主题:软骨

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强迫拉伸引发“瑜伽病” 25岁到45岁女性韧带拉伤、软骨撕裂增多


  北京积水潭医院中医骨科主任李建民说,很多瑜伽练习者做动作时过于勉强自己,以至伤了下肢、背部、腰部、颈部等。韧带拉伤、软骨撕裂、跟腱撕裂,引起关节炎症、神经痛等都是常见的“瑜伽病”。“瑜伽病”患者大都年龄在25岁到45岁之间,以女性居多。
  
  李建民提醒,人的肢体有一个活动的范围,习练者应该充分考虑自己的柔韧、平衡和力量素质,一定要遵循量力而行的原则。

 

(来源:北京积水潭医院)

 

日期:2010年1月21日 - 来自[运动伤害]栏目
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骨关节炎研究进展

    骨关节炎(0sanhritis0A)是一种退行性骨关节疾病,是中老年人常见、多发的关节病,以关节软骨生化代谢异常,进行性变性和消失,关节边缘和软骨下骨质产生反应性变化,使得软骨组织产生变化,关节囊纤维增生,并最终导致关节疼痛和功能丧失为其病理特点。在祖国传统医学属于骨痹痹证范畴。

  1 0A的病因病机

  11 0A的病因  几十年来,医疗界对OA研究虽已取得了很大进步,但对其确切病因仍未明了。按照美国风湿病协会的分类,0A可分为原发性0A和继发性OA。前者确切原因不清,可能包括年龄、性别、职业、种族等因素;后者可继发于  各种关节损伤或疾病,如半月板损伤、关节内或关节周围骨  折、关节韧带损伤、股骨头坏死、先天畸形或脱位等。也有学者认为0A产生症状的原因是骨髓水肿、滑膜炎和关节  渗出。目前认为,0A是由于各种原因引起关节软骨纤维化、劈裂、溃疡、脱失而致的全关节疾病,包括软骨退变脱失、软骨下骨硬化或囊性变、关节缘骨赘形成、滑膜增生、关节囊  挛缩、韧带变性或挛缩、肌肉萎缩无力等。

  12 0A的病机  近年随着对OA研究不断深人,0A的最基本的病理改变是关节软骨的损伤退变。但针对0A的发病机理形成了如下一些不同的学说和观点。

  121慢性炎症学说该学说  认为,OA病人滑膜细胞和软骨细胞中的炎症刺激因子及炎症介质产物的水平增高,包括有降解作用的酶类。OA病人临床上常表现出炎症性特征,如关节红肿、僵硬及疼痛。此外,在OA的治疗中,非甾体类抗炎药的效果优于纯粹的镇痛药,这也是OA炎症本质的义一个证据。

122关节疼痛综合征学说  该学说认为,0A是滑膜关节在各种刺激下(包括衰老)所进行的修复过程。在0A中几乎所有的病人中都可见关节疼痛、结构异常和关节功能丧失等改变,但0A关节疼痛的原因很难确定。

123关节应力平衡失调学说  研究表明:当关节超负荷时,软骨变形,拱形纤维结构承受沿胶原纤维方向传导的压力分散到软骨下骨,卸载时,压力消失,纤维恢复到原状,在这一过程中,软骨细胞始终在纤维网格内受到保护。但当负荷传导紊乱时,软骨基质的拱形结构将遭到破坏,软骨细胞失去保护作用而受损。

124骨内静脉瘀滞及骨内高压学说  现代医学研究提示,以骨内静脉瘀滞为特征的骨血流动力学异常及由此所致的骨内高压,可能是导致骨性关节炎的发生、发展的重要因素之一。研究发现,骨性关节炎早期的病理改变是软骨细胞增殖、肥大、软骨厚度增加,稍晚才出现细胞变小及萎缩变薄,认为骨内压升高后动静脉压差缩小,营养血管的血流减小,营养障碍可引起骨小梁缺血坏死,骨细胞坏死可能是诱发骨性关节炎的原因之一。

125  细胞因子及生长因子的作用  细胞因子与生长因子广泛存在于各种组织中,它们从分子水平上对多种疾病发生、发展起着重要的调节作用。同样细胞因子在0A的发病过程中亦起着重要的作用,它可加速软骨基质的分解代谢,加速软骨退变。目前已阐明作用机制的细胞因子已达5O  多种,其中经实验或临床证实可能与与OA有关的近10种,现主要介绍如下几种:(1)白介素一1(IL1)IL1可促进滑膜细胞的软骨细胞合成并释放前列腺素E2(PGE2)和胶原酶产生强大的促炎症作用,从而引起滑膜炎症和骨的吸收,而且形成的PGE反过来又进一步加强IL1对软骨的分解作用,使滑膜细胞与浸润性炎性细胞反应性增强,从而造成关节软骨生存的恶劣微环境。(2)肿瘤坏死因子一a(TNFa)TNF—a可激活多型棱细胞,刺激滑膜细胞的PGE产生,增加骨、软骨的破坏。邓廉夫等通过对TNFa的研究指出,TNF—a以促滑膜成纤维细胞样细胞增殖作用为主,并因其增强滑膜细胞RNA的表达功能,而使滑膜组织纤维性变及滑液中细胞因子水平异常升高,从而改变关节的力学特征和软骨细胞的生活微环境,而成为参与OA关节软骨退变的途径之一。(3)白细胞介素6(IL6):又称B细胞分化因子,其作用与B细胞功能相关联,IL6可激活B细胞和T细胞,通过其自分泌形式作用于软骨细胞,促进软骨细胞的增殖。(4)胰岛素样生长因子(IGF)OA病理表现中关节软骨表面粗糙不平,软骨基质的原纤维性变、软骨细胞肿胀、崩解、增生,导致这种表现的基本原因之一就是异常增加的胰岛素样生长因子结合蛋白阻碍了IGF—l和受体之问的结合,而使OA软骨细胞对IGF1不敏感。并且OA骨赘形成与血清IGF1水平呈正相关。(5)一氧化氮(NO)与一氧化氮合酶(NOS)NO是一种细胞间信使分子,可介导许多生物学现象。NOS可导致重要炎性介质NO的产生,NO可引起软骨代谢的紊乱,同时可抑制软骨细胞增殖,促使软骨细胞消亡,抑制软骨细胞PG、胶原的合成,促进其分解。这些变化均可导致关节软骨修复能力下降,软骨破坏增加,加速软骨退变。(6)其他因素:蛋白酶、内皮素、自由基、性激素、内皮素(ET)、免疫反应、骨质疏松在OA的发病过程中也起着重要的作用。

  2 OA不同给药途径的治疗方法

  21  口服给药  目前口服给药是治疗骨关节炎最为常见的给药方法。

  211  中药口服  中医根据膝OA的病因、病理来进行辨证论治,大多数以补肝肾、强筋骨、祛风湿、活血化瘀为治疗原则。刘氏等采用补肝汤加减治疗本病属肝肾亏虚、气滞血瘀76例,显效32例,有效39例。沈氏等L161用补肾健骨汤(黄芪、牛膝、丹参、杜仲、柴胡等)治疗本病58例,显效25例,有效25例,总有效率为862%。高氏等通过观察纯补肾药(鹿角胶、熟地黄、枸杞子、肉苁蓉、骨碎补)对兔膝骨性关节炎软骨的影响,结果示补肾组兔膝关节软骨细胞破坏程度明显低于模型组,软骨胶原紊乱及转型明显减轻。董建勇等采用具有补肾活血治疗后软骨退变明显减轻。郭氏等运用壮筋活血汤(以熟地黄、山药、牛膝、山茱萸、土  鳖虫、红花等中药组成)对实验性家兔的膝骨性关节炎模型进行防治研究,结果显示壮筋活血汤口服给药后可促进软骨细胞合成基质,并可阻止软骨中胶原类型由正常的Ⅱ型向I型转变,同时也发现壮筋活血汤可促进软骨基质的合成代谢,而对基质分解代谢的抑制作用较弱。毛氏等运用风湿骨痛药酒药槌外治法防治关节软骨退变,风湿骨痛药酒中秦艽、威灵仙具有明显抗炎作用,对滑膜炎性改变有明显消除作用。实验中还发现该方法可降低软骨中纤溶酶原激活物(PA)的活性,提高了纤溶酶原激活物抑制因子(PAt)活性,消除导致关节病变的内在因素,从而达到保护关节软骨、抗关节软骨退变的目的。

212西药口服

2121非甾体抗炎镇痛药  (1)常规的非甾体抗炎镇痛药(NSAIDS)NSAIDS是指一类具有抗炎、止痛和解热作用的非类固醇药物,对于骨关节炎有确切的止痛效果,是治疗骨关节炎的常用药物。但NSAIDS并不能阻止OA最主要的病理进展,即受累关节软骨的进行性破坏;另外,对长期服用者的胃肠道、肝和肾脏的毒副作用电不容忽视。(2)新型NSAIDS:目前临床研制出一些毒副反应小或能阻止软骨退变的新药,以环氧化酶2的选择忡抑制剂为代表。

2122镇痛药物  (1)扑热息痛:无抗炎作用,足OA 止痛的首选药物,但毒剐作用不容乐观。亦有学者用可待因加扑热息痛治疗OA,其镇痛作用明显优于单用扑热息痛,但有13的患者因恶心、呕吐、头晕、便秘而停药。(2)阿片类药物:越来越多的资料表明,此类药适用于年龄偏大,OA程度严重,NSAIDS已无法控制疼痛或由于自身其他疾病已不能耐受NSAIDs,又不能耐受关节手术的患者。由于此类药物潜在的成瘾性,临床应用时一定要严格选择患者。(3)另外还有硫酸氨基葡萄糖、四环素类、激素类药物用于骨OA的治疗。

22关节腔给药  由于关节腔给药可使药物直达用药部位,减少了其他途径的药物代谢,使得局部的药物浓度保持较高的水平,起到持续的治疗作用。因而正迅速成为治疗骨关节炎的重要手段,而且其独到的治疗效果也日益受到重视。

