA多肽,某些试剂的稳定性尚存在一定问题,故通常琼脂免疫双扩散和免疫印迹两种方法同时做,以相互弥补其实验缺陷,提高其敏感性和特异性。④抗核仁抗体的测定通常应用间接免疫荧光法。
   
  1971年Faulk 和Taylor[1]建立了一种新的标记物系统—免疫胶体金技术用于免疫细胞化学,现在已应用于光镜和电子显微镜标本抗原和抗体的检测。胶体金的制备方法比较简便,标记抗体也较容易。1983年Holgate[1]等人将免疫金法与银显影方法相结合创立了免疫金银法(IGSS ),即经银显影液增强,使金颗粒周围吸附大量银颗粒,光镜下就可看到阳性反应部位呈金属银的黑褐色,从而提高了灵敏性。IGSS染色方法成功的关键在于要保持好的抗原性,组织结构,并要求有高特异性和高效价的抗体,严格避免金颗粒和银颗粒的非特异性沉积。本文应用欧蒙德国医学实验诊断公司制备的ANA抗原和双链DNA抗原,并自行制备抗人IgG胶体金,达到试验要求。在本实验中,用IGSS和间接免疫荧光法同步检测自身免疫性疾病病人血清中的ANA,结果显示出两种方法结果有良好一致性。在未配置荧光显微镜的实验室,可用IGSS法检测自身免疫性疾病患者血清抗核抗体(ANA)。但对核型的观察,IGSS似不如IIF法清晰。因此,应用IGSS法检测ANA阳性时,应进一步采用免疫印迹等方法检出不同种类的抗核抗体,结合临床,做出正确诊断。

【参考文献】
    [1] 叶应妩,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社,2006,655.

  [2] Holgate CS. Immunogold silver staining:new method of immunostaining with enhanced sensitivity[J]. Histochem cytochem, 1983,31:938~944.

  [3] Beeley JE. Immunocytochemistry: A practical approach, 1st ed.[M]. Oxford: Oxford University Press Inc, 1993,115.

  [4] 张铁汉, 刘琳, 贺志安,等.银强化滴金免疫法检测肾综合征出血热IgM的研究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志, 2000,14(3):266.


作者单位:新乡医学院第三附属医院,河南 新乡 453003.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第8期]栏目
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胶体金试剂条在鼠疫监测中的应用

【摘要】  目的 探讨鼠疫胶体金试剂条在动物鼠疫血清学监测中的应用。 方法 股动脉采鼠血、分离血清,同一份血清分装在两个离心管中。其中一管血清56℃ 30min灭活,首先进行鼠疫间接血凝(IHA)的初筛试验。初筛阳性血清,经醛化吸收后,再进行复判试验,严格按照中华人民共和国鼠疫诊断标准“GB15991-1995”执行。同时对初筛阳性的原血清样的另一管未灭活血清进行鼠疫胶体金免疫层析试剂条检测。 结果 在广东省鼠疫疫源地(雷州市)采集的鼠类血清799份中有7份血清发生非特异凝集,初筛假阳性率0.88%;在广东鼠疫历史疫区(佛山市南海区)采集鼠类血清601份中有31份血清发生非特异凝集,初筛假阳性率5.17%,经复判试验全部为阴性。相应的非灭活原血清样经胶体金试剂条快速检测也全部为阴性。 结论 鼠疫胶体金免疫试剂条检测的特异性高于间接血凝试验,可同时作为间接血凝复判中的平行试验参考。在广东不同地区来源的鼠类血清样本中,历史疫区的IHA假阳性率明显高于现在的疫源地。

【关键词】  鼠疫监测 间接血凝 非特异凝集 胶体金免疫试剂条

在家鼠鼠疫动物监测中,间接血凝试验(IHA)的假阳性发生率远高于我国北方的野鼠鼠疫疫源地。很可能是由于家鼠种群密度高与人类接触频繁、生存环境复杂等因素。野鼠由于远离人类居住环境,相对生存环境比较单一和干净。家鼠由于生存环境复杂,受到微生物侵袭及感染的几率较大,体内血清中可能携带多种病原微生物的抗体及抗原成分。在这些抗体中,很可能由1~2种抗体会与鼠疫菌全菌抗原成分中的某种抗原发生交叉免疫反应,从而出现鼠疫间接血凝试验中的非特异凝集反应。甚至直接与致敏血球发生凝集反应。为此近年来,我们加强了这方面资料的收集与分析。

  1  材料和方法
   
  股动脉采集、分离鼠类血清,同一份血清分装在两个离心管中。其中一管血清56℃ 30min灭活后,进行鼠疫间接血凝初筛试验。初筛检出的阳性血清,经醛化吸收后,再进行复判试验,严格按照中华人民共和国鼠疫诊断标准GB15991-1995执行。同时对初筛阳性的原血清样(另一管非灭活)进行快速胶体金试剂条检测。鼠疫F1间接血凝试验检测试剂盒,统一由中国CDC鼠疫、布氏菌病防治基地供给,鼠疫免疫胶体金试剂条由北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司生产(批号20060508)。同时收集假阳性反应血清的全血进行全血成分的细菌分离和培养。具体方法严格参照2002年中华人民共和国卫生部疾控司出版的鼠疫防治手册中的方法执行。

  2  结果
   
  在家鼠鼠疫疫源地-雷州市采集的799份鼠类血清中,鼠疫F1间接血凝初筛试验检出阳性血清7份,后经复判试验和免疫胶体金试验条检测证实为非特异凝集反应,属假阳性反应,假阳性率为0.88%。同时这7份假阳性反应血清的全血成分细菌学检验结果为阴性,排除杂菌污染血清的可能性。
   
  在鼠疫历史疫区-南海区采集的601份鼠类血清中,鼠疫F1间接血凝初筛试验检出阳性血清31份,后经复判试验和免疫胶体金试验条检测这31份全部为非特异凝集反应,属假阳性反应,假阳性率为5.17%。同时这31份假阳性反应血清的全血成分细菌学检验结果为阴性,排除由杂菌污染血清导致非特异凝集反应发生的可能性。
   
