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与肾脏发生相关的基因研究进展

  从基因水平来研究器官发生学,将以往的形态发生学的研究方法提高到分子水平。一些基因在肾脏发生,特别是后肾发生中起着重要的作用。当这些基因被破坏时,导致肾脏不能正常地发生,并且对肾脏疾病的形成有着极为深刻的影响。本文对近年来一些基因与肾脏发生的关系,以及这些基因破坏时对肾脏发生影响的有关研究进行综述。

  与肾脏发生相关的基因主要在后肾发生阶段发挥作用,它们对后肾的发生起着决定性的作用。这些基因异常可引起后肾的发生、发育障碍。

  1 WT-1 基因

  WT-1基因是一种肿瘤抑制基因,1990年由Call等克隆,其主要功能是特异识别并结合目标DNA,调节转录。当其识别部位受到影响时,可抑制转录。该基因对泌尿生殖系的发育和儿童wilms肾肿瘤的发生有重要意义。当WT-1基因发生突变时,导致儿童wilms 肾肿瘤。另外芽胚WT-1基因发生突变时与泌尿生殖系的畸型发生有关。WT-1基因最早表达在中肾小管,进一步研究显示,WT-1基因变异体小鼠(mutant mice)中肾小管的头侧与尾侧两个部位发生异常,即中肾小管的尾侧缺乏,头侧在雌性小鼠退化,在雄性小鼠则转为附睾导管[1]。

  如同许多基因作用于发生中的多阶段一样,WT-1基因与心脏和肾脏的发生有关。WT-1基因变异鼠在胚胎期约15天死亡,其中死于肾衰者多于死于心衰者。WT-1基因在后肾发生的早期中起着必要的作用。它对于输尿管芽的生长起着决定性的作用。生后肾原基中功能性WT-1的缺失是引起WT-1基因变异体个体肾缺失的主要原因。

  2 Pax-2 基因

  Pax-2基因是配对盒家族中的转录因子(trabscription factor of the paired box family)。在正常情况下,Pax-2表达在凝缩中的中肾导管、输导管芽以及生后肾原基[2],杂合子型Pax-2变异体由于在输尿管上部及稀释皮质部缺少氧化钙而容易导致肾发育不良,提示在输尿管芽的分枝及生后肾原基的上皮转化中存在缺失和(或)缺乏输尿管芽及生后肾原基的细胞增生[3]。在纯合子Pax-2变异体的新生鼠中,完全缺乏肾脏、输尿管及生殖道。这种变异体鼠于生后第1天死于肾衰。另外,这种基因变异体的中肾导管不能伸入泄殖腔且不能表达c-ret基因[3],c-ret基因还作为中肾导管及输尿管的标志物而发挥作用。

  3 c-ret 基因

  c-ret基因编码受体酪氨酸激酶,是将信息传导给细胞以生长发育,位于细胞表面的分子。c-ret基因正常表达在发生中的神经系统、中肾导管及输尿管芽。在输尿管芽长出前c-ret基因表达在正常中肾导管。

  c-ret变异体鼠于出生后第一天内死于肾衰。此时,变异体的肾原基内能识别的肾成分、形成成熟集合管的输尿管及较大范围未分化的间质已减少,58%的c-ret基因变异体出现两侧完全性发育不全,31%的变异体出现单侧肾发育不全,33%的变异体完全缺乏输尿管[4]。由此说明c-ret基因在肾发生过程中,从生后肾原基中将信息传导给输尿管芽以正常地发生[4]。

  4 GDNF 基因

  GDNF基因是形成生长因子的超家族成员之一,它是在大部分c-ret与GDNF基因敲除鼠(knock out mice)被鉴定的表型中作为c-ret基因受体的配体而被鉴定[5]。资料显示,GDNF基因是一种生后肾原基由来因子,它通过其受体c-ret诱导输尿管芽的生长和分枝[6,7]。

  在GDNF的基因变异体中前肾与中肾正常,且于胚胎期2.5天尚可见Pax-2基因表达在生后肾原基[7]。Pax-2基因变异体的中肾导管中没有c-ret基因的表达[4],表明Pax-2基因可能位于GDNF/c-ret基因的上游。其生后肾原基在胚胎期13.5天经过凋亡而完全消失[6]

  与c-ret基因变异体一样,GDNF基因变异体在出生后12~14h内死于肾发育不全所致的肾衰。与c-ret对照,将近35%的GDNF杂合子变异体在生后3~5个月时由于单侧或双侧肾发育不全而出现肾功能异常[6,7]。为了探讨GDNF基因是否对输尿管芽的分枝有影响,Pichel等将GDNF基因进行重组,并用移植的泌尿生殖器进行孵

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育,其结果显示,在体外GDNF基因变异体的输尿管分枝有意义地增加[7]。

  5 Wnt-4 基因

  Wnt-4基因编码分泌型糖蛋白,目前尚不知道其确切受体。Wnt-4基因在后肾的间质转化为上皮的过程中发挥着自身调节因子的作用。在胚胎期12.5天,Wnt-4基因变异体内输尿管芽周围的生后肾原基开始凝缩,直至胚胎期14天,发生过程正常。在胚胎期15天,变异体的肾脏生长明显迟缓,可观察到非逗号及非S型的小体,表明生后肾原基被诱导,但没有经历前小管的集合及上皮转化。在胚胎期14.5天以前的Wnt-4基因变异体中,WT-1基因及Pax-2基因的表达正常,且此时c-ret基因表达在输尿管芽内[8]。所以WT-1、Pax-2、及c-ret基因可能与Wnt-4基因的转录调节有关。

  Stark等[8]对12种鼠Wnt基因进行调查的结果表明,Wnt基因在胚胎期11.5天表达在中肾导管周围的中肾间质,以后表达在肾发生中的皮质部生后肾原基内,并在此形成新的小管聚合。Wnt-4基因变异鼠在出生后24h内死于肾衰,其肾脏小且发育不全,由输尿管芽点缀的未分化生后肾原基组成。

  6 BF-2 基因

  BF-2基因于1994年由Hatini等[9]克隆,他最近在lacZ基因使用敲入/敲除(knock-in/knock-out)方法建立了BF-2变异体鼠。这种杂合子变异体鼠首先显示了β-gal的表达,β-gal作为BF-2基因启动部位的受体在胚胎期11.5天输尿管芽长出后输尿管间质周围发挥作用。β-gal的表达定义为包绕在被诱导的生后肾原基周围的细胞环。它是产生肾基质的细胞环[9]。

  BF-2基因变异体鼠于出生后24h之内死于肾衰,其输尿管短,肾脏发育不全。与野生型比较,肾脏被纵向融合,并旋转了90度。BF-2变异体的肾脏不到正常肾脏的1/3,与相应的野生型相比,仅含有1/14的肾小球[9]。

  7 BMP-7 基因

  骨形态发生蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7,又称为成骨蛋白-7)是TGF-β的超家族成员之一,BMPs是TGF-β超家族中的最大亚群。BMP-7基因最初于胚胎期表达在中肾导管及小管[10],在后肾形成期间,基因转录并表达在肾发生区的间质、正在凝缩聚合的部位及逗点、S型结构的上皮,在输尿管芽有微弱的表达[11]。BMP-7基因在整个肾发生期都有表达,成人肾也能观察到BMP-7基因的表达[12]

  BMP基因变异体在出生后24h内死于肾衰,并出现骨骼重叠,缺乏眼的形成[11,13]。在胚胎期14.5天,BMP基因变异体鼠与野生鼠之间在形态学方面没有明显的不同。这种基因变异体鼠的肾脏结构正常,输尿管芽明显地分枝,其逗号小体及S型小体也存在,表明它们之间的相互作用对于已出现的后肾初期生长及分化是必要的。另外,在胚胎期12.5天的BMP-7基因变异体有WT-1基因的表达[13],在胚胎期14.5天c-ret基因、Pax-2基因及Wnt-4基因的表达正常。在此胚胎期两天以后,证实有少量活性间质聚合形成,肾周围层缺乏间质干细胞,而髓质部位充满大量的集合管,其中散在着疏松的基质细胞。BMP-7基因变异体在出生时缺乏肾小球[13]。与野生型对照组比较,其生后肾原基内细胞凋亡大大增强[13]。

  8 PDGF B基因与PDGF Rβ基因

  血小板源性生长因子B是血小板由来生长因子家族的成员之一。PDGFs原作为血小板的分泌产物而被鉴定,但以后显示由许多正常细胞合成,如平滑肌细胞。PDGF B以二聚体稳态的形式存在,并能与PDGF受体α或β亚基相结合,PDGF β亚基是酪氨酸激酶受体,仅能与PDGF B结合。PDGF B与PDGF R表达在发生中的人体肾[14],PDGF B与PDGF R在肾小球系膜也有表达,提示这种配体/受体结合在肾小球发生中的作用[15],Soriano[16]将lacZ基因与pgk-neo基因相连接以观察PDGF β基因启动部位在杂合子变异体上的表达。PDGF β基因在肾小球发生早期表达在输尿管芽,在发生后期主要局限于系膜细胞。

  PDGF B与PDGF R基因变异体的表型已被鉴定。虽肾小球的数目没有改变,但二者因缺乏系膜细胞及肾小球毛细血管丛而显示出肾小球发生的明显异常。然而肾小球基膜、内皮细胞、肾小球脏层上皮细胞(又称为肾小球足细胞)都在正常范围内出现。一些PDGF B及PDGF R变异体在胚胎期17天到18.5天内死亡,但大多数由于不能进行氧合作用而于出生时死亡。出生时,变异体鼠还出现血液学的异常并出现明显的出血和水肿[16]。虽有的变异体鼠出生时幸存,但随后死于缺乏毛细血管丛及肾小球异常所致的肾衰。有资料表明,PDGF B通过PDGF R而起作用,这对于肾小球系膜细胞的发生、系膜细胞的转化和肾小球毛细血管丛的形成是必要的[16]。

  9 α3β1和α8β1基因

  α3 β1和α8 β1基因是整合素(integrin)家族成员。整合素是由信息α和信息β链组成的细胞表面异二聚体受体,并且是细胞外基质受体的主要成员。在输尿管芽生长以前,没有显示α8 β1的表达。在胚胎期11天,α8 β1基因表达在整个生后肾原基以及包绕在生后肾原基周围的正在成长和分枝的输尿管芽。当生后肾原基经历了上皮转化后,α8 β1基因表达消失在上皮结构中[17]。α3 β1基因表达在输尿管芽及诱导的集合导管,肾小球内皮细胞和肾小球脏层的上皮细胞。其它的整合素,如α2 β1和α6 β1也表达在肾发生中[18]。68%的α8 β1变异体在出生时没有肾脏,并在出生后24h之内死于肾衰。80%没有输尿管。除肾脏外,其它的器官似乎没有受到影响。在缺乏α8 β1整合素的动物中,虽有输尿管芽形成,但生后肾原基的生长及分枝却受到严重的抑制。生后肾原基的上皮转化也受到损伤,17%的变异体动物在出生时被证实有上皮的转化。另外,Pax-2基因表达在α8 β1基因变异体的生后肾原基中[17]。