221  中药关节腔给药  中药关节腔给药主要是着眼活血化瘀作用,改善微循环和血液流变学,使局部血流供应增多,促进组织修复与再生。同时中药还可发挥抗菌作用,以减缓局部的炎症反应。王氏等在试验研究中证实丹参给药后主要是起到抑制血小板聚集,增加红细胞变形能力,影响凝血因子,降低血浆粘度,促进纤维蛋白溶解,同时促进组织修复与再生,调节细胞因子,改善微循环和血液流变学,使局部血流供应增多,另外还有抗菌消炎止痛作用。

222西药关节腔给药  主要根据关节内理化特性及生物学特点变化,通过冲洗改变关节内环境,使之接近于正常,促进关节软骨修复,缓解症状,达到治疗目的。本法主要包括透明质酸、激素,羧甲基壳聚糖等。凌氏等研究证实,透明质酸关节腔给药可减缓兔骨关节炎软骨的退行性改变从而改善病理改变。由于透明质酸是类似于关节滑液,可减少关节软骨于滑膜之间的摩擦。郭氏等玻璃酸钠和地塞米松联合关节腔注射治疗膝骨关节炎,总有效率为861%,临床研究说明:玻璃酸钠和地塞米松关节腔注射是治疗骨关炎的有效方法。另外,刘氏等注射羧甲基壳聚糖在也可改善兔关节软骨的退行性改变。

23其他疗法

231  中医药其他途径治疗方法  主要包括熨烫法、熏洗法、外敷法、中药离子导入法、推拿手法、拔罐、针刺、艾灸、小针刀等。

232  西医外科治疗  早期外科治疗主要是针对引起OA的原因,中期主要是关节镜冲洗清理,晚期行关节置换。

3 

0A是一种复杂的慢性疾病,其病因、病理生理尚未完全阐明;相信随着医学研究的不断深入,一定会彻底的弄清楚0A的病因病机。随着对0A的治疗手段的多样化,尤其是关节腔注射疗法,将会为患者带来福音。

 

 

日期:2010年1月14日 - 来自[中医中药]栏目

地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞体外培养的影响

【摘要】    目的 探讨地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞的影响。方法 兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同浓度地塞米松磷酸钠的DMEM培养液,应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖情况及其合成Ⅱ型胶原能力,并应用透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果 实验各组软骨细胞进入S期、G2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0/G1期的细胞比率增加,免疫细胞化学阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性,电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。 结论 地塞米松磷酸钠可抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白合的合成能力有关。

【关键词】  软骨细胞;地塞米松;细胞培养

  Effects of dexamethasone sodium phosphate on rabbit articular chondrocytes cultured in vitro.

  TANG Chen-feng, LI Guo-xin, WEN Jian, et al.

  (Shenzhen Hospital of  Beijing University , Shenzhen 518036, Guangdong, P.R. China)
   
  Abstract:Objective  To investigate the effects of dexamethasone sodium phosphate on proliferation of rabbit articular chondrocytes cultured in vitro.  Methods  Rabbit articular chondrocytes cultured in vitro were divided randomly into four groups. Cells of the control group were cultured in DMEM media without dexamethasone sodium phosphate; cells of experimental groups were cultured in DMEM media with different concentration of dexamethasone sodium phosphate respectively. Flow cytometry and immunocytochemistry were used to observe the effect of dexamethasone sodium phosphate on proliferation of chondrocytes and synthesis of typeⅡcollagen . The changes of ultrastructure of cultured chondrocytes were observed under transmission electron microscope.  Results  The cellular proportions of S period and G2+M period of the experimental groups decreased and the cellular proportions of G0/G1 period increased. There were significant differences between the average gray scale values of the experimental groups and those of the control group. Under transmission electron microscope the amount of rough surfaced end oplasmic reticula and mitochondria of the experimental groups decreased.  Conclusion  Dexamethasone sodium phosphate can inhibit the prolifreation of articular chondrocyte. The enhanced proliferation of chondrocyte may be due to the decrease of cellular proportions of S period. Dexamethasone sodium phosphate can inhibit the synthesis of type Ⅱcollagen and protein of chondrocytes. The injection of dexamethasone sodium phosphate into articular cavity may result in impairemen of articular cartilage and may accelerate the retrogrde degeneration of articular cartilage.
   
  Key words:Chondrocyte; Dexamethasone; Cell culture 

    关节内注射糖皮质激素在治疗骨性关节炎及类风湿关节炎的临床实践中应用较广,使用后能迅速缓解炎症减轻症状。但也有文献报道,关节腔内多次注射糖皮质激素可造成关节退行性改变[1,2]。目前,关节内注射糖皮质激素仍存争议,糖皮质激素对关节软骨的作用机制尚不十分清楚。本实验采用兔关节软骨细胞体外培养的方法,观察地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞增殖及代谢的影响,探讨糖皮质激素对关节软骨作用的机理。

  1  材料与方法

  1.1  实验材料 

  新西兰白兔,DMEM培养基、胰蛋白酶(GIBCO公司),Ⅱ型胶原酶、地塞米松磷酸钠(SIGMA公司),Ⅱ型胶原单抗(NEOMARKERS公司),SABC试剂盒(BOSTER公司)。

  1.2  实验方法

  1.2.1  软骨细胞的分离与培养 

  取1月龄新西兰白兔处死后,切取关节软骨,D-Hanks缓冲液冲洗2次。把软骨切割成1mm3大小的碎块,加入浓度为0.25%的胰蛋白酶5ml,37℃恒温振荡箱中消化30min后,以DMEM培养液终止消化。再加入浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶5ml,不断剪切、搅拌。镜下观察大部分细胞游离时,加入DMEM培养液5ml离心,用DMEM培养液洗两遍。按每瓶约1×106个软骨细胞接种于25cm2塑料培养瓶中,于37℃、饱和湿度、5% CO2细胞孵箱内培养。每天以倒置显微镜观察软骨细胞的形态及生长状况,细胞长满后用0.25%胰蛋白酶传代。

  1.2.2  免疫细胞化学检测软骨细胞Ⅱ型胶原合成能力 

  将传代后的软骨细胞分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0、0.02、0.1和0.5mg/ml的DMEM培养液,继续培养72h后终止培养。按10μl/片将细胞悬液滴加至预先用Poly-L-Lysine处理好的载玻片上,将涂片晾干后用4%多聚甲醛固定,贮存于-20℃冰箱中以备免疫组化检测用。用PBS代替一抗作空白对照,结果阴性;以正常软骨细胞作为阳性对照,结果阳性。在油镜(10×100)下观察免疫细胞化学阳性信号在细胞中的定位,对信号强弱作初步观察。用计算机图象分析系统(MPIAS-500)对阳性细胞的平均灰度进行定量分析,用平均灰度值表示Ⅱ型胶原的表达量,实验资料用x±s表示。

  1.2.3  流式细胞术检测软骨细胞增殖 

  原代细胞接种于25cm2塑料培养瓶中,镜下观察细胞贴壁后,随机分为对照组和实验组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),对照组换液后只加入DMEM培养液,实验组分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0.02、0.1和0.5mg/ml/ml的DMEM培养液,每组8瓶,继续培养72h。用胰蛋白酶消化后收集细胞,离心10min(1 000rpm),弃去上清液。用4℃预冷的0.01mol/l PBS 液0.5ml制成单细胞悬液,再缓慢加入4℃预冷的无水乙醇1.5ml,静置30min(4℃),要求细胞浓度为106/ml。取细胞悬液与等体积的光辉霉素(MI)染液混合,室温染20min,即可上机检测。

  1.2.4 透射电镜观察软骨细胞超微结构 

  传代后的软骨细胞在其指数增长期时分别加入地塞米松磷酸钠浓度为0、0.02、0.1和0.5mg/ml的DMEM培养液,继续培养72h后终止培养。将培养瓶内细胞用0.25%胰蛋白酶消化,加入0.01mol/l PBS,离心10min(2 500rpm),弃上清。缓慢加入4℃预冷的2.5%戊二醛4ml,固定30min(4℃),1%四氧化锇后固定25h(4℃),于饱和双氧醋酸铀过夜(4℃),梯度乙醇脱水后用环氧树脂浸透、包埋、聚合,常规制作超薄切片及染色后,在透射电子显微镜下进行观察。

  1.3 统计学处理 

  免疫细胞化学检测资料行单因素方差分析(ANOVA),流式细胞术检测资料行χ2方检验。以α=0.05为检验水准。

  2 结果

  2.1  原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察 

  接种软骨细胞最初为圆球状,呈悬浮状态,有折光性。接种24~48h,细胞开始贴壁,细胞形态转为透明圆盘状,大部分细胞贴壁后,形态由圆盘状逐渐向外伸出突起,转变成多角形,少数呈梭形。随细胞分裂增殖,细胞密度增加,细胞形态趋于一致,逐渐融合形成单层,呈“铺路石”样外观,细胞内出现大量分泌颗粒。由于先用胰蛋白酶消化30min,去除了软骨表面的滑膜等结构,可以避免成纤维细胞等细胞成分的污染,因而获得的软骨细胞纯度很高。传代后,关节软骨细胞24h内贴壁,形态与原代细胞相似,生长迅速,7~10d即可形成单层。处理组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢。

  2.2 免疫细胞化学检测结果 

  免疫细胞化学阳性信号为棕褐色颗粒,Ⅱ型胶原阳性信号定位于细胞胞浆。其阳性信号的平均灰度值如表1所示,各实验组阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性(P<0.05)。

  2.3 流式细胞术检测结果 

  经含地塞米松磷酸钠的培养液作用的软骨细胞,各期细胞比率如表2所示,进入S期、G2+M期的细胞比率均较对照组减少(P<0.05),G0/G1期细胞比率增加(P<0.05)。