  合计检测鼠类血清标本1 400份,IHA初筛(假)阳性38份,复判试验和胶体金试剂条检测均为阴性,假阳性率0.27%。用中国CDC鼠疫、布氏菌病防治基地生产的鼠疫F1间接血凝试验检测试剂盒中的阳性参照血清作对照,发现北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司生产的鼠疫免疫胶体金试剂条:只有在IHA滴度≧1:160,才呈现阳性反应条带。
    
  在统计中发现,发生(鼠疫F1间接血凝试验)假阳性的鼠类血清全部为家栖的黄胸鼠和褐家鼠。经χ2检验。广东鼠疫历史疫区鼠类血清的假阳性率明显高于现疫源地区。

  3  讨论
   
  影响间接血凝的因素主要有:①配置溶液的离子浓度及酸碱度;②醛化血球的制作工序(单宁酸、醛化处理过程等)。③F1抗原的提取及纯化技术。④被检样品中含有异种凝集素或外源性凝集素所引起的非特异凝集反应。⑤由病原微生物之间交叉抗原或抗体所引起的非特异凝集反应。⑥被检血清的实验室交叉污染。⑦尽可能避免被检血样的反复冻融及其溶血。
   
  本资料中,将鼠疫F1间接血凝试验检出假阳性的38份原未灭活的血清,进行鼠疫血清的F1抗体胶体金试剂条检测结果全部为阴性。说明鼠疫F1抗体胶体金检测的特异性高于F1间接血凝试验,因此,鼠疫免疫胶体金试剂条可作为IHA复判平行试验参考。
   
  由于目前提纯的鼠疫菌F1抗原,是一种复合抗原成分,为此必须在提取工艺上进行革新,把目前我们提取所谓纯的F1抗原再通过透析、毛细管电泳及亲合层析技术,分离提取真正纯的F1抗原成分,用于鼠疫血清学诊断。提高鼠疫血清学诊断的特异、敏感和科学性。避免与其他抗原的交叉反应,阻止非特异凝集反应的发生。当然近年来随着单克隆技术的发展,鼠疫ELISA和免疫胶体金技术(特别是DIGFA)得以应用,其抗原检测特异及其灵敏性都很高。尤其是在快速诊断方面,显示出方便和快捷的特点。在抗体检测中,可结合鼠疫间接血凝初筛试验的结果,把胶体金标记的鼠疫免疫层析试剂条检测结果作为最后的确诊试验。但目前鼠疫金标-抗体检测中,灵敏度还较低,只对IHA滴度≧1:160的血清样本呈现阳性反应,存在一定的漏检率;同时还不能对全血样本直接检测,需在血清分离后才能检测。对此可考虑在检测条上加滤膜首先对全血成分进行滤过,然后检测。对多次反复冻融及其溶血的血清样品,经胶体金鼠疫免疫层析试剂条检测前后结果一致,不受影响。
   
  由于现在胶体金直接检测细菌响应信号微弱,对鼠疫菌浓度的检测下限为≧105cfu/ml,可考虑引入生物素-亲和素,将胶体金复合抗原作为夹心法的二次综合利用夹心式方法,胶体金复合抗体和延长微生物与抗体的结合时间等部分显著提高检测精确度,将SPR生物传感器对鼠疫菌检测的灵敏度提高到101cfu/ml。
   
  同时现在推广使用的鼠疫胶体金检测试剂条还无法定量。第一种定量检测可通过试剂条反应后颜色深浅的视觉比较,实现半定量结果,具体结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性;第二种是将检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物,任何过量的分析物将会和下一条检测线结合,产生一个温度式的条带梯度。第三种是应用反射光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,将颜色强度传化为数字指标,以实现定量检测。
   
  在胶体金快速诊断技术中应用生物传感器,通过检测阻抗信号的变化来测定抗原(或抗体)的含量。这些方法大多通过在生物分子上连接的酶,在一定条件下催化某一反应底物,产生一种非导电性物质,沉积于电极表面,使电极表面的阻抗增加,达到放大信号的目的。
   
  在广东不同地区来源的鼠类血清样本中,历史疫区鼠类血清标本的IHA初筛假阳性率明显高于现在的疫源地。其原因值得进一步探讨。同时建立以鼠疫噬菌体为病原学(特异性片段的PCR扩增)和血清学(抗原和抗体)的诊断方法。

【参考文献】
    [1] 张涛,海荣,徐冬蕾,等.鼠疫监测血清学中的非特异凝集反应[J].地方病通报,2006,21(1):

  [2] 张涛,冯志勇,邱峻荣.鼠疫高级细菌学[M].银川:宁夏人民出版社,2006,129~139.

  [3] A.J.Shepherd, D.E.Hummitzsch.Comparative test for detection of plague antigen and antibody in experimentally infected wild rodents[J].Clinical microbiology,1986,24(6):1075~1078.

  [4] L.E.Lindler, G.V.Plano, V.Burland,et al. Complete DNA sequence and detail analysis of the Y.pestis KIM5 plasmid encoding murine toxit and capsular antigen[J].Infect Immun,1998,66:5731~5752.

  [5] 张涛.鼠疫菌研究进展[J].中国地方病防治杂志,2006,21(5):273~275.


作者单位:湛江鼠疫防治研究所,广东 湛江 524000; 广东省农科院,广东 广州 510640; 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 100000

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第7期]栏目

胶体金法快速检测滴虫性阴道炎的临床应用研究

【摘要】  目的 探讨胶体金快速检测阴道毛滴虫感染的临床应用价值。方法 对381份妇科门诊患者的阴道分泌物标本分别用胶体金法和培养方法检测并进行分析。结果 与培养方法比较,胶体金法的敏感性为82.7%,特异性为91.5%,阳性预测值70.4%,阴性预测值为95.5%。结论 胶体金法检查滴虫性阴道炎具有快速简便及特异性和敏感性较高的特点,适合临床广泛应用。

【关键词】  阴道毛滴虫;胶体金法;培养

Clinical evaluation on rapid diagnosis of colloidal gold of trichomonas vaginitis

    WANG Chang-hai.Shangqiu Medical College,ShangQiu 476100,China

    [Abstract]  Objective  To study the clinical application value of the colloidal gold rapid check trichomonas vaginatis infection.Methods  381 vaginal discharge specimens from Obstetrics & Gynecology clinic were detected by using colloidal gold and culture methods respectively.Results  In this study,the sensitivity of colloidal gold was 82.7%,its specificity was 91.5%.Conclusion  The colloidal gold is rapid,useful,with high specificity and sensitivity for diagnosing trichomonas.

