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Nature新闻:发布基因工程标准化元件

在美国国家科学基金会的资助下,BIOFAB于2009年在加州成立,该机构旨在建立标准化的DNA序列元件,以便更好的控制基因表达,推动合成生物学的发展。利用这些标准化的DNA序列,生物学家们只需插入各种基因就能够进行工程改造,获得生产药物或者执行其他任务的特殊细胞。 BIOFAB就像是一家特殊的工厂,专门开发基因工程所需的DNA工具。日前,BIOFAB推出了他们的第一批产品,能够在大肠杆菌中精确控制基因表达的DNA序列元件。

人们发现,即使是在相当成熟的表达体系中(如E. coli),插入基因的表达也并不一定符合预期,这是目前合成生物学面临的一个关键性障碍。

基因表达包括RNA转录和蛋白翻译,要想在细胞中表达目的基因,就需要在其上游添加一些识别序列。例如,合成RNA转录本需要启动子序列,而蛋白翻译需要核糖体结合位点RBS。过去三十年来,科学家们积累了大量上述序列,并利用它们来表达目的基因。不过,有些序列能力强,有些序列能力弱,导致RNA和蛋白的合成水平并不稳定。

BIOFAB的Drew Endy和Adam Arkin在本周的Nature Methods杂志上发表了两篇文章,指出上述DNA元件的作用效果难以预测。他们领导研究人员将许多不同的启动子-RBS序列组合,插入到编码荧光蛋白的基因前,然后检测其中的蛋白合成水平。研究显示,其后搭配的基因不同,各组合的作用效果也大相径庭。

文章还引用了此前的一项发现指出,希望以特定水平表达蛋白的科学家们,实际只有50%的几率获得所需产量。这种基因表达的随意性是合成生物学家们面临的主要挑战,因为他们往往需要建立多基因表达的系统。

为此,BIOFAB研究团队为大肠杆菌E. coli设计了不干扰下游DNA的启动子和RBS序列。这些元件的作用效果与搭配的目的基因无关,能够帮助科学家们更严格的控制基因表达。研究显示,采用这些元件,大大提升了基因表达水平达到预期的几率(约93%)。现在,研究者们可以通过网络免费获取这些序列(见http://www.biofab.org/data),Arkin的一些同事已经开始从中受益。

此外,研究人员还设计了一个统计学方法,用来衡量启动子和RBS序列的性能可变性。这一方法也适用于合成生物学中的其他遗传学元件。科学家们可以在此基础上建立各元件的规格表,使自己的研究和成果共享更为方便。 

 

(生物通编辑:叶予)

日期:2013年3月14日 - 来自[技术要闻]栏目
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出生后不同发育时期大鼠基底前脑雌激素β表达的免疫组织化学研究

【摘要】  目的 研究雌激素β受体(estrogen receptor,ERβ)在出生后不同发育时期大鼠基底前脑内表达的变化。方法 硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学技术。结果 在两性大鼠,出生之日(P0)时均未见ERβ蛋白表达,P3后开始出现散在的阳性细胞。随后在两性大鼠基底前脑ERβ的表达增加,在P14~1月龄达到高峰,然后略有下降,但仍保持较高水平,一直到12月龄。到老年时,表达明显减弱,甚至消失。雄性的ERβ免疫反应性强于雌性。阳性物质主要位于细胞核,但在大鼠基底前脑也可见到阳性物质位于细胞浆的情况。结论 ERβ的上述表达模式与性别差异提示该受体可能参与了对基底前脑胆碱能神经元发育和功能的性别差异性调节。ERβ免疫阳性产物也可位于细胞核以外的部位,提示它可能在发育的特定时期还具有非基因型调节效应,即通过第二信使途径调节胆碱能神经元的结构与功能。

【关键词】  雌激素受体;基底前脑;性别差异

 【Abstract】 Objective To investigate the expression and sex differences of estrogen receptor beta(ERβ)in the basal forebrain of male and female rats.Methods Nickelintensified immunohistochemistry.Results In P0 rats no ERβ immunoreactivities were detected,it appeared from P3 then increase until P30,after that it decreased but remained high levels until 12 months old,while in the old basal forebrain ERβ immunoreactivities decreased significantly.Similar profile was also detected in the females but with less stronger ERβ immunopositive reactivity.The immunopositive materials were predominantly detected in the cell nuclei but also in cytoplasm.Conclusion The above mentioned profile of ERβ in the basal forebrain of both male and female rats indicating its potentiate role in the regulation of cholinergic neurons with sexdifference.Furthermore,this nuclear receptor may also function with nongenomic regulatory pathway besides its classic genomic regulation.

  【Key words】 Estrogen receptor;Basal forebrain;Sex difference

  雌激素在脑内具有多方面的作用,是由其受体(estrogen receptor,ER)介导的。目前已经发现了多种ER,即“经典的”α受体(ERα)和β受体(ERβ)以及雌激素膜性受体(G protein coupled estrogen receptor,GPER)[13]。脑内ERβ对学习记忆、应激等具有重要的调节作用,ERβ表达见于与学习记忆有关的脑区如基底前脑、大脑皮质和海马[4]。我们先前研究了ERβ成年大鼠脑内表达的性别差异,认为该受体可能是介导雌激素调节学习记忆的功能性受体[5]。近年基因敲除实验证实了ERβ在学习记忆过程中发挥了重要作用[6,7],然而其机制尚不清楚,因此对脑内ERβ的表达与功能研究具有重要的理论和临床意义。

  基底前脑包括隔内侧核(medial septal nucleus,MS)、斜角带垂直部背侧部(vertical band of Diagonal band,dorsal part;VBDD)和垂直部(vertical band of Diagonal band,ventral part;VBDV)、斜角带水平部(horizontal band of Diagonal band;HBD)以及嗅结节岛(Calleja island,IC)等部位,其纤维投射到大脑皮质与海马等部位。研究发现基底前脑含有大量的胆碱能神经元,这些神经元参与了学习记忆和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等神经退行性疾病的发病过程[8]。我们先前的研究发现成年大鼠基底前脑内ERβ的表达相当高并报道了小鼠基底前脑内ERβ的发育学表达以及循环雌激素对其表达的影响[9,10],但其在大鼠出生后不同时期基底前脑内的发育学表达变化以及性别差异并不清楚。为此,我们应用免疫组织化学技术研究了ERβ在大鼠出生后不同发育时期基底前脑的表达与性别差异,以期为研究雌激素作用于基底前脑神经元的基础研究提供更多的资料。

  1 材料和方法

  1.1 实验动物

  SPF级雌雄Wistar大鼠购自本校实验动物中心。出生之日为P0,以此类推。取P0、P3、P7、P14、1月龄、3月龄、12月龄、18月龄动物,每组3只;成年动物经阴道涂片证实为动情间期。除出生后早期动物经麻醉后直接断头取脑外行浸泡固定外,其余均经灌注固定。

  1.2 主要试剂和药品

  兔抗ERβ多克隆抗体(sc8974)购自Santa Cruz公司;生物素化羊抗兔抗体(ZB2010)与辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素复合物(ZB2404)、封闭血清、DAB等购自北京中杉公司;其余试剂均为市售分析纯。

  1.3 动物固定、取材

  5%水合氯醛麻醉后开胸,经左心室插管到主动脉,剪开右心耳,先后灌注生理盐水200 ml和4%多聚甲醛溶液300 ml,灌注后取出前脑组织(至下丘脑为界),用4%多聚甲醛后固定过夜,然后换30%蔗糖溶液脱水至组织块沉底。脑组织经OCT包埋后进行连续冰冻切片(片厚30 μm),每隔6片收集一片于含4%多聚甲醛溶液的6孔培养板内备用。

  硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法参照文献[5,9,10]进行。切片经磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次后用3%过氧化氢溶液孵育15 min,然后用PBS漂洗3次,切片入5%正常羊血清孵育30 min,倾去血清后切片与兔抗ERβ抗体(1:200)于4℃孵育24 h。PBS漂洗后用二抗(1:200)于室温孵育1 h,PBS漂洗后用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素复合物(1∶200)室温孵育1 h。PBS漂洗后用硫酸镍铵DAB显色法室温显色5 min后用PBS终止显色,裱片后于60℃烘烤过夜然后用二甲苯透明、DPX封片。阴性对照操作同前,但用PBS代替一抗。

  1.4 数据统计

  脑核团的定位于显微镜下结合Paxinos等的The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates(2007,第六版)进行,用奥林巴斯DX60显微摄像系统采集数码图像。各核团内ERβ免疫反应的强弱根据每只大鼠同一脑区3~5张切片、5只大鼠共计15~25张切片的染色水平综合判断,以++++、+++、++、+和表示,分别代表最强、强、中等、低和无明显表达。

  2 结果

  与一般的DAB/H2O2显色结果(棕黄色)不同,采用硫酸镍铵增强的免疫组织化学显色结果为蓝黑色沉淀。结果发现ERβ免疫阳性产物主要位于细胞核,但在特定时期也可在细胞浆甚至突起中检测到。由于嗅结节岛内ERβ蛋白的表达较低,因此我们主要观察了MS、VBD和HBD内ERβ蛋白的表达情况。P0:此时两性大鼠基底前脑内未见ERβ蛋白表达。P3:雄性在VBDD有少数的阳性细胞核散在分布(图1A),雌性仍未见表达。P7:雄性HBD出现阳性细胞,同时MS内也出现少数的阳性细胞(图1B)。雌性的VBD背侧有较多的阳性细胞,MS只有散在的阳性细胞核。P14:雄性的HBD、VBD腹侧可见很强的表达(图1C),VBD背侧和MS内的表达较弱。雌性的HBD表达最强(图1D),其次为VBD背侧部。MS和VBD腹侧表达较微弱。大部分的阳性细胞可见深染的细胞核与浅染的突起,个别细胞为细胞核阴性而细胞浆与突起着色。雄性的表达明显强于雌性。1月龄:基底前脑各部位均有ERβ蛋白表达。在雄性,VBD背侧部的表达最强,其次为腹侧部、MS和HBD(图1E),为单纯的细胞核阳性。在雌性大鼠,MS表达最强,其次为HBD、VBD,细胞核着色深,呈清晰的点状。3月龄:在雄性,VBD腹侧表达最高,MS次之,HBD和VBD背侧部较弱。在雌性大鼠,仍然是MS内表达最高,HBD、VBDV次之(图1F)。阳性物质均位于细胞核。12月龄:阳性信号明显较3月龄时减弱。雄性主要见于VBD,其中背侧部强于腹侧部;隔内侧核内阳性细胞减少,HBD内更少。雌性则以VBD表达最强,MS次之,HBD内只有少数散在的阳性细胞。18月龄:免疫阳性信号进一步减弱。雄性仅仅在MS内有一些阳性细胞(图1G),其余部位基本消失。雌性为MS强于VBD,阳性细胞数量多,但信号强度明显减弱。其余部位基本上未见阳性反应。以上结果总结见表1.表1 生后不同发育时期大鼠基底前脑内的ERβ免疫反应性图1 硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法研究ERβ在出生后不同发育时期大鼠基底前脑内的表达

  3 讨论

  应用硫酸镍铵增强显色的免疫组织化学SP法,我们首次观察了ERβ蛋白在大鼠基底前脑的发育学表达,实验结果表明基底前脑内ERβ的表达具有明显的性别差异,即出生后早期和老年时雄性强于雌性。其次,从发育学表达图谱来看,新生时基底前脑ERβ蛋白表达较低甚至缺如,随后逐渐增强,出生后第14天~3月龄时达到高峰,然后逐渐下降,老年(18月龄)时表达显著降低,在某些部位甚至消失,尤其在雌性更明显。以上结果与我们对小鼠基底前脑ERβ表达的性别差异研究[9]基本一致,提示ERβ对基底前脑神经元的发育、分化和性别差异可能具有重要的调节作用。

  哺乳动物脑在结构、功能和行为等多方面都存在性别差异,如与生殖功能有关的内侧视前区(medial preoptic area,POA)的体积是雄性显著大于雌性[11]、AD的发病是女性多于男性而PD和老年性耳聋等则是男性多于女性[12]等,造成这些差异的分子机制尚不清楚。研究发现,无论是外周来源的雌激素还是脑局部合成的雌激素都对脑的性分化(包括神经发育、神经元迁移或存活)具有很重要的作用,尤其是在发育阶段。如在新生时向雄性小鼠POA注射芳香化酶(雌激素合成酶)抑制剂或芳香化酶反义寡核苷酸,成年后雄性小鼠POA的体积则显著减小;若向雌性小鼠POA注射芳香化酶激动剂,成年后雌性小鼠POA的体积则显著增加。

  ERβ在脑内具有多方面的重要功能,尤其是学习记忆等高级功能。Liu等[6]采用药理学、形态学、分子生物学、生物化学与行为学等方法,证明雌激素对海马突触可塑性和记忆受ERβ的调节。ERβ激动剂能促进突触可塑性的关键蛋白PSD95、突触囊泡素(synaptophysin)和AMPA受体亚单位GluR1的表达,敲除ERβ基因后上述效应被抑制;海马脑片实验表明ERβ激动剂能增强LTP,这也能被ERβ基因敲除所抑制。ERβ活化能诱导海马神经元形态的改变,如促进树突分枝、增加树突棘密度等。Srivastava等[7]发现ERβ活化能增加皮质神经元树突棘密度并促进PSD95的表达、诱导细胞浆内PSD95迁移到突触后致密物从而形成脚手架样结构以锚定GluR1等突触可塑性蛋白,其分子机制涉及到诱导p21活化的激酶(p21activated kinase,PAK)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signalregulated kinase 1/2,ERK1/2)的磷酸化,提示ERβ的活化与细胞骨架的调节相关,表明ERβ通过PAK/ERK1/2依赖的信号途径快速调节神经元形态。另外,活化ERβ与降低焦虑有关[13]。在胚胎发育时期,ERβ影响皮质分层与中间神经元的迁移、因此对脑的形态发生极为重要[14]。另外,ERβ的表达在很多脑区如下丘脑、中脑等都有性别差异[16,17]。