  2.4 透射电镜观察结果 

  透射电镜下见对照组软骨细胞细胞核清晰,胞浆丰富、核周围有大量的线粒体、粗面内质网及高尔基体发达。实验组软骨细胞较对照组胞浆粗面内质网减少、脱颗粒,胞浆中分泌泡数量减少,线粒体数量减少、排列紊乱、出现断裂,并出现少量溶酶体。表1  各组关节软骨细胞Ⅱ型胶原平均灰度值的比较(略)注:*与对照组比较,P<0.05;△与实验组Ⅰ比较,P<0.05;▲与实验组Ⅱ比较,P<0.05。表2  各组关节软骨细胞增殖周期分析(略)注:*与对照组比较,P<0.05;△与实验组Ⅰ比较,P<0.05;▲与实验组Ⅱ比较,P<0.05。

  3  讨论

  3.1  地塞米松磷酸钠与软骨细胞增殖的关系及其机制 

  流式细胞术是对单个细胞或其它生物微粒进行快速定量分析与分选的一门技术,细胞周期DNA分析是其基本分析内容之一,而实施的技术是通过测定细胞增殖周期各时相的DNA含量来达到的。细胞周期分为间期和分裂期两个阶段,在间期中,细胞又分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)和G2期(DNA合成后期),这一过程主要完成DNA的合成。细胞群中多数细胞处于间期,少数细胞处于分裂期。DNA的合成反映细胞在体外培养过程中的生长复制能力,DNA含量的减少反映了细胞分裂后数量的减少,因为对同一个体来说细胞染色体和DNA含量除在分裂前期外是恒定的。本实验运用流式细胞仪对关节软骨细胞进行细胞周期DNA分析,发现实验组的软骨细胞S期、G2期细胞比率减少,G1期细胞比率相应增加,提示实验组软骨细胞的增殖活动减少是由于S期细胞比率减少、DNA合成受到抑制所致。

  3.2  地塞米松磷酸钠与软骨基质合成的关系  

  软骨基质是由软骨细胞分泌的,对软骨细胞具有保护作用,同时为其提供营养和底物,并能完成转导和传递信号。Ⅱ型胶原是软骨基质中抗张力的主要成分,正常软骨中张力强度主要取决于胶原纤维含量的多少和纤维排列的顺序。胶原还具有维持蛋白多糖含量的作用,胶原合成的增加有利于形成新的基质。在关节软骨缺损时,因自身免疫反应,关节软骨中的胶原纤维受到破坏。胶原结构的破坏使位于其间的蛋白多糖暴露,易于裂解并引起免疫反应。蛋白多糖的丢失又加速了胶原网的破坏,这样互为因果使基质的破坏向深层推进。Miyazaki Y等[3]通过体外细胞培养鼠关节软骨的方法,发现地塞米松抑制软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原的合成。Nakamura-M等[4]给鼠肌注地塞米松,发现在软骨表层细胞中,处理组的Ⅰ型胶原免疫印迹强度升高,而Ⅱ型胶原免疫印迹强度降低。说明地塞米松使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多。提示胶原成分由Ⅱ型胶原占优势转变为Ⅰ型胶原占优势是糖皮质激素注射后关节软骨退变、破坏的原因之一。
   
  本实验采用免疫细胞化学的方法检测软骨细胞经地塞米松磷酸钠作用后Ⅱ型胶原合成能力的变化,结果显示各实验组阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性,说明各实验组细胞Ⅱ型胶原的表达均比对照组弱,提示地塞米松磷酸钠抑制关节软骨细胞的胶原合成能力。透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构显示实验组软骨细胞较对照组软骨细胞胞浆粗面内质网数量减少、脱颗粒,线粒体数量减少、排列紊乱、出现断裂现象。线粒体是细胞合成能量的场所,粗面内质网是细胞合成蛋白质的场所,软骨细胞中的粗面内质网数量是软骨细胞蛋白(包括蛋白多糖和胶原)合成的指示剂。本实验结果提示糖皮质激素可引起关节软骨细胞的活性及蛋白合成能力的下降。
   
  软骨细胞无特异性的标志物,Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测结合取材部位,可鉴定为软骨细胞。因除软骨细胞、视网膜神经细胞,其它组织无合成Ⅱ型胶原的能力[5]。

  3.3 地塞米松磷酸钠的临床应用 

  糖皮质激素应用短期内可通过抑制免疫反应减轻临床症状,但长期来讲可改变软骨细胞的表型,抑制软骨细胞的增殖功能及胶原的合成能力,诱发或加重关节软骨的损害。在关节炎及关节损伤的情况下,软骨基质遭到破坏,此时需要软骨细胞大量增殖、合成更多的软骨基质来进行修复。若此时软骨细胞表型发生改变,细胞的增殖和基质合成能力遭到抑制,就无法满足修复的需要,关节软骨的损害就会进一步加重。临床上关节腔内注射地塞米松磷酸钠常用量虽在短期内可减轻临床症状,但长期应用会造成关节软骨的损害,加速关节软骨退行性改变。建议临床上尽量避免长期使用地塞米松磷酸钠行关节腔内注射。

【参考文献】
    [1]Papacrhistou G, Anagnostou S, Katsorhis T. The effect of intraarticular hydrocortisone injection on the articular cartilage of rabbits[J]. Acta Orthop Scand Suppl, 1997, 275: 132~134.

  [2]刘昆鹏, 陈百成. 节内注射糖皮质激素对关节软骨影响的实验研究[J]. 中国矫形外科杂志, 2001,8(7):674~677.

  [3]Miyazaki Y, Tsukazaki T, Hirota Y, et al. Dexamethasone inhibition of TGF beta-induced cell growth and type II collagen mRNA expression through ERK-integrated AP-1 activity in cultured rat articular chondrocytes[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2000, 8(5):378~385.

  [4]Nakamura-M, Watanabe-J, Ogawa-R, et al. Immunohistochemical localization of type II and type I collagens in articular cartilage of the femoral head of dexamethasone-treated rats[J]. Histochem-J, 1997, 29(9): 645~654.

  [5]顾天爵. 生物化学[M].第3版. 北京: 人民卫生出版社, 1989,20~23.


作者单位:北京大学深圳医院骨科,广东 深圳 518036.

日期:2010年1月13日 - 来自[2008年第8卷第2期]栏目
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软骨发育不全症最早的报告

【关键词】  软骨 发育

  原著标题:Abbildungen und Beschreibungen einiger MiBgeburten.

  原著作者:Soemmering Samuel Thomas(1755-1830)

  刊载杂志:Mainz.Universitt sbuchhandlung,Seite 30,1791.

  原著摘译:报告1例四肢显著短小的女婴,附有测量值和图绘(略)。其特点是四肢短,相比之下头部很大,鼻根部凹陷,肱骨、肘、桡骨呈块状并有异常弯曲,大体上貌似佝偻病儿童。据此,笔者认为该畸形由骨骼疾病所致。(众多学者认为,该病例是软骨发育不全症最早的报告)。

  作者简介:单鹏程(1983-),男,在读博士,主要研究方向:关节外科,(电话)13581556637,(电子信箱)shanpc@sina.com


作者单位:山东省千佛山医院骨科

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第23期]栏目

体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞

【摘要】  [目的]探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外诱导形成软骨细胞的方法,以及转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,bFGF)之间的相互作用。[方法]对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养,按加入诱导条件不同分为四组:A组:TGF-β1+ bFGF;B组:TGF-β1+ IGF-Ⅰ;C组:TGF-β1;D组:空白对照组。3周后分别做四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色试验、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)检测和免疫组织化学染色。[结果]A、B、C三组Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性;MTT吸光度值和GAG含量检测结果均为:A组>C组>D组, B组>C组>D组,统计学有显著差异。[结论]兔BMSCs在一定条件下可以诱导成软骨细胞,TGF-β1和IGF-Ⅰ、bFGF在BMSCs向软骨细胞分化和增殖时起协同作用。

【关键词】  骨髓间充质干细胞  软骨细胞 转化生长因子-β1  胰岛素样生长因子-Ⅰ 碱性成纤维细胞生长因子

  Inducing bone mesenchymal stem cells of rabbits into chondrocytes using the technology of micromass culture in vitro
  
  LI Bin, ZHANG Wei, WANG Jian,et al.

  Department of Joint Surgery,Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China
   
  Abstract: [Objective]To study the methods of inducing bone mesenchymal stem cells(BMSCs)of rabbits into chondrocytes in vitro and the interaction of transforming growth factor β1(TGF-β1), insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ) and basic fibroblast growth factor (bFGF). [Methods]BMSCs of rabbits were primarily cultured and subcultured in vitro, and then divided into four groups according to the difference of factors: group A receiving TGF-β1 and bFGF; group B receiving TGF-β1 and IGF-Ⅰ; group C receiving TGF-β1; group D receiving no cell growth factor. After three weeks all the four groups were detected by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay,measurement of glycosaminoglycan (GAG) and immunohistochemistry.  [Results]Immunohistochemical detection of collagen Ⅱ was positive in groups A, B and C.The results of the MTT assay and the GAG content in groups A and B were obviously higher than those in groups C and D.[Conclusion]Rabbit BMSCs can be induced into chondrocytes under certain conditions.TGF-β1, IGF-Ⅰ and bFGF have synergy effect in the differentiation from BMSCs into chondrocytes.