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  α3 β1基因变异体鼠虽然在肾脏发生中出现明显的异常,但多于生后24h内死于肾衰。其基因变异体的肾脏比野生型的要小,髓质的集合管减少了1/2。最明显的异常出现在肾小球的脏层上皮细胞,表现为数目上显著减少。随后是肾小球的周围,表现为完全缺乏底部形成的过程。肾小球基底膜的结构也受到破坏,α3 β1变异体肾扩大,邻近的小管含有过剩的溶酶体或成为小囊。有关α3 β1基因在小管的表达尚未见报道,在野生型对照组中使用一种抗α3的抗体,观察到其发生中的小管缺乏α3的表达,提示α3 β1变异体的小管表型是肾小球异常的一种继发性的结果[19]。这些结果提示α3 β1基因在肾小球脏层上皮细胞发生、肾小球基膜形成、以及输尿管芽分枝的形态发生学中起着重要作用。

  除以上基因外,还有几种基因与肾脏发生密切相关。如Lim 1的基因变异体鼠一般死于胚胎期10天,即在后肾发生以前[20]。另外,N-myc基因的变异体鼠死于胚胎期11天,且在胚胎早期出现中肾发生异常[21]。其它如与成年多囊肾肾病有关的Bcl-2基因变异体鼠等[22],这些基因及基因破坏在器官发生学方面的研究已获得了大量有关肾发生及哺乳动物发生的大量信息,对于研究肾脏疾病的发病机制及从基因方面开展治疗具有重要意义。虽然这些研究刚刚起步,但相信将不断取得新的进展。

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日期:2004年9月24日 - 来自[病理生理学]栏目
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基因表达差异分析方法进展

  高等真核生物的基因组一般具有80 000~100 000个基因,而每一个细胞大约只表达其中的15%[1]。基因在不同细胞间及不同生长阶段的选择性表达决定了生命活动的多样性,如发育与分化、衰老与死亡、内环境稳定、细胞周期调控等。比较细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。

  由于真核细胞 mRNA 3′端一般含有 poly( a)尾,因此现有的方法基本上都是利用共同引物将不同的 mRNA反转录成 cDNA,以 cDNA为对象研究基因表达的差异。1992年 Liang等[2]建立了一种差异显示反转录 pCR法( differential display reverse transcription PCR, dDRT-PCR),为检测成批基因表达的差异开辟了新天地。迄今为止已出现了大量应用该技术的研究报道[3,4]。然而,尽管应用 dDRT-PCR方法已经取得了不少成果,而且该方法还在不断改进之中,但它仍然存在几个难以解决的问题:(1)重复率低,至少有20%的差异条带不能被准确重复[5];(2)假阳性率可以高达90%[6];(3)获得的差异表达序列极少包含编码信息。近年来,针对 dDRT-PCR方法的不足,又有几种新的检测差异表达基因的方法出现,现仅就这方面的进展做一简要介绍。

  1.基因表达指纹( gene expression fingerprinting, gEF): gEF技术使用生物素标记的引物 bio-T13合成 cDNA第一链,用 dGTP对其进行末端加尾,再以富含 c的引物引发合成 cDNA第二链。用限制性内切酶消化双链 cDNA,以交联有抗生物素蛋白的微球捕获 cDNA3′端,以 t4DNA连接酶连接同前述内切酶相对应的适配子,并以 bio-T13及适配子中的序列作为新的引物进行特异的 pCR扩增,得到大量的特异 cDNA片段。适配子末端被32P-dATP标记后,固定于微球上的 cDNA片段经过一系列酶切,产生的酶切片段从微球表面释放出来,其中那些含有标记末端的片段经凝胶电泳后构成 mRNA指纹图谱。通过分析不同细胞间的指纹图谱就能得到差异表达的序列[7]。 gEF技术所需的工作量较 dDRT-PCR明显减少,由于用酶切反应替代了条件不严格的 pCR反应,其重复性也较好,假阳性率低,并且所获得的片段中包含有一定的编码信息。 gEF技术最大的缺点在于电泳技术的局限。由于它的指纹图谱要显示在同一块电泳胶上,经过几轮酶切之后常会得到1 000~2 000条电泳带,而现有的 pAGE电泳很少能分辨超过400条带,故只有15%~30%的 mRNA能够被辨认出来,因此得到的只能是高表达基因。如果希望寻找部分新基因,这是一种比较简单有效的方法;如果希望得到有关某种细胞的基因表达谱,可能比较困难;采用双向电泳技术可能会有所帮助[8]。

  2.基因表达系统分析( serial analysis of gene expression, sAGE): sAGE法的建立基于两条理论。首先,一段来自某个转录子确定位置的核苷酸,其长度只要有9~10个 bp,就能够特异地确认该转录子。第二,对短片段标签的链接有利于在同一克隆中对多个标签测序。 sAGE也是用生物素标记的 bio-Oligo(dT)为引物合成双链 cDNA,然后以限制酶(锚定酶)进行酶切,捕获 cDNA3′端。在此处产物被分为两部分,分别与包含有 iIS型内切酶(标签酶)位点的 a、 b连接子相接。 iIS型内切酶的特点是作用位点处于识别位点之外。这样经过酶切,就有可能得到只有9~10bp的标签序列。每两个标签的钝端结合后成为 pCR的模板,以基于 a、 b连接子的引物进行 pCR反应的结果是得到了大量每条包含两个不同来源标签的序列,接下来再用锚定酶酶切、连接,就能将多个不同的标签链接在一起(大约为每条包含数十个不同来源的标签),克隆至质粒载体中后集中测序[9,10]。 sAGE的最终结果是通过计算机统计得到的,根据某个标签出现频率的高低来判断并计算其所属基因表达的丰度。对于在数据库中找不到对应序列的标签,还可以利用13bp的寡核苷酸探针(9bp加上锚定酶识别位点的4bp)对 cDNA文库进行筛选,以寻找新基因。 sAGE可以检测不同细胞间已知基因表达的具体差异,精确到每个细胞中大约有多少拷贝,可以建立较全面的基因表达谱,系统地分析基因表达的差异。它的缺点在于工作量非常大,有大量的测序及计算机分析任务;而且,对于寻找新基因而言,仅用长度为13bp的寡核苷酸探针筛选 cDNA文库是很不严格的,根据我们的经验,往往是假阳性结果居多。

  3 . cDNA3′端限制酶切片段显示( display of 3′ end restriction fragments of cDNAs):cDNA3′端 rFD利用带有“踵”结构的锚定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一链,以 okayama和 berg的置换法合成 cDNA第二链,然后将双链 cDNA以限制酶消化。本方法的适配子由 a1和 a2两条寡核苷酸构成,其序列与所用限制酶识别位点相符合,先将 a2的5′端磷酸化,再加入 a1退火,就会形成一个 y型结构;把 y型适配子与酶切后的 cDNA片段相连接,以适配子及锚定引物中所含序列为特异引物进行 pCR反应,则只有 cDNA3′末端的一段被扩增出来,这时的产物可用凝胶电泳表示出来构成差异表达图谱。对于每次切割6bp的限制酶来说,每种大概只能切割8%的 cDNA,因此至少需要12种以上的限制酶才能使所有 cDNA都显示出来[11]。 cDNA3′端 rFD与 gEF的思路比较相似,由于它利用多种限制酶进行酶切,因此不会象 gEF因凝胶电泳分辨率不够而漏掉信息。它的重复性较好,假阳性率低,尤其是对于已知基因,可以根据选择内切酶的作用位点确定该基因在凝胶电泳中的位置并判断其含量,从而避免了进一步的分析。对于精力有限的研究人员,这可能是个值得一试的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相类似的缺点,它得到的片段中包含的编码信息比较少,需要多花一些时间对所得到的差异条带进一步分析。

  4.分子指数的 rNA指纹( rNA fingerprinting by molecular indexing, mI):MI是一种能够较好地显示 mRNA中编码序列的方法。它利用Ⅱ s型内切酶的作用位点在识别位点之外可以形成一个4bp的突出端的特点,设计43共64种(最外侧一个核苷酸随机)适配子,使得获取编码序列片段成为可能。首先是以常规方法合成双链 cDNA,用Ⅱ类限制酶进行酶切后连接5′端磷酸化的相应适配子,再以Ⅱ s类

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内切酶酶切后形成一个随机的4 bp突出端,用连接有生物素的64种适配子予以结合,可将这些限制片段分为64类,用包被抗生物素蛋白的磁珠捕获连接产物,就可以利用前后两个适配子所携带的特异序列为引物进行 pCR扩增反应,凝胶电泳显示表达差异[12]。由于扩增的序列位于 cDNA内部,因此最后得到编码序列的可能性很大,这是该方法最大的优点。鉴于并不是所有 cDNA都含有某一识别位点,故采用不同的内切酶组合。理论上可以显示所有的差异表达基因,但这样一来工作量就变得十分巨大。因此,该方法只适合对样本的快速分析和部分差异表达基因的研究;如果要对某种细胞的基因表达进行全面的研究,可能还要采用其它的方法。

  5.抑制性消减杂交( suppression subtractive hybridization, sSH): SSH方法源于代表性差异分析法( representational difference analysis, RDA)。它原是一种研究基因组之间差异的以杂交为基础的方法。 diatchenko等[13]将“抑制性 pCR”理论[14]与 rDA相结合,建立了一种分离差异表达基因的新方法。 sSH将需要检测的细胞称为“检测子”,将对照细胞 mRNA称为“驱赶子”,把 mRNA合成 cDNA后,通过仅仅两轮杂交和 pCR过程,就能有效地分离到在检测子中表达,而在驱赶子中不表达或表达丰度不同的 mRNA(图5)。通过 sSH有可能得到某种细胞中相对其他组织的差异表达基因的全面信息,它较好地克服了其它方法中低丰度基因难以得到的问题,据称对低拷贝基因的富集可以达到1 000~5 000倍,因此可能发现一些用原有方法没有检测到的新基因。这方面已经有人进行了尝试[15,16],获得了一些成果。 sSH的不足之处在于它需要 mRNA的量较大,检测子和驱赶子都要达到2微克以上,这在某些情况下是非常难以做到的,因此目前有关 sSH的报道基本上都以肿瘤细胞为研究对象。

  基因表达差异的研究方法在 dDRT-PCR出现之后又有了很大的发展,每种方法都各有自己的优缺点,研究人员应该根据自己的侧重点选择适合于自己的方法。目前真正能够做到简单、准确、全面地揭示基因表达差异的方法仍在不断探索之中,因此许多研究机构仍采用 dDRT-PCR来达到自己的目的,毕竟经过最近数年的完善,该技术在许多方面都有了一定的改进,完成一般的研究项目已是绰绰有余。 sSH作为一种基因表达差异研究的新方法,假阳性率低,所得到的结果也更加全面,因此,希望以不太复杂的方法全面揭示差异表达基因的研究者,可以尝试一下这种方法。