  基底前脑在学习记忆中有核心作用。研究发现基底前脑含有大量的胆碱能神经元,已经证实这些神经元参与了学习记忆和AD的发病过程,雌激素通过调节胆碱能神经元内的已酰胆碱而增强认知功能,给予雌激素可以改善胆碱能神经元的功能,如促进胆碱能神经元ChAT的表达。基底前脑胆碱能神经元是海马、大脑皮质核杏仁复合体主要的胆碱能来源,对认知、注意行为有重要意义,在AD中出现功能障碍。这些神经元具有胆碱能的各种标记物,也有神经生长因子受体、钙结合蛋白、谷氨酸受体以及雌激素受体(ERα和ERβ)。一些中间神经元则含有m型乙酰胆碱受体(mAChRs)、 NADPH黄递酶、γ氨基丁酸(GABA)以及一些抑制性神经肽如甘丙肽(galanin,在AD中有过表达)。研究发现AD患者基底前脑谷氨酸受体GluR2与钙结合蛋白的表达失衡,提示在老化过程中这些分子可能协同性诱导兴奋性毒性细胞死亡。 基底皮质系统的ChAT活性与胆碱能神经元数量在AD早期数量比较稳定,而在晚期患者隔海马区则上调;NGF阳性神经元在发病早期即减少,晚期患者则出现trkA mRNA表达减少但p75(NTR)维持不变,表明在AD的进程中伴有基底前脑神经营养的缺失[8]。

  目前对基底前脑ERβ的研究报道不多。我们曾报道了该部位ERβ蛋白的表达[5,9,10],Milner也报道ERβ见于基底前脑[4],BlurtonJones等[15]发现基底前脑ERβ可位于抑制性神经元,提示ERβ可以调节神经元兴奋性。以上研究表明ERβ对基底前脑神经结构与功能的保持具有重要的意义。由于基底前脑是AD的主要受累脑区,AD患者的基底前脑出现老年斑(β淀粉样蛋白沉积)、神经原纤维缠结和胆碱能神经元丢失等病理改变。目前研究认为,在老化过程中,随著卵巢功能的丧失,循环雌激素水平下降,导致基底前脑胆碱能神经元功能下降,可能是造成老年性痴呆等神经退行性疾病的重要原因。尽管对雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy,ERT)在AD中的作用还有争议,但是大量的研究还是表明ERT可有效地缓解上述症状从而改善AD的痴呆症状、预防或推迟AD的发生,其机理尚不清楚。我们发现ERβ蛋白表达的上述变化趋势与循环雌激素水平下降的趋势基本一致,表明老年后雌激素对基底前脑的作用减弱,其原因可能是由于ERβ蛋白的表达减少所致。由于雌性鼠的减弱较雄性显著得多,因而上述发现或许可以解释为何AD患者多为女性的原因,因此深入研究基底前脑内ERβ的功能与性别差异研究具有重要的理论和临床意义。

【参考文献】
   [1] 张东梅,边晨,邓其跃,等.脑雌激素研究新进展[J].生理科学进展,2010,41(4):310313.

  [2] 梅春霞,张吉强.雌激素受体[J].生命的化学,2010,30(4):590594.

  [3] 王颖,邬仪杰,刘艺昀,等.G蛋白偶联的雌激素受体GPER/GPR30在体内的表达与功能[J].生命的化学,2010,30(6):860865.

  [4] Milner TA, Thompson LI,Wang G,et al.Distribution of estrogen receptor beta containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice[J].Brain Res,2010,1351:7496.

  [5] Zhang JQ, Cai WQ,Su BY,et al.Distribution and differences of estrogen receptor beta immunoreactivity in the brain of adult male and female rats[J].Brain Res,2002,935(12):7380.

  [6] Liu F, Day M,Muiz LC et al.Activation of estrogen receptorbeta regulates hippocampal synaptic plasticity and improves memory[J]. Nat Neurosci,2008,11(3):334343.

  [7] Srivastava DP, Woolfrey KM,Liu F,et al.Estrogen receptor activity modulates synaptic signaling and structure[J].J Neurosci,2010,30(40):1345413460.

  [8] Mufson EJ, Ginsberg SD,Ikonomovic MD,et al.Human cholinergic basal forebrain: chemoanatomy and neurologic dysfunction[J].Chem Neuroanat,2003,26(4):233242.

  [9] 张吉强,姚青,蔡文琴.雌激素β受体免疫阳性物质在生后不同发育时期小鼠基底前脑的表达研究[J].第三军医大学学报,2002,24(8):889891.

  [10] 张吉强,姚青,蔡文琴.卵巢切除对小鼠基底前脑内雌激素β受体表达的影响[J].第三军医大学学报,2003,25(3):260262.

  [11] Sakuma Y. Gonadal steroid action and brain sex differentiation in the rat[J].J Neuroendocrinol,2009,21(4):410414.

  [12] 刘鑫国,刘霞,张博.驻马店市老年性耳聋调查分析[J].中原医刊,2004,31(18):18.

  [13] Bodo C, Rissman EF.New roles for estrogen receptor beta in behavior and neuroendocrinology[J].Front Neuroendocrinol,2006,27(2):217232.

  [14] Fan X, Xu H,Warner M,et al.ERbeta in CNS: new roles in development and function[J].Prog Brain Res,2010,181:233250.

  [15] BlurtonJones M, Tuszynski MH.Estrogen receptorbeta colocalizes extensively with parvalbuminlabeled inhibitory neurons in the cortex,amygdala,basal forebrain,and hippocampal formation of intact and ovariectomized adult rats[J].J Comp Neurol,2002,452(3):276287.

  [16] Pendergast JS, Tuesta LM,Bethea JR.Oestrogen receptor beta contributes to the transient sex difference in tyrosine hydroxylase expression in the mouse locus coeruleus[J].J Neuroendocrinol,2008,20(10):11551164.

  [17] Orikasa C, Sakuma Y.Sex and regionspecific regulation of oestrogen receptor beta in the rat hypothalamus[J].J Neuroendocrinol,2004,16(12):964969.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第4期]栏目

OMgp及其受体NgR在大鼠中枢神经系统发育中的表达

【摘要】  目的 探讨再生抑制相关蛋白OMgp及其受体NgR在中枢神经系统发育中的表达规律及其意义。方法 SD大鼠按不同发育阶段(E20,2、6、10 w,1 y)取材,用RTPCR、免疫组织化学方法检测OMgp和NgR在海马、脑干、脊髓部位的表达情况。结果 RTPCR结果显示,OMgp的表达从E20开始逐渐升高,6 w达到最高峰,之后逐渐下降直到1 y;NgR在E20开始有微弱的表达,之后逐渐升高。免疫组织化学结果显示,NgR在E20无表达,但从2~10 w表达逐渐增强,并且10 w时可见其在脊髓白质少突胶质细胞表达。结论 OMgp在中枢神经系统发育中可能是作为一种正常环境因子参与轴突生长、突触联系的调节以及少突胶质细胞和神经元轴突间的识别,NgR也可能具有与轴突再生抑制无关的其他功能。

【关键词】  OMgp;NgR;中枢神经系统;发育;髓鞘

 【Abstract】 Objective To explore the expression of oligodendrocyte myelin glycoprotein(OMgp)and its receptor NgR during the development of central nervous system.Methods RTPCR and immunohistochemistry were performed to detect the expression of OMgp and NgR in the hippocampus,brainstem and spinal cord from E20,2,6,10weeks and 1year old rats.Results RTPCR results indicated that the expression of OMgp increased gradually from E20 to 6 weeks and decreased from 6 weeks to 1 year(the longest time detected).The expression of NgR was weak at E20 and increased after then.Immunohistochemistry results indicated that although the expression of NgR was not detected at E20,it increased gradually from 2 to 10weeks and could be detected in oligodendrocytes in the white matter of spinal cord at 10weeks.Conclusion OMgp may be one of the normal environment factors that regulate the axonal outgrowth and synaptic connection and recognition between oligodendrocytes and neurons.NgR could have functions other than inhibiting axonal regeneration.

  【Key words】 OMgp;NgR;CNS;Development;Myelin

  少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligodendrocytemyelin glycoprotein,OMgp)是继MAG、NogoA之后发现的第三种CNS髓鞘抑制蛋白,它与MAG、NogoA一样,通过与三者共同的受体NgR结合来发挥抑制轴突再生的作用。出生后OMgp在CNS发育中的表达已有研究报道[1,2],但是胚胎期OMgp在CNS的表达情况目前并不清楚,发育中CNS所表达的OMgp和成年后表达的OMgp相比可能具有不同的功能,正如Nogo在CNS发育中的功能可能就和成熟后不同一样[3,4]。因此研究胚胎期OMgp的表达情况将有助于进一步研究OMgp在CNS发育中的功能。

  NgR是三种髓鞘抑制蛋白共同的受体,并且三者对NgR活性结合位点具有竞争作用,可见NgR在轴突再生抑制信号的传导通路中起着枢纽作用,因此在CNS损伤与再生的研究中受到广泛的重视。NgR除了广泛表达于CNS的多种神经元[5],在少突胶质细胞等非神经元细胞类型中也有NgR的表达[6],提示NgR除了介导髓鞘抑制蛋白的抑制信号,可能还有其它功能。研究CNS发育中NgR在神经元和少突胶质细胞中的表达变化规律将为深入探讨NgR的其它功能打下基础。

  本研究通过对OMgp及其受体NgR在CNS发育中的表达进行检测,旨在探讨这两种再生抑制相关蛋白在CNS发育中的表达规律及其意义。

  1 材料和方法

  1.1 实验动物与分组

  健康SD大鼠,除胎鼠雌雄不限外,其余均为雌鼠,由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。动物分组如下:(1)OMgp组:按胚胎期第20天(E20)、出生后2周(2w)、6周(6w)、10周(10w)、1年(1y)5个时间段取材(n=10),取海马、脑干、脊髓,用于RTPCR;(2)NgR组:按E20,2、10 w三个时间段取材(n=10),取海马、脑干、脊髓,用于RTPCR;取全脑作冠状面切片,取脊髓作横切,片厚25 μm,用于免疫组织化学染色。

  1.2 RTPCR

  Trizol(Invitrogen)提取总RNA,按RTPCR试剂盒(TAKARA,DRR019A)使用说明进行RTPCR,内参为βactin。引物序列如下:OMgp:上游引物5'GCCTTCCAAACTACATAT3,下游引物5'AGTGGTGTCTTTGCTTAG3';NgR: 5'CAGCTCTGCAGTACCTCTAC3',5'CTCTAAGTCACTGGTAGCCAG3';βactin:上游引物5'GGGACCTGACAGACTACCTC3',下游引物5'GATGCCACAGGATTCCAT3'。 RTPCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳后,在凝胶成像分析系统上观察照相并分析处理凝胶,产物量以积分光密度(IOD)×面积表示,以OMgp/NgR mRNA RTPCR产物与内参βactin产物的比值代表OMgp/NgR mRNA表达的相对水平。

  1.3 免疫组织化学染色

  免疫组织化学染色按之前所述方法进行[7]。一抗为小鼠抗OMgp(1∶200,Serotec),兔抗NgR(1∶200,R&D)。对照组一抗用正常山羊血清或磷酸盐缓冲液(PBS)代替。硫酸镍按增强法显色。

  1.4 统计学处理

  RTPCR实验数据用均数±标准差(±s)表示,用t检验比较均数间相差的显著性,以P<0.05表示差异有统计学意义,以P<0.01表示差异有显著性统计学意义。免疫组化实验每组取5张切片,用Image Pro.5.0进行图像分析,以IOD代表免疫反应强度,并计算阳性细胞数量。

  2 结果

  2.1 CNS发育中OMgp的表达

  RTPCR结果显示,E20~6 w,海马、脑干、脊髓的OMgp mRNA的表达逐渐升高,6 w达到最高峰,之后逐渐下降,在海马和脊髓一直下降到1 y,而在脑干10 w后已无显著变化(图1A~1C,1G)。