     Key  words:bone mesenchymal stem cells;  chondrocytes;  transforming growth factor-β1;  insulin-like growth factor-Ⅰ;  basic fibroblast growth factor
   
  由于软骨内没有血管,成熟软骨细胞有丝分裂能力低下等原因,软骨的自我修复能力非常有限,所以由创伤和退变等所引起的关节软骨损伤成了临床上无法解决的难题。在传统的关节软骨钻孔、自体软骨膜、骨膜移植和自体的骨软骨移植都没有取得良好效果的情况下,组织工程为关节软骨损伤的修复带来了一线曙光。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)取材简单,体外增殖能力强,并且具有多向分化潜能,成为了软骨组织工程理想的种子细胞。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的条件以及转化生长因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,bFGF)之间的相互作用。

     1  材料与方法

  1.1  实验材料

  1.1.1  实验动物为健康新西兰大白兔,雌雄不限,2~3个月龄,体重2.0~3.0 kg,由山东省农科院提供。

  1.1.2  实验试剂 

  TGF-β1、IGF-Ⅰ和bFGF均购自Peprotech公司;密度为1.131 g/ml的Percoll分离原液购自Sigma公司;Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;胰蛋白酶购自华美生物制品公司;Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

  1.1.3  实验器材
 
  培养板和培养瓶:Hyclone公司;CO2恒温培养箱:美国Nuaire公司;倒置显微镜:日本Olympus公司;超净工作台:苏州净化设备公司;离心机:北京医用离心机厂;分光光度计:Duseries600,USA;酶联标记检测仪:Multiskan MS,芬兰。

  1.2  实验方法

  1.2.1  兔BMSCs的体外分离和培养 

  取2~3个月龄健康新西兰大白兔麻醉毕,无菌条件下穿刺髂骨成功后接上10 ml空针,内含3 000 U/ml的肝素0.4 ml,抽取骨髓6~8 ml。将肝素骨髓与等体积的D-hanks液混合,洗涤去除脂肪。经1.073 g/ml的Percoll分离液密度梯度离心后(2 500 r/min,20 min),吸取单个核细胞层,D-hanks洗涤后收集细胞,接种到含有完全培养基4 ml(低糖DMEM、10%胎牛血清、青霉素钠100 U/ml、链霉素100 μg/ml)的培养瓶中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养。3 d后半量换液,以后每3 d全量换液一次。培养的原代细胞12~14 d铺满瓶底,用0.25%的胰酶消化,1 000 r/min离心6 min,收集细胞,按1∶3的比例传代,命名为P1。P1传代细胞培养到铺满瓶底时消化、收集细胞再进行传代培养,命名为P2。

  1.2.2  兔BMSCs的高密度微团诱导培养和分组 

  P2传代细胞长满瓶底时,消化、收集细胞,用高糖DMEM悬浮,调整细胞浓度为1×106/ml。在每个60 mm培养皿中各分布6滴细胞悬液,每滴100 μl,在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中静置2 h后再缓慢加入诱导液。按加入诱导液的不同分为四组:A组:TGF-β110 ng/ml+bFGF10 ng/ml;B组:TGF-β110 ng/ml+IGF-Ⅰ10 ng/ml;C组:TGF-β110 ng/ml ;D组:空白对照组。四组均加入地塞米松10-7 mmol/ml,VitC 50 μg/ml,含10%胎牛血清的高糖DMEM。每3 d换液1次,共培养14 d。

  1.2.3  四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色试验检测细胞增殖率 

  将四组加入不同诱导液的BMSCs培养14 d,胰酶消化,收集细胞并调整细胞浓度为1×104 /ml,接种于96孔板,每组5孔,每孔200 μl,再加入各组不同的诱导液200 μl。3 d换液1次, 7 d后每孔加入200 μl MTT,培养4 h,弃上清液,每孔加入150 μl二甲基亚枫,震荡10 min,用酶联标记检测仪490 nm波长测定吸光度值。

  1.2.4  糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量检测 

  将四组加入不同诱导液的BMSCs培养14 d,胰酶消化,收集细胞并调整细胞浓度为1×104 /ml,接种于96孔板,每组5孔,每孔200 μl,再加入各组不同的的诱导液200 μl。3 d换液1次,7 d后取上清液,以硫酸软骨素为标准品,紫外分光光度计制作标准曲线,阿利新蓝法检测上清液中GAG含量。

  1.2.5  Ⅱ型胶原免疫组织化学检测 

  将四组加入不同诱导液的BMSCs诱导14 d后,胰酶消化,收集细胞并调整细胞浓度为1×105/ml,接种于24孔板(每孔底部已加入预处理过的细胞爬片)中,每组5孔,每孔400 μl,继续培养7 d,弃上清液,取出载玻片做免疫组化:甲醛室温固定20~30 min,PBS(pH 7.2~7.6)洗涤一遍;0.1%TritonX-100破膜40 min,PBS(pH 7.2~7.6)冲洗一遍;3%H2O2室温浸泡10 min,PBS(pH 7.2~7.6)冲洗5 min×3次;加入封闭用正常山羊血清工作液浸泡细胞10 min,加一抗前吸除;添加稀释的一抗(兔抗人Ⅱ型胶原抗体IgG),4℃过夜,37℃30 min复苏,PBS(pH 7.2~7.6)冲洗5 min×3次;滴加二抗(生物化山羊抗兔IgG), 37℃固定10 min,PBS(pH 7.2~7.6)冲洗5 min×3次;滴加试剂S-A/HRP,37℃ 10 min,PBS (pH 7.2~7.6)洗5 min×3次;DAB显色;苏木素轻度复染,自来水冲洗干净;酒精分化,返蓝,脱水,晾干封片。结果观察: BMSCs定向分化为软骨细胞的阳性表现为细胞浆内棕黄色细密颗粒,光镜下BMSCs细胞的胞浆染成黄色或棕黄色为阳性信号,在20×10视野下,每张爬片随机取6个视野计算阳性细胞数,并以x-±s表示。

  1.2.6  统计学方法

  采用SPSS 13.0统计软件包,单因素方差分析,数值以x-±s表示,以P﹤0.05表示差异有显著性意义。
   
  2  结果

  2.1  细胞形态学变化 

  原代细胞培养24 h就可见少量细胞贴壁,呈短梭形散在分布。3 d后贴壁细胞明显增多,多为短梭形或成纤维细胞样,偶有多角形和扁平状的,有小的集落形成(图1)。到第7 d时,集落明显增大,变多,细胞呈长梭形,随后细胞生长迅速形成明显的克隆,克隆逐渐向四周扩展,集落间相互融合,12~14 d铺满瓶底(图2)。传代后的细胞不再以集落方式生长,而是均匀分布,呈长梭形,但增殖加快,6~7 d就铺满瓶底。高密度的微团培养在倒置相差显微镜下可见BMSC在培养皿底部局部密集 ,细胞排列成多层,使单个细胞的轮廓不清楚(图3),A、B、C组细胞团的边缘细胞增殖迅速,5~7 d后可见到细胞逐渐变为多角形或多边形,体积增大,胞浆内颗粒增多,细胞核间隙增大,以A组和B组明显(图4、5),诱导14 d,细胞形态明显改变,成不规则形,胞质内颗粒丰富,D组仅表现为细胞团边缘的细胞增殖,始终呈稠密的长梭形。

  2.2  MTT检测细胞增殖率诱导培养后第21 d各组吸光度值(表1)。表1  细胞椅子对BMSCs细胞增殖率的影响组别标本数吸光度值A组(略)

  单因素方差分析:F=91.117,P<0.01。进一步四组行两两比较:A组与B组,P=0.845>0.05;A组与C组,P<0.01;A组与D组,P<0.01;B组与C组,P<0.01;B组与D组,P<0.01;C组与D组,P<0.01。

  2.3  GAG含量检测诱导培养后第21 d四组培养上清液中GAG的含量(表2)。表2  细胞因子对BMSCs分泌糖胺聚糖(GAG)的影响(略)
   
  单因素方差分析:F=108.68,P<0.01。进一步四组行两两比较:A组与B组,P=0.934>0.05;A组与C组,P<0.01;A组与D组,P<0.01;B组与C组,P<0.01;B组与D组,P<0.01;C组与D组,P<0.01。

  2.4  Ⅱ型胶原免疫组织化学检测诱导培养后第21 d,A、B、C组多数细胞阳性染色,以A组和B组最多(图6、7),D组极个别细胞阳性信号。在20×10视野下,每个视野平均阳性细胞数(表3)。

     3  讨论

     种子细胞是组织工程研究的关键因素之一,是工程化组织形成的物质基础。干细胞是各种组织细胞的最初来源,它具有高度自我复制、高度增殖、多向分化等特征,按来源不同可分为胚胎干细胞和成体干细胞,本实验所用的BMSCs即为成体干细胞的一种。BMSCs目前已经成为软骨组织工程最理想的种子细胞[1、2],它具有以下优点:(1)穿刺髂骨、股骨、胫骨均可得到,取材方便,来源充足,对机体损伤小;(2)采用密度梯度离心结合贴壁筛选和传代的方法即可纯化,易于分离培养;(3)体外增殖力强,可以大量扩增;(4)具有多向分化能力[3],在一定条件下可以转化为软骨细胞;(5)由自体BMSCs诱导成的软骨细胞移植时属于自体移植,不发生免疫排斥反应等。
   
  BMSCs向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导[4]、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等。作者认为软骨细胞的诱导成功必须满足两个条件:(1)较高的细胞密度;(2)三维的立体环境。本实验采用了体外高密度微团培养法,它模拟人体内软骨发育时的状态,提供了三维立体环境,细胞聚集成团,形成内部相对缺氧的环境,有利于高密度的细胞粘附、增殖,有利于细胞之间的信号传递,也可使细胞分泌的细胞外基质固守在细胞的附近,充分发挥细胞外基质对细胞增殖、分化及代谢的调节作用,为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境。1×106ml的细胞密度也满足了BMSCs向软骨细胞转化的最低细胞密度要求。
   