    [Key words]  trichomonas vaginalis;colloidal gold method;cultivate

    阴道毛滴虫感染导致的阴道炎,是妇科常见病、多发病。阴道毛滴虫主要寄生在女性泌尿生殖道,引起滴虫性阴道炎和尿道炎,是一种全球分布,以性传播为主的疾病。目前临床实验室检测主要采用直接湿片高倍镜法,但由于受温度、涂片厚薄及检验者水平的影响,其阳性诊断率较低(约占50%)[1],易发生漏诊和误诊。为快速准确检测阴道毛滴虫感染,我们分别用胶体金法和培养方法对阴道分泌物标本进行对比检测,现介绍如下。

    1  资料与方法

    1.1  标本来源  381份阴道分泌物标本来源于2007年4月至11月我院妇科门诊患者,均为毛滴虫感染疑似病例,年龄16~45岁,平均28岁。患者有白带增多,呈白色泡沫状,稀薄有臭味,外阴瘙痒与腰痛,部分患者有尿痛、尿急、尿频等尿路感染症状。

    1.2  试剂材料  胶体金法试剂为阴道滴虫(T.V)检测试剂盒(胶体金法),济南杏恩生物科技有限公司提供。培养法所用培养基为大豆蛋白胨液体培养基,严格依照配方说明配制[2]。

    1.3  原理  胶体金法利用双抗体夹心法检测标本中是否含有相应的待测抗原。将抗阴道滴虫的分泌性蛋白纯化后包被在胶体金上成为金标抗体,检测时,当样品中含有阴道滴虫的分泌性蛋白时,在检测区(T区)时,形成金标抗体-抗原-抗体复合物显示红色线条,呈阳性反应。培养法是依据阴道毛滴虫的生物学特性,给以合适的营养条件,利于少量滴虫大量繁殖提高检出率。

    1.4  测定方法  (1)胶体金法用消毒棉拭子从阴道后穹隆及阴道壁取分泌物,移入含1 ml样品稀释液小管中,并且旋转混合约30 s~1 min,将棉拭子取出丢弃。将试纸条插入小管,在规定时间读取结果。(2)培养法用消毒棉拭子从阴道后穹隆及阴道壁取分泌物移入液体培养基中,37℃温箱培养,24~48 h后吸取管内沉淀物检查有无原虫生长[2]。

    2  结果

    381份阴道分泌物标本共有75份培养出阴道滴虫,阳性率为19.6%。对75份阳性标本患者用胶体金法检查阳性为62份,阴性13份;在306份培养阴性非患者胶体金法检查阴性为280份,阳性26份。

    3  讨论

    培养法以其高灵敏和高特异被誉为阴道滴虫病原学诊断的“金标准”。实验中经常采用的培养基为液体培养基,有肝-胨-麦芽糖培养基、半胱氨酸-肝-胨-麦芽糖培养基和大豆-肝-胨-麦芽糖培养基等几种。但操作复杂费时,可用于疑难病例诊断。

    阴道毛滴虫是一种常见的性传播疾患病原体,可引起女性阴道炎、尿道炎和男性的尿道炎、前列腺炎等病症。本病的诊断主要依靠实验室诊断,传统的湿片法由于其简便价廉,仍为大多数医院所采用,但其敏感性低。

    荧光定量PCR被认为是检测阴道毛滴虫较快速、准确、高效的方法之一。这是一种对阴道毛滴虫的DNA进行定量测定的方法,敏感性和特异性分别为90.1%和100%[3]。但设备要求条件高,价格昂贵,临床常规难以应用。

    近年来,新型免疫学方法的出现为阴道毛滴虫病的诊断提供了新的发展途径。方法类型有酶免疫法(EIA)、直接荧光抗体实验(DFA)、胶乳凝集试验(LAT)及斑点金免疫层析试验即胶体金法(DICA)。胶体金法以其简便、快速、试剂稳定及较高准确性适合临床推广使用。

【参考文献】
  1 罗春丽.临床检验基础,第2版.北京:人民卫生出版社,2004,240-241.

2 仇锦波.寄生虫学检验,第2版.北京:人民卫生出版社,2002,101-102,165.

3 Hardick J, Yang S, Lin S.Use of the Roche LightCycler instrument in a real-time PCR for Trichomonas vaginalis in urine samples from females and males.J Clin Microbiol,2003,41(12):5619-5622.

(本文编辑:乔 雨)


作者单位:476100 河南,商丘医学高等专科学校医学技术系

日期:2009年8月24日 - 来自[2009年第7卷第5期]栏目
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胶体金免疫结合试验在检验医学中的应用

关键词:胶体金免疫结合试验  胶体金免疫结合试验是在酶免疫结合试验的基础上发展起来的一种固相标记免疫测定新技术。其特点是单份测定、简单、快速、除商品试剂外不需任何仪器设备,几分钟即可用肉眼观察结果。目前已在临床检测中获得广泛应用。现就其检测原理、试剂制作及应用现状和展望作一介绍。

  一、胶体金免疫结合试验的检测原理

  胶体金免疫结合试验的检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合,再通过胶体金结合物达到检测目的。根据检测装置的不同可分为金免疫渗滤试验(GIFA)和金免疫层析试验(GICA)。

  1.GIFA:GIFA始于1985年[1],最初以酶作为标记物。1989年发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病病毒抗体的渗滤试验[2],确立了GIFA的基本技术。