  作者单位:200433 上海,第二军医大学长海医院烧伤中心

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日期:2004年9月23日 - 来自[遗传学]栏目

人α-珠蛋白基因表达调控研究进展

  摘 要 人α-类珠蛋白基因簇位于6号染色体的短臂近端粒区,由4个功能基因和3个假基因组成,其中,ξ-珠蛋白基因在胚胎期表达,α2、α1和θ珠蛋白基因在胎儿和成人期表达。α-类珠蛋白基因的主要调控序列位于ξ-珠蛋白基因上游40kb的位置,称为HS-40,另外还存在其它的HS位点。在HS-40和各种珠蛋白基因启动子上有多种红系和通用反式作用因子的结合位点,它们间的协同作用保证了α-类珠蛋白基因表达的组织和时序特异性。对于α-类珠蛋白基因表达调控的研究主要采用转基因动物和细胞转染的方法。

  血红素结合蛋白是一类广泛存在的蛋白质,从细菌、真菌、软体动物到植物和脊椎动物细胞内都有分布,功能也各不相同,但是它们都来自共同的始祖基因。血红蛋白在体内承担着运输氧气和CO2的生理功能,每个红细胞约含2.8亿个血红蛋白分子,是红细胞中的主要蛋白质。人从胚胎、胎儿、新生儿到成年整个发育过程中,共有HbGower I (ζ2ε2)、HbGower Ⅱ (α2ε2)、HbPortland(ξ2γ2)、HbF(α2γ2)、HbA2(α2δ2)和HbA(α2β2)六种血红蛋白出现,其α类和β类由两种不同的珠蛋白多肽链和血红素分子构成,其中α-类珠蛋白基因包括ξ、α2、α1和θ,β-类珠蛋白包括β、δ、ε和γ。α-类珠蛋白与β-珠蛋白的同源性为50%,空间结构相似,大约在5亿年前由共同的始祖基因进化而来。

  人的α-类珠蛋白肽链共有4种,ξ基因与α基因在大约4亿年前开始分离,θ基因与α基因的分离发生在2.6亿年前。其多肽链均由141个氨基酸残基构成,在胚胎第一天,主要是ξ多肽链(42%)和α2多肽链(24%)的表达,从第五周起ξ珠蛋白基因的表达开始关闭,而代之以α2和α1珠蛋白基因的表达,与β类珠蛋白基因相比,α类珠蛋白基因只有一次开关(switch),其表达调控机制可能较为简单,在研究基因表达的时序上是一个更好的模型。而且,α-地中海贫血的发病率在我国也较高,在广西高达14.9%,广东为4.11%,因此,研究α类珠蛋白的基因表达调控,对于了解α-地中海贫血的发病机理和选择有效的治疗方法,都有重要的意义。

  1 α类珠蛋白基因簇的结构特点

  人的α类珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂靠近端粒的位置,长度约为26kb,与端粒的距离为170kb-340kb,具有多态性[1]。小鼠的α类珠蛋白基因簇位于11号染色体近着丝粒的位置。整个α类珠蛋白基因簇在进化上是非常保守的,共有7个基因组成,包括4个可编码基因和3个假基因:端粒-ξ-ψξ1-ψα2-ψα-α2-α1-θ1-着丝粒。另外,在人的第22号染色体上还发现了一个ψθ珠蛋白基因的拷贝。与β-珠蛋白基因簇相比,α类珠蛋白基因簇的基因密度较高,G+C含量较高(54%),Alu序列的密度也很高(占整个序列的26%),另外还含有一些数目可变的串联重复序列(VNTRs)和CpG岛。

  由于人α类珠蛋白基因簇位于16号染色体近端粒区,在DNA复制起始的早期即开始复制,所以在各种细胞中染色体结构始终处于开放状态,CpG岛也保持未甲基化,但是其表达却是红系特异的。小鼠α-珠蛋白基因簇位于其11号染色体近着线粒位置,在染色体位置和结构上与人存在较大差异,只在红系细胞中呈现开放状态,没有CpG岛。小鼠α-珠蛋白基因簇附近存在许多与端DNA同源的序列,说明小鼠α-珠蛋白基因簇可能是从小鼠染色体的端粒红色转位到现在所处的位点[2]。

  在α-类珠蛋白基因簇和端粒间存在4个看家基因(housekeeping gene)和一个IL-9受体的假基因,在人16号染色体上的位置依次是:端粒-ψIL-9-未命名-Dist1-MPG-Pros1-ξ-,MPG编码一种DNA修复酶:3-甲基腺嘌呤DNA糖苷酶,转录方向与α类珠蛋白基因簇的转录方向一致,而Dist1和Prox1的转录方向与α类珠蛋白基因簇的方向相反,分别位于α珠蛋白基因上游-89/-91kb和-14kb的位置,因此又分别被称为-89/-91基因和-14基因。3种基因的表达都不是红系特异的,人的MPG和Prox1基因的在3’-端有重叠,小鼠没有重叠[3]。α珠蛋白基因特异的增强子序列HS-40就位于Prox1基因的第5内含子中。

  2 调控α类珠蛋白基因表达的上游顺式反应元件和反式作用因子

  人α类珠蛋白基因簇上游40kb的一个DNase I高敏位点(HS-40)是已知最重要的α类珠蛋白上游表达调控序列,虽然在ξ基因上游也存在其它的DNase I高敏位点,如HS-33、HS-10、HS-8和HS-4[4],类似于β-LCR5个DNase I高敏位点排列方式,但都没有HS-40对α类珠蛋白基因的增强子活性,最新的研究发现,HS-40对α-珠蛋白基因的表达还有负的作用,因此早期α-LCR的定义是不确切的,现在一般叫做α-主动控制元件(positive control element)或α-位点调控元件(locus regulatory element)[5]。

  HS-40序列长约300bp,在这希区域内集中了多种组织特异和广泛存在的反式作用因子的结合位点。在10bp、100bp、270bp和290bp处存在4个红系特异的GATA盒,在120bp和150bp处有两个NF-E2/AP1的结合位点(GCTGAG/CT-CA),以及3个CACCC盒和一个AG盒。在第二个GATA盒和第一个NF-E2/AP1结合位点中间有一个YY1结合位点,另外,与第一个CACCC盒重叠的一段GGGCGG序列[6]。HS-40增强子的缺失对MPG基因的表达没有影响,只引起α类珠蛋白表达的降低,造成严重的α-地中海贫血。但是α珠蛋白所呈较低水平的组成性表达,这与人α-珠蛋白所处的染色体位置有关,因

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为α类珠蛋白基因簇靠近染色体的端粒,始终处于开放状态,允许较低水平转录合体的形成。

  小鼠HS-40的同源序列位于ξ-珠蛋白基因上游26kb,核心序列的长度约为270bp,也位于鼠Prox基因的内含子内,有3个GATA盒、两个NF-E2/AP1结合位点和一个YY1的结合位点,但是与人HS-40相比,缺少CACCC盒和3’-端的一个GATA盒。在MEL中,HS-26不能促进人α-珠蛋白基因科长的表达调控机制是不同的[7]。

  NF-E2蛋白是一种重要的红系反式作用因子,是由分子量分别为45kD(p45)和18kD(p18)的两类亚基构成的异二聚体,它们都是属于AP-1基因超家族的含碱性亮氨酸拉链的蛋白,p45亚基只在各种造血细胞中有表达,而p18亚基几乎在各种组织中均表达,其中人mafG的表达与珠蛋白的调控有关。缺失NF-E2基因的MEL细胞不能促进α类和β类珠蛋白基因的表达,但是NF-E2敲除的小鼠并未出现红系发育和分化的异常,进一步缺失NF-E2蛋白相关因子(Nrf-2)基因也未能引起红细胞成熟的缺陷,而且NF-E2和Nrf-2间也不存在相互调控的现象,推测新近发现的这一家族的BACH-1和BACH-2基因可能起更重要的作用[8]。GATA-1和EKLF也是重要的红系反式因子,它们在DNA分子上的结合基序分别是(A/T)GATA(A/G)和CACCC[9],在红系细胞的分化和基因表达过程中起着关键的作用,GATA位点的突变会使红系的分化终止。GATA-1和EKLF都可以通过锌指结构与其它蛋白因子相互作用而形成核酸-蛋白复合物,GATA-1位点一般是成对出现。GATA-1发挥作用时需要辅助蛋白FOG(friedn of GATA-1)的存在,FOG的缺失也会造成红系分化的终止[10]。

  YY-1和X-BP蛋白在HS-40上也存在结合位点,它们虽然不是红系特异的反式因子,但是对HS-40的增强子活性都有重要的作用。另外,在α-珠蛋白基因簇的3’-下游区域内存在的GATA-1结合位点可能对α-珠蛋白基因的表达也具有重要作用,包含α1基因在内的α2基因下游20kb的缺失也使α2基因不能表达,检测发现,虽然ξ和α2基因是完整的,HS-40也正常,但患者还是表达严重的α-地中海贫血。这可能也与α-珠蛋白基因簇的完整性有关[11]。

  3 α-类珠蛋白基因的表达

  α-类珠蛋白基因的表达具有红系组织特异性和不同发育阶段的特异性,与β-类珠蛋白相比,只有一个开关,即胚胎期ξ基因向胎儿/成人期α基因的转换。位于基因簇的5’-端的ξ基因在卵黄囊期首先开启表达,同时3’端的α基因表达也开启,但是水平较低。它们与同时表达的胚胎期β类珠蛋白共同构成两种胚胎血红蛋白。人ξ基因的表达水平随胚胎的发育逐步降低,至第五、六周造血功能从卵黄囊转移到胎肝后,ξ-基因的表达基本关闭(小鼠的转换发生在9-11d),而α基因开始活跃表达。这时ξ基因也存在低水平的渗漏表达,在成人期仍可以检测到ξ基因的痕量表达。α基因有两个拷贝,编码的氨基酸序列完全相同,但是在编码区有两个碱基的替代,第二内含子上有7bp的缺失,3’-非翻译区也存在一定的差异。在成人外周血红细胞中,α2和α1mRNA的比例是2.6:1,说明它们的转录效率是有差异的,但是翻译水平的差异无法确证,因为两个基因所编码的多肽链是完全相同的。事实上两个α基因在发育过程中也存在一个转换,在胚胎早期,α2和α1mRNA的比例接近1:1,α2基因的表达逐渐占优势,到第8~10周达到2.6:1的比例[11]。在K562细胞中α2和α1 mRNA的比例发生异常,只有8:29,经氯高铁血红素诱导后比例有所增加,如果将K562细胞的16号染色体导入MEL细胞,则恢复正常比例。说明存在调节α2和α1 mRNA比例的因子,但目前还没有发现[12]。

  在人α珠蛋白基因的启动子区TATAA盒的上游有一个α-IRP结合位点、一个α-CP-1和两个SP-1结合位点,但是缺乏珠蛋白基因所特有的GATA序列和CACCC序列,这一点与小鼠及其它动物的α-珠蛋白基因存在显著的不同,鼠α-珠蛋白基因的启动子区有3个IRP/SP1结合位点,一个CP-1结合位点,一个CP-2结合位点,一个NF-5结合位点和一个GATA-1结合位点。所以在MEL细胞中,人α-珠蛋白基因呈现组成性表达,如果在要α珠蛋白基因的启动子区加上GATA和CACCC序列,则α-珠蛋白基因也与β-珠蛋白基因相似,可被氯高铁血红素(hemin)诱导表达[13],提示人α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因在表达调控上的差异与GATA-1和EKLF因子的关系非常密切。