  细胞因子也是组织工程中的重要因素,它通过细胞间信号传递来影响细胞的活动,具有促进或抑制细胞分裂、增殖、迁移和基因表达等作用。目前常用于诱导BMSCs向软骨细胞转化的细胞因子有TGF-β、IGF、FGF和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic factor,BMP)等,本实验选用了TGF-β1、IGF-Ⅰ和bFGF。TGF-β是一族具有多种功能的蛋白多肽,具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成和分泌的作用[5]。它在软骨细胞发育的不同阶段起的作用也不相同,在软骨细胞未分化或分化早期,它能促进其DNA合成、增殖、分化和外基质的合成;对于成熟的软骨细胞,它能抑制其增殖和分化,抑制外基质的分解代谢,不改变细胞的表型。TGF-β在哺乳动物组织有三种存在形式:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,Barry等[6]认为 TGF-β2和TGF-β3的诱导成软骨细胞作用均强于TGF-β1。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ两个成员,它们结构相似但功能有很大的不同。IGF-Ⅰ可以促进软骨细胞DNA合成,加快细胞增殖和成熟,并合成软骨基质蛋白多糖;而IGF-Ⅱ只是能够促进间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的葡萄糖代谢。 FGF家族有酸性成纤维细胞生长因子、bFGF、FGF3、FGF4等多个成员。bFGF主要是通过旁分泌机制发挥作用,是目前发现的最强的促细胞生长因子,可以促进MSCs增殖,促进软骨细胞前质的分化以及软骨细胞的增殖和成熟。

     BMSCs体外诱导形成软骨细胞是一个非常复杂的过程,细胞因子在这个过程中起了非常重要的作用。本实验对各种细胞因子诱导BMSCs形成软骨细胞的作用和细胞因子之间的相互作用进行了探索。通过比较四组的实验结果,发现除了D组,其余三组形态学上都可见到类软骨细胞形成,GAG含量检测和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测可以证实其为软骨细胞,尤其是Ⅱ型胶原免疫组织化学检测,因为Ⅱ型胶原是软骨细胞合成的特异的主要的胶原成分。这就说明A、B、C三组的诱导方法都可以使BMSCs诱导成为软骨细胞,而这三组有一个共同点就是都含有TGF-β1,恰恰缺乏TGF-β1的D组没有明显的软骨细胞形成,这足以证明TGF-β1在诱导BMSCs成为软骨细胞的重要性。值得一提的是诱导液中加入地塞米松和VitC的必要性,地塞米松可以结合MSCs上的糖皮质激素受体并激活之,从而促进MSCs向软骨细胞分化,抑制其向脂肪细胞分化;VitC其本身并不能使MSCs发生转化,但它可以使细胞分泌的外基质有机的组成与排列,有利于细胞发挥自分泌与旁分泌作用,保证内外源因子的传输,具有非特异的促进细胞增殖与转化的作用。

     本实验还得出这样一个结果,使用TGF-β1+ bFGF组合和TGF-β1+ IGF-Ⅰ组合的组别的细胞增殖率、GAG含量和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性表达均明显高于单独使用TGF-β1组和空白对照组,并且从形态学上来说,分别加用bFGF和IGF-Ⅰ组别的软骨细胞的增殖和分化均较其他两组明显,说明TGF-β1和 bFGF、TGF-β1和IGF-Ⅰ在诱导BMSCs形成软骨细胞的过程中具有协同作用。这与Fukumoto等[7]的结论相符合。

     软骨组织工程治疗关节软骨损伤具有广阔的前景。本实验通过探讨BMSCs体外诱导形成软骨细胞的方法以及各种细胞因子之间的相互作用为将来组织工程的临床应用提供实验依据。当然,本实验只是软骨组织工程的一小部分,得到的软骨细胞如何进行体内组织构建还需要进一步研究。

【参考文献】
    [1]Bernardo ME, Emons JA, Karperien M,et al.Human mesenchymal stem cells derived from bone marrow display a better chondrogenic differentiation compared with other sources [J]. Connect Tissue Res,2007,3:132-140.

  [2]Yoshimura H, Muneta T, Nimura A,et al.Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle [J]. Cell Tissue Res,2007,3:449-462.

  [3]Kassem M, Kristiansen M, Abdallah BM. Mesenchymal stem cells:cell biology and potential use in therapy [J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2004,5:209-214.

  [4]吕昌伟,胡蕴玉,崔玉明,等.应力环境下三维诱导组织工程种植细胞修复关节软骨缺损[J].中国矫形外科杂志,2004,1:74-76.

  [5]Li WJ ,Tuli RC,Okafor CK,et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells [J] .Biomaterials,2005,6:599-609.

  [6]Barry F,Boynton RE,Liu B,et al.Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow:differentiation dependent gene expression of matrix components [J]. Exp Cell Res,2001,2:189-200.

  [7]Fukumoto T,Sperling JW,Sanyal A,et al.Combined effects of insulin-like growth factor-Ⅰ and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro[J].Osteoarthritis Cartilage ,2003,1:55-64.


作者单位:1、山东大学附属省立医院关节外科,济南 250021;2、山东省医药卫生科研计划项目(2005-97)

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第23期]栏目
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氧环境影响关节软骨细胞表型的相关研究

【摘要】  [目的]观察检测低氧和常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因及蛋白表达的改变。[方法]采用3~5日龄C57BL/6小鼠,取四肢关节软骨,经机械分离和酶消化法获得关节软骨细胞,将原代细胞P0和传代后细胞P1、P2分别在普通和低氧培养箱中培养2 d,用RT-PCR检测II型胶原、可聚蛋白聚糖和sox9特异性基因及Ihh、PTHrP、bmp4、wnt5a分化相关基因的表达差异,原代软骨细胞用免疫组化和阿利新蓝染色检测II型胶原、可聚蛋白聚糖的蛋白表达。[结果]低氧条件下,免疫组化显示II型胶原和可聚蛋白聚糖的表达较普通培养增强,II型胶原、wnt5a的基因表达增强,Ihh的表达降低;传代后软骨细胞的蛋白、特异性基因和分化相关基因表达未见明显差异。[结论]低氧条件下,原代软骨细胞的II型胶原表达增强,且可能主要是受Ihh、wnt5a等分化相关基因的调控。短期单层培养方式不能明显改善、 恢复特异性基因表达降低的传代后软骨细胞表型。

【关键词】  软骨细胞 低氧 Ⅱ型胶原 蛋白聚糖

   Effect of oxygen tension on  chondrocytic phenotype in vitro
  
  LIANG Jing, DENG Lian-Fu, ZHU Ya-Ping,et al.

  Shanghai Institute of Traumatology and Orthopaedics, Orthopaedic Department of Ruijin Hospital, Shanghai 200025, China
   
  Abstract: [Objective]To examine the specific gene and protein expression of primary and passaged chondrocytes in normal oxygen tension and hypoxia. [Methods]Articular chondrocytes were isolated from limb joint cartilage of C57BL/6 mice (3~5 days). Primary chondrocytes (P0) and passaled chondrocytes (P1, P2) were cultured in normal oxygen tension and hypoxia respectively for two days.The mRNA levels of collagen II, aggrecan, sox9, Indian hedgehog (ihh), parathyroid hormone-related protein (PTHrP), bone morphogenetic protein (BMP)-4 and wnt5a were examined with RT-PCR, and protein levels of collagen II,aggrecan were examined with immunohistochemistry and toluidine blue staining.[Results]During the culture of primary chondrocyte, the expression of collagen II and aggrecan increased under hypoxia, mRNA levels of collagen II, wnt5a  increased and ihh decreased at the same time.The mRNA levels of special genes and differentiation related genes of passaged chondrocytes were not altered under hypoxia.[Conclusion]Protein and mRNA level of Collagen II of primary chondrocyte under hypoxia increased. It may be regulated by chondrocyte differentiation gene ihh,and  wnt5a. The chondrocyte phenotype could not be resumed under hypoxia through short-term monolayer culture in vitro.

     Key  words:chondrocyte;  hypoxia;  collagen type II;  aggrecan
   
  正常生理情况下,关节软骨无直接的血液供应,主要通过关节滑液和软骨下骨组织来间接提供,与其它由动脉血供应的组织相比,关节滑液的氧分压仅约7%,关节软骨表层的氧分压为7%,深层则低于1%,故体内软骨细胞是始终处于低氧环境中的。关节损伤、退变等病理情况时,损伤、炎症等引起关节滑液中氧分压明显降低,导致软骨内氧分压相应下降,影响细胞外基质新陈代谢,将会直接或间接影响关节软骨细胞的正常代谢和功能发挥[1]。软骨细胞在体外单层培养时随传代次数增多细胞易发生去分化,细胞呈成纤维细胞样变,II型胶原及可聚蛋白聚糖表达减少,I型胶原表达增加[2]。为进一步了解低氧对体外培养的软骨细胞表型变化的影响,本实验拟观测低氧与常氧条件下原代和传代后软骨细胞各特异性基因、分化相关基因及蛋白量的改变。

     1  材料和方法

  1.1  关节软骨细胞的分离和培养

     3~5 d龄C57BL/6小鼠20只,断颈法处死,75%酒精浸泡3 min。在超净台上用眼科剪离断四肢,解剖显微镜下清理髋、膝、肩、肘关节周围皮肤、肌肉和软组织,分离出软骨块,放入盛有DMEM(Gibco,USA)培养基的培养皿中。D-Hanks液冲洗2次,将软骨块剪碎,置入锥形瓶中用5倍体积的0.25%胰蛋白酶(Sigma),37℃预消化半小时,过滤后将软骨块重新置入锥形瓶用0.2%的胶原酶(Sigma)继续消化,待大部分软骨块消失,终止消化。过滤获得细胞悬液,1 200 r/min离心8 min,去上清,无血清培养基洗涤2次,所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清(JRH,USA)的DMEM中,按2.5×105/ml接种于25 cm2培养瓶中,以8×105/ml接种于预置有盖玻片的24孔板中,设3个复孔,置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,即P0,每2 d换1次液。