  2.2 CNS发育中NgR的表达

  RTPCR结果显示,E20时海马、脑干、脊髓部位已有较弱的NgR mRNA表达,之后逐渐增强(图1D~1F,1H)。但免疫组织化学实验中,E20时CNS各部位并未检测到NgR的表达。2 w时CNS各部位神经元呈现较弱的NgR免疫反应阳性,阳性物质为淡蓝紫色,高倍镜下显示免疫反应阳性物质主要集中于细胞浆,另外,皮层、海马的部分神经元突起也可见染色,而细胞核则均为阴性。阳性细胞数量较少,主要分布于扣带后皮质、海马CA2和CA3区(图2 A)、脑干中缝隐核以及脊髓前角。10 w时CNS各部位神经元呈现很强的NgR免疫反应阳性,阳性物质为深紫色,高倍镜下显示免疫反应阳性物质大量集中于神经元细胞浆及突起,细胞核为阴性,阳性细胞数量多,主要分布于扣带后皮质、下丘脑室周核、丘脑内侧背核、丘脑外侧背核、丘脑后核、海马CA2和CA3区(CA1和CA4区阳性细胞数量相对较少)(图2B、2C、2C')、脑干三叉神经脊束核、小细胞网状核、脊髓前角运动神经元(后角阳性细胞数量相对较少),而脊髓白质的少突胶质细胞也出现了很强的免疫反应阳性,胞体呈多角形,突起少而长,主要分布于薄束、楔束、皮质脊髓前束、皮质脊髓侧束、顶盖脊髓束、前庭脊髓束等区域(图2D)。CNS发育中神经元NgR免疫反应性的相对强度见表1 。表1 CNS发育中神经元NgR免疫反应性

  3 讨论

  OMgp是一个相对分子质量为120×103的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白,1988年由Mikol和Stefansson鉴定并命名,2002年Kevin等[8]和Vicky等[9]分别发现OMgp具有抑制轴突再生的作用,成为继MAG,NogoA之后发现的第三种髓鞘源性抑制蛋白。虽然啮齿类动物出生后CNS OMgp mRNA的表达已有研究[1,2],但胚胎发育时期CNS OMgp mRNA的表达情况国内外目前尚未见报道。本实验以大鼠为实验对象,观察了CNS海马、脑干以及脊髓三个部位E20,2、6、10 w、1 y 5个时间段OMgp mRNA的表达情况,发现至少在胚胎末期(E20)OMgp mRNA已经开始表达,而从出生后到6 w其表达一直呈上升趋势,之后有所下降。在海马和脊髓,OMgp mRNA的表达10 w与1 y有显著差异(P<0.05),说明在这两个部位OMgp mRNA的表达从10 w之后仍然呈下降趋势。Vourc'h等[2]曾报道大鼠OMgp mRNA的表达在生后第6周略有下降,到成年时趋于稳定,但其观察时期只到生后10周为止。而我们的实验证明,至少在大鼠的海马和脊髓两个区域,OMgp mRNA的表达从生后第6周直至老年时期(1 y)仍然是呈下降趋势。

  成年哺乳动物体内,OMgp发挥了CNS损伤后抑制轴突再生的作用[8,9],而在发育过程中OMgp的作用尚不清楚。成年动物中正常的环境因子对防止轴突异常生长、保持突触的正常联系是十分重要的,CNS损伤后星形胶质细胞及其相关联的蛋白多糖分子如硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitin sulfate proteoglycan,CSPG)以及Tenascin等的存在可能发挥防止轴突异常生长、形成异常连接的作用[10]。鉴于OMgp在CNS的分布以及损伤后的抑制效应,推测OMgp在CNS发育中可能也是作为一种正常的环境因子参与轴突生长与突触联系的调节,因此随着发育时间的推移,神经元逐渐成熟,OMgp的表达也相应逐渐下降。另外,CNS髓鞘完整性的维持需要少突胶质细胞和神经元轴突间的识别与相互作用,另一种髓鞘抑制蛋白MAG就在其中发挥着重要作用[11],由于OMgp与CNS髓鞘化的相关性,OMgp可能也和MAG一样在髓鞘完整性的维持中起着类似的作用。

  NgR是一种糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白,由Fournier等在2001年运用碱性磷酸酶融合技术首次发现。NgR最初是作为Nogo的受体而被认识的,后来发现它同时也是MAG和OMgp的受体。Mingorance等[12]报道在小鼠发育过程中,海马部位的NogoA蛋白表达从E16到P0P5阶段一直是在增强的,随后表达下降直到成年,而相应的NgR蛋白表达则是从P0P7逐渐增强,因此NogoA并不能通过与NgR结合来抑制胚胎期海马神经元。虽然对大鼠CNS发育中的不同部位进行RTPCR检测发现E20已有NgR mRNA的表达,但免疫组织化学染色在E20却未能检测到NgR的表达,这可能与两者检测水平不同有关。前者检测的是mRNA,而后者检测的是蛋白,因此RTPCR检测到的表达时相要早于免疫组织化学。从出生后2 w到10 w NgR的表达明显增强:2 w时大脑皮层、海马、脑干等处神经元均呈现较弱的免疫反应性,10w时相同部位的神经元已具有很强的免疫反应性,脊髓灰质的前、后角神经元胞体也具有较强的免疫反应性,但Hunt等[5]用原位杂交检测脊髓NgR mRNA的表达情况却发现颈段、腰段脊髓NgR mRNA的表达普遍很低(但运动神经元信号却很强烈),两种结果不一致可能是因为采用的方法不同所致。

  图1 RTPCR显示中枢神经系统发育过程中OMgp和NgR的表达1A1C,1G发育过程中OMgp mRNA在海马、脑干和脊髓的表达。1D1F,1H发育过程中NgR mRNA在海马、脑干和脊髓的表达。*:P<0.05 vs 10w图2 免疫组织化学显示中枢神经系统发育过程中NgR的表达AC,C'海马横切显示NgR在2w(A)和10w(B,C,C')的表达。C是C'的高倍放大。D脊髓横切显示出生后10w NgR在少突胶质细胞(箭头所示)表达。  另外,在观察脊髓切片时我们还发现,2w时脊髓白质部分未能检测到NgR的表达,而10w时则明显可以看到NgR在白质少突胶质细胞表面的分布,免疫反应阳性物质集中于胞体和突起,说明成年大鼠脊髓白质有NgR的表达,而在发育中至少从E20到2 w这段时间脊髓白质都没有NgR表达。以往的研究表明,NgR广泛分布于CNS多种类型的神经元中[5]以及脊髓白质的少突胶质细胞中[6],本实验结果进一步表明,大鼠发育早期脊髓白质少突胶质细胞并无NgR的表达,至于成年后NgR在脊髓白质少突胶质细胞表达的意义,由于NgR定位于胶质细胞间缝隙连接的膜上,有报道推测可能在胶质细胞间的通讯中发挥一定的功能[13],或具有与再生无关的某些生理功能[6]。NgR作为髓鞘抑制蛋白Nogo、MAG、OMgp的受体,定位于神经元表面,这与少突胶质细胞表面的抑制因子通过神经元表面的NgR发挥轴突再生的抑制作用是相符合的。然而NgR在发育早期(E202w)不表达于少突胶质细胞,成年时在少突胶质细胞又有表达,这种表达变化及其意义还有待进一步研究。

  本研究从mRNA和蛋白水平初步探讨了大鼠CNS从胚胎期经成年期直至老年期的整个发育过程中,髓鞘抑制蛋白OMgp及其受体NgR的表达及意义。虽然都是CNS再生抑制相关蛋白,但两者在发育中的表达规律提示,可能还存在与再生抑制无关的其他功能,有待进一步研究。

【参考文献】
   [1] Habib AA,Marton LS,Allwardt B,et al.Expression of the oligodendrocytesmyelin glycoprotein by neurons in the mouse central nervous system[J].J Neurochem,1998,70(4):17041711.

  [2] Vourch P,Dessay S,Mbarek O,et al.The olidodendrocytemyelin glycoprotein gene is highly expressed during the late stages of myelination in the rat central nervous system[J].Brain Res Dev Brain Res,2003,144(2):159168.

  [3] Huber AB,Weinmann O,Brsamle C,et al.Patterns of Nogo mRNA and protein expression in the developing and adult rat and after CNS lesions[J].J Neurosci,2002,22(9):35533567.

  [4] Tozaki H,Kawasaki T,Takagi Y,et al.Expression of Nogo protein by growing axons in the developing nervous system[J].Mol Brain Res,2002,104(2):111119.

  [5] Hunt D,Mason MR,Campbell G,et al.Nogo receptor mRNA expression in intact and regeneration CNS neurons[J].Mol Cell Neurosic,2002,20(4):537552.

  [6] Guo Q,Li S,Su B.Expression of oligodendrocyte myelin glycoprotein and its receptor NgR after the injury of rat central nervous system[J].Neurosci ence Belletin,2007,422(2):103108.

  [7] Guo Q,Li S,Su B.NogoA immunoreactivity in injured spinal cord of adult rats[J].Neuroscience Belletin,2005,21(4):287290.

  [8] Wang KC,Koprivica V,Kin TA,et al.Oligodendrocytemyelin glycoprotein is a Nogo receptor ligand that inhibits neurite outgrowth[J].Nature,2002,417(6892): 941944.

  [9] Kottis V,Thibault P,Mikol D,et al.Oligodendrocytemyelin glycoprotein(OMgp)is an inhibitor of neurite outgrowth[J].J Neurochem,2002,82(6):15661569.

  [10] 蔡文琴主编.医用神经生物学基础[M].重庆:西南师范大学出版社,2001:424426.

  [11] Quarles RH.Myelinassociated glycoprotein(MAG): past,present and beyond[J].J Neurochem,2007,100(6):14311448.

  [12] Mingorance A,Fontana X,Marta Solé M,et al.Regulation of Nogo and Nogo receptor during the development of the entorhino hippocampal pathway and after adult hippocampal lesions[J].Mol Cell Neurosci,2004,26(1): 3449.

  [13] 胡泽岚,刘莹莹,金卫林,等.Nogo66受体在成年大鼠脊髓白质内胶质细胞的分布[J].第四军医大学学报,2004,25(16):14441447.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第4期]栏目
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小鼠骨折愈合过程中骨痂中FGFRs的表达

【摘要】  目的 观察小鼠骨折愈合过程中FGFRs的表达变化。方法 按标准闭合性骨折制作模型的方法来制作骨折模型,分别从5个时间点(骨折后第3天、7天、14天、21天和28天)观察骨痂组织中FGFRs mRNA的表达情况。结果 FGFR1骨折后3天开始显著升高,14天达到峰值并持续到骨折后28天(P<0.001);FGFR2骨折后7天显著升高(P<0.01),FGFR3在骨折后7天达到峰值后逐渐恢复正常。结论 在骨折愈合过程的不同阶段,FGFRs存在差异表达,可能在成年骨折愈合中发挥重要作用。

【关键词】  骨折愈合;成纤维细胞生长因子受体;小鼠

 Abstract:Objective To investigate the expressions of FGFRs mRNAs in mice fracture healing.Methods Closed proximal tibia fracture was created in 2monthold mice.Callus tissue properties was analyzed at 1,2,3 weeks postfracture histology.RNA was isolated from callus tissues,and the expression levels of bone formationrelated genes were evaluated by real time PCR.Results FGFR1mRNA levels upregulated on day 3 and reached maximum expression on day 14,then began to decline,but remained at relatively high levels even on day 28.FGFR2 mRNA levels upregulated on day 7.FGFR3 mRNA levels reached the peak on day 7 then declined to normal on day 28.Conclusion These results indicate the expressions of FGFRs at different stage of the healing process are different,which may participate in the regulation of fracture healing.

  Key words:fracture healing;FGFRs;mice

  骨折愈合是一个包括软骨形成,骨形成和重建的复杂过程[1]。骨折愈合过程是局部骨骼的再发育过程[2,3]。骨折愈合机理研究发现,许多参与调控骨骼发育的分子如细胞因子、生长因子、转录因子和基质蛋白分子参与了骨折愈合过程,且这些分子的变化类型和规律与胚胎骨骼发育过程中的分子信号通路变化有较大的相似性。与发育过程中相似,成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs),转化生长因子(transforming growth factors,TGFs)和骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等肝素结合生长因子(heparinbinding growth factors,HBGFs)对骨折愈合发挥着重要的调节作用[4],并且体内实验发现FGF2等具有促进骨形成的作用[5]。成纤维细胞生长因子受体(Fibroblast growth factor receptors,FGFRs)是FGFs的特异性受体,提示它们同样也参与骨折愈合过程的调控。既往对于骨发育过程的研究发现,FGFR1和FGFR2主要影响膜内成骨过程,它们的功能增强型点突变均导致囟门早闭[6],而FGFR3在骨发育尤其是软骨内成骨中发挥关键作用,它是骨骼生长的负性调节分子[7,8]。不同的FGFRs发挥的作用不同,因此研究其在骨折愈合过程的表达对于明确其在骨折愈合中作用有较大的意义。

  我们利用SPF级C57BL/6J小鼠制作标准骨折模型,组织学观察骨折愈合情况及骨折后第3天、第7天、第14天、第21天和第28天FGFRs表达水平,为研究FGFRs在骨折愈合的作用和寻求改善骨折愈合的方法提供理论基础和实验依据。

  1 材料和方法

  1.1 主要试剂和仪器

  Trizol(Invitrogen,美国),逆转录试剂盒(Exscript,TAKARA,日本),定量PCR反应试剂盒(SYBRTM Premix Ex TaqTM Kit,TAKARA,日本),PCR 仪(Eppendorf,德国),实时荧光定量PCR仪(Stratagene,美国),紫外分光光度计(Eppendorf,德国),石蜡切片机(Leica,德国)。

  1.2 动物模型及分组

  2月龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠(第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物中心)50只,体重2228g,随机数字法分为骨折后3、5、7、14、21和28天等6个时相点组。以Choi[9]等描述的非稳定骨折动物模型制作方法为基础改良。使用1%戊巴比妥钠按1ml/kg剂量腹腔注射,待小鼠完全麻醉后,备皮、消毒小鼠右下肢,在小鼠右侧膝关节下切开约0.5cm纵行切口,分离肌肉筋膜后,于胫骨中上1/3处用眼科剪横断胫骨。逐层缝合切口,制成小鼠右侧胫骨干闭合性骨折模型。