  GIFA试剂盒有2个主要成分:一是金标抗体结合物,另一是渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料的塑料小盒,在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜,膜上预包被抗原或抗体斑点。试验时将标本滴加在膜上,通过渗滤使抗原抗体在膜上发生免疫结合反应;再滴加金标结合物,使其与对应抗体抗原结合并显色。阳性结果在膜上出现着色斑点。GIFA检测操作步骤与酶联免疫吸附试验(ELISA)法相同。差别在于加样、反应和洗涤均通过渗滤完成。检测全过程仅需数分钟,但敏感度却与需数小时完成的ELISA相仿。其原因在于:ELISA样品中的待检抗原需缓慢地扩散才能与吸附于固相表面的抗体反应,而在膜渗滤法中,抗体充满了膜的微孔,待检液体层层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩,从而提高了反应效率。另外,以胶体金作为标记物,不但减少了操作步骤,而且试剂可在室温长期保存。

  2.GICA:1990年Oskiowicz等[3]应用硒作为标记物建立了免疫层析试验。其后一般均采用简便的胶体金试验。其检测原理与GIFA相同,不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流,而是基于层析作用的横向流动。

  GICA是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上,待检标本加在试纸条的一端,将一种试剂溶解后,通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触,样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域(检测带),通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目的。GICA特点是单一试剂,一步操作,全部试剂可在室温长期保存。这种新的方法将胶体金免疫检测试验推进到一个崭新的阶段。

  二、GICA试剂的制作

  1.试剂:为试纸条形式。在试纸条的塑料片上依次粘贴如下组分:(1)吸水纸(加样区),(2)玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥的金标抗体(流动带),(3)硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带),(4)吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。因此在(1)处滴加液体标本,液流即向(4)处移动。当液体到达(2)处时,金标抗体被溶解,同时与标本中的抗原反应形成复合物。液流继续前移至(3)时,带有金标记的复合物被膜上的抗体捕获,呈现红色的线条。未结合的金标抗体继续前移至(4)处。

  2.GICA制作中须注意的几个问题:GICA检测的可靠性主要依赖于所用试剂的质量。其中层析材料的选择、处理以及受体固定是免疫层析条研制的关键技术。

  微孔滤膜:层析反应是以滤膜为载体,所以滤膜的质量致关重要。其吸附性能、过滤速度等均会影响检测结果。有些滤膜很难达到各部分性质均一的质量,因此,应仔细筛选优质滤膜。可选择的滤膜除硝酸纤维膜外还有尼龙膜、羧化纤维素膜、聚酯膜、纯纤维素膜和玻璃纤维膜等多种类型,但硝酸纤维素膜(NCM)运用较多。这主要得益于NCM的2个特性:较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性。纯纤维素膜和羧化纤维素膜也是免疫层析的常用材料,但一般要求预先对其作化学处理,使其具有与受体蛋白共价联接的特性。常用的处理方法有苯醌法[4]、溴化氰法[5]和碳二亚胺法[6]

  受体 :固定于滤膜的受体要求具备如下几点性质:(1)与膜材料的结合稳定性好;(2)有较高的生物活性,因而有足够的配体捕获容量;(3)有较高的纯度,此为特异性检测的基础;(4)对于以干态吸附于流动带的标记或非标记受体,其可流动性是评价其性能优劣的主要指标。往往要求在流动带加入高效助溶剂,从而使吸附于流动带的受体具有快速溶解的特性。

  受体固定工艺:受体固定工艺应简单、有效。如大规模生产应采用机械喷膜,保证制膜快速、稳定、一致。

  受体包被量:筛选最佳的受体包被量是提高检测敏感度的重要因素之一。在不影响所需灵敏度的前提下可提高固相抗原或抗体的浓度,扩展测定的线性范围,以减少钩状效应。另外,有些检测项目如血清肌红蛋白、肌钙蛋白和甲胎蛋白等阳性质控的阈值高低与检测的敏感性和特异性密切相关。这类检测的质控受体包被量还需解决具有临床诊断意义的“检测下限”即阴性或阳性分界的临界值问题。包被滤膜剩余吸附位点的有效封闭:除上述几点外,与此相关的其他内容如筛选和纯化抗体、制备标记物和确定标记物工作液浓度以及选择助溶剂等,也是不容忽视的重要环节。

  三、胶体金免疫结合试验的应用

  胶体金免疫结合试验可应用于免疫学检测的所有方面。但主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质(如诊断传染病中的抗原或抗体),以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质(如HCG、甲胎蛋白、C-反应蛋白等)。近年来由于制备技术的改进和试剂原料的提高,应用范围更加广阔。现国内外有商品供应及文献报道的检测项目有:

  1.激素:应用最广的首推尿液检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的早早孕诊断试剂。妇女受孕后10 d,即预期月经前2~4 d,即可呈现阳性反应。还有促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)等。

  2.传染病病原的抗原和抗体:(1)肝炎病毒:甲型肝炎IgM抗体(抗HAV-IgM)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗体(抗HBc-IgM、IgG)和丙型肝炎抗体(抗HCV)等。(2)其他病毒:艾滋病病毒抗体(抗HIV)、肾综合征出血热病毒抗体、乙型脑炎血清特异性抗体、传染性单核细胞症嗜酸性抗体、单纯疱疹病毒抗体、巨细胞病毒抗体、风疹病毒抗体、轮状病毒(粪便)、登革热病毒抗体、呼吸道合胞病毒(分泌物)和流感病毒A抗原(鼻咽部分泌物)等。

  3.性病病原:梅毒螺旋体抗体、淋球菌(分泌物)和泌尿生殖系沙眼衣原体(分泌物)等。

  4.细菌:结核杆菌抗体、A族乙型溶血性链球菌(喉拭标本)、沙门菌血清抗体和与慢性胃炎、消化道溃疡密切相关且可能是胃癌发病的危险因素的胃幽门螺杆菌抗体等。

  5.寄生虫:弓形虫抗体、包虫体抗体、血吸虫抗体、人囊虫病、恶性疟原虫循环抗原和间日疟原虫、班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原等。