  在基因转染实验中,β-珠蛋白基因只能在红系细胞中表达,如果要使β-珠蛋白基因能够在异源细胞中表达,必须在β-珠蛋白基因的前面加上病素的启动子序列,而α-珠蛋白基因不需病毒的启动子序列就可以实现在红系和非红系细胞中的组成性表达。研究发现,这种特性与α-珠蛋白基因起始密码子后259bp范围内的DNA序列有关,这段序列通过与α-珠蛋白基因启动子区相互作用而使α-珠蛋白基因在各种被转染细胞中持续高水平地表达,而对β-珠蛋白基因的启动子及SV40启动子没有作用。

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这段序列在K562细胞中包含一个红系特异的DNase I高敏位点,其它细胞中则不存在,说明α-珠蛋白基因可能在各种细胞中都处于开放状态,而染色体水平上的负性调控对α-珠蛋白基因的表达起着重要作用[14]。

  θ基因位于α-珠蛋白基因簇的3’-末端,在成人红细胞中可以检测到θmRNA的存在,但θ-珠蛋白的功能尚不清楚,因为θ基因敲除的小鼠在各方面的表型都是正常的。θ基因的表达与α基因的表达基本是平行的,θmRNA的出现与αmRNA出现的时相相同,表达量一直稳定在α珠蛋白表达量的1/50左右,表明θ基因是一种胎儿/成人期的α-类珠蛋白[15]。

  α-珠蛋白基因簇内的假基因均不能被转录,ψα1基因结构中存在一系列的转录控制突变,ψα2基因则缺乏整个启动子区。ψξ1基因与ξ基因相比,除内含子的一些变化外,只有6个碱基的差异,其中在第六密码子上有一个CAG→TAG的无义突变。该位点的回复突变也不能使ψξ1基因进行转录。而位于第22号染色体上的ψθ2基因却可以被转录、加工,但目前未检测到它的翻译产物。

  α-类珠蛋白基因表达的时序性受各自3’、5’-旁侧区、启动子区和部分基因内部结构的控制。ξ基因5’-端300bp的区域内存在一个CP-2结合位点,两个GATA盒,3个CACCC盒,一个ZF-1结合位点和一个ZF-2结合位点,另外还有CCAATA盒和TATA盒。Pondel等的研究表明只包含CCAATA盒和TATA盒的67bp长的近起始密码子区和HS-40的存在,即具有调控ξ-基因及与之相连的报告基因在胚胎期表达的作用[16],NF-E3结合在所有人/鼠胚胎型珠蛋白基因启动子区的TGACCA序列上,与CCAATA盒重叠,所以NF-E3可能对ξ-珠蛋白基因的表达有重要的作用。而Zhang等的研究则证明,HS-40需要通过和ξ-启动子上游的两个GATA位点的相互作用才具有活性,不在Pondel等所指的67bp范围之内[17];Stephen等采用β-LCR作为上游增强子调控ξ-基因的表达发现,启动子区、ξ-基因的编码序列和3’-非翻译区对ξ-基因的定时关闭都有作用并相互叠加[18]。虽然这些研究存在一定的相互矛盾,但是也存在共同的特征,都需要红系特异的上游增强子,并且存在增强子和启动子区的相互作用。HS-40和α-类基因启动子区与各种反式各自形成独立的核酸蛋白复合物,然后通过它们之间的相互作用促进α-类珠蛋白基因的表达。ξ-珠蛋白基因启动子区的CACCC盒的结合蛋白不同于已知的CACCC结合蛋白,如SP-1,EKLF等,目前这种蛋白正在鉴定中[19]。

  ξmRNA的稳定性对ξ-基因表达的有效关闭也起着重要作用。在α-类珠蛋白mRNA3’-非翻译区内有一段16个碱基的嘧啶富含区,α和ξmRNA的差异只是一个与C→G的突变,就使ξ-mRNA与PABP及其它mRNA结合蛋白的结合能力降低了一个数量级,因此组装形成mRNP的能力较弱,而且它的poly(A)也较短,所以ξmRNA容易降解。Stephen据此提出了一个ξ-基因关闭的模型,认为转录后加工在ξmRNA的清除和关闭过程中起着关键作用。

  4 α-类珠蛋白基因表达调控研究的模型

  在细胞水平上研究α-类珠蛋白基因的表达调控一般采用人红白血病细胞K562、HEL细胞和鼠红白血病细胞MEL细胞作为研究对象,K562细胞在红系发育的过程中属于胎儿期的红细胞,表达胎儿期的γ-珠蛋白、部分ξ珠蛋白和α-珠蛋白,而HEL和MEL细胞则是处于成熟期的红细胞,表达成人期的珠蛋白基因。采用HS-40或α-类基因的启动子调控的报告基因,如Lac-Z、CAT或荧光素蛋白均可以在K562、HEL和MEL细胞中表达,人α类珠蛋白基因也可以在MEL细胞中获得表达,但是与β-珠蛋白基因不同的是,α-珠蛋白基因呈现组成性表达,而不需氯高铁血红素(hemin)的诱导。

  由于细胞水平的研究不能体现α-珠蛋白基因表达的时序性,要在时间和空间上对α珠蛋白基因及其调控因素进行研究,转基因鼠则是更好的模型。采用HS-40或β-LCR作为上游增强子研究单个α-类珠蛋白基因或报告基因表达的模型由于片段较短,可以使用逆转录病毒形体或真核表达质粒,在转基因鼠体内,ξ-珠蛋白基因或连接在ξ启动子后的报告基因只在鼠胚胎期卵黄囊中表达,第10d左右关闭,β-LCR调控的α2-和α1-珠蛋白基因在胚胎早期表达量相同,在第11d也出现表达量的转换并呈现正常的比例。但是HS-40在转基因鼠体内并不能使下游的α-珠蛋白基因表现拷贝数依赖发育阶段的稳定表达,表明HS-40与β-LCR是不同的。如果制备包含完整α-珠蛋白基因簇的转基因鼠,则必须采用粘粒、PAC或YAC作为载体的人基因组DNA,Wood等通过筛选人粘粒基因组DNA文库,得到两段重叠的包含人α-珠蛋白基因簇的DNA片段,通过连接得到70kb的DNA片段,虽然α-珠蛋白基因表达量可以达到鼠内源性α-珠蛋白基因的66%,但是与短片段相似,仍然是非拷贝数依赖的,并且随着发育的进程,表达量降低1.5~9.0倍。而采用PAC载体克隆的150kb的人α-珠蛋白基因簇在转基因鼠体内表达的组织特异性、时序性等都呈现基本正常的表达调控,表达稳定,表达量有些甚至可以超过内源鼠α-珠蛋白基因表达的水平,但是都不能与鼠内源性α-珠蛋白基因表达水平相当[20],这可能与物种的差异有关。

  有α-珠蛋白基因整合的转基因鼠并不是都表达α-珠蛋白,与整合位点有关,不表达的α-珠蛋白基因的小鼠红系细胞染色体上不能形成红系特异的DNase I高敏位点,整合位点靠近着丝粒区或异染色质区,而插入位点染色体的甲基化状态没有变化。

  5 结语

  α珠蛋白基因表达调控的组织特异性、发育时序性以及与β-类珠蛋白基因簇间表达的平衡,为研究基因表达调控的机理提供了一种良好的模型,现在的研究主要希望从顺式元件、反式因子、染色体结构等方面阐明α-珠蛋白基因表达调控的模式,但是还没有提出一种令人信服的模型,从目前所取得的结果看,α-类珠蛋白基因的表达调控也是一个非常复杂的过程,可能有多种不同的机制在起作用从而对其表达的组织特异性、时序性和平衡进行调控,要精确了解α-类珠蛋白基因的表达调控模式,应该进一步选取基因结构相对简单动物模型进行研究,如河豚鱼、斑马鱼,其α-类珠蛋白基因结构较为简单,而且α-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇尚未分离,存在于同一染色体上,这对于研究两种珠蛋白基因表达的平衡具有重要的意义。

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  作者单位:中国医学科学院基础医学研究所 中国协和医科大学基础医学院

  国家医学分子生物学重点实验室(北京,100005)

  参考文献

  1 Higgs DR et al.Blood,1989;73:1081

  2 Kielman MF et al.Mamm Genoem,1993;4:314

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  7 Bouhassira EE et al.Am J Hematol,1997;54:30

  8 Martin F et al.Blood,1998;91:3459

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  19 Russell JE et al.Mol Cell Biol,1998;18:2173

  20 Higgs DR et al.Seminar In Hematology 1998;35:93

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结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化

  【摘要】目的 表达与纯化结核分支杆菌katG蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有katG基因的pET24b-katG表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3) 菌株,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产 物进行SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染 色。获得稳定的高表达菌株后采用Xpress TM蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯 化。最后对纯化产物进行过氧化氢酶活性的初步检测。结果 对诱导后的重组大肠杆菌菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE)以及考马斯亮蓝染色后 发现相对分子质量约为80 000。表达蛋白量约占总蛋白量的17.7%。对重组katG基因表达产 物进行 纯化的结果发现,以350 mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上。对 表达产物进行过氧化氢酶活性初步检测证明,重组的katG基因产物具有过氧化氢酶活性。[ HTH〗结论 通过pET24b-katG表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的katG高表 达菌株,表达产物具有一定酶活性,经纯化后可达到较高的纯度。

Overexpression and purification of catalase-peroxidase katG from mycobacterium tuberculosis

ZHANG Wenhong WENG Xinhua JI Chaoneng et al.

  (Departme nt of Infect ious Diseases, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040, China)

  【Abstract】Objective To express and purify the catala se-peroxidase katG gene from mycobacterium tuberculosis. Methods  Plasmid pET24b containing katG was transferred into com petent Escherichia coli and katG gene was overexpressed by the challenge of isopropylthio-β-D-glactoside(IPTG). The expression of katG protein was on e-step purified by Xpress systemTM. Furthermore, the catalase activity of katG protein was preliminarily detec ted. Results The recombinant escherichia coli produced katG p rotein in large quantities, accounting for 17.7% of total cell protein. The mole cular mass of katG protein was estimated to be 80 000 by sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gradient gel electrophresis (SDS-PAGE). It was found that imidazole at the concentration of 350 mmol/L could elute the katG protein most efficiently and yield the final preparation at greater than 90% purity. Th e katG protein was preliminarily detected to have the activity of catalase. Conclusions The stable katG overexpressing recombinant Escherichi a coli can be constructed by the plasmid pET24b containing katG gene. The reco mbinant strain can produce katG protein with catalase activity and the product o f which can be purified into higher activity.