  1.2  RT-PCR检测软骨细胞特异基因和分化相关基因的表达

  1.2.1  细胞标本收集

     待5 d细胞长满后以相同密度接种传代即P1、P2,并分别将70%~80%融合的P0、P1、P2置于普通培养箱和2%O2(N2平衡)培养箱(Model 3110,Thermo)中培养2 d。用Trizol裂解沉淀细胞后,抽提RNA。

  1.2.2  RT-PCR反应

     取RNA 2 μg,随机引物1μl, 加水至12 μl ,70℃5 min置于冰上;5×反应缓冲液4 μl,10 mMdNTP 2 μl,RNase抑制剂0.5 μl,加水至19 μl ,25℃ 5 min;逆转录酶(M-MLV)1 μl,42℃ 1 h,70℃10 min,置于冰上终止反应。按照94℃5 min~-94℃30秒,以各基因退火温度30秒,72℃20秒~-72℃ 7 min进行PCR反应,各基因引物见表1。取10 μl PCR反应产物行琼脂糖凝胶电泳。用天能凝胶图像处理仪紫外灯下观察并拍照。

  1.3  软骨细胞表型鉴定

     将不同氧环境下24孔板中的玻片取出,进行II型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)的免疫组化染色及阿利新蓝染色。

  1.3.1  II型胶原和Aggrecan的免疫化学染色

     培养细胞依次执行下列步骤:吸去培养液,PBS洗2次,10 min/次;4%多聚甲醛室温固定15 min;3%H2O2离子水孵育10 min,消除内源性过氧化酶活性;牛血清白蛋白封闭20 min;一抗II型胶原(1∶100)、Aggrecan(1∶50)孵育过夜;二抗37℃孵育1 h;加ABC30~60 min;滴加DAB液,镜下观察显色;PBS缓冲液冲洗,脱水,透明,封片。

  1.3.2  阿利新蓝染色

     吸去培养液,PBS洗2次,10 min/次;4%多聚甲醛室温固定15 min;PBS洗3次,3 min/次;1%阿利新蓝染色30 min;蒸馏水冲洗;脱水,透明,封片。

  2  结果

  2.1  软骨细胞形态学观察

     接种后24 h,倒置显微镜下观察,大部分小圆形细胞已经贴壁。继续培养,典型的软骨细胞为上皮样细胞,外形为多边形或圆形,胞浆丰富,胞核圆形,居中。镜下细胞有立体感。5 d左右细胞融合,呈明显的铺路石样外观。传代后,细胞由圆形、多边形变成长梭形,并有大量的突起出现。

  2.2  软骨细胞标志性基因和分化相关基因表达(图1、表2)

     RT-PCR半定量结果:各样本基因表达量=各样本目的基因净光密度/各样本β-actin净光密度(x-±s,n=3)。经机械分离和酶消化方法获得的细胞表达II型胶原、Sox9和Aggrecan,并且低氧培养时标志性基因的表达高于普通培养。传代后,特异性基因的表达量降低,低氧培养和普通培养未见有明显差异。Ihh的表达:原代软骨细胞及传代后P1低氧培养时低于普通培养,传代后P2两种条件下均无ihh的表达。Pthrp的表达:原代和传代后软骨细胞低氧培养时Pthrp的表达均低于普通培养,且传代对Pthrp的表达没有什么影响。bmp4的表达:低氧条件下,随着传代,软骨细胞bmp4的表达逐渐降低,普通培养时bmp4的表达基本一致,且原代细胞低氧时bmp4表达高于常氧,传代后P2低于常氧。bmp7的表达:原代细胞两种条件下bmp7的表达没有明显差异,传代后P2低氧培养时bmp7表达明显高于普通培养。wnt5a的表达:传代后,wnt5a的表达降低,且两种条件下没有明显差异。原代软骨细胞低氧培养时wnt5a的表达高于普通培养。表1  RT-PCR反应各基因引物序列及反应条件目的基因引物序列产物大小
(略)

  2.3  细胞免疫化学染色和阿利新蓝染色(图2)

    低氧和普通培养时原代软骨细胞均有大量免疫化学染色阳性的棕褐色细胞和阿利新蓝染色阳性细胞,低氧时软骨细胞着色多深于普通培养。传代后,细胞形态由圆形、多边形变为长梭形,且胞体变大,突起增多,II型胶原和Aggrecan染色着色变淡,两种条件培养没有明显差异。

  2.4  统计分析

     RT-PCR半定量结果用均数±标准差(x-±s)表示,采用SPSS 11.5软件进行分析,用非配对t检验,P<0.05有统计学意义。

     3  讨论

     关节软骨急性损伤、慢性劳损及年龄增长引起的退变等病理情况下,由于软骨自身修复能力差,一旦损伤即产生永久性病变。随着组织工程学的发展,关节软骨损伤的修复技术也取得了长足进展。种子细胞-软骨细胞的来源及体外的扩增培养是组织工程学修复软骨的重要环节。软骨组织较之其他血供丰富的组织器官,其组织内氧分压更低。在关节软骨组织不同区带,氧分压存在着差异,介于1%~7%之间。软骨细胞处于低氧环境,通过糖酵解获取能量。低氧是软骨细胞生长和存活的一个关键因素。低氧可促进软骨细胞分化和软骨基质合成,但抑制软骨细胞的最终分化,并且低氧能明显促进间充质细胞向软骨细胞方向分化,促进软骨基质合成,在细胞培养和器官培养中均抑制最终分化[3]。所以适宜的氧环境也是体外软骨细胞生存的重要条件。表2  常氧和低氧条件下关节软骨细胞P0、 P1、P2各基因mRNA表达的RT-PCR半定量结果(略)

  软骨细胞为维持软骨的特性会分泌特异的蛋白。II型胶原是关节软骨内表达最多的胶原蛋白,它与其他胶原相互交织形成纤维网,使软骨组织具有张力和剪力特性,并固定基质中的蛋白多糖。可聚蛋白聚糖是软骨基质内另一个重要组成部分,它由一个核心蛋白与糖胺聚糖以共价结合。Sox9是调控间充质细胞向软骨方向分化的必要因子,Sox9表达后,进一步诱导下游相关基因II型胶原等的表达。

  Murphyl等[4]用藻酸钙包被去分化的软骨细胞,4周后发现低氧条件下(5%)培养的软骨细胞的特异性基因II型胶原表达与原代完全相同,可聚糖胺多糖及sox9的表达甚至高于原代细胞。本实验中,原代软骨细胞经低氧干预后,II型胶原的基因表达明显高于普通培养,免疫组化染色和阿利新蓝染色也证实II型胶原和蛋白聚糖的表达增高。传代后,软骨细胞的标志性基因表达降低,发生去分化,低氧干预和普通培养条件下没有明显差异。在软骨内骨形成过程中,Ihh/PTHrP和BMPs家族参与了对软骨细胞分化的调控。Ihh/PTHrP形成负反馈环来调控软骨细胞向肥大软骨细胞分化的启动,而BMPs家族也和这一负反馈环相互作用,参与调控。Ihh可以促进软骨细胞增殖,并促使软骨细胞由增殖期向肥大期转化,分泌X型胶原。Ihh信号活化后,可以上调PTHrP的表达,PTHrP可以使软骨细胞维持在增殖状态,抑制增殖性软骨细胞的肥大化分化,并下调Ihh的表达。另外,Ihh也可以不依赖于PTHrP直接调控软骨细胞增殖[5]。有实验证实,外源性bmp4能以剂量依赖方式促进软骨生长、基质沉积和软骨细胞增殖,较大剂量能够诱导异位肥大软骨细胞的生成[6]。Wnt5a在增殖型软骨细胞和前肥大软骨细胞表达,可以促进软骨细胞增殖,维持软骨细胞变为关节/静息软骨细胞的状态,抑制其分化[7]。普通培养条件下,软骨细胞传代后各分化相关基因表达基本不变;低氧培养时,Ihh的表达较常氧降低,Wnt5a的表达较常氧升高,说明低氧条件更利于软骨细胞保持增殖状态,传代后,Ihh、 bmp4的表达较常氧均下降,Wnt5a与常氧相似,则可能Ihh和bmp4参与了低氧条件下传代后软骨细胞表型的调控。低氧条件下原代及传代后软骨细胞PTHrP表达低于常氧培养,可能是由于Ihh表达量较低不足以启动Ihh/PTHrP负反馈环。本实验证实越接近于体内环境更容易保持软骨细胞的生物学特性,但是传代后软骨细胞经低氧单层短期培养,并未见明显的软骨细胞特异的表型基因表达的增高,所以单纯的氧环境改变并不能恢复软骨细胞的表型。

     组织工程修复关节是治疗关节损伤、退变的重要手段,而维持体外软骨细胞表型是需要解决的关键技术。低氧环境接近于体内的生理环境,本实验中低氧条件下原代软骨细胞的表型基因表达较常氧增高,促进软骨细胞分化的基因Ihh表达降低,抑制软骨细胞分化的基因wnt5a表达增高。由此,低氧环境也许是组织工程中软骨细胞准备的必要条件,更易于发挥修复材料的治疗作用。

     低氧是体内软骨细胞的生存环境,体外培养也观察到软骨细胞较之常氧培养时表型特异性基因的表达增强,但是低氧条件下引起软骨细胞特性改变的使动因素、相关基因和病理条件下(骨关节炎等)、年龄增大引起的关节软骨内氧浓度降低没能逆转软骨细胞的变性,其原因还不是很清楚,这有待于进一步研究。

【参考文献】
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作者单位:上海交通大学瑞金医院,上海市伤骨科研究所 200025;  基金项目:上海交通大学医学院科技基金项目(编号:05XJ21035)

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第23期]栏目

软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用

【摘要】  :很多实验证明软骨下骨在骨关节炎的发生发展过程中发挥着重要作用,软骨下骨硬化可能是关节炎发病的始发因素,但是关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系至今仍不完全清楚。骨重塑异常导致的软骨下骨硬化,极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用,使其丧失保护关节软骨的功能,进而引起关节软骨退变,加速骨关节炎进程。研究软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用、开发调控软骨下骨重塑的药物必将给骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。

【关键词】  骨关节炎 软骨退变 软骨下骨 骨重塑 骨硬化

  Role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis

  SHAN Peng-cheng,CAO Yong-ping

  Department of Orthopaedic Surgery,Peking University First Hospital,Beijing 100034, China

     Abstract: Many studies have proved that the subchondral bone plays an important role in the development of osteoarthritis ,and may be the initial factor of the disease, but the exact relationship between articular cartilage degeneration and subchondral bone sclerosis is still unclear. Subchondral bone sclerosis caused by bone remodeling abnormality severely decreases the ability of subchondral bone stress absorption and protective function of articular cartilage ,which finally leads to cartilage degeneration and osteoarthritis deterioration . Studying the role of subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis and developing potential drugs to regulate subchondral bone remodeling will provide a new way of prevention and treatment for osteoarthritis.