  1.3 小鼠骨折愈合情况观察

  术后清洁环境下单笼饲养,室温2224℃,湿度60%,定期紫外线消毒与排风。常规给水及饮食,小鼠可自由活动。手术当日,观察其苏醒情况。于骨折后5、7、14、21 天处死小鼠(n=4),取其骨折胫骨多聚甲醛固定,乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,梯度乙醇脱水,石蜡包埋,切片厚5 μm,常规HE色,光镜观察其组织病理改变。

  1.4 总RNA提取、逆转录

  取各时间点(n=4)的右侧胫骨骨折处上下各0.3 mm处剪下骨痂,加入液氮待组织变脆后研磨至粉末加入1ml Trizol中,样品体积不应超过Trizol体积10%.静置10 min;加200 μl 氯仿混匀、离心、取上清,异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤,用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。OD260/OD280范围在1.82.0 之间。取1μg总RNA为模板,参照逆转录试剂盒的说明书进行逆转录反应。取手术当日左侧胫骨同样位置骨组织提取RNA为对照。

  1.5 实时荧光定量PCR检测

  内参和目的基因的引物由上海生工生物工程公司合成(表一)。PCR反应体系配制及扩增条件设置参照定量PCR反应试剂盒说明书进行,每次做3个复孔,每个基因重复3次。扩增条件:95℃30s;95℃5s,57℃20s,72℃15s,40个循环(扩增);95℃ 30s,57℃30s,95℃30s。定量PCR 仪自动给出熔解曲线分析,得到扩增曲线、熔解曲线和样本的循环阈值(cycle threshold,CT)值和目的基因的相对含量。表1 目的基因引物序列

  1.6 统计学方法

  数据值以均值±标准差(±s)表示。用SPSS 11.0软件对均数进行独立样本的t检验(双侧)分析。P<0.05 为差异有显著性。

  2 结果

  2.1 骨折模型制作成功

  骨折小鼠麻醉后约23小时可完全苏醒并逐渐恢复正常活动,伤侧肢体大约在术后35天方可承重。小鼠可自由饮水、饮食及活动。实验动物术后成活率为100%,取材前X光摄片,初步观察骨折愈合,取对合良好、无明显错位和骨碎片的(图1)40只进入结果分析。图1 胫骨骨折X光

  2.2 骨折愈合情况评价

  骨折后5天,骨痂中主要是软骨组织,以尚未成熟的静息期、增殖期软骨为主(图2A、E)。骨折后7 天,骨痂主要由软骨性骨痂及少量骨性骨痂组成,其中软骨痂内软骨组织与第5天比有明显增多,骨折线周围以软骨细胞为主,局部开始出现肥大软骨细胞(图2B、F)。骨折后14 天,骨痂进入硬骨痂形成期,骨痂中大部分区域被新生编织骨取代,软骨组织明显减少,残留的软骨组织中软骨细胞基本上都已经分化为肥大软骨细胞(图2C、G)。骨折后21天,骨痂处于重建阶段,软骨痂基本被编织骨替代,并且开始形成骨髓腔(图2D、H)。骨折后28天,小鼠骨髓腔完全再通(图片未显示)。

  2.3 小鼠骨折愈合过程中FGFRs mRNA表达水平变化

  我们利用定量PCR检测了骨折愈合各阶段骨痂组织中FGFRs mRNA的表达。结果显示:与对照组相比,FGFR1骨折后3天开始显著升高,最高在14天时表达量达到对照的6倍,且持续到骨折愈合的28天仍处在对照3.2倍水平(图3A);FGFR2表达在骨折后显著增加,在骨折后7天达到峰值,约为对照的2.1倍,骨折后28天恢复正常水平(图3B);FGFR3骨折后7天表达达到峰值,持续到骨折后21天仍处在较高水平(图3C)。

  3 讨论

  骨折愈合过程包括炎症期、血肿机化期、软骨痂形成期、硬骨痂形成期和骨痂塑型改建期等病理学过程。骨折愈合过程有与骨骼发育过程类似之处:如骨折稳定,骨折处骨髓间充质细胞及骨膜下骨生成细胞等可直接分化为成骨细胞,在骨折端内外形成骨样组织并逐渐骨化成新骨,即膜内成骨;而在不稳定骨折时,骨折断端间的间充质细胞等先分化为软骨细胞,形成软骨痂,随后软骨细胞增生、成熟肥大、凋亡,在软骨细胞成熟肥大的同时伴有血管长入,成骨细胞成骨,逐步替代软骨,并在破骨细胞的作用下发生骨重建,即软骨内成骨。绝大多数骨折愈合都是两种成骨模式交织进行的,只是稳定性骨折以膜内成骨为主,非稳定性骨折以软骨内成骨为主[10,11]。本实验采用的是不稳定骨折模型,组织学观察结果与上述过程一致,是一个软骨形成和骨形成交织进行的过程。骨折后5天,血肿消失,骨痂中出现明显的软骨细胞,主要以静息期和增殖期软骨为主;骨折后7天,骨痂以软骨痂为主,有少量的骨性骨痂出现,局部可见肥大软骨细胞;骨折后14天,骨痂中大部分是新生编织骨所形成的硬骨痂,存有少量的软骨组织;骨折后21天,骨痂进入重建期,软骨组织逐渐消失,骨髓腔也开始逐渐恢复再通。

  FGFs/FGFRs信号通路在骨发育中发挥着重要作用。由于表达谱和与不同配体的亲和力不同,FGFRs在骨发育中的作用有明显的分工。FGFR1、FGFR2主要在颅骨成骨细胞中表达,参与骨形成过程。FGFR1、FGFR2功能增强型点突变主要由于前成骨细胞分化加快膜内成骨增强进一步导致颅缝早闭[6,12]。相反地,FGFR3主要在软骨形成过程中表达,其突变能引起异常的软骨内成骨,研究证实,FGFR3是软骨发育的负性调节因子[7,13,14]。骨折愈合与骨折发育过程相似[15]。这提示我们,不同的FGFR在骨折愈合过程中发挥不同的作用。图2 胫骨骨折后第5、7、14、21天骨痂组织学形态(上排HE×40,下排HE×100) 图3 骨折愈合过程中FGFRs表达水平变化

  我们应用定量PCR检测FGFRs在骨折愈合过程中的表达情况。我们发现,FGFR1在骨折后3天开始显著升高,骨折后14天达到峰值并持续到28天。这点与Nakajima等[16]的结果相似,FGFR1的表达从骨折后3天即开始升高,这与其在骨骼肌受损后促进肌源性细胞增殖和分化以及优先参与骨膜下骨前体细胞增殖相关[17]。同时研究证实,FGFR1与炎症反应有关[18,19],这也是FGFR1在骨折后早期就出现高表达的可能原因。随着骨折愈合过程的发展,软骨痂中的软骨细胞不断成熟形成肥大软骨细胞,成骨过程不断进行,表达于成骨细胞和的肥大软骨细胞的FGFR1在骨折后14、21天持续处于高表达,与组织学的骨折愈合过程相一致。

  FGFR2表达在骨折后显著增加,在骨折后7天达到峰值,而后逐渐恢复到正常水平,这与其的表达谱也是相一致的。FGFR2主要在骨膜下的成骨细胞和软骨痂的肥大前、肥大软骨细胞表达[20],因此其在骨折后表达变化不如FGFR1灵敏,在骨折后5天,骨痂中以尚未成熟的软骨细胞为主,因此FGFR2的表达变化不明显,而在有肥大软骨细胞出现的骨折后7天发生明显改变,并且由于软骨细胞的不断肥大凋亡被成骨细胞取代而一直处在较高水平。

  与对照相比,FGFR3骨折后7天、14天表达达到峰值,持续到骨折后21天仍处在较高水平。FGFR3在软骨发育中在长骨的静息期和增殖期软骨细胞表达,然而在骨折愈合中,FGFR3主要在肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中表达[21],因此,在有大量静息期与增殖期软骨的骨折后5天,并不能检测FGFR3表达的显著增高,而在肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞较多的骨折后7天、14天高表达,这与组织学观察的过程相吻合。

  总之,通过对骨折愈合中FGFRs表达的研究,可望为阐明FGFs/FGFRs在骨折愈合过程中的可能作用和采取干预FGFs/FGFRs信号的措施促进骨折愈合,降低骨不连率提供理论基础。

【参考文献】
   [1] Yamazaki M,Nakajima F,Ogasawara A,et al.Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus[J].Bone Joint Surg Br,1999,81(3):508515.

  [2] Gerstenfeld LC,Cullinane DM,Barnes GL,et al.Fracture healing as a postnatal developmental process:molecular,spatial,and temporal aspects of its regulation[J].Cell Biochem,2003,88(5):873884.

  [3] Hadjiargyrou M,Lombardo F,Zhao S,et al.Transcriptional profiling of bone regeneration.Insight into the molecular complexity of wound repair[J].Biol Chem,2002,277(33):3017730182.

  [4] Barnes GL,Kostenuik PJ,Gerstenfeld LC,et al.Growth factor regulation of fracture repair[J].Bone Miner Res,1999,14(11):18051815.

  [5] Kawaguchi H,Nakamura K,Tabata Y,et al.Acceleration of fracture healing in nonhuman primates by fibroblast growth factor2[J].Clin Endocrinol Metab,2001,86(2):875880.

  [6] Wilkie AO,MorrissKay GM,Jones EY,et al.Functions of fibroblast growth factors and their receptors[J].Curr Biol,1995,5(5):500507.

  [7] Deng C,WynshawBoris A,Zhou F,et al.Fibroblast growth factor receptor 3 is a negative regulator of bone growth[J].Cell,1996,84(6):911921.

  [8] Colvin JS,Ogilvie C,Thompson Z,et al.Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3[J].Nat Genet,1996,12(4):390397.

  [9] Choi P,Ogilvie C,Thompson Z,et al.Cellular and molecular characterization of a murine nonunion model[J].Orthop Res,2004,22(5):11001107.

  [10] Le AX,Miclau T,Hu D,et al.Molecular aspects of healing in stabilized and nonstabilized fractures[J].Orthop Res,2001,19(1):7884.

  [11] Ferguson C,Alpern E,Miclau T,et al.Does adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation?[J].Mech Dev,1999,87(12):5766.

  [12] Iseki S,Wilkie AO,Heath JK,et al.Fgfr2 and osteopontin domains in the developing skull vault are mutually exclusive and can be altered by locally applied FGF2.[J].Development,1997,124(17):33753384.

  [13] Rousseau F,Bonaventure J,LegeaiMallet L,et al.Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor3 in achondroplasia.[J].Nature,1994,371(6494):252254.

  [14] Chen L,Li C,Qiao W,et al.A Ser(365)>Cys mutation of fibroblast growth factor receptor 3 in mouse downregulates Ihh/PTHrP signals and causes severe achondroplasia[J].Hum Mol Genet,2001,10(5):457465.

  [15] Cheung C.The future of bone healing.[J].Clin Podiatr Med Surg,2005,22(4):631641.

  [16] Nakajima A,Nakajima F,Shimizu S,et al.Spatial and temporal gene expression for fibroblast growth factor type I receptor (FGFR1) during fracture healing in the rat[J].Bone,2001,29(5):458466.

  [17] Templeton TJ,Hauschka SD.FGFmediated aspects of skeletal muscle growth and differentiation are controlled by a high affinity receptor,FGFR1[J].Dev Biol,1992,154(1):169181.

  [18] Byrd VM,Kilkenny DM,Dikov MM,et al.Fibroblast growth factor receptor1 interacts with the Tcell receptor signalling pathway[J].Immunol Cell Biol,2003,81(6):440450.

  [19] Schwertfeger KL,Xian W,Kaplan AM,et al.A critical role for the inflammatory response in a mouse model of preneoplastic progression[J].Cancer Res,2006,66(11):56765685.

  [20] Rundle CH,Miyakoshi N,Ramirez E,et al.Expression of the fibroblast growth factor receptor genes in fracture repair[J].Clin Orthop Relat Res,2002,(403):253263.