  【Key words】Mycobacterium tuberculosis; katG ; Gene expression; Protein purification

  异烟肼(INH)是一种最经济有效的抗痨药,几乎所有的抗痨方案中均包括IN H。结核分支杆菌编码的katG基因的突变可致结核分支杆菌对INH 产生耐药性[1]。自1992年以来,对于katG基因变异或缺失造成分支杆菌对异烟肼 耐药的基因水平研究已较为深入[1,2],有必要在蛋白水平对耐药机制进行进一步 研究。本研究将含有katG基因的pET24b-katG表达载体转化埃希大肠杆菌BL21(DE3)菌株 ,获得稳定的高表达菌株后进一步对表达产物进行了纯化,并对纯化产物进行了酶活性的初 步检测。

  材料与方法

  一、材料

  (一) 质粒与菌株 表达质粒pET24b-katG与埃希大肠杆菌BL21(DE3)由复旦大学遗传学研究 所惠赠。

  (二) 试剂 XpressTM蛋白纯化系统为美国Invitrogen公司产品;异丙基-β-D硫代 半乳糖苷(IPTG)为华美生物工程公司产品;其他主要生化试剂为美国Sigma公司产品或国内A R级产品。

  二、方法

  (一) 表达载体的转化与基因产物的表达 将表达质粒pET24b-katG转化用氯化钙处理法得 到的感受态大肠杆菌BL21(DE3)菌株,将菌株涂于含卡那霉素的LB平板上,30°C过夜培养。 挑取抗卡那霉素的菌株接种于20 ml的LB培养基(加入20%的葡萄糖0.2 ml,浓度50 mg/ml的 卡那霉素40 μl,浓度20 mg/ml的氯霉素34 μl)中,37°C,160 r/min振摇过夜。取3 ml过 夜培养物种入100 ml的LB培养基(含20%的葡萄糖1 ml,浓度10 mg/ml的卡那霉素400 μ l, 浓度20 mg/ml的氯霉素170 μl)中,37°C以160 r/min振摇,每20 min测定1次A60 0值,直至A600值到达0.4~0.5(勿超过0.5)。随后每100 ml LB培养基中 加入1 mol/L IPTG 400 μl,分别在加入IPTG后的第2、3、4、5、6 h收集菌液。将菌液在4 °C下,5 000 g,离心5 min,弃上清。将沉淀物以10 ml缓冲液(50 mmol/L Tris.Cl, pH 8 .0, 2 mmol/L EDTA, 0.1% Triton X-100)重新悬浮,加入溶菌酶(100 μg/ml)。在冰浴中以中等强度超 声破菌,每次10 s,共3次,破菌后,4°C, 离心5 min,收集上清液备用。

  (二) 表达产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测 参照文献[3] 进行。收集IPTG诱导后的菌液10 μl,与 加样液10 μl混合,100°C水浴,3 min后点样,25 mA恒流通电进行SDS-PAGE。电泳后以 考马斯亮蓝染色15 min,然后以脱色液脱色观察结果。

  (三) 表达产物的纯化 采用Xpress TM蛋白纯化系统进行纯化。用无菌双蒸水悬 浮树 脂纯化柱3次。加入7 ml结合液(20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L氯化钠,pH 7.8),以及经IP TG不同时间诱导后产量最高的破菌液上清5 ml,重新悬浮纯化柱。反复轻摇混合2 min。静 置10 min,吸弃上清,再加入破菌液上清5 ml重复以上步骤。以4 ml结合液重新悬浮纯 化柱 ,温和摇动混合2 min,静置沉淀,吸弃上清,共3次。再以冲洗缓冲液(20 mmol/L磷酸钠, 500 mmol/L氯化钠,pH 6.0)洗4次,分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、200、350、500 mmo l/L)各5 ml加入柱中,收集不同洗脱浓度的洗脱液。将洗脱液进行SDS-PAGE。将纯化后的 蛋白以85%的硫酸胺沉淀,离心后将沉淀物以无菌双蒸水溶解,4°C透析过夜。透析产物加 入甘油(40%)后贮藏于-80°C的环境下。

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  (四) 过氧化氢酶活性测定 对破菌液上清进行过氧化氢酶活性的初步测定。用磷酸盐(K2 HPO4+KH2PO4,0.1 mol/L)与NaCl(2 mol/L)的缓冲液配制10%的Tween 80溶液,取 5 ml 与30%的双氧水5 ml混合。分对照管与katG管,在katG管内加入不同容积的含pET-katG表达 质粒的菌株破菌上清(20、40、80、160 μl),对照管 则加入含pET空载体的菌株破菌上清,10 min后观察气泡产生情况。如产生大量气泡则提示 酶活性较佳。

  结  果

  一、重组katG蛋白的诱导表达以及产物的鉴定分析

  将含有katG基因的pET24b-katG表达质粒转化大肠杆菌,在IPTG诱导下表达,分别对不同诱 导时间的表达产物进行SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色,可在相对分子质量80 000处见一诱 导表达带 (图1)。比较不同诱导时间的表达产量可以发现,经诱导2 h后的表达产量已达到峰值。在其 后蛋白纯化中即可选取该诱导时间的产物。对此诱导表达带进行黑度密度自动扫描分析,此 处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的17.7%。

  二、重组katG基因表达产物的纯化结果

  采用Xpress TM蛋白纯化系统进行纯化发现,分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、 200、350、500 mmol/L)洗脱纯化柱后,所收集的洗脱液再次进行SDS-PAGE分析。结果发现 ,以350 mmol/L咪唑洗脱后纯化的效率最高,通过SDS-PAGE黑度密度自动扫描分析可以发 现纯化率可达90%以上。

  三、对katG基因表达产物的过氧化氢酶活性测定结果

  在过氧化氢反应系统中加入不同容积的破菌上清(20、40、80、160、320 μl),比较气泡产 生情况,发现加入含pET-katG表达质粒的菌株破菌上清的各管均有气泡产生,且均较对照 管为明显,而以加入量为160 μl与320 μl的反应管产生气泡最为显著。提示重组katG表达 产物具有过氧化氢酶活性。

  讨  论

  结核分支杆菌的katG在INH的抗结核作用机制中起着关键作用。研究表明INH实际上是一个 药物前体,需经结核分支杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶活化后 才发挥抗结核作用,而katG则由katG基因所编码[4]。有研究 通过质粒将katG基因转移到INH耐药菌株胞内,可令其对INH重新恢复敏感性。而对结核分支 杆菌的临床耐异烟肼菌株进行katG基因分析亦发现该基因的缺失或突变是引起耐药的主要原 因[5]。然而对于katG如何活化INH以及katG发生变异后导致耐药的 确切机制仍然 不清,特别是近年来对于不同突变位点变异对药物敏感性的影响程度颇有争议[6] ,因此在蛋白水平研究katG的作用环节与耐药机制,以及比较不同位点 基因突变对酶结构与活性的影响等方面进行研究可深入了解INH耐药的发生机制,进而可 能在蛋白水平找到消除耐药的途径。由于结核分支杆菌生长较缓,而且具有较强的传染性, 长期以来在提取结核分支杆菌蛋白进行研究的进展较缓。本研究通过基因重组的katG表达载 体转化到大肠杆菌后产生高表达的katG蛋白,相对分子质量约为80 000,表达量可占总菌体 蛋白的17.7%。表明该基因重组的菌株为katG的高表达菌株,对表达产物进行初步过氧化氢 酶活性研究验证了其酶活性。进一步对表达产物进行纯化后可提取到纯度超过90%的katG蛋 白。本研究为进一步研究katG蛋白、katG对异烟肼的活化机制以及为检测katG变异耐药菌株 奠定基础,并且对深入阐明INH的耐药产生机制与寻求消除耐药的方法有较大的意义。

  本课题为国家自然科学基金资助项目(39970672)

  参考文献

  1,Rouse DA, Li Z, Bai GH, et al. Characterization of the KatG a nd inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuber culosis. Antimicrob agents Chemother, 1995, 39:2472-2477.

  2,Zhang Y, Heym B, Allen B, et al. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. Nature, 1992, 358:591-593.

  3,Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T,著. 分子克隆实验指南.金冬雁,黎孟枫,译. 第2版. 北京:科学出版社,1992.

  4,Telenti A, Honore N, Bernasconi C, et al. Genotypic assessment of isoniazid a nd rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a blind study at refer ence laboratory level. J Clin Microbiol, 1997, 35:719-723.

  5,Stoeckle MY, Guan L, Riegler N, et al. Catalase-peroxidase gene sequences in isoniazid-sensitive and resisitant stains of,M.tuberculosis from New York City. JID, 1993,168:1063.

  6,Rouse DA, DeVito JA, Li Z, et al. Site-directed mutagenesis of the K atG gene of mycobarterium tuberculosis: effects on catalase-peroxidase activite s and isoniazid resistance. Mol Microbiol. 1996, 22:583-592.

日期:2004年9月23日 - 来自[生物医学工程]栏目

肝脏肿瘤和预后中的基因表达

  发表在2004年9月的Hepatology上的一项新研究中,对91个不同的肝脏肿瘤中基因表达模式的分析将肝癌症划分成两种与病人的存活密切相关的亚类。这项研究首次研究了肝癌的完整的分子发病机制,而且这项研究确定了一些能够精确预测病人存活时间的基因的表达模式。

    研究人员用从91个肝癌组织中分离的总RNA来衍生出互补的DNA,并记下每个样品的基因表达特征。然后用三种相互独立的方法分析数据,以此找出肝癌亚类间的生物学差异。

    研究确定了两种与病人存活密切相关的肝癌亚类并且对肝癌的发病机制有了新的了解。低存活率亚类的肿瘤,其细胞增殖快并且抗凋亡基因表达信号强烈。而且在这个亚类中与泛素化作用(ubiquitination)和组蛋白修饰有关的基因表达水平较高。因此研究人员认为这些结果表明肝癌预后可以利用肿瘤基因表达特征进行。而且,每种亚类的分子特征可能有助于开发肝癌的新疗法。

    研究人员认为即使对肝癌患者的治疗还不能达到这个程度,但也是有可能确定出能起到缓解疾病恶化的治疗性靶标。例如,一些能够抑制转录因子的活性小分子或许有可能改变A亚类和B亚类肝癌的进级过程

日期:2004年9月23日 - 来自[业界动态]栏目
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胶质瘤基因治疗的进展

  胶质瘤基因治疗的实验研究始于80年代末。随着分子生物学技术的进步和肿瘤发病机制研究的深入,恶性肿瘤的基因治疗越来越受到重视,本文将胶质瘤在突变补偿、分子化疗和遗传性免疫增强三方面的研究情况加以综述。

  1 突变补偿

  目前对肿瘤的病因学研究发现,肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。突变补偿就是消除激活的癌基因或增强抑癌基因的功能。

  1.1 消除激活的癌基因 包括反义核酸、核酶和单链抗体技术。反义核酸是指与体内某RNA或DNA序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的RNA或DNA片段。癌基因反义核酸的导入,抑制了癌基因编码蛋白质的合成,从而抑制癌基因的功能。胶质瘤常过表达一些生长因子。TGF-β是一种T细胞抑制因子,用反义TGF-β表达质粒转导9L胶质肉瘤细胞,可使荷瘤鼠长期生存率达100%,12周后肿瘤消失,淋巴结效应细胞增加了3~4倍[1]。VEGF可促进血管内皮细胞的分裂,把VEGF/VEGFR的通路打断,可抑制肿瘤血管的形成。Saleh等[2]把C6胶质瘤细胞用反义VEGF的真核表达载体转导,VEGF的表达水平下降,组织学检查见肿瘤内血管数目减少且有很大程度的坏死。肽生长因子bFGF对胶质瘤的增殖、浸润有刺激作用。反义bFGF使U-87胶质瘤细胞增殖被抑制70%[3]。Trogan等[4]发现恶性胶质瘤有IGF-1异常表达,此表达异常可促进肿瘤的生长;反义IGF-1的导入,成功治疗了转基因鼠的脑内胶质瘤。