     Key  words:osteoarthritis;  cartilage degeneration;  subchondral bone;  bone remodeling;  bone sclerosis
   
  骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种主要累及负重关节的慢性、退行性疾病,其典型的病理特征为关节软骨进行性退变、软骨下骨骨质硬化。临床上以关节疼痛、肿胀、活动受限、关节畸形等为主要表现。OA病因复杂,至今仍不完全清楚,导致OA发病的可能因素包括年龄、肥胖、过度负重及创伤等。长期以来,骨关节炎被认为始发于关节软骨代谢紊乱、局部软骨降解[1、2],但是近些年的研究发现,OA早期已经出现软骨下骨骨转化增强、骨小梁结构改变,而且很多实验证明,软骨下骨硬化在骨关节炎的发生和发展中发挥着重要作用,可能是OA发病的始发因素[3、4]。因此研究软骨下骨在OA进程中的作用以及调控软骨下骨硬化来防治OA,已经成为目前OA研究的热点。

     1  软骨下骨的解剖构成

     软骨下矿化组织可以分为三层:钙化软骨、软骨下皮质骨和软骨下松质骨(图1),它们在形态学、生理学及机械作用方面是各不相同的[5]。作者通常所说的软骨下骨包括软骨下皮质骨及其下方的骨小梁、血管和小梁间腔隙等。软骨下骨区含有数量众多的动脉、静脉和神经,它们的细小分支不规则地排列成口径不一的窦状小管,这些窦状小管的末端与构成横向静脉窦的细小静脉丛相连。软骨下骨区的小动脉、小静脉和窦状小管穿行在皮质终板的血管通道中,将髓腔和钙化软骨层连接起来,向得不到关节液滋养的深层软骨提供营养。

     2  软骨下骨的生物学功能

     软骨下骨的主要生物学功能为吸收应力、缓冲震荡和维持关节形态。
     软骨下骨的弹性模量比关节软骨低,但数量相对较多,所以在缓冲震荡中起主要的衬垫作用,保护关节软骨免受过度应力的损伤[6]。在正常负重情况下,富含水分的关节软骨可将所受应力分散传导,但却仅能缓冲所受应力的1%~3%。当所受应力从关节软骨向骺端传导时会形成较大的剪切力,此时钙化软骨、软骨下骨和锯齿状潮线的波动可将这种剪切力转化为压力和张力,所以当关节所受的应力传到软骨下骨时几乎完全是压力和张力[7]。软骨下骨可将传来的力缓冲掉30%,其余的部分被皮质骨和周围的关节囊所吸收。正常关节中软骨下骨的密度和厚度是不均一的,所以不同部位软骨下骨的生物力学特性也有所不同,其缓冲震荡的衬垫作用也随所受应力的改变而改变,使不同部位的软骨下骨力学特性与其衬垫作用达到最佳平衡,从而维持关节的正常生理环境。

     软骨下骨的另一作用是维持了不一致的关节表面形态,使周围的关节面保持密切接触,而中央的关节面不接触。这样关节在负重时其中央部分可发生轴向移动,将所受的应力传到周围的皮质骨,这有助于维持关节软骨浅层的营养。

  3  骨关节炎中软骨下骨的病理生理

     在骨关节炎中软骨下骨硬化非常常见,  目前就软骨下骨硬化与关节软骨退变之间的关系存在两种假说:一种观点认为作用在关节上反复的超负荷压力导致骨与关节软骨的轻微损伤、水肿和出血。随着关节软骨的缓慢侵蚀,软骨下骨逐渐硬化,最终导致软骨下骨硬度升高,这可能反过来引起关节软骨进一步损伤[1];另一种观点认为,软骨下骨的硬化发生在关节软骨改变之前,关节软骨的完整性依赖于其下方骨床的生物力学特性,因此软骨下骨硬化可能是骨关节炎发病的始发因素[3、4]。
   
  OA软骨下骨硬化可能与成骨细胞的功能缺陷有关。研究表明来自OA软骨下骨的成骨细胞在甲状旁腺激素和前列腺素的刺激下合成环磷酸腺苷的能力较来自正常人群的成骨细胞低[8]。软骨下骨的硬化还可能与局部和系统的力学因子有关,这主要是指胰岛素样生长因子(IGF)和血浆酶原,并且血浆酶和血浆酶原系统调节着IGF系统的活性。IGF以及IGF连接蛋白系统的激活促进软骨下骨成骨细胞过度增殖,从而导致软骨下骨的增厚和硬化[8、9]。

     软骨下骨具有粘弹性特性,急性过度负重比逐渐过度负重更容易导致微损伤。软骨下骨和钙化软骨的反复微损伤将启动骨重塑过程[10]。Mori和Sokoloff等研究发现OA患者钙化软骨和软骨下骨的微损伤增加,这些微损伤启动了骨重塑过程,由于骨重塑区的血流增加和破骨细胞的局部溶骨,软骨下区可表现为短暂的骨质疏松。重塑过程中纤维血管长入钙化软骨中,产生了新的软骨下骨和新的软骨矿化区,导致了潮线的扩展和软骨下骨的硬化,软骨下骨的这种慢性改变最终导致了关节软骨的变薄和丢失[11、12]。关节软骨和软骨下骨的过度负重还可以导致未钙化软骨的结构改变,包括纤维损伤和产生异常基质蛋白,导致软骨水肿和深层软骨区的肿胀。如果持续过度负重,软骨下骨的硬化、纤维化、囊性变等将导致其血液循环减少,进一步加重深层关节软骨和软骨下骨的损伤以及未钙化软骨浅层发生剥脱并导致关节表面不规则,甚至关节软骨的全层缺失。

     4  软骨下骨硬化与关节软骨退变的关系

     关节软骨退变是进展期骨关节炎的显著病理改变,因此很多学者认为骨关节炎始自关节软骨细胞合成蛋白多糖的减少,并逐渐发展为胶原纤维框架结构改变,最终导致关节软骨退变[1]。然而,Burr DB认为在骨关节炎发病中软骨下骨起着重要作用,软骨下骨硬化不仅可以加速疾病进程,而且可能是骨关节炎发病的始发因素[5]。Day等通过实验证明在骨关节炎早期关节软骨退变之前,软骨下骨已经出现弹性模量减低、骨量减少的改变[13]。他们认为软骨下骨在OA发病中发挥着至关重要的作用。
   
  1986年,Radin和Rose首先提出软骨下骨硬化可能是导致软骨损伤的重要因素。他们认为软骨下骨就像一把坚硬的椅子,而关节软骨就像放在上面的软垫,如果椅子表面的硬度不均匀,垫子承重后就会产生剪切力,造成关节软骨损伤[6]。在众多相互争论的关于骨关节炎病因的理论中,这是第一个主要强调软骨下骨作用的一种假说。1993年,Dieppe等首次用实验数据证明了软骨下骨与关节软骨之间存在密切关系。他们对94位膝骨关节炎患者进行5年的前瞻性研究,结果显示入组时48%的患者胫股关节面存在软骨下骨硬化,34%的患者存在关节间隙狭窄>2 mm或者需要手术治疗,54%的人最终发展到关节间隙狭窄>2 mm或是行膝关节置换术。64%的膝关节有同位素异常浓聚,其中88%为进展期骨关节炎。这组数据强有力的支持了关节软骨进行性损伤与软骨下骨硬化之间存在密切关系。遗憾的是,此实验未能从根本上说明关节软骨降解与软骨下骨硬化之间的因果关系[14]。

     为了进一步研究二者之间的关系,Libicher等利用狗前交叉韧带横断骨关节炎模型,通过MRI检查,发现在软骨退变发生之前软骨下骨已经出现骨髓水肿[3]。Tomoya Muraoka等利用Hartley豚鼠自发性骨关节炎模型进行研究,结果发现2个月龄时其软骨下骨已经发生结构的改变,直到3个月龄时才发现关节软骨细胞减少,而且随时间延长数目不断减少。通过此实验,Tomoya Muraoka认为,软骨下骨改变是发生在关节软骨降解之前的[4]。

     然而,Yamada等通过对72名志愿者140膝的研究发现,软骨下骨增厚及骨密度增加不是导致关节软骨退变的原因,软骨下骨硬化更像是继发于关节软骨损伤的结果[2]。Raudenbush等认为软骨下骨硬化与关节软骨降解之间不存在必然联系[15],这就意味着软骨下骨硬化可能并不是关节软骨降解的病因。

     目前,虽然关节软骨退变与软骨下骨硬化之间的因果关系仍不完全清楚,但是人们对骨关节炎的发病机制已经有了新的认识,不再认为是由于单纯的关节软骨磨损及撕裂而导致的不可避免的结果。软骨下骨在骨关节炎发病中的作用越来越受到重视,而且越来越多的研究支持软骨下骨硬化继发关节软骨损伤这一理论。