  6.肿瘤标记物:前列腺癌特异抗原(PSA);对消化道恶性肿瘤尤其是结肠癌有较高的诊断价值,并对辅助诊断胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等也有重要意义的血清癌胚抗原(CEA);以及对肝癌的诊断有较高价值的甲胎蛋白(AFP);绒毛膜促性腺激素(HCG)还可对滋养层细胞肿瘤(葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等)具有诊断意义。

  7.心血管病检测标志物:血清心肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的测定对急性心肌梗塞的诊断极为有利。

  8.其他蛋白质:对临床诊断消化道出血和普查筛选消化道肿瘤的重要检测项目大便潜血(FOB);和对系统性红斑狼疮的诊断及临床病情判断意义较大的抗双链DNA抗体;C反应蛋白(CRP);尿白蛋白和对桥本甲状腺炎的诊断有重要意义的甲状腺微粒体抗体等。

  9.其他:检测血糖、尿糖;及检测尿液中其他小分子物质的试剂有苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡和海洛因等。

  四、胶体金免疫结合试验的应用展望

  1.进一步提高检测灵敏度。灵敏度的提高无疑会拓宽金免疫结合试验的检测范围,而采用信号放大系统如生物素亲和素系统[7]或免疫金银染色法进行银加强[8],并结合一些相应的简单检测仪器可能是最有希望的途径之一。

  2.实现检测多元化。可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定2种方式。一次检测可同时得到一组结果,这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。如HBsAg、艾滋病病毒抗体和抗原以及抗HCV的检测组合对献血者检查更为方便。同时检测抗弓形体、抗巨细胞病毒和抗风疹病毒等的抗体在围产期检查中极为有用。

  3.实现定量或半定量检测。(1)根据显色强度应用简单仪器进行定量:GIFA可用反射光密度计对斑点颜色的强度进行测定,可得到半定量的结果。(2)控制受体捕获量:应用多种不同灵敏度受体固定量的方式,通过观察各自显色情况,将待测物含量确定于某一浓度区间,以实现半定量检测。

  4.通用试剂的应用。(1)在间接法检测中用胶体金标记葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG标记物,用于各种抗体的检测[9]。有利于减少非特异性反应,稳定检测试剂的质量。(2)链亲和素固定滤膜检测带可作为通用固定受体,与各种生物素化抗体结合用于检测相应的抗原性物质。由于链亲和素的四价性使其固定于膜材料后,仍能对生物素化抗体保持较高的反应活性,而且两者的结合具有高度的稳定性。

  作者单位:王培之(100011北京地坛医院)

  徐克沂(100011 北京地坛医院)

  皮国华(中国预防医学科学院病毒学研究所)

  参考文献

  1,Valkirs GE,Barton R. immunoconcentration - a new format for solid-phase immunoassays. Clin chem,1985,31:1427-1431.

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  7,Self CH. Enzyme amplification: a general method applied to provide an immunoassisted assay for placental alkaline phosphatase. J Immunol Methods,1985, 76,389-393.

  8,杨振修,陈宽莲,陶义训.银强化金标记免疫吸附试验的方法学研究.上海免疫学杂志,1996,16:42-45.

  9,黄俏佳,兰小鹏,佟韬,等.快速斑点免疫金渗滤法检测梅毒血清反应素.中华医学检验杂志,1996,19:181.


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人心肌肌钙蛋白T胶体金免疫层析法的建立

人心肌肌钙蛋白T胶体金免疫层析法的建立

免疫学杂志 2000年第5期第16卷 技术与方法

作者:李志梁 钱洪津 焦保明 姜朝新 陆青 王素华

单位:李志梁(第一军医大学珠江医院心内科,广东 广州 510280);洪津(第一军医大学珠江医院心内科,广东 广州 510280);焦保明(第一军医大学珠江医院心内科,广东 广州 510280);姜朝新(第一军医大学珠江医院检验科,广东 广州 510280);陆青(第一军医大学珠江医院心内科,广东 广州 510280);王素华(第一军医大学珠江医院心内科,广东 广州 510280)

关键词:心肌肌钙蛋白T;胶体金;链霉亲和素;生物素;免疫层析法

  [摘 要] 目的 建立一种简便、快速、准确检测人心肌肌钙蛋白T(cTnT)的胶体金免疫层析法(GICA)。方法 制备的胶体金标记抗cTnT单克隆抗体3F7,生物素标记另一株抗体2H8,链霉亲和素结合于硝酸纤维素膜上,制成免疫层析试纸条。血清中cTnT与测试条两种抗体结合后,沿硝酸纤维素膜移动,与链霉亲和素交联形成肉眼可见的红色线条。结果 测试条灵敏度可达0.5 ng/ml。检测30例急性心肌梗塞(AMI)患者血清cTnT水平,并与国外同类产品比较,符合率达92%。结论 本方法特异性强、灵敏度高、简便快速,可广泛应用于急性心肌梗塞的早期诊断。

  [中图分类号] 392.33 [文献标识码] A

  [文章编号]1000-8861(2000)05-0380-03

Development of a gold-immunochromatography assay for determi-nation of human cardiac troponin T

LI Zhi-liang QIAN Hong-jin JIAO Bao-ming LU Qing WANG Su-hua

  (Department of Cardiovascular Disease ,Zhujiang Hospital,the First Military Medical University,Guangzhou 510280,China)

  Jiang Chao-xin

  (Department of Laboratory,Zhujiang Hospital,the First Military Medical University,Guangzhou 510280,China)

  [Abstract] Objective To develope a sensitive,rapid and simple gold immunochromatography assay(GICA)for determination of human cardiac troponin T (cTnT)in sera.Methods Colloidal gold was prepared and coupled with anti-cTnT monoclonal antibody 3F7.2H8,another monoclonal antibody,was biotinylated,streptavidin solidified to nitrocellose to prepare a test strip.cTnT in sera which combined with 3F7 and 2H8,migrates up the nitrocellulose strip after combination of serum cTnT and the two antibodies fixed on the test strip,two red lines were detectable to naked eyes.This was taken as positive.Results The sensitivity of GICA was 0.5 ng/ml.The Level of cTnT in 30 patients with acute myocardial infarction(AMI)were measured by this assay and also by using test kit supplied by Boehringer Mannheim Corp.The corresponding rate between the results using this method and that obtained by using products supplied by Boehringer Mannheim Corp was 92%.Conclusion This is a sensitive,specfic,simple and rapid assay for measuring cTnT.It may be used for early diagnosis of AMI.