  [21] Nakajima F,Nakajima F,Shimizu S,et al.Spatial and temporal gene expression in chondrogenesis during fracture healing and the effects of basic fibroblast growth factor[J].Orthop Res,2001,19(5):935944.doi:10.3969/j.issn.16742257.2010.03.007

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第3期]栏目

皮肤创伤愈合过程中基质细胞衍生因子1表达及其影响因素

【摘要】  目的 探讨伤创面愈合过程中基质细胞衍生因子1 (Stromacell derived factor1,SDF1)的表达及其年龄和炎症刺激对其表达的影响。方法 建立不同年龄小鼠背部皮肤全层缺损伤模型,分别于伤后获取创面组织,应用半定量逆转录聚合酶链反应(Reverse TranscriptionPolymerase Chain Reaction,RTPCR)和免疫组织化学方法检测损伤后各时间点创面SDF1 mRNA及蛋白表达;同时,分离培养小鼠皮肤成纤维细胞,分别用不同浓度的TNFα和IL1(均为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)作用于成纤维细胞48h后收获细胞,通过RTPCR法检测细胞SDF1α的基因表达。结果 RTPCR结果发现成年鼠创伤愈合过程中创面SDF1呈双峰表达,在损伤后1天表达显著增加(P<0.01),3天表达最低(P<0.05),5天表达达峰值(P<0.01);免疫组织化学检测发现在正常皮肤组织,SDF1主要表达在表皮基底层和真皮成纤维细胞;第1天主要表达在表皮基底层和血管周围;第3天主要表达在血管周围;第5天主要表达在表皮细胞和血管周围。新生组和2周龄组小鼠创面SDF1基因表达于伤后前3d都呈高水平表达 (P<0.05)。体外实验结果显示,低浓度(0.1 ng/ml)TNFα和IL1均能显著抑制成纤维细胞的SDF1α mRNA表达(P<0.05),并随着浓度的增加,其抑制作用逐渐增强。结论 年龄因素和炎症反应对创面SDF1表达有明显影响,炎性细胞因子对创面SDF1表达具有负性调控作用,影响创伤愈合质量。

【关键词】  皮肤;创伤愈合;基质细胞衍生因子1,成纤维细胞;肿瘤坏死因子α;白介素1

 Abstract:Objective To investigate the expression profile of stromal cell derived factor1 (SDF1) in different age mice and to observate inflammation stimulus for its expression influence during fullthickness cutaneous wound healing in mice.Methods On one hand,mice fullthickness wound models were prepared.The endogenous expression of SDF1 mRNA of wound tissue was measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) analysis and its protein expression was detected by immunohistochemistry at different time point.On the other hand,fibroblasts of mice were isolated from dermis and cultured in vitro routinely,and were respectivly stimulated with different concentrations of tumor necrosis factorα (TNFα) and interleukin1 (IL1) indifferent contrations(0.1,1.0,10and 100 ng/ml).After treated 48hrs,fibroblasts were harvested for SDF1 mRNA expression by RTPCR.Results The gene expression of SDF1 assessed by RTPCR exhibited a doublepeak expression,which peaked on day 1 (P<0.05) and day 5 (P<0.05) after excision,but reached the lowest level on day 3 (P<0.05),which was consistent with the results of immunohistochemistry.SDF1 protein was predominantly expressed at reepidermal cells of wound edge and neovascularity endothelial cells and fibroblasts of granulation tissue;The gene expression of SDF1 of 2 weeks old mice was enhanced until day 2 (P<0.05) after trauma,and then was decreased;but in newborn mice,the SDF1 gene expression was consecutively enhanced until day 3 (P<0.05);The production of SDF1 of fibroblasts can be intensivly inhibited by TNFα and IL1 (P<0.05).This inhibition was gradually enhanced in a dosedependent.Conclusions The expression of SDF1 is markedly influenced by age factor and inflammatory reacton,and is negatively regulate by inflammatory cytokines,resulting in impaired wound healing.

  Key words:Skin;Wound healing;Stromal cell derived factor1;Inflammatory cytokine;Age

  皮肤创伤修复/愈合是一个复杂而有序的过程。创伤部位释放的多种细胞因子和生长因子严格调控创伤愈合过程,这些细胞因子在局部表达水平、表达类型以及表达规律决定了参与修复细胞的活性及功能状态,从而对组织修复速率、纤维化程度以及修复结局产生极其重要的影响[1]。基质细胞衍生因子1α(stromal cellderived factor1,SDF1)是一种由基质细胞合成分泌、缺血缺氧诱导表达、对人类CD34+祖细胞等有显著趋化作用的CXC类强效趋化因子[2,3],能与CXCR4特异性结合构成SDF1/CXCR4生物轴,参与并调节器官发生、干细胞归巢、癌症转移和重要脏器损伤修复等病理生理过程[48]。皮肤损伤必然发生缺血缺氧,存在明显诱导创面SDF1表达的诱因,而大量文献证实SDF1是参与调节组织/器官损伤修复的关键细胞因子[911],由此我们推测,SDF1可能参与皮肤创伤愈合过程,但是对其在皮肤创伤修复过程中的表达及作用了解甚少。为此,本实验旨在探讨SDF1在皮肤创伤修复过程中的表达规律及其可能作用,为进一步丰富创面愈合的分子机制提供新的实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 主要试剂

  一抗:SDF1α抗体(购于美国Santa Cruz Biotechnology公司);RTPCR试剂盒(购于TaKaRa宝生物公司);二氨基联苯胺(……DAB)、SP9000通用免疫组化试剂盒(购于北京中衫金桥公司);SDF1α及GAPDH引物(由上海生工合成)。

  1.2 实验动物模型的建立

  清洁级雄性昆明小鼠32只(第三军医大学实验动物教研室提供),体重2530 g.小鼠背部剃毛后,应用速眠新Ⅱ(1 ml·kg1)肌肉麻醉,常规消毒,于背部近颈侧以脊柱为中线切除约1.5 cm × 1.5cm的正方形全层皮肤,创面以消毒纱布止血后暴露,不用任何药物,常规饲养,观察伤口的自然愈合过程。分别于伤后第1、2、3、4、5、7、10和14天随机取4只小鼠,麻醉后取材,切取创面组织。部分组织4%中性多聚甲醛缓冲固定液固定标本,常规脱水,包埋,切成5 μm切片,用于组化染色。

  同窝新生1 d和2周龄的昆明种小鼠各12只,清洁级,雌雄不拘。新生组小鼠于背部切除0.5 cm×0.5 cm的全层皮肤,创面以无菌纱布止血后暴露,母乳喂养;2周龄小鼠用适量戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后,背部剃毛,常规消毒,于背部近颈部以脊柱为中线切除约1.0 cm×1.0 cm的全层皮肤,创面以消毒纱布止血后暴露,不用任何药物,常规饲养,于伤后1、2和3 d均随机处死4只小鼠,切取创面及创缘正常侧0.3 cm组织,切取正常小鼠皮肤组织作为对照组,所有标本液氮冻存,用RTPCR法检测SDF1α基因表达。

  1.3 小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养

  清洁级68周龄雄性昆明种小鼠,体重(28±2)g.3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉,背部剃毛后常规消毒,取背侧皮下组织。采用组织块法分离培养小鼠皮肤成纤维细胞,分别用0.1、1、10、100 ng/ml浓度的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNFα)和白细胞介素1(interleukin 1,IL1)作用于成纤维细胞,48 h后收获细胞,对照组仅加培养基,不加任何刺激物。应用RTPCR法检测细胞SDF1α的基因表达。

  1.4 免疫组化染色

  取创面以及周围0.5 cm宽的皮肤组织,室温下4%中性多聚甲醛缓冲固定液固定标本48 h,逐级脱水,石蜡包埋,切成5 μm厚度切片。切片脱蜡至水化;经0.3%过氧化氢甲醇去除内源性过氧化物酶,0.1% Tritox100 37℃孵育8 min;以10%正常山羊血清封闭,滴加一抗SDF1α(1∶300)4℃过夜;次日,PBS洗涤后,加入生物素化二抗和辣根过氧化物酶标记链酶卵白素分别在37℃孵育30 min,最后DAB显色,苏木素复染后,脱水、透明、中性树胶封片。显微镜下观察,胞浆内有棕黄色颗粒的为阳性细胞。免疫组化阴性对照以PBS代替一抗。

  1.5 RTPCR检测SDF1αmRNA表达

  采用异硫氢酸胍一步法提取皮肤创面组织中的总RNA,紫外分光光度计测定RNA的浓度,凝胶电泳分析RNA结构。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术对转录产物进行扩增,以三磷酸甘油醛脱氢酶(……,GAPDH)作为内参对照,所用引物为:SDF1α,上游引物:5’AAA CTG TGC CCT TCA GAT TGT T3’,下游引物:5’CGG GGA ACT AGT TTT TCC TTT T3’,产物大小为209碱基对(bp);GAPDH,上游引物:5’TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G3’,下游引物:5’ATC CTG TTG CTG TAG CCG TAT T3’,产物大小470 bp.取PCR反应产物10 μl在1×TAE制备2.0%琼脂糖凝胶中电泳,加入浓度为0.5 μg/ml的溴化乙啶(……,EB)染色,用DL2000为标准来判断PCR产物片段大小,恒压5 V/cm电泳,然后用凝胶扫描仪观察并扫描。实验结果以检测条带与GAPDH条带的总灰度值的比值作为检测目的片段的相对表达水平。

  1.6 统计学处理

  实验所得数据用均数±标准差(±s)表示,所有资料用SPSS 13.0统计软件包进行方差分析和t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

  2 结果

  2.1 免疫组织化学染色

  正常皮肤组织表达力量SDF1,主要表达在皮肤表皮基底层和真皮层成纤维细胞(图1),正常皮肤表皮基底层细胞呈SDF1阳性表达,而真皮间质也可见少量阳性表达的细胞,主要是梭形的成纤维细胞。而创伤后第1天真皮组织内SDF1阳性细胞显著增加,主要位于创缘表皮基底层、毛囊外周、血管上皮细胞以及间质细胞胞浆内;伤后第3天,阳性表达细胞显著减少,而血管周围仍有一些SDF1阳性细胞;伤后第5、7天,SDF1阳性细胞又显著增加,主要是位于真皮的基质细胞、创沿表皮细胞、血管周围和皮脂腺的一些细胞;伤后14天在真皮层成纤维细胞表达SDF1,基底层未见有表达。图1 损伤前后SDF1α在皮肤创面的表达(SP,×400)表1 各组小鼠损伤后不同时间的SDF1α的半定量结果

  2.2 SDF1 mRNA表达变化

  正常皮肤组织存在SDF1 mRNA表达,当皮肤组织发生缺损伤后1 d,SDF1 mRNA表达较正常组织明显增加(P<0.01)。随后,伤后2、3 d,SDF1 mRNA表达减少,2 d时基本恢复到正常组织水平,3 d时表达量最低,低于正常组织水平(P<0.05)。伤后4、5 d SDF1 mRNA表达又开始回升(P<0.01),5 d时达峰值(P<0.01),以后又逐渐下降,14 d时基本恢复至正常水平。小鼠全层皮肤缺损伤创伤愈合过程中创面SDF1 mRNA表达呈双峰(图2)。

  2.3 新生组和2周龄组创面愈合过程中SDF1α基因的表达规律

  新生组和2周龄组小鼠皮肤均构成性表达SDF1 mRNA。新生组的SDF1 mRNA在创伤后表达呈逐渐增加趋势,于第3天表达达峰值,显著高于正常皮肤(P<0.05);2周龄组的SDF1 mRNA在创伤后第1天表达即增加,于第2天表达达峰值(P<0.05),在第3天时表达虽减少,但仍高于正常皮肤(P<0.05)。与2周龄小鼠比较,新生鼠伤后第2天SDF1 mRNA表达显著下降(P<0.05),而第3天显著升高(P<0.05)(图3,表1)。

  2.4 不同浓度TNFα和IL1对成纤维细胞表达SDF1α基因的影响

  成纤维细胞构成性表达SDF1基因。低浓度(0.1 ng/ml)TNFα和IL1能够显著抑制成纤维细胞的SDF1α基因表达(P<0.05),并随着浓度的增加,其抑制作用逐渐增强(图4、5,表2),相同浓度的TNFα组和IL1组间差异没有统计学意义(P>0.05)。

  3 讨论

  趋化因子是一类对细胞具有定向趋化、迁移和募集作用的细胞因子。机体组织发生创伤后,创面局部产生的趋化因子不仅能趋化白细胞以及修复细胞聚集到创面,而且还能激活这些细胞并增强它们的功能,因此,趋化因子在创伤修复中的作用十分重要。新近研究证实,SDF1作为迄今发现的对骨髓细胞趋化效应最强的趋化因子,在组织/器官损伤修复过程中发挥着极其重要的作用[2]。目前对SDF1在重要脏器如心、肾等损伤修复过程中的作用研究报道较多,但其在皮肤创伤愈合过程中的作用及机制尚不清楚[7,8]。为此,本实验欲探讨皮肤创伤后SDF1在创伤愈合过程中的表达特点及其可能的作用。图2 RTPCR检测小鼠皮肤创伤后各时间点创面组织SDF1 mRNA的表达

  SDF1是以成纤维细胞和内皮细胞为主的基质细胞合成的趋化因子,并非由炎症细胞分泌表达,在多种器官中持续性表达,SDF1有6种同分异构体:SDF1、SDF1β、SDF1γ、SDF1δ、SDF1ε及SDF1φ,但它们在功能上没有显著差异,并且SDF1α是其在体内的主要存在形式[12],因此,本实验主要观察了SDF1在创面的表达特征。本实验结果显示,正常皮肤组织构成性表达SDF1,主要表达于表皮基底层和真皮的成纤维细胞胞浆内。在皮肤创伤愈合过程中,创缘SDF1 mRNA表达呈双峰改变,分别位于创伤后第1天和第5天。伤后第1天SDF1 mRNA表达显著增加,很可能与皮肤组织缺损造成的局部缺血缺氧有关。Daniel等[2]研究发现,组织缺血缺氧能够快速诱导缺氧诱导因子1α表达,而后者能够在转录水平上促进SDF1表达上调,SDF1表达量与缺氧程度呈明显的正相关。伤后第2、3天是创伤愈合炎症反应最为严重的阶段,大量巨噬细胞募集创面,合成分泌大量促炎细胞因子,如IL1和TNFα,通常在伤后第3天创面IL1和TNFα表达达峰值[13]。有研究显示,IL1和TNFα能强烈抑制成纤维细胞合成和分泌SDF1[14],由此可见,创面愈合的炎症反应期大量的炎症细胞浸润和炎症细胞因子产生,可能对SDF1 mRNA表达呈负性调控作用,因此,这可能是伤后第3天SDF1 mRNA表达显著减少的重要原因。图3 皮肤创面愈合初期SDF1和GAPDH的电泳结果图4 不同浓度TNFα作用成纤维细胞后SDF1和GAPDH的电泳结果图5 不同浓度IL1作用成纤维细胞后SDF1和GAPDH的电泳结果图6 不同浓度TNFα和IL1作用成纤维细胞后SDF1的RTPCR结果