  虽然反义核酸治疗恶性肿瘤有一定效果,但也有局限性,不能转运足够的反义核酸到靶细胞而达到长期逆转肿瘤的目的,现已设计了一种具有催化活性的反义RNA,又被称为核酶(ribozyme),它不仅可与RNA结合,同时还能使其裂解,可反复使用。多形性胶质母细胞瘤(GBM)表达CD44粘附分子,设计了两种锤头核酶(ham merhead ribozymes)来抑制CD44的表达。两种核酶定靶于CD44的外显子2上,对转录的CD44S、CD44R1RNA进行剪切,流式细胞仪(FCM)检测显示了其对CD44转录的裂解作用,这样降低了CD44的表达[5]。

  单链抗体技术是利用抗体的特异性和高亲合特征,对表达抗体的基因进行操作,使其在抗原结合区表达,又被称为内抗体(intrabody)。erbB2在许多肿瘤,特别是一些腺癌中过表达,将erbB2单链可变区抗体(scFV)基因导入肿瘤细胞内,可抑制erbB2跨膜蛋白质的过表达,引起明显的细胞生长抑制[6]。这种“敲除”(knockout)癌基因的方法很有效,也很有前途,但这方面报道较少。

  1.2 增强抑癌基因的功能 P53是普遍公认的抑癌基因,是一种多功能蛋白质。它可以调节转录,监控细胞周期,激活细胞凋亡,控制DNA的复制与修复,也发挥着保持基因组稳定的作用。许多肿瘤都发生P53的点突变,突变使P53抑癌功能丧失,而获得了肿瘤的形成能力。Frankel等[7]报道,在40例胶质瘤中有16例(40%)发生了P53突变。Badie等[8]用AdP53转染9L细胞进行体内、外试验,PCR和Westennblot证实了P53的转录和表达,抑制了肿瘤细胞的生长,使肿瘤体积缩小。Morita等[9]对521例多形胶母细胞瘤病人进行回顾性分析,其中10例生存期≥7年,这10例中有4例P53过表达,表明GBM病人的长期生存可能与P53的过表达有一定的关系。

  新近又发现一种抑癌基因P21WAF1/CIP1,为野生型P53激活片段,也是周期依赖激酶的抑制剂。用AdP21WAF1/CIP1转导肿瘤细胞,可抑制其增殖和肿瘤形成。P16(CDKN2/MTS1)是一种具有许多特性的肿瘤抑制基因,在胶质瘤中缺失率高达50%。Fueyo等[10]用Ad5RSV-16将P16基因导入胶质瘤细胞,可直接合成功能性的P16,明显抑制了细胞的生长,改善了被转导细胞的恶性表型。

  2 分子化疗

  该方法是将毒素基因释放到肿瘤细胞而达到化疗“辐射”的作用。在这方面研究最多、最深入的是HSV-TK/GCV系统。HSV-TK基因表达产物可使对哺乳细胞无毒或低毒的核苷类似物(GCV或ACV)转换成毒性的GCV-TP,抑制DNA多聚酶并掺入到DNA链中,导致肿瘤细胞的死亡。有关这方面报道较多,大多是采用产生HSV-TK的逆转录病毒颗粒的包装细胞转导各种胶质瘤细胞,GCV治疗后,发现肿瘤完全消退。也有对转导动力学和毒性进行了试验,发现该系统对小鼠、大鼠和猴基本是安全的;也未检测到插入突变和有复制能力病毒的产生。胶质瘤细胞处于活跃的增殖状态,易被自杀基因TK转导。但也存在正常细胞转导表达TK基因导致组织损伤的可能性,如肠上皮和骨髓细胞被转导可引起腹泻和骨髓抑制,为此,研究者们克隆了只在特异组织表达的启动子基因,用MBP启动子与HSV-TK结合就可只转导胶质瘤细胞,GCV治疗后使肿瘤消退,避免了腹泻和骨髓抑制等副作用[11]。

  对HSV-TK基因的转导开始多采用逆转录病毒,近几年开始尝试用其它载体,如单纯疱疹病毒本身,腺病毒及质粒DNA的直接注射等,对单纯疱疹病毒进行操作,保留其TK基因,去除那些编码神经毒性的基因如RR(核糖核酸还原酶)基因,成为单纯疱疹病毒的突变体hrR3,用此载体结合GCV治疗胶质瘤很有效[12]。腺病毒以其极高的转导效率及安全性备受青睐。Maron[13]用腺病毒把HSV-TK导入C6胶质瘤中,GCV治疗后,肿瘤体积缩小28倍,生存期延长了4倍。也有学者把含有HSV-TK的质粒直接注射来转导,这种质粒表达载体较安全,易构建。也可应用较强的启动子和脂质体包裹提高转导效率和表达时间。HSV-TK/GCV是第一个被批准用于人恶性胶质瘤临床试验的基因治疗系统。Oldfield[14]报道7例接受HSV-TK/GCV治疗的病人,其中5例肿瘤缩小,临床效果和安全性都较好。其它研究机构有关这方面的报道尚少,总之仍处于实验阶段。

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  3 遗传性免疫增强法

  本策略是通过增强免疫反应而获得有效的抗肿瘤效应。可通过细胞因子、导入肿瘤相关抗原和其刺激分子来实现。细胞因子是调控免疫反应所必需的。把细胞因子导入肿瘤、抗肿瘤效应细胞(LAK,CTL,TIL)或易于移植和在体内长期存活的载体细胞,使在肿瘤局部分泌高浓度的细胞因子,发挥抗肿瘤效应。目前已报道用于胶质瘤基因治疗的细胞因子很多,有IFN-γ、IFN-β、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-7、M-CSF等。Wei[15]和Nam[16]分别用NIH3T3和内皮细胞把IL-4和IL-2导入C6和9L肿瘤内,可见肿瘤生长明显受抑,荷瘤鼠生存期延长。组织化学检测在注射部位有小胶质细胞、吞噬细胞、CD8+NK细胞的浸润。Sobol等[17]报道了1例星形细胞瘤病人,用自体肿瘤细胞混合IL-2基因修饰的成纤维细胞,分10次皮下注射,病人细胞免疫反应增强,治疗4周后,肿痛有明显的坏死。但是,由于细胞因子生物学作用多样性,其与疾病发生发展的关系相当复杂,加上细胞因子在体内处于一个复杂的细胞因子网络(Cytokinenet-work)之中,并受到整体调节,如何在体内充分发挥其治疗作用仍需进一步研究。

  肿瘤的发生与肿瘤细胞逃避机体免疫反应有关,这是由于肿瘤细胞免疫原性比较差,不足以刺激机体产生抗肿瘤的免疫反应。导入肿瘤相关抗原,提高肿瘤细胞的免疫原性,从而达到抗肿瘤的目的。Asai[18]把s-myc基因与巨细胞病毒启动子结合转导C6、9L胶质瘤,抑制了肿瘤的形成。这是由于s-myc的表达刺激C6、9L肿瘤相关抗原提呈给T-淋巴细胞,激活了宿主的免疫反应。缺陷型单纯病毒Ⅰ型(dlsptk)治疗胶质瘤有效,部分是由于病毒的感染,肿瘤细胞表面产生新抗原而诱发的免疫反应所致。B7是激活CTL细胞的第二个信号,B7分子的导入可激活CD8+CTL细胞,引起肿瘤消退。Yang等[19]把B7·2cDNA用质粒导入P815细胞中,引起P815肿瘤的消退,而且对P815的再次攻击产生抵抗。Zitvogel[20]把IL-12和B7·1共同导入肿瘤细胞中,抗肿瘤效应更明显。这种联合应用两种或多种方法可能成为今后治疗肿瘤的一个方向。

  目前进行胶质瘤基因治疗的方法和策略很多,但都处于实验阶段。几种用于人肿瘤基因治疗的方法中,疗效满意的并不多。基因治疗的发展受限于分子生物学技术和肿瘤病因学的研究进展,根据肿瘤是一种多基因遗传病的理论推测,随着胶质瘤所涉及恶性转化的所有异常基因表达的阐明,这种针对肿瘤发生的基因治疗,一定会有美好前景。

日期:2004年9月23日 - 来自[神经生物学]栏目

碱性成纤维细胞生长因子促神经再生的研究进展

  1975年Gospodarowicz首先报道运用理化方法从牛的大脑和垂体中分离纯化出碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF )。80年代,bFGF的氨基酸序列得到澄清。90年代,国内外相继运用基因工程方法成功获得重组bFGF,有力推动了关于bFGF的研究。系列研究证实,bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增殖,在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。神经方面,关于bFGF的研究集中在中枢神经,发现其神经活性广泛,能保护神经元,促进突起增生,提示在周围神经再生方面的研究意义。现参考近年来bFGF与神经再生的相关文献作一综述。

  一、内源性bFGF正常情况下的表达和神经损伤后的变化

  (一)中枢神经:正常情况下,内源性bFGF以微量分布于脑、垂体和下丘脑等器官,已证实星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞能分泌bFGF,在海马皮质、中脑、纹状体和小脑颗粒细胞均有其受体。神经损伤后,早期就能观察到内源性bFGF表达增多,是神经损伤后早期反应之一。

  叶诸榕用原代培养的大鼠大脑星形胶质细胞作成机械损伤模型,观察发现bFGF在损伤后2小时开始表达,12小时达高峰,2天后开始回落,星形胶质细胞胞体肥大,突起粗大。崔建忠运用Northern杂交、组织学方法动态观察大鼠颅脑弥漫性损伤后bFGF的基因表达和组织学改变,结果发现轻度损伤后12小时,重度损伤后4小时,bFGF基因表达增加,均于第3天达到高峰。Grothe〔1〕研究脊髓神经节bFGF及其Ⅰ型受体(FGFR-1)的表达时发现,正常情况下,bFGF和FGFR-1的mRNA在脊神经节均有表达,原位杂交显示星形胶质细胞产生bFGF,而感觉神经元表达FGFR-1,提示旁分泌作用;坐骨神经损伤后,L4~6感觉神经元bFGF的表达在1天内即上调,7天达高峰,28天后恢复,FGFR-1的变化则不明显。

  (二)周围神经:Grothe〔1〕和Meisinger〔2〕1997年报道了bFGF及其受体在周围神经的表达和损伤后变化的研究结果,而此前该领域未见报道。该研究发现,正常情况下,大鼠坐骨神经FGFR-1 mRNA表达高于bFGF mRNA。坐骨神经损伤后,FGFR-1和bFGF的mRNA在损伤远、近端均于不同的时相点上调,并有时间依赖性;bFGF的表达具有自身正反馈特点,且不影响FGFR-1。这一实验说明,与在中枢神经一致,内源性bFGF表达增多同样是外周神经损伤后的早期反应。