  [Key words] cardiac troponin T;colloidal gold;streptavidin;biotin;immunochromatography

  人心肌肌钙蛋白(cTnT)是90年代发展起来的一种新的诊断心肌缺血、坏死的高敏感性、高特异性的血清学指标[1],其定量、定性测量方法已在国内外临床心血管领域广泛应用。目前国内应用这一测定方法的测试盒均依赖于国外产品。我们于1994年进行cTnT的基础和临床应用研究,在提取人cTnT、制备抗cTnT单克隆抗体的基础上,采用免疫层析技术,制成检测人cTnT的胶体金免疫层析(GICA)测试条并与宝灵曼产品比较分析,证明本方法具有简便、快速、准确等优点。

  1 材料和方法

  1.1 材料 氯金酸:北京化学试剂厂出品;链霉亲和素:BNHS:Sigma产品;cTnTT、I:本室从自愿者捐献心肌中提取[2];抗cTnT单克隆抗体:本实验室经多次细胞融合制备[3]。从12株细胞株中筛选2H8、3F7两株进行本实验;cTnT定性标准测试条:Boehringer Mannheim Corp产品;血清标本:30例急性心肌梗塞(AMI)患者均有典型胸痛(时间>30 min)、心电图改变及心肌酶学增高(CK-MB超过正常值2倍以上),并经选择性冠状动脉造影证实。所有病人血清标本均在入院时抽取,静置析出血清后即刻检测。50例对照组血清均为本院健康体检者。

  1.2 方法

  1.2.1 胶体金制备及抗cTnT抗体:根据参考文献[4]加以改进。三蒸水溶解氯金酸,加热至沸腾,至终浓度为0.01%,每100 ml加入10%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml。再煮沸10 min呈橙红色,冷却后用0.2 mol/LK2CO3调至pH8.5,快速搅拌下加入纯化的3F7抗体IgG2 mg,加入牛血清的蛋白250 mg,快速搅拌10 min,加入10%NaCl,使NaCl的浓度为1%,摇匀,分别以2 000、4 000、10 000 r/min梯度离心,10 min/次,最后获得沉淀物即为初步纯化的金标记抗cTnT结合物,溶于储存液。

  1.2.2 生物素化抗体2H8制备:根据参考文献[5]的方法加以改进为:按BNHS∶IgG>(重量比)根据1∶7进行,室温搅拌3 h后,用pH7.2 0.05 mol/L PB溶液透析过夜,加等量甘油,-30 °C储存。

  1.2.3 免疫测试条的制备:根据Müller-Bardoff法改进[6]。整个测试条由2层吸水纤维,1层硝酸纤维素膜,吸水滤纸及白色塑料垫板组成。吸水纤维使用前予0.5%BSA处理,上层吸水纤维点生物素化抗体2H8,下层吸水纤维点胶体金标记抗体3H7,硝酸纤维素膜上标记1∶100链霉亲和素(检测线)及兔抗鼠IgG(对照线),均为1 mm宽。晾干后用含1%新生牛血清的0.1 mol/L pH7.4 PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片上。切成0.6 cm×10 cm条,-4 °C储存备用。

  1.2.4 cTnT检测:新鲜血清0.5 ml滴入检测孔观察20 min。结果判定:以硝酸纤维素膜上出现两条红色为cTnT阳性;若有对照线红色为阴性;两条线均无显色为测试条失效。为检测其灵敏度,将cTnT抗原按0,0.1,0.2,0.5,1,10 ng/ml滴入测试孔,检测线出现红色则为最低可测定量。

  2 结果

  2.1 特异性 本测试条与cTnT,cTnI反应,显示仅与cTnT反应,与cTnI呈阴性反应。测定健康体检者有一例弱阳性反应。

  2.2 灵敏度 当cTnT浓度高于0.5 ng/ml时,检测线为红色,示其最低检测值可达0.5 ng/ml(见图1)。

图1两种测试条检测cTnT

  Fig 1Two assays detecting cTnT

  A:Boehringer Mannheim Corp.assay;B:Colloidal gold immunochromatography assay.The level of cTnT antigen is 0.5 ng/ml.

  2.3 稳定性 将测试条置入-4 °C 1个月后,与新制备的测试条比较无明显差异。

  2.4 临床初步检测 30例AMI患者及50例健康体检者血清应用本测试条及国外同类产品比较,本测试条50例健康人血清中1例为弱阳性,符合率为96%;30例AMI患者,其中26例为阳性,符合率为86.66%(见表1,2)。

表1 急性心肌梗塞血清cTcT水平

  Tab 1 Detecting results of serum cTnT both AMI and control groups

group sample

  number

this method BMC method
positive

  number

positive

  rate(%)

positive

  number

positive

  rate(%)

AMI 30 26 86.66 30 100
health control 50  1 98  0  0
Total 80 27 33.75 30  37.5

  BMC:Boechringer Mannheim Corp

表2 两种方法测定结果比较

  Tab 2 Comparison of positive and negetive results in 80 sera using two assays

this assay BMCassay total
26  1 27
 4 49 53
total 30 50 80

  BMC:Boechringer Mannheim Corp3 讨论

  免疫层析技术是80年代发展的一种独特的免疫分析方式。以条状纤维层析材料为固相,通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,当样品与纤维材料上相应的抗体相结合产生高特异、高亲和的免疫反应,并滞留或富集在检测区域,通过反应物而出现呈色现象,是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术[7]。现在临床广泛使用的人绒毛膜促性腺激素(HCG)、乙型肝炎表面抗原(HbsAg)、可卡因等检测方法均是采用这类方法建立的,其优点是在于快捷、简便、准确,具有高度特异性及高敏感性。