  此时新生血管内皮细胞和成纤维细胞构成了肉芽组织的主要细胞成分,而它们均是SDF1的重要来源细胞[2,14]。这可能是伤后第5天出现SDF1表达再次达峰值的主要原因,随后一直维持在较高水平。

  本实验还观察了不同年龄小鼠皮肤创伤后SDF1 mRNA的表达变化,结果显示:不同年龄小鼠皮肤创面的SDF1 mRNA表达规律不同,特别是在伤后前3天的炎症反应期,与成年小鼠完全不同,新生组和2周龄组小鼠皮肤SDF1 mRNA表达水平是增加。以往研究认为,新生小鼠免疫系统发育尚未成熟,炎症细胞聚集功能不足,缺少炎症介质,创面的炎症反应(23 d)程度低[15,16],提示创面的炎症反应程度可能对SDF1 mRNA表达产生重要影响,新生鼠和2周龄组小鼠创面低炎症反应状态可能是SDF1 mRNA表达持续高水平的原因,进一步提示炎症反应对SDF1 mRNA表达起着负调节作用。

  成纤维细胞是创伤愈合和纤维化瘢痕形成的主要效应细胞,不仅是损伤局部分泌的细胞因子和生长因子作用的主要靶细胞,也是一些细胞因子和SDF1的重要来源。我们通过体外实验观察促炎细胞因子TNFα和IL1对于小鼠皮肤成纤维细胞SDF1 mRNA表达的影响,结果显示:炎性细胞因子能够强烈抑制成纤维细胞SDF1 mRNA表达,并且随着细胞因子浓度的增加,其抑制作用显著增强。本实验结果与文献报道是一致的[17]。

  SDF1是一个与新生血管生成以及促进干细胞募集密切相关的趋化因子[6,7],而炎性细胞因子对其表达具有负调控作用,炎症反应越重,SDF1合成分泌越少,将严重影响创面愈合速度。这可能是感染创面愈合速度慢和愈合不良的重要原因之一。抑制创面炎症反应,促进SDF1合成分泌或外源性给予SDF1治疗,可能成为提高创面愈合速度、改善创面愈合质量的新的治疗手段,也暗示促炎细胞因子对于创面愈合与组织修复是不利的。

  已有研究显示SDF1不仅是第一个报道的对人类CD34+祖细胞有强烈趋化作用的CXC趋化因子,也是参与新生血管形成的关键细胞因子[14,18]。有研究显示,糖尿病小鼠皮肤创面的SDF1表达减少,循环中的内皮祖细胞数目显著减少,其增殖、黏附和形成血管的能力减弱,导致创面毛细血管密度显著降低,即使增加外周循环的内皮祖细胞数目,这些细胞也不能有效地到达到皮肤创面,但是增加创面的SDF1表达,能显著增加内皮祖细胞募集到达创面,参与新血管形成,加速创面愈合,改善愈合质量[19,20]。本研究结果提示,SDF1参与了皮肤创伤愈合的炎症期和增生期,其在创面的表达特征提示炎症反应(炎性细胞和炎性细胞因子)可能抑制SDF1表达,其结果可能干扰创面新生血管形成,抑制骨髓来源的修复细胞在创面的募集,从而影响修复速度和愈合质量,造成延迟愈合或愈合不良。因此,外源性SDF1对创面愈合尤其是难愈创面可能具有潜在的临床应用价值。

【参考文献】
   [1] Mescher AL,Neff AW.Regenerative capacity and the developing immune system[J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2005,93:3966.

  [2] Ceradini JD,Kulkarni AR,Callaghan MJ,et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF1 induction of SDF1[J].Nat Med,2004,10(8):858864.

  [3] Aiuti A,Webb IJ,Bleul C,et al.The chemokine SDF1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood[J].J Exp Med,1997,185(1):111120.

  [4] Ratajczak MZ,ZubaSurma E,Kucia M,et al.The pleiotropic effects of the SDF1CXCR4 axis in organogenesis,regeneration and tumorigenesis[J].Leukemia,2006,20(11):19151924.

  [5] Kucia M,Reca R,Miekus K,et al.Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms:pivotal role of the SDF1CXCR4 axis[J].Stem Cells,2005,23(7):879894.

  [6] Jiang YP,Wu XH,Xing HY,et al.Role of CXCL12 in metastasis of human ovarian cancer[J].Chin Med J(Engl),2007,120(14):12511255.

  [7] Tang YL,Qian K,Zhang YC,et al.Mobilizing of haematopoietic stem cells to ischemic myocardium by plasmid mediated stromalcellderived factor1α(SDF1α)treatment[J].Regul Pept,2005,125(13):18.

  [8] Tgel F,Isaac J,Hu Z,et al.Renal SDF1 signals mobilization and homing of CXCR4 positive cells to the kidney after ischemic injury[J].Kidney Int,2005,67(5):17721784.

  [9] Kucia M,Ratajczak J,Ratajczak MZ.Bone marrow as a source of circulating CXCR4+ tissuecommitted stem cells[J].Biol Cell,2005,97(2):133146.

  [10] Magda K,Ratajczak J,Reca R,et al.Tissuespecific muscle,neural and liver stem/progenitor cells reside in the bone marrow,respond to an SDF1 gradient and are mobilized into peripheral blood during stress and tissue injury[J].Blood Cells Mol Dis,2004,32(1):5257.

  [11] Falanga V.Wound healing and its impairment in the diabetic foot[J].Lancet,2005,66(9498):17361743.

  [12] 林建银,郑志竑,章涛,等.分子医学技术[M].北京:科学出版社,2000:4951.

  [13] Efron PA,Moldawer LL.Cytokines and wound healing:the role of cytokine and anticytokine therapy in the repair response[J].J Burn Care Rehabil,2004,25:149160.

  [14] Yu L,Cecil J,Peng SB,et al.Identification and expression of novel isoforms of human stromal cellderived factor 1[J].Gene,2006,374:174179.

  [15] Adzick NS,Lorenz HP.Cells,matrix,growth factors and the surgeon:the biology of scarless wound repair[J].Ann Surg,1994,220(1):1018.

  [16] Olutoye OO,Yager DR,Cohen IK,et al.Lower cytokine release by fetal porcine platelets:a possible explaination for reduced inflammation after fetal wounding[J].J Pediatr Surg,1996,31(1):9195.

  [17] Fedyk ER,Jones D,Critchley HO,et al.Expression of stromalderived factor1 is decreased by IL1 and TNF in dermal wound healing[J].J Immunol,2001,166(9):57495754.

  [18] Gallagher KA,Liu ZJ,Xiao M,et al.Diabetic impairments in NOmediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF1 alpha[J].J Clin Invest,2007,117(5):12491259.

  [19] Gallagher KA,Liu ZJ,Xiao M,et al.Diabetic impairments in NOmediated endothelial progenitor cell mobilization and homing are reversed by hyperoxia and SDF1 alpha[J].J Clin Invest,2007,117(5):12491259.

  [20] Stellos K,Langer H,Daub K,et al.Plateletderived stromal cellderived factor1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells[J].Circulation,2008,117(2):206215.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第3期]栏目
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重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【摘要】  目的 重组表达人细胞核输入蛋白α(Importin α),制备多克隆抗体。方法 提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RTPCR法扩增Importin α 基因。构建pGEX6P1Importin α 融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导表达GSTImportin α 重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA 检测抗体效价。结果 RTPCR扩增出的Importin α 基因片段(1300bp)与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GSTImportin α 重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论 在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α 蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。

【关键词】  核输入蛋白α;原核表达;蛋白质纯化;抗体制备

 Abstract:Objective To express recombinant Importin α and prepare antiImportin α polyclonal antibody.Methods The Importin α gene was obtained by RTPCR from the total RNA of human hepatoma cell HepG2 and cloned into the vetor pGEX6P1.The recombinant plasmid pGEX6P1Importin α was transferred into E.coli BL21 and the GSTImportin α fusion protein was expressed by inducing with IPTG.The fusion protein was purified by glutathione sepharose 4B affinity chromatography.Mice were immunized with recombinant Importin α,and the titer of the polyclonal antiserum was detected by ELISA.Results The length of the RTPCR product of Importin α was consistent with the expected.The purified GSTImportin α fusion protein was 83kD demonstrated by SDSPAGE,mass spectrometry and western blot.Antiserum was obtained by immunizing in mice and had a high titer determined by ELISA.Conclusion The recombinant Importin α is prokaryotically expressed and purified,and polyclonal antibody is obtained.Our study lays the foundation for further research of importing system and its application.

  Key words:Importin α;prokaryotic expression;protein purification;antibody preparation

  核膜上分布的核孔复合体(NPC)是沟通细胞核内外物质交流和信息交流的主要通道。生物大分子经NPC跨核膜转运是真核细胞基因复制、转录和翻译的必要环节,也是联系细胞内信号转递、参与细胞核反应(即细胞增殖、分化、凋亡等核反应)调控的重要环节。Importin蛋白是核定位信号的受体蛋白,存在于胞质溶胶中,可与核定位信号结合,帮助核蛋白进入细胞核,这种受体称为输入蛋白。它们作为一种穿梭受体( shuttling receptor )在细胞质内与核蛋白的核定位信号结合,然后一起穿过核,在核内与亲核蛋白分离后再返回到细胞质中。输入蛋白有α和β两种亚基。本实验主要研究Importin α,在克隆全长人Importin α cDNA的基础上,构建了重组人Importin α 的原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化,并获得小鼠抗人Importin α多克隆抗体,为进一步深入研究其生物活性及其应用打下基础。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 质粒、菌株与细胞系

  E.coli DH5α菌株和E.coli BL21菌株为本实验室保存;HepG2细胞来自四川大学国家重点实验室。

  1.1.2 试剂与仪器

  异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG),蛋白预染Marker.PCR仪,紫外分光光度计,高速冷冻离心机(Eppendorf公司);MiniProtein Ⅳ电泳系统(BioRad公司);凝胶成像系统(Gene公司)。

  1.1.3 引物

  根据人Importin α基因序列设计引物,5’端引物包含起始密码子并引入BamH I酶切位点,3’端引物包含终止密码子并引入Xho I酶切位点(下划线为酶切位点),引物序列如下:上游引物序列为:5’GTG GAT CCA TGTCCACCAACGAGAATGCT3’;下游引物序列为:5’CGC TCG AGC TAAAAGTTAAAGGTCCCAGG3’.

  1.2 方法

  1.2.1 重组表达质粒pGEX6P1Importin α的构建

  用TRIzol法提取HepG2细胞总RNA,根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,按照回收试剂盒说明书纯化回收目的片段。将Importin α基因纯化回收产物与载体pGEX6P1分别用BamH I和Xho I限制性内切酶进行双酶切,分别用1%与1.5%琼脂糖凝胶电泳后,切胶回收线性载体与目的基因片段。将Importin α目的基因与pGEX6P1线性载体2∶1用T4连接酶22℃连接1h后,连接产物转化到大肠埃希菌感受态细胞E coli DH5α中。将连接产物用BamH I和Xho I酶进行双酶切,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测[1]。

  1.2.2 重组质粒载体的诱导表达

  将构建好的重组质粒pGEX6P1Importin α转化到宿主菌BL21中进行诱导表达。在LB琼脂培养基(Amp)上挑取菌落并接种到5ml LB(Amp)液体培养基中,37℃振荡培养14 h.次日将培养菌接种到50ml LB(Amp)液体培养基中,37℃振荡培养3h,使其A540为0.40.6,加入IPTG,使其终浓度达到0.2 mmol/L,继续在28℃振荡培养5h,诱导Importin α 重组蛋白表达[1]。

  1.2.3 Importin α 重组蛋白的纯化

  将制备的抗血清稀释5倍,上样至 Protein A亲和层析柱(按说明书操作)进行纯化,用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱,收集的抗体溶液立即中和并透析,70℃保存备用[2]。

  1.2.4 Importin α 重组蛋白的鉴定

  取纯化样品,经12% SDSPAGE分离后,用考马斯亮蓝染色,进行质谱分析。采用蛋白质印迹方法。将上述纯化蛋白行12% SDSPAGE后,半干法转印至硝酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶适当摇晃后放入4℃,牛奶倒入TBST(150 mmol/L NaCl、0.1%Tween20、20mmol/L TrisHCl,pH 7.27.4)漂洗3次(5min/次),加入兔抗人多克隆抗体(1∶1000)封闭4℃ 过夜。取出用TBST漂洗3次,加入羊抗兔多克隆抗体,封闭2h后,再用TBST漂洗3次(5min/次),再用TBS漂洗一次(5 min),ECL_plus 显色液显色,Typhoon 多功能激光扫描成像系统扫描[3]。

  1.2.5 多克隆抗体的制备

  将纯化Importin α 蛋白采用腹腔注射方式免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。每只小鼠每次注射剂量为100 μg Importin α,每7天免疫一次,共四次。首次免疫时,取纯化Importin α 蛋白适量,加等体积福氏完全佐剂,乳化后于多点注射于实验小鼠背部皮下,每点约20μl,每只小鼠约注入100μg(约100μg混合液 )目的蛋白。最后一次免疫3天后摘除眼球取血,分离血清,-20 ℃保存[4]。