  神经损伤后bFGF表达上调的意义是什么?不少学者将bFGF运用于神经细胞培养和神经损伤模型,发现bFGF具有广泛的促神经再生作用,提示bFGF表达增多是神经损伤后的修复反应,且可能具有始动意义。

  二、外源性bFGF促进神经再生

  (一)中枢神经

  (1)离体试验:端礼荣在原代培养的大鼠胚胎中脑神经细胞中加入bFGF,观察发现细胞微团集落形成率明显增加,不同剂量的bFGF表现量效关系,图像分析见神经细胞突起增多,连接丰富呈网状。Miyagawa运用bFGF于原代培养的海马神经元轴突损伤模型,观察发现实验组较对照组轴突增生、突起增多。Himmelseher〔3〕进一步研究了不同浓度的bFGF对如上模型的作用,结果未用bFGF的对照组神经元存活65%,运用不同剂量bFGF的试验组神经元变性均减少,10 mg/L组存活神经元达85%,神经突起亦增多、增长。

  由上述试验可见,bFGF能促进培养的神经细胞增生,神经细胞损伤后运用bFGF,变性死亡减少,神经突起增生,说明bFGF在体外具有促进、保护神经细胞的作用。Malgrane〔4〕研究大鼠背根神经节神经元对神经毒性药物的反应时发现:bFGF不但能刺激轴突再生,而且提前24小时运用可以显著减少神经毒性物质的作用,这从另一个角度说明了bFGF对神经细胞的保护、维持作用。

  (2)在体实验:bFGF保护中枢神经细胞、促进突起增长的效应在体内亦得到证实。汪春风运用bFGF治疗成年大鼠大脑皮质损伤模型,于损伤术中和术后分次给予bFGF,术后40天取材作体视学分析,结果实验组存活神经元显著多于对照组。Miyamoto〔5〕分别运用bFGF、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)于大鼠大脑单侧伞穹窿部切断模型,发现bFGF和NGF均能刺激海马乙酰胆碱酯酶阳性纤维生长,NGF组仅为细纤维而bFGF组粗、细纤维均有。

  Nakahara〔6〕将经基因修饰后可分泌bFGF的成纤维细胞移植于大鼠脊髓损伤模型中央灰质处,发现2周至6月后,背侧区的感觉神经、去甲肾上腺素能神经均有纤维长入移植细胞,提示bFGF具有诱神经活性。

  (二)周围神经:bFGF及其受体在周围神经的表达尚不清楚,Aebischer、Laquerriere即已尝试运用填充bFGF的小管套接坐骨神经缺损,术后4周行组织学、电生理检查,发现实验组有神经纤维生长,而对照组没有。虽然有神经纤维生长并不就说明神经成功再生,但已提示了bFGF直接或间接促进轴突生长的可能。故bFGF的作用效能、分子生物学作用机制,值得深入研究。

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  雪旺细胞(Schwanns cell,SC)分裂增殖是周围神经再生的重要环节,增殖的SC吞噬变性产物,形成索带引导再生轴突长向远侧,并分泌多种神经营养、趋化因子,使轴突迅速、准确生长。体外培养的SC移植到神经再生室中能促进神经生长已为试验证实。在培养SC的工作中,Rater、Dong、龚炎培均发现bFGF能促进SC分裂增殖,龚氏运用流式细胞计观察FGF、NGF、纤连蛋白和神经再生条件液对SC体外细胞动力学的影响,发现8天后FGF组SC增殖最显著,达8倍以上,而NGF对SC分裂增殖不起作用。虽然SC超常增殖的意义学者们尚无定论,但对SC增殖期已过的陈旧性神经损伤,促进SC增殖对神经再生很可能有重要意义。因此,应进一步验证bFGF能否促进在体SC增殖及增殖后的继发效应。

  血管发生对神经损伤后创口愈合、神经再生的意义重大,然其初始介质仍未完全阐明。Baffour〔7〕在兔下肢急性缺血模型运用bFGF,发现治疗组肌肉活力、肌内血氧含量、每平方毫米毛细血管数和每肌纤维毛细血管数均明显高于对照组。提示bFGF能促进微循环重建。Nissen〔8〕收集术后创口内液体分析发现,血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)浓度术毕无变化,后7天逐渐升高,而bFGF浓度术毕即升达高峰,3天后降至血浆浓度;各时相点创室内液均对内皮细胞有趋化性,能引发神经、血管反应,术毕采取的创室内液,经VEGF的抗体中和后仍具趋化性和促血管发生能力,术后3至6天采取的创室内液,经VEGF的抗体中和后趋化性和促血管发生能力显著降低。提示bFGF是血管发生的始动介质,VEGF则起着继发而持续的作用。Seghzzi研究小鼠角膜血管发生时,发现形成毛细血管的内皮细胞表达VEGF mRNA和蛋白,外源性bFGF或上调内源性bFGF能增加VEGF的表达。说明VEGF的表达受bFGF调控,运用bFGF能促进血管发生,改善血供。而血供的改善显然有利于创口愈合和神经再生。

  综上所述,bFGF促进神经再生的作用是多方面的:(1)保护神经元;(2)促进轴突再生;(3)促进SC增殖;(4)促进血管发生,改善血供微循环等。借助分子生物学、免疫学等的新技术,各方面的研究还在不断深入。但另一方面,强调神经营养性之外,神经支配的效应器应如何减缓退变?有关效应器营养性的研究仍不多见,值得注意,因为效应器不可逆性退变,同为神经损伤、尤其陈旧性损伤修复困难的主要障碍。

  三、bFGF与周围神经再生

  近10余年来,新兴的、跨学科的神经生物学发展迅速,对周围神经再生的研究从细胞、亚细胞发展到分子水平,提出了一些新的概念和理论。认为神经不同于一般组织,神经细胞胞体位于中枢,而轴突延伸很长,组成周围神经,神经损伤的性质是细胞损伤。损伤后不仅轴突断裂,还引起近端神经元坏死,远段神经变性,失神经支配的感觉、运动效应器退变萎缩,因此神经损伤不仅是损伤局部一个水平有病变,还包括神经元、效应器,是三个水平的病变,只注重损伤局部的处理是片面的。成功的神经再生要求:(1)保护近端神经元;(2)再生轴突快速、准确长向远段;(3)效应器未发生不可逆性退变;(4)再生轴突与效应器形成功能性突触。SC、基底膜和神经营养因子(Neurotrophic Factor,NTF)是发挥以上作用的物质要素。NTF是指能保护神经元,和/或促进轴突再生的物质,已提出NGF、睫状神经节营养因子(CNTF)、脑源性营养因子(BDNF)、bFGF等20余种。至今,NGF由于:(1)体内有特异受体;(2)体内外作用均有效;(3)制备的抗体能阻断活性,唯一得到证实,而bFGF及其受体在周围神经的表达及损伤后变化的研究正在开展,其在体运用的效能、抗体阻断的实验亦待进行,所以是一种潜在的、未完全证实的NTF,但在试验中已经展现了较NGF促神经再生活性广泛的特点,除与NGF一样能保护神经元、促进轴突生长外,还能刺激SC增殖,促进毛细血管形成改善损伤神经及周围组织的血供,因而又是很有潜力的,预计随着以上两方面研究的进展,bFGF作为一种NTF的性质将很快澄清,为神经损伤患者带来新的希望。

  作者单位:650032 云南省昆明市,成都军区昆明总医院全军骨科中心

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参考文献

  [1] Grothe C,Meisinger C,Hertenstein A,et al. Expression of fibroblast growth factor-2 and fibroblast growth factor receptor-1 mRNAs in spinal ganglial and sciatic nerve:regulation after peripheral lession. Neurosci, 1997,76:123-135.

  [2] Meisinger C,Grothe C.Differential regulation of fibroblast growth factor (FGF)-2 and FGF receptor mRNA and FGF-2 isoforms in spinal ganglial and sciatic nerve after peripheral nerve lesion. J Neurochem, 1997,68:1150-1158.

  [3] Himmelseher S, Pfenninger E, Geo-rgieff M. Effect of basic fibroblast growth factor on hippocampal neurons after axonal injury. J Trauma, 1997,42:659-664.

  [4] Malgrane B,Delree P, Rigo JM, et al. Imge analysis of neuritic regeneration by adult rat dorsal root ganglion neurons in culture. J Neurosci Methods, 1994, 53:111-122.

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  [6] Nakahara Y, Gage FH, TuszynskiMH.Grafts of fibroblast genetically modified to secrete NGF, BDNF, NT-3,or basic FGF elicit differential responses in the adult spinal cord. Cell Transplant,1996,5:191-204.

  [7] Baffour R,Berman J, Farb JL, et al. Enhanced angiogenesis and growth of collaterals by in vivo administration of recombinant bFGF in a rabbit model of acute lower limb ischemia:dose response effect of bFGF. J Vasc Surg, 1992,16:181-193.

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日期:2004年9月23日 - 来自[神经生物学]栏目
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神经生长因子受体TrkA在中枢神经系统的表达、分布和作用

  摘 要 酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TrkA)是神经生长因子(nerve growth factor,NGF)的功能性受体。胆碱乙酰化转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)是胆碱能神经递质乙酰胆碱合成的关键酶。大鼠发育过程中基底前脑TrkA、ChAT表达有一定的规律,老龄鼠和早老性痴呆病人基底前脑TrkA、ChAT表达明显下调。TrkA、ChAT雌激素受体共存于基底前脑神经元。雌性激素对于大鼠基底前脑TrkA、ChAT维持正常的水平发挥作用。雌性激素替代治疗绝经后的妇女有助于减少其患阿尔茨海默病的可能性。

   关键词:TrkA ChAT 基底前脑 阿尔茨海默病 雌激素

  神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是一种经典的神经营养因子。NGF在周围神经系统(peripheral nervous system,PNS)参与交感神经元、神经嵴起源的感觉神经元的发育、存活,维持及损伤修复等作用已逐渐为人们所认识。八十年以后,人们发现NGF对中枢神经系统(certral nervous system,CNS)中基底前脑(basal forebrain)胆碱能神经元有作用。而作用于该部胆碱能神经元的NGF主要由靶区(海马及新皮质)产生,经逆行运输到胆碱能神经元胞体,发挥其靶源性营养作用。大量的研究表明这类神经元亚群在学习和记忆中具有特殊功能。

  在培养PC12细胞的培养基中加入NGF时,能诱导PC12突起的生长并使酶的活性提高,但当注射NGF到PC12细胞体或胞核时,并不发生以上变化,从而说明NGF生理功能的启动是由膜受体介导的。进一步研究发现,NGF效应细胞膜上有两种受体类型,根据其对NGF的亲和性分为高亲和力受体(high affinity receptor,HNGFR)和低亲和力受体(low affinity receptor,LNGFR)。LNGFR是一种富含半胱氨酸的糖蛋白,其分子量为75kD,所以又称p75。LNGFR胞质部分没有ATP结合位点,致使NGF与p75结合后不能活化内源性激酶,故NGF与p75的结合不能直接发挥生物学效应,但能通过增加HNGFR与NGF的结合率,影响通过HNGFR进行的信号传递。1991年Klein[1]等研究发现HNGFR是由酪氨酸激酶原癌基因(tyrosine kinase proto-oncogene,TrK)表达的一种跨膜糖蛋白,分子量为140kD。现已知HNGFR至少有一个亚基由TrkA原癌基因编码。TrkA由三部分组成:即辨别并结合NGF的细胞外部、跨膜部及含酪氨酸激酶的胞质部。TrkA是NGF的功能性受体,当其与NGF结合后,可激活酪氨酸激酶信号传递系统,从而启动细胞活性,产生生物效应。Boissiere[2]等用免疫组化方法检测人基底前脑,发现99%胆碱能神经元有TrkA表达;有人用原位杂交和免疫组化方法发现TrkA mRNA和蛋白质广泛地分布于大鼠中枢神经系统[3]。在基底前脑表达TrkA mRNA的胆碱能纤维广泛地投射到海马和新皮质。