  本实验采用链霉亲和素固定于检测带,是根据链霉亲和素具有与各种生物素化抗体结合的能力,同时其四价性使其具有较高的放大系统,提高其敏感性和稳定性[6,7]。这对于检测血清中含有极微量(ng/ml水平)物质是极重要的。本实验是在建立了链霉亲和素-ELISA定量检测cTnT的基础上进行的,同时cTnT血清正常水平应在0.1 ng/ml以下,因此,不引入链霉亲和素是无法实现检测目的的,宝灵曼cTnT产品亦是采用这一方法而实现的。

  胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同,前者技术要求更高,实施中更为困难。其主要原因在于:①胶体金免疫层析技术发展快,时间较短;②层析材料选择,处理至为重要。本实验采用国内外5种层析材料,其差异性较大,国内产品尚无法达到要求;③必须有较好的抗体及固定、稳定方法。

  本测试条诊断临床急性心肌梗塞患者血清cTnT与国外同类产品比较符合率为86.66%,与冠状动脉结果比较,检测敏感性略低于国外同类产品,但基本达到临床早期快速、特异诊断的目的。目前这一国外产品价格昂贵,临床广泛开展和使用有困难。本方法的成功建立为国内城乡罹患心肌缺血、坏死患者的临床诊断提供新的手段,并具有广泛的应用价值。

  [基金项目] 广州市重点攻关项目(9724806)

  [作者简介] 李志梁(1958-),男,福建长汀县人,硕士,副教授,主要从事冠心病早期诊断和防治的研究。

[参考文献]

  [1] 杨振华.应考虑在缺血性心脏疾病中使用一些新的生化标记物[J].中华心血管杂志,1997,25(5):327-329.

  [2] 李志梁,付朝平,陆 青,等.人心肌肌钙蛋白T的纯化和鉴定[J].第一军医大学学报,1996,16(2):130-131.

  [3] 李志梁,付朝平,陆 青,等.人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体的制备[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(4):459-461.

  [4] 蔡文琴,王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术[M].成都:四川科学技术出版社,1994.100-108.

  [5] 李成文.现代免疫化学技术[M].上海:上海科学技术出版社,1992.160-168.

  [6] MULLER-BARDORFF M,FREITAGX H,SCHEFFOLD T,et al.Development and characterization of a rapid assay for bedside determinations of cardic of troponin T[J].Circulation,1995,92(9):2 869-2 876.

  [7] 吴冯波,侯惠仁,贺优丰,等.免疫层析分析进展[J].中华医学检验杂志,1998,22(2):122—127.

  [收稿日期] 1999-10-26; [修回日期]2000-05-16


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应用包埋前免疫胶体金直接法研究细胞内病毒抗原超微定位

应用包埋前免疫胶体金直接法研究细胞内病毒抗原超微定位

中国免疫学杂志 1999年第12期第15卷 免疫学技术与方法

作者:李向群 毛琳 文莉 肖红 杨占秋

单位:湖北医科大学病毒所临床病毒室,武汉 430071

关键词:包埋前免疫胶体金技术;免疫电镜;I型单纯疱疹病毒;病毒抗原

  摘 要 目的:探讨细胞内病毒抗原的超微定位的方法。方法:采用包埋前免疫胶体金方法标记I型单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原以研究该病毒在人胚肺细胞(HEL)内的超微定位。结果:发现金颗粒约为5 nm,大小均一,在HSV-1囊膜、内质网膜表面及其邻近区域有大量的金颗粒,而阴性对照在这些地方未见金颗粒。结论:表明包埋前免疫胶体金方法可靠,可用于病毒抗原的超微定位研究。

  中国图书分类号 R392-33

The application of preembedding direct immunogold for ultrastructual localization of intracellular antigens of HSV-1

LI Xiang-Qun,MAO Lin,WEN Li et al.

  Department of Clinical Virology,Institute of Virology Research,Hubei Medical University,Wuhan 430071

  Abstract Objective:In order to explore the method for ultrastructual localization of viral intracellular antigens.Methods:The authors established a preembedding direct immunogold method to study the localization of HSV-1 antigens in human embryo lung cell.Results:The immunmoeletronic microscopy show that a lot of SPA-gold particles (diameter about 5 nm)exist in the membrance of HSV-1 envelope and endoplasmic reticulum and the areas adjacent to them ,but no SPA-gold particules exist in the same areas.Conclusion:Those results suggest that the preembedding direct immunogold method is reliable and can be used for ultrastructual localization of viral antigens.

  Key words Preembedding immunogold technique Immunoelectronic microscopy Herpes simplex virus type I Viral antigens

  细胞内病毒抗原的定位及检测,不仅可用于病毒鉴定,而且是研究病毒形态发生及病毒致病机理的重要手段,细胞内病毒抗原的定位以往多用免疫荧光法(IF)和过氧化物-抗过氧化物酶法(PAP)。前者不能用于细胞内抗原的超微定位;后者虽能,但由于有显色剂电子密度低在电镜下阳性显色不易与正常细胞结构区别等缺点。为克服上述方法的不足,我们建立了包埋前免疫胶体金直接法标记细胞内病毒抗原方法,且成功地应用于研究I型单纯疱疹病毒抗原的超微定位。

  1 材料与方法

  1.1 细胞与病毒

  1.1.1 人胚肺细胞(HEL) 人胚肺取自人工引产4个月胚胎,按常规制备传代HEL细胞。

  1.1.2 I型单纯疱疹病毒SM44株(HSV-1 SM44) 由美国耶鲁大学医学院熊菊贞教授惠赠。

  1.2 氯化金(HAuCl4) 上海试剂一厂产品,批号XK13-0010801064。

  1.3 葡萄球菌A蛋白(SPA) 西德Boehringer公司,Cot NO.775177。

  1.4 血清 从武汉市七医院产妇血清中筛选出HSV-1阴性血清和HSV-1阳性血清,其免疫荧光效价为1:640。

  1.5 5 nm胶体金制备 按Romano方法制备[1]