  1.2.6 多克隆抗体的效价测定

  抗Importin α效价检测采用间接ELISA,将纯化的重组蛋白稀释为1.0μg/ml作为包被抗原,鼠抗血清倍比稀释作为一抗,免疫前鼠血清作为阴性对照,兔抗鼠IgGHRP为二抗,加入显色液,终止反应。BioRad 450全自动酶标仪测定各孔在450 nm的光密度值,以P/N>2.1且PN>0.2所对应的最大抗体稀释倍数为抗体效价[5]。

  2 结果

  2.1 RTPCR

  用TRIzol法提取HepG2细胞总RNA后,逆转录获得cDNA,通过PCR 扩增获得目的基因片段。PCR产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示importinα基因片段为1590 bp,与理论 DNA 表达片段大小一致(图1),以此PCR产物进行BamH I和Xho I酶双酶切。图1 Importin α RTPCR片段的琼脂糖电泳

  2.2 重组表达载体的构建

  将扩增得到的importinα基因片段与pGEX6P1质粒连接后转化E.coli DH5α,获得pGEX6P1Importin α重组质粒,经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析,可见获得了单一纯质粒,以此为模板,进行PCR验证。

  重组质粒经PCR验证,扩增片段大小为1600bp左右,与理论相符(图3),证明目的基因插入到了pGEX6P1质粒中。将此重组质粒测序,结果鉴定显示克隆的Importin α 基因序列与基因本身表达序列相符。

  2.3 重组蛋白的诱导表达

  将重组质粒pGEX6P1Importin α导入大肠杆菌BL21,筛选出转化子。重组蛋白诱导表达情况见图4.结果表明,与未加IPTG诱导的样品相比,随着IPTG诱导时间延长,83kD的重组蛋白GSTImportin α表达增加。图2 pGEX6P1Importin α重组质粒的琼脂糖电泳 图3 PCR鉴定pGEX6P1Importin α重组表达质粒

  2.4 重组蛋白的质谱鉴定

  纯化获得的GSTImportin α蛋白经12% SDSPAGE分离后,用考马斯亮蓝染色,切除83kD蛋白带,通过胶内酶解后,对酶解产物进行ESITOFMS质谱分析,结果通过http://www.matrixscience.com网站的MASCOT数据库查询,鉴定结果见图5.质谱鉴定结果表明,样品中主要蛋白GST和Importin α,数据库得分分别在400分和1200分以上,远高于及格分数线45分。质谱结果表明,83kD电泳蛋白条带为GSTImportin α重组蛋白。图4 GSTImportin α 重组蛋白的表达

  2.5 Western blot

  纯化GSTImportin α 重组蛋白经 12% SDSPAGE 分析后进行蛋白印迹鉴定,可见在相对分子质量约为83kD处出现特异性条带,表明为Importin α蛋白(图6)。图6 GSTImportin α免疫印迹

  2.6 多克隆抗体的特异性分析及效价测定

  Western blot 结果显示约在83kD处有特异性显色反应,无杂交带出现,表明制备的多克隆抗体能与表达蛋白集合,并具有较强的特异性。以纯化的融合蛋白Importin α为包被抗体,间接ELISA法测定多克隆抗体效价,结果表明抗体效价达到 1∶1×105(图7)。图7 鼠抗Importin α效价检测

  3 讨论

  在真核细胞中,NPC是一种具有分子筛功能的孔状结构,能允许分子量小于4060kD的小分子物质以自由扩散通过,而分子量超过此范围或直径大于6nm的生物大分子(如mRNA、蛋白质等)则必须在胞质中可溶性转运受体蛋白的介导下,以能量依赖的方式进行主动转运[8,9]。

  大分子蛋白及部分小分子物质通过耗能的主动运输方式进行核转运,并通过核转运受体家族(importins)促进转运[10]。importinβ直接结合到货物蛋白及核孔蛋白上。在人类细胞中多于20种importinβ超家族成员已经被发现[11]。在经典核输入通路中,importinβ1通过核输入结合体家族中的importinα结合到货物蛋白上,并在人类细胞中发现了6种importinα.大多数importinα和importinβ对于不同类型的货物表现出不同的偏好性,表明不同的刺激可能补充不同的importins从而激活特异性的信号通路。货物蛋白通过一段短氨基酸序列(NLS)进行识别[7]。

  亲核蛋白通过NLS识别importinα,与可溶性NLS受体importinα/importinβ异二聚体结合,形成转运复合物。在importinβ的介导下,转运复合物与核孔复合物的胞质纤维结合。转运复合物通过改变构象,从胞质面转移到核质面。转运复合物在核质面与RanGTP结合,并导致复合物解离,亲核蛋白释放。受体的亚基与结合的Ran返回胞质,在胞质内RanGTP水解形成RanGDP并与importinβ解离,RanGDP返回核内再转换成RanGTP形态[12]。图5 质谱鉴定GSTImportin α

  生物大分子细胞核转运过程具有重要的医药学研究价值。真核细胞核孔的输入输出是直接联系胞浆与胞核的重要节点,它的输入输出速度以及效率直接影响到基因表达的效率。Importin α是NPC的重要组成部分,也是决定核孔输入输出这一过程的关键因素,一些病毒如HIV、HBV都是通过与Importin α的特异结合而完成其入核过程[13]。通过特异性抗体结合核孔复合物,能使该蛋白的作用得到抑制,不能和胞质内具有核定位信号肽的转运蛋白结合,从而达到靶向治疗的目的。因此,Importin α抗体的制备对于研究病毒、药物对基因表达影响等有重要意义。

  本实验提取人肝癌细胞的mRNA,通过逆转录克隆Importin α基因,并构建重组质粒,诱导并纯化重组Importin α蛋白,利用纯化蛋白免疫小鼠,成功制备该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价达1∶1×105,通过免疫印迹实验证明该抗体具有高度特异性,本研究可制备大量纯化蛋白和多克隆抗体,为进一步探索Importin α的蛋白结构、生物学效应及其生物学作用机制提供了依据。

【参考文献】
   [1] Feng N,Hou XQ.Prokaryotic Expression and Purification of Mouse Macrophage:Migration Inhibitory Factor Gene[J].Chin J Biologicals,2009.22(2):132135.

  [2] 汪家政,范明.蛋白质技术手册[M].北京,科学出版社.2002,231259.

  [3] Zhang L,Gao J.Construction of prokaryotic expression vector of human neuronal pentraxin 2 gene,and expression and purification of its recombinant protein[J].Med J Chin PLA,2009.34(1):2426.

  [4] 张文利,申慧.耻垢分枝杆菌glmU基因克隆、表达及多克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志,2008.24(6):601603.

  [5] 杨凡,刘朝奇,柳发勇,等.HIV1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(7):703705.

  [6] Kohler M.Evidence for distinct substrate specificities of importinα family members in nuclear protein import[J].Mol Cell Biol,1999,19(11):7782779.

  [7] 孙兆明,于士柱,安同岑,等.GSTNLS(ING1)融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究[J].国际生物医学工程杂志,2006,29(2):6972,80.

  [8] 李载权,唐朝枢,周爱儒.生物大分子的细胞核质转运[J].生理科学进展,2000,31(3):253256.

  [9] Kotera1 I,Sekimoto T,Miyamoto Y,et al.Importin a transports CaMKIV to the nucleus without utilizing importinβ[J].EMBO J,2005,24(5):942951.

  [10] Weis K.Regulating access to the genome:nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle[J].Cell,2003,112(4):441451.

  [11] Harel A,Forbes DJ.Importin bata:conducting a much larger cellular symphony[J].Mol Cell,2004,16(3):319330.

  [12] Otis KO,Thompson KR,Martin KC.Importinmediated nuclear transport in neurons[J].Curr Opin Neurobiol,2006,16(3):329335.

  [13] Goldfard DS,Cobett AH,Mason DA,et al.Importin alpha:a multipurpose mucleartransport receptor[J].Trends Cell Biol,2004,14(9):505514.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第3期]栏目

西洋参茎叶皂苷对局灶性脑缺血后caspase9表达的影响

【摘要】  目的 研究西洋参茎叶皂苷(PQS)对大鼠局灶性脑缺血后caspase9表达的影响,并进一步探讨其机制。方法 采用线栓法阻断大鼠一侧大脑中动脉(MCA),制备局灶性脑缺血模型,RTPCR技术检测大脑皮质凋亡相关基因caspase9 mRNA表达。结果 西洋参茎叶皂苷能明显降低局灶性脑缺血大鼠脑组织凋亡相关基因caspase9 mRNA表达。结论 西洋参茎叶皂苷对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用,其机理可能与西洋参茎叶皂苷抑制神经元细胞凋亡有关。

【关键词】  西洋参茎叶皂苷;脑缺血;细胞凋亡;caspase9

  【Abstract】 Objective To investigate the effects and the further mechanism of Panax quinquefolium saponins from stems and leaves (PQS) on caspase9. Methods The rats with incomplete cerebral ischemia were induced with line occlusion in the middle cerebral artery (MCA). Caspase9 mRNA in the cortical neuron was detected with reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR). Results Panax quinquefolium saponins significantly reduced the expression of caspase9 mRNA. Conclusion Panax quinquefolium saponins have protecting effect on cerebral ischemia,and the mechanism is related to inhibition of cell apoptosis.

  【Key words】 Panax quinquefolium saponins from stems and leaves; cerebral ischemia; cell apoptosis; caspase9

  脑血管病(CVD)是一种在世界范围内威胁人类健康的主要疾病之一,尤其是中、老年人具有发病率高、死亡率高、致残率高及复发率高的特点,研究一种能有效防治缺血性脑血管病的药物具有重要的意义。西洋参茎叶皂苷(PQS)是从西洋参茎叶中提取的有效成分,具有多种药理作用,但对脑缺血细胞凋亡的研究较少,因此对PQS抗凋亡作用的研究,不仅能为综合利用开发西洋参资源,而且为研发抗脑缺血的新药奠定理论和实验依据。本研究利用RTPCR等技术手段,观察PQS对脑组织凋亡相关基因的影响,皆在从基因水平探讨PQS对局灶性脑缺血损伤的保护作用及其作用机制。

  1 实验材料

  1.1 试验药物

  PQS(纯度>90%)由吉林大学基础医学院有机化学教研室提供;尼莫地平片(规格:20 mg):山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司。

  1.2 主要试剂

  DNA Marker D2000,引物核苷酸片段,TRIquick Reagent,三羟甲基氨基甲烷(TRIS ),N马林代丙磺酸(MOPS),甲酰胺(FORMAMIDE),溴化乙锭(EB),乙二胺四乙酸(EDTA)等。

  1.3 主要仪器

  SWCJ2F型净化工作台(苏州净化设备有限公司),Z36HK型台式高速低温离心机(德国Hermle公司),MyCyclerPCR仪(美国BIORAD公司),Alpha Imager EC型凝胶成像分析系统(美国Alpha Inntech公司),DYY8C型电泳仪和DYCP31D型水平电泳槽(北京六一仪器厂)等。

  1.4 实验动物

  健康Wistar大鼠,体重300 g±20 g,雄性,鼠龄4~5个月,由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供,动物合格证号:SYXK黑2008001.

  2 实验方法与步骤

  2.1 动物分组及给药

  取50只Wistar大鼠随机分为5组,每组10只,分别为PQS高、低剂量组、尼莫地平组、模型组、假手术组。PQS高剂量组100 mg/(kg·d)、低剂量组50 mg/(kg·d)、尼莫地平组21.6 mg/(kg·d)、模型组及假手术组给予同体积的生理盐水。各组均采取口服灌胃给药途径,每天给药一次,连续给药7天。最后一次给药30 min后,除假手术组外均参照longa法制备右侧大脑中动脉阻塞MCAO模型,在造模符合标准的动物中每组随机取出6只进行实验,假手术组动物仅行血管剥离术,术后随机取出6只进行实验。

  2.2 RTRCR检测caspase9 mRNA的表达

  2.2.1 引物设计

  引物自行设计,以βactin为内参照,引物具体序列信息如下:(1)caspase9(Gene Bank NM_031632.1)引物序列:上游引物为5'-CTGCAGACACCAGCATCACT-3';下游引物为5'- AGGACCAGGCTCACTTAGCA-3';扩增产物片段长度327 bp.(2)内参照βactin(Gene Bank NM0311442)引物序列:上游引物为5'- TCTATGAGGGTTACGCGCTC-3';下游引物为5'- CTTCTGCATCCTGTCAGCAA-3';扩增产物片段长度452 bp.