  1 发育过程中基底前脑TrkA表达的变化

  利用免疫组化方法证实在成年大鼠基底前脑的胆碱能神经元有p75和TrkA的表达[4],有人用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)探及到胚胎17天大鼠基底前脑胆碱能神经元无TrkA mRNA表达[5],生后3天到2周才发现有TrkA mRNA的表达;Li[6]等用原位杂交和Northern印迹等方法定量分析TrkA mRNA、ChAT mRNA在大白鼠胚胎、生后、成年基底前脑内侧隔核(MS)的变化。发现胚胎17天时均无表达,生后0天少数几个细胞表达TrkA mRNA、ChAT mRNA;生后4天至11天,两者表达明显增加,生后21天表达最强,高于成年鼠的水平。生后30天呈下降趋势,在成年鼠维持在一个相对稳定比较高的水平。TrkA mRNA和ChAT mRNA的表达有相似的时空模式。最近有人用免疫组织化学方法观察TrkA表达,无ChAT表达,生后5天可见ChAT表达,生后20天TrkA mRNA表达达高峰;生后30天下调,成年时维持相对较高水平,老年时TrkA mRNA表达明显下调。大鼠基底前脑Meynert基底核TrkA表达早于ChAT表达。从生后5天起,TrkA、ChAT表达有相似的时间模式。TrkA可能参与Meynert基底核胆碱能神经元的发育、分化、成熟。NGF mRNA、TrkA mRNA在发育过程中的变化对于基底前脑胆碱能神经元的存活及突起形成可能起一定的调节作用。在脑发育不同阶段基底前脑胆碱能神经元TrkA基因表达具有阶段性差异,Hsiang[7]等用原位杂交方法发现,在出生后1天大鼠基底前脑胆碱能神经元没有测到TrkA基因,以后逐渐增加,4周时达最高水平,这种发育阶段的变化与海马及皮质中NGF mRNA基因表达的变化有平行关系[8],提示NGF对胆碱能神经元发育的调控作用,也反应了这个过程中NGF受体对这种调控的参与。

  2 老龄鼠和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)病人基底前脑胆碱能神经元TrkA、ChAT表达的变化

  Cooper[9]等将125I-NGF注射入成年大鼠和老龄大鼠(26~30个月)海马内,发现老龄鼠内侧隔核能摄取和逆行转动125I-NGF的ChAT免疫反应神经元数目减少31%,不能摄取和逆行转运125I-NGF的胆碱能神经元严重萎缩、胞体的平均面积减少60%,同时,TrkA mRNA表达下调43%,而p75没有差异。表明老龄鼠基底前脑胆碱能神经元维持受体介导靶源性神经营养因子的摄取和逆行转运能力下降,导致NGF信号传递功能削弱。增加了老年动物胆碱能神经元变性的易感性。最近我们用免疫组织化学方法发现老龄鼠(Meynert)基底核(basal nucleus of Meynert,nBM)TrkA、ChAT-IR神经元萎缩、数量分别减少31.9%、37.5%;胞体平均截面积分别减少39.4%、30.4%;平均灰度分别减少11.8%、9.9%。早老性痴呆是由于基底前脑胆碱能神经元的变性死亡及相应皮质、海马神经元退化所引起的老年神经元退行性疾病,其主要临床表现为学习及记忆功能障碍,导致严重的智力低下。多数学者认为AD病因主要与乙酰胆碱能系统改变有关。Boissiere[10,11]等用原位杂交方法发现AD病人与老年人对照组比较,nBM胆碱能神经元TrkA mRNA表达减少75%,差异有显著性(P<0.001);腹侧纹状体(ventral atriatum)TrkA mRNA表达减少41%(P<0.01)。豆状核壳(putamen)TrkA mRNA表达减少43%~53%(P<0.01)。Mufson[12]等用原位杂交方法发现AD病人与老年人对照组比较,nBM胆碱能神经元TrkA mRNA表达减少66%,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法也得出同样的结论。进一步用免疫组化方法研究发现:AD病人nBM内胆碱能神经元TrkA蛋白质表达与老年人对照组比较,AD病人nBM内幸存的TrkA iR阳性神经元数量减少60%,染色密度减少35%,细胞外形皱缩,树突截断变形,整个细胞呈肿胀的球形外观(swollen globose appearance)[13]。

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  3 TrkA对于基底前脑胆碱能神经元的作用

  Fagan[14]等将小鼠基底前脑、纹状体胆碱能神经元编码TrkA受体的基因失活(TrkA-/-)发现生后7天小鼠基底前脑、纹状体胆碱能神经元ChAT-IR阳性产物胞体的平均截面积减少10%~20%;生后20~25天小鼠ChAT-IR阳性神经元数目20%~36%,胞体萎缩变小,ChAT免疫反应性降低,胞体和胆碱能神经纤维毡标记密度减少,表明正在发育的(TrkA-/-)小鼠胆碱能神经元ChAT表达减少,阻碍发育成熟。结果表明正在发育(TrkA-/-)小鼠胆碱能神经元ChAT的表达减少,细胞死亡增加。(TrkA-/-)小鼠基底前脑胆碱能神经元丢失与生后1~4周时,靶源性神经营养因子缺失导致细胞死亡是一致的[15]。缺乏TrkA受体,NGF不能与特异性的受体结合,不能进行细胞内信号传递,正在发育的基底前脑胆碱能神经元不能充分地发育成熟。

  4 TrkA与ChAT、雌激素受体(estrogen receptor,ER)共存

  Sobreviela[16]等用免疫组化方法发现:内侧隔核和斜角带核内95%以上TrkA免疫反应阳性神经元内既含有ChAT也含有p75 nGFR;Meynert基底核内80%以上TrkA免疫反应阳性神经元内含有ChAT,95%以上的TrkA免疫反应阳性神经元内含有p75。Gibbs[17]等用免疫组化方法证明50%~80%的胆碱能ChAT免疫反应神经元内含有ER,雌性大鼠较雄性大鼠多10.5%。纹状体内双标细胞占74.2%,斜角带核水平支内为63.4%。Toran[18,19]等用放射自显影和原位杂交、免疫组化方法发现基底前脑胆碱能神经元含有雌性激素的高亲和性连接位点,即雌激素受体,属核受体,为一核转录因子。结果提示它们的配体(神经营养因子、雌性激素)可能作用于同一神经元,协同调节细胞内特异的基因或者基因网络的表达。从而调控mRNA的细胞内组成,影响蛋白质生成的量及其性质,最终影响神经元的存活、分化、再生和可塑性。

  5 雌性激素对于基底前脑胆碱能神经元TrkA mRNA和ChAT mRNA表达的调节

  Pamela[20]等人将成年大白鼠卵巢切除后10天,HDB和nBM内TrkA mRNA表达水平分别下调56%和34%,而ChAT mRNA分别下调38%~65%,与Gibbs[21]等人研究结果相似。雌性激素替代治疗3天后,TrkA mRNA、ChAT mRNA表达恢复到未切卵巢的动物的水平,而VDB中的TrkA mRNA、ChAT mRNA表达没有明显的差异。Gibbs[22]等观察鼠龄分别为13个月、19个月和25个月的雄性、雌性大鼠,发现年龄对于MS、nBM内ChAT、p75免疫反应阳性神经元的细胞大小、纤维染色密度的影响没有显著性差异,13~25个月龄鼠中,25个月龄鼠TrkA mRNA明显地减少。将13个月龄鼠卵巢切除6个月后,MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA明显地减少,短期内雌性激素替代治疗后,MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA明显地减少,短期内雌性激素替代治疗后,MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA部分恢复。结果提示卵巢分泌的雌激素对于大白鼠基底前脑MS、nBM内TrkA mRNA、ChAT mRNA维持正常水平发挥重要作用。卵巢切除后,MS和nBM内TrkA mRNA表达减少,对于内源性的神经生长因子效应降低,基底前脑对于衰老和疾病的易感性增加,胆碱能神经元的功能下降。因此,长期的卵巢功能丧失,对基底前脑胆碱能神经元将产生不利影响。雌性激素替代治疗绝经后的妇女有助于减少其患AD病的可能。

  6 雌性激素和NGF协同作用,可望应用于临床

  雌性激素能够上调神经营养因子和它们的受体的表达,而NGF能够增加ChAT mRNA的数量,增强ChAT的活性,从而增加Ach的释放。雌性激素对于胆碱能系统神经元的营养作用可能部分地经过神经营养因子与其受体结合后传递信息而被介导。Gibbs等研究发现雌性激素的剂量和给药治疗的周期不同,它对神经营养因子基因以及受体的表达有不同的效果。临床应用中绝经后的妇女用雌性激素替代治疗可以预防AD病的发生[21],但是乳腺癌发病率明显增高这一副作用也不容忽视。雌性激素和NGF协同应用于临床还有待于进一步的探索。

 

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  参考文献

  1 Klein R,et al.Cell,1991;65:189

  2 Boissiere F,et al.C-R-Acad-Sci-Ⅲ,1994;37(11):997

  3 David M,et al.Cell,1991;65:189

  4 Steining TL,et al.Brain Res,1993;612:330

  5 Masami K,et al.Neuroscience Letters,1994;169:47

  6 Li Yiwen,et al.J Neurosci,1995;15(4):2888

  7 Hsiang J,et al.Neuroscience,1988;26:417

  8 Large TH,et al.Science,1986;234:352

  9 Cooper JD,et al.Neuroscience,1994;62(3):625

  10 Boissiere F,et al.Exp Neurol,1997;145(1):245

  11 Boissiere F,et al.Dement Geriatr Cogn Disord,1997;8:1

  12 Mufson EJ,et al.Neuroreport,1996;8:25

  13 Mufson EJ,et al.Exp Neurol,1997;146:91

  14 Fagan AM,et al.J Neurosci,1997;17(20):7644

  15 Crowley C,et al.Cell,1994;76:1001

  16 Sobreviela T,et al.J Comp Neurol,1994;350:587

  17 Gibbs RB.Brain Res,1996;720:61

  18 Toran-Allerand,et al.Proc Natl Acad Sci USA,1992;89:4668

  19 Miranda RC,et al.Horm Behav,1994;28:367

  20 Pamela J,et al.J Neurosci,1996;16:1860

  21 Gibbs RB,et al.Exp Neurol,1994;129:70

  22 Gibbs RB.Exp Neurol,1998;15:289

日期:2004年9月23日 - 来自[神经生物学]栏目
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