  1.6 SPA胶体金复合物的制备、纯化和质量鉴定

  1.6.1 SPA与胶体金结合的最适浓度测定 取50 μl SPA(1 mg/0.2 ml)加入硅化的1.5 ml Ep管中用0.005 mol/L NaCl进行倍比稀释,各管加入250 μl胶体金液(pH 6)混匀后再加入250 μl 10% NaCl,用胶体金颜色由红变蓝的EP管的SPA量,计算出稳定1 ml 5 nm胶体需SPA 6 μg。

  1.6.2 SPA胶体金复合物的纯化及鉴定 按上述最适浓度将SPA与胶体金混合,加入1%聚乙二醇2000(PEG-2000)使其最终浓度为0.05%,60 000 r/min, 4℃,离心1 h,于透射电镜下摄片鉴定其大小均一性。

  1.7 包埋前胶体金标记细胞内抗原的电镜观察 HSV-1 SM44感染HEL细胞12 h,细胞病变至++,用PBS洗3次,橡皮帚刮下细胞,1 500 r/min,离心10 min,细胞沉淀悬浮于0.5 ml 1%多聚甲醛、0.002%皂素、0.025%戊二醛混合液中,4℃ 1 h,PBS洗3次,加1:40稀释的HSV-1阳性血清。室温1 h,PBS洗3次,加1:80稀释的SPA胶体金复合物,室温

  1 h,PBS洗3次后,常规锇酸固定、乙醇脱水、包埋、切片用于透射电镜观察,用阴性血清代替阳性血清作阴性对照。

  2 结果

  2.1 SPA胶体金均一性及大小鉴定 在电镜下见SPA胶体金呈圆形,单个分散,电子密度高、致密。金颗粒大小基本一致,其直径平均为(5.04±1.14) nm(图1)。

  2.2 SPA胶体金直接法标记HSV-1电镜观察 电镜下见HEL细胞膜结构完整,细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合,在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒,他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集(图2)。阴性对照电镜下可见细胞膜结构完整,细胞核内有大量未成熟的HSV-1颗粒。细胞浆内有大量成熟的病毒颗粒,但其囊膜上无特异性结合的金颗粒。少量金颗粒透入细胞浆及细胞核内呈随机散在游离性分布(图3)。

图1 5 nm SPA胶体金电镜观察

  Fig.1 Electronic microscopy of 5 nm SPA-immunogold

图2 SPA胶体金标记HSV-1抗原免疫电镜

  Fig.2 The immunoelectronic microscopy of SPA-gold labelled HSV-1 antigens

  Note:a. the SPA-gold particles conjugatied with the envelope of mature HSV-1;b. the SPA-gold particles conjugated with the envelope of immature HSV-1;c. the SPA-gold particles existed in the membrance of endoplasmic reticulum;d. the areas congregated with SPA-gold particles

图3 阴性对照免疫电镜

  Fig.3 The immunoelectronic microscopy of negative control

  Note:a.immature HSV-1 in nucleus b.mature HSV-1 in cytoplasm c.the scattering free gold particles

  3 讨论

  自Faulk等建立胶体金免疫电镜技术以来,该方法广泛地应用于细胞内分泌蛋白、多肽、膜结构蛋白、胞浆蛋白等抗原的超微定位研究[2-6],但用于病毒抗原的研究鲜有报道。上述研究多用包埋后免疫金标记的方法,该方法有非特异性金颗粒较多的不足。我们用皂素处理HEL细胞,在包埋前用自己制备的5 nm SPA胶体金成功地标记了HSV-1抗原,电镜下可清楚地显示HSV-1在形态发生过程中抗原在细胞内的分布,其分布的部位与HSV-1在核内复制,由核膜芽生,经内质网输送至胞浆。成熟释放于胞外的增殖过程及与HSV-1结构蛋白抗原的分布相符。

  我们在细胞固定时加入皂素的目的是为增加细胞膜结构的通透性,使抗体和SPA金颗粒易于透过细胞膜。皂素的量要适当,其浓度太高有损于细胞膜结构的完整性,且非特异性金颗粒增多,皂素浓度过低影响特异性标记的效果。包埋前免疫金标记排除了包埋和切片过程中对待检抗原的抗原性影响,因而比包埋后金标更真实地反映病毒抗原的分布情况。

  总之,我们建立的包埋前胶体金直接法标记细胞内病毒抗原的方法具有简便、经济、特异性好,可用于病毒抗原超微定位,研究病毒抗原的分布、动态变化、定量分析及病毒鉴定。

  作者简介:李向群,男,35岁,微生物及免疫学硕士;

  指导教师,杨占秋,男,47岁,博士生导师,主要从事病毒免疫学研究

  参考文献

  1 Romano E L,Stobinskic,Hcghes N C et al.An anti-globulin reagent labelled with colloidal gold for use in electron microscopy.Immunochemistry,1974;11:521

  2 Faulk W P,Taylor G M.An immunocoloid method for the electron microscope.Immunochemistry,1971;8:1081

  3 Bendayan M,Roth J,Perrelet A et al.Quantitative immunocytochemical localization of pancreatic secretory proteins in subcellular compartments of rat acinar cell.J Histochem Cytochem,1980;28:149

  4 Ravazzola M, Orcil L.Glucagon and glicentin immunocreactivity are topologically segregated in the grarule of human panereatic A cell.Nature,1980;284:66

  5 Roth J, Thorens B,Hunziker W et al.Immunocytochemical localization of galactosyltransferase Hela cells:codistribution with thiamine pyrophospha-tase in trans gogicis ternae.J Cell Biol,1984;263:1760

  6 Roth J, Thorens B,Hunziker W et al.Vitamin D-dependent calcium binding protein:Immunocytochemical localization in chick kidney.Science,1981;214:197

收稿 1998-10-10 修回 1999-02-01


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