  2.2.2 取材

  大鼠局灶性脑缺血后24 h,断头处死动物,取缺血侧大脑额顶叶皮质约100 mg,迅速将所取组织用锡纸包裹、编号,然后放进盛有液氮的保温瓶中进行快速冷冻,最后放入86℃超低温冰箱中保存备用。

  2.2.3 总RNA提取

  取出冻存的脑组织60 mg,置于研钵中,加入1 ml Trizol 充分研磨,抽提匀浆。将匀浆移入1.5 ml Eppendorf管,冰浴5 min.每管加入0.2 ml氯仿,剧烈震荡15 s,冰浴3~5 min.12 000 r/min、4℃,离心5 min,取水相移入1.5 ml新Ep管,加入等体积异丙醇(约为0.4 ml),混匀,冰浴放置10 min.12 000 r/min、4℃、离心10 min,弃去上清液,加入1 ml 75%乙醇(DEPC水配制),震荡拍匀。7 000 rpm、4℃,离心5 min,弃去上清液,超净工作台下倒置于干净滤纸上,自然干燥1~2 min,加入DEPC水30 μl混匀、溶解RNA,70℃保存。

  2.2.4 RNA纯度与完整性鉴定

  总RNA 的完整性和纯度要求:甲酰胺10 μl,37%甲醛3.5 μl,10 ×MOPS 2 μl,RNA样品液4.5 μl混匀,1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察样品28 s rRNA与18 s rRNA分离完整,且紫外分光光度计检测RNA样品A260/A280在1.8~2.0之间者为样品纯度合格。

  2.2.5 RTPCR反应

  按试剂盒程序操作配制RTPCR反应体系配制,然后移入PCR仪,按以下条件进行PCR反应:Caspsae9:①50℃ 30 min;②94℃ 2 min;③94℃ 30 s;④54℃ 30 s;⑤72℃ 30 s;⑥72℃ 7 min,其中③④⑤循环30 cycles.βactin:①50℃ 30 min;②94℃ 2 min;③94℃ 30 s;④56℃ 30 s;⑤72℃ 30 s;⑥72℃ 7 min,其中③④⑤循环30 cycles.

  2.2.6 PCR扩增产物电泳及半定量分析

  取3 μL目的基因PCR产物和3 μL对应βactin基因PCR产物,加2 μL上样缓冲液,在90 V电压下进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,时间为50 min.电泳完毕后,应用凝胶成像系统拍照,并用Imagepro Plus 6.0分析软件测定产物的累积光密度值(IOD),以目的基因产物IOD值与βactin产物IOD值之比表示目的基因mRNA的含量。

  2.3 统计学方法

  应用 SPSS17.0 统计分析软件进行统计学分析,实验结果以均数±标准差(±s)表示,单因素方差分析(OneWay,ANOVA)进行组间差异的比较,显著性差异水平以 0.05 和 0.01 为标准。

  3 大鼠脑组织凋亡基因mRNA 表达产物分析

  对大鼠脑皮质组织提取的RNA经RTPCR扩增后,分别于327、452 bp处出现了亮度不同的条带,说明各组均有Caspase9 mRNA的表达(见图1)。对各组条带进行吸光度分析(表1),可见模型组Caspase9 mRNA表达较假手术组明显增加,差异有显著性意义(P<0.01),PQS高剂量、低剂量组及尼莫地平组Caspase9 mRNA的表达较模型组明显减少,差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01)。

  4 讨论

  细脑凋亡受基因编码调控,脑缺血后,凋亡相关基因及其表达产物发生了变化,导致细胞凋亡的发生。影响细胞凋亡的基因按其表达物对凋亡过程的作用大致可分为两类:一类为存活基因,主要包括Bcl2、BclxL、HSP、Cfos、sFas等,起抑制凋亡的作用;另一类为致死基因,主要包括caspases家族、Bax、Bad、NFkB、p53、Fas/Fasl等,起促进凋亡作用[1,2],其中被研究较多的有Bcl2家族、caspase家族、P53等。表1 各组大脑皮质Caspase9 mRNA表达的比较图1 大脑皮质凋亡相关基因caspase9 RTPCR凝胶电泳图

  目前发现脑缺血后神经元凋亡其信号转导通路有3条,即死亡受体通路、线粒体通路和caspase非依赖性途径,以前两条通路为主。死亡受体通路是指细胞表面的死亡受体[主要包括Fas/Apo1和肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)]通过其细胞外结构域与相应的死亡配体(FasL和TNFα)结合,将细胞外凋亡信号传入细胞内,激活caspase8 基因,而后激活下游的caspase3基因,最终启动细胞凋亡。线粒体途径是指当细胞受到各种因素的刺激(如缺血、缺氧等),线粒体膜去极化,线粒体膜电位下降,线粒体通透性转变孔开放,释放的凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf1)和细胞色素C(Cyt C)在dATP/ATP存在的情况下,形成凋亡体,激活caspase9,继而活化caspase3,引起细胞凋亡[3],可见死亡受体通路和线粒体通路分别以caspase8 和caspase9 基因的激活为特征。有研究证实,脑缺血各亚组caspase8和caspase9 mRNA 及其蛋白质的表达水平均明显升高,而且其分布及动态演变规律与缺血后神经元凋亡的变化基本一致[4]。

  本实验利用RTPCR法检测脑缺血后caspase9 mRNA的表达,发现模型组大鼠缺血侧脑组织caspase9 mRNA表达明显升高,PQS可抑制caspase9 mRNA的表达,与缺血后神经元凋亡的变化基本一致,提示线粒体通路参与了脑缺血后神经元凋亡的发生和发展。PQS能抑制细胞调亡而对脑缺血损伤产生保护作用,这可能是对脑缺血损伤保护作用的机制之一。

【参考文献】
   [1] Shafer TJ,Atchison WD.Transmitter,ion channel and receptor properties of pheochromocytoma(PC12)cells:a model for neurotoxicological studies[J].Neurotoxicology,1991,12(3):473492.

  [2] Yousuf S,Atif F,Ahmad M,et al.Selenium plays a modulatory role against cerebral ischemiainduced neuronal damage in rat hippocampus[J].Brain Res,2007,11(47):218225.

  [3] 高欣,康立源,高秀梅.脑缺血后神经细胞凋亡通路及中药干预[J].中国中医药信息杂志,2007,4(7):9698.

  [4] 张鸿,刘艳艳,贾春红,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注后caspase8 和caspase9 mRNA 及蛋白质表达[J].中国现代神经疾病杂志,2007,7(6):543547.

日期:2013年2月27日 - 来自[2010年第5卷第2期]栏目
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小胶质细胞表达OX40L维持保护性CD4+ T细胞应答的体外研究

【关键词】  小胶质细胞;CD4+T细胞

           已知T淋巴细胞介导的免疫反应在中枢神经系统(central nervous system,CNS)的多种疾病中发挥重要作用,加重疾病进程,包括自身免疫性炎症、 微生物感染和神经退行性疾病。而近年来越来越多的证据表明其对损伤后神经细胞存活和功能修复可发挥有益作用,例如神经发生和学习记忆功能。T淋巴细胞的存活时间和活化程度直接决定了其功能发挥,但是,由于紧密的血脑屏障的保护,CNS是一个相对独立的系统,所以T淋巴细胞进入CNS后,其功能主要受CNS内部的微环境影响。那么,T淋巴细胞的存活在CNS中依赖哪些细胞和分子维持呢?

  小胶质细胞是CNS内最主要的免疫细胞,在正常脑组织中处于静息状态,在一定因素刺激时迅速发生活化,发挥吞噬和抗原提呈功能。T淋巴细胞的活化和存活需要抗原提呈细胞表达免疫共刺激分子进行辅助。其中OX40配体(OX40 ligand,OX40L),一种肿瘤坏死因子家族成员,结合T淋巴细胞上的OX40后在维持T淋巴细胞存活和增殖、记忆性T淋巴细胞的产生方面发挥关键作用。因此,为更好地了解CNS内部保护性T淋巴细胞应答的维持机制,本研究体外用T淋巴细胞产生的前炎症细胞因子——γ干扰素(interferonγ,IFNγ)刺激小胶质细胞,观察OX40L的诱导性表达并探讨其对T淋巴细胞和小胶质细胞功能的影响。本研究中,首先分离培养C57/BL6小鼠的小胶质细胞和CD4+T淋巴细胞。小胶质细胞取自新生胞的过程。4.EOLA1和MT2A的相互作用和内皮细胞凋亡、分化及增殖的关系:很多文献表明MT2A参与调解细胞周期,与细胞凋亡、分化和增殖关系密切。EOLA1与MT2A存在相互作用,他们之间的相互作用是否参与了细胞凋亡、分化和增殖的调解。

  初步的研究结果显示EOLA1为胞内蛋白,在ECV304细胞中呈全细胞分布,有胞核聚集现象;哺乳细胞双杂交和免疫共沉淀实验证实MT2A与EOLA1在哺乳细胞内存在相互作用关系;EOLA1和MT2A在ECV304细胞中存在共定位现象,主要定位于细胞核和核膜周围;应用RNA干扰技术对EOLA1进行基因沉默,然后利用细胞计数和流式细胞仪技术观察EOLA1下调表达对ECV304细胞增殖的影响,结果发现EOLA1基因被抑制可以促进ECV304细胞的增殖。关于其机理目前尚无任何线索,我们推测EOLA1可能是通过MT2A对细胞的增殖发生影响。在将来的研究中我们将进一步了解清楚MT2A与EOLA1的相互作用关系,建立EOLA1上调和下调表达模型,通过这些模型观察LPS刺激对MT2A表达的影响及细胞增殖的改变。这些研究为全面认识EOLA1的功能奠定了基础。1~2 d的小鼠大脑皮层,用0.25%胰酶消化组织,巴氏吸管机械吹打后经200目不锈钢筛网过滤为单个细胞悬液。加入含10%胎牛血清的IMDM培养基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium),采用贴壁和振荡法纯化小胶质细胞。用小胶质细胞标志物CD11b和F4/80抗体辅以DAPI核染荧光显示细胞核,计数分离细胞的纯度;为诱导OX40L的表达,在培养液中加入重组小鼠 IFNγ(20 ng/ml),使用重组小鼠OX40和IgG Fc融合蛋白 (mOX40Fc,1 μg/ml)交联激活OX40L,以小鼠 IgG Fc (mIgFc)作为对照。CD4+ Th细胞用免疫磁珠阴性分选法从小鼠脾脏中纯化。其次,用实时定量RTPCR、Western blot和流式细胞术检测小胶质细胞上OX40L和IGFI的表达。再次,用[3H]TdR掺入法检测IFNγ活化后小胶质细胞对T淋巴细胞增殖的影响。最后用annexin V 和碘化丙啶双染法检测对T淋巴细胞凋亡的作用。研究结果显示:① IFNγ可诱导小胶质细胞表达OX40L.定量RTPCR结果表明OX40L的mRNA表达水平在IFNγ作用下明显升高,Western blot结果表明OX40L在小胶质细胞上无组成性表达,而IFNγ可使其表达OX40L蛋白。流式细胞仪分析也显示OX40L阳性的小胶质细胞在加入IFNγ后显著性增加。并且小胶质细胞上OX40L的RNA和蛋白表达水平与IFNγ的剂量呈正相关;②小胶质细胞表达OX40L促进CD4+ T淋巴细胞增殖。由于OX40只表达于活化后CD4+ T淋巴细胞,因此先用抗CD3单抗淋巴活化T细胞。将IFNγ刺激后表达OX40L的小胶质细胞与活化后表达OX40的CD4+ T淋巴细胞以1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的不同比例共培养,结果显示可以促进CD4+ T淋巴细胞,当比例为1∶4时效果最显著。 当用抗OX40L中和性抗体阻断OX40/OX40L信号通路时,CD4+ T淋巴细胞的增殖明显下降。为进一步证明小胶质细胞对 CD4+ T淋巴细胞的促增殖作用不是通过分泌性细胞因子产生,我们使用了跨膜共培养(transwell cocultures);③小胶质细胞表达OX40L抑制CD4+ T淋巴细胞凋亡。而用抗OX40L中和性抗体后CD4+ T淋巴细胞凋亡的比例又明显增加。与T淋巴细胞跨膜共培养的小胶质细胞则对其凋亡无抑制作用;④小胶质细胞表达OX40L促进其分泌胰岛素样生长因子I (insulinlike growth factor I,IGFI)。小胶质细胞分泌的IGFI对CNS具有保护作用,而交联OX40L后明显促进其IGFI在mRNA和蛋白水平的表达。李茂全,等.小胶质细胞表达OX40L维持保护性CD4+ T细胞应答的体外研究

  根据以上研究结果,可初步得出以下研究结论:① IFNγ活化的小胶质细胞显示的表型明显不同于静息状态,尤其是OX40L表达显著;② 小胶质细胞表达的OX40L对CD4+ T淋巴细胞的增殖有促进作用; ③ OX40L信号在小胶质细胞抑制CD4+ T淋巴细胞凋亡过程中发挥功能;④ OX40L信号是双向传导信号,可以促进小胶质细胞分泌IGFI从而有益于CNS损伤后修复。长久以来,CNS中的自身免疫反应被认为有破坏性作用,近年来大量研究表明T淋巴细胞在正常和病理条件下均对CNS的自稳和修复发挥有益的作用。但是,T淋巴细胞在CNS这样一个相对独立器官内的存活机制缺乏相关探讨。本研究初步证明CNS内固有的抗原提呈细胞——小胶质细胞在IFNγ活化后表达的OX40L能够帮助CD4+ T 淋巴细胞增殖,抑制其凋亡;但阻断OX40OX40L信号通路并未完全抑制小胶质细胞对T细胞的作用,提示小胶质细胞上很有可能还存在其它分子或机制共同精确地调控T细胞的增殖或凋亡。同时,OX40L信号被激活可反向传导使小胶质细胞分泌利于CNS修复的细胞因子。总之,本研究有助于了解CNS内部T淋巴细胞免疫的存在机制,为CNS内相关疾病的防治提供新思路。

日期:2013年2月27日 - 来自[2009年第4卷第3期]栏目
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