     5  调控软骨下骨重塑对关节软骨退变的作用

     早在上世纪80年代,Radin和Rose便已提出骨关节炎的发病中机械因素起至关重要的作用[6]。而且很多研究证实骨关节炎中软骨下骨改变早于关节软骨退变[3、4]。骨重塑异常导致的软骨下骨密度增高和硬化,极大的减弱了软骨下骨吸收应力震荡的作用,使其丧失保护关节软骨的功能,引起继发性关节软骨退变[5]。因此,通过调控软骨下骨重塑来防治骨关节炎越来越受到研究者的关注。

     Tadashi Hayami等人[16]建立大鼠前交叉韧带横断骨关节炎模型,发现在骨关节炎早期骨转换增强,继发软骨下骨硬化,应用阿仑磷酸钠后,不仅抑制了软骨下骨硬化,而且还降低了关节软骨降解产物血清软骨低聚物基质蛋白和尿Ⅱ型胶原C端肽的水平,有效地减缓了骨关节炎进程。Lajeunesse等[17]利用狗膝关节前交叉韧带横断OA模型,通过体外培养膝关节软骨下骨成骨细胞,测量其代谢表型标志物、碱性磷酸酶、骨钙素及uPA、IGF-1等物质的水平,发现OA成骨细胞与正常细胞相比代谢活性明显增强,应用环氧化酶抑制剂licofelone后,其分泌的uPA、IGF-1、PEG2等因子的水平明显降低。因此,Lajeunesse认为licofelone可以改变软骨下骨代谢活性,间接稳定关节软骨的生物力学环境,减少关节软骨的损伤。此外,Hayami等[18]应用大鼠膝关节创伤性骨关节炎模型,发现在软骨退变及软骨下骨硬化之前已经出现软骨下骨骨吸收增强,而且与OA早期发病关系密切,认为骨吸收抑制剂可以作为潜在药物用于OA的防治。

     Tat等[19]利用OA患者膝关节置换术后股骨髁标本进行软骨下骨成骨细胞体外培养,加用硫酸软骨素及氨基葡萄糖进行干扰,结果发现:两种药物对骨吸收活性均有抑制作用,硫酸软骨素能够增加骨转换过程中骨保护素/RANKL的比率,在OA疾病进程中发挥积极作用。Boileau等[20]应用相同的方法,证明双醋瑞因可以抑制骨吸收因子MMP-13及组织蛋白酶K的活性,抑制破骨细胞的生成,调节软骨下骨异常代谢,对关节软骨产生保护作用。
   
  软骨下骨硬化在OA的发生和发展中发挥着至关重要的作用。软骨下骨代谢增强、骨重塑加快所导致的软骨下骨硬化可能是引起软骨退变的始发因素,而且会进一步加速OA的进程。研究软骨下骨在OA发病机制中的作用,通过调控软骨下骨硬化以减少关节软骨损伤必将给OA的防治带来新的理念。

     6  展望

     虽然软骨下骨在骨关节炎发病机制中的作用还不完全清楚,但是软骨下骨与关节软骨紧密的解剖关系决定了它的特殊作用。很多实验已经证实,通过药物调控软骨下骨代谢活性、抑制骨重塑速度可以延缓骨关节炎的进程。因此,开发调控软骨下骨代谢和重塑的药物,调节软骨下骨的代谢活性和骨重塑强度,改善软骨下骨硬化,必将为骨关节炎的防治开辟一条崭新的途径。

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作者单位:北京大学第一医院骨科,北京 100034

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第23期]栏目
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5例骨软骨发育异常导致脊柱侧凸的手术治疗

【摘要】  [目的]探讨骨软骨发育异常导致脊柱畸形的特征,探讨其临床特点及手术方法的选择。[方法]2001年1月~2008年6月共收治5例骨软骨发育异常患者,均以脊柱侧凸或后凸就诊入院,男2例,女3例;术前常规进行X线片、CT和MRI检查,就其临床特点及外科治疗进行回顾性分析。[结果]对本组脊柱侧凸患者均行手术治疗,顺利完成手术,未出现脊髓血管损伤等严重并发症,颈椎不稳、胸腰段后凸、侧凸和椎管狭窄在本组骨软骨发育不良患者中常见。5例患者均获得随访,随访12~24个月,平均随访15.6个月,采用Frankel脊髓评分,术前患者评分3例C,2例D;获得随访患者术后Frankel评分1例D,4例E,与术前相比神经功能改善1~2级。[结论]因气管插管困难和阻塞性肺病,患者术前应进行麻醉科和影像评估,因患者脊柱发育不良,脊柱的内固定常常很困难。

【关键词】  脊柱侧凸 骨软骨发育异常 治疗

  骨软骨发育异常通常全身骨骼受累,随着生长而进展。骨软骨发育异常[1]包括典型的合并骨骼发育异常的矮化病,如软骨发育不全、骺和干骺端发育异常、胶原病变(包括成骨不全)和各种各样的骨发育不全群(溶酶体的累积异常),常常导致脊柱侧凸畸形,需要进行手术处理,但由于其解剖结构和临床表现复杂,导致治疗比较困难。近年来由于影像学诊断技术和医疗水平的不断提高,该类疾病逐渐引起人们的重视。本研究主要将作者收集的5例有脊柱侧凸的骨软骨发育异常患者,就其临床特点及外科治疗进行回顾性分析。

     1  资料与方法

  1.1  一般资料

     2001年1月~2007年6月收治5例骨软骨发育异常,男2例,女3例;年龄10~18岁,平均13.6岁,均以脊柱侧凸或后凸就诊入院。其中,软骨发育不全2例、成骨不全1例、粘多糖病1例、甘露糖苷贮积症1例。

  1.2  临床表现

     5例均生长缓慢,身材矮小;骨骼畸形的4例,其中脊柱胸腰段后凸畸形3例、脊柱侧凸2例,持续的后凸畸形可以导致脊髓病变,1例出现截瘫。2例患者存在间隙性跛行等腰椎管狭窄的症状。膝外翻的1例,鸡胸、肋骨外翻的2例,下肢关节僵直2例,特殊面容的3例,多为头大、前额突出、鼻梁低平、唇厚,1例突眼,肝脾肿大1例,脐疝1例,语言障碍2例。成骨不全患者曾发生多次多部位的骨折。

  1.3  影像学表现

     术前常规均行X线和MRI或CT检查。X线影像表现:粘多糖病例和甘露糖苷贮积症病例骨骼系统的表现为颅骨变大,脊椎椎体变扁,呈弹头样改变,椎体前上角变圆,前下角变尖而突出如鸟嘴状,胸腰椎后凸成角,肋骨前端膨大成浆形如飘带样。髂骨体变短小,髂骨翼相对较宽,髋臼发育不良。MRI提示脊柱腰段椎管狭窄(图1)。成骨不全X线表现为全身骨密度减低,普遍性骨质疏松并易骨折。脊柱表现为脊椎侧凸,椎体扁平,明显骨质疏松,部分呈双凹型或楔状变形。

  1.4  治疗方法

     根据患者术前症状、物理查体和影响学检查结果,本组脊柱侧凸均行手术治疗。胸腰段后凸畸形1例T10~L4Cobb’s角87°,行经后路L1椎体切除、椎管减压,后路椎弓根内固定、钛网支撑融合术(图1),术后后凸T10~L4Cobb’s角5°。成骨不全脊柱侧凸的患者行侧凸矫正手术,脊柱胸段向右侧凸,腰段向左侧凸。术前胸腰双弯,胸弯T6~T11,Cobb’s角55°,顶椎T8Ⅱ度旋转;腰弯T12~L4Cobb’s角30°,顶椎L2Ⅰ度旋转。术后胸弯矫正至23°(图2)。

  2  结果

  2.1  手术结果

     根据术前检查结果制定的手术计划,所有患者均顺利完成手术,未出现脊髓血管损伤等严重并发症,所有患者伤口均按期愈合,未见伤口感染等并发症。

  2.2  随访结果

     5例患者均获得随访,随访12~24个月,平均随访15.6个月,采用Frankel脊髓评分,术前患者评分3例C,2例D;获得随访患者术后Frankel评分1例D,4例E,与术前相比神经功能改善1~2级。

  3  讨论

     骨发育异常指基因异常导致的异常骨生长。这些异常过去常按影像学来分类,现在逐渐依靠基因学来诊断[1]。目前国际上将此类骨骼疾病按形态学和基因学描述来分为2类:骨软骨发育异常(osteochondrodysplasias)和骨发育不全(dysostoses)[2]。由于骨软骨发育异常发病相对罕见,国内文献报道较少。其发病机制的确切病因尚不完全清楚,一般认为在脊椎发育成熟过程中一些刺激因素可以导致畸形。近年随着CT三维重建、MRI等影像技术的进步,以及脊椎分子遗传调控机理的认识,对骨软骨发育异常的研究逐渐深入。Hall等[2]从基因学方面将骨软骨发育不全主要分为以下几种类型:(1)软骨发育不全;(2)骨畸形性发育不良;(3)粘多糖病;(4)脊椎骨骺发育不良;(5)假性软骨发育不良;(6)斑点状软骨发育异常;(7)变型骨发育不良和kniest骨发育不良;(8)屈肢骨发育不良。

     本文着重讨论文章中几种病例。骨软骨发育不全[3]患者的临床表现为额部隆起、面中部发育不全、耳鼻喉系统功能障碍和短肢侏儒症。骨科方面表现在脊柱和四肢,上肢可表现为桡骨头脱位,下肢表现为膝内翻。成骨不全[4]患者主要临床特征为骨质疏松合并骨折,关节松弛,湖蓝色巩膜,牙齿发育不良和成熟前耳聋。甘露糖苷贮积症临床表现为头大、前额突出、鼻梁低平、唇厚,语言障碍。粘多糖病的临床表现为面容丑陋、关节活动受限,手呈爪型挛缩、 骨骼畸形、 髋关节脱位、 肝脾增大、 角膜混浊及视网膜和视神经损害。骨软骨发育不良常见脊柱畸形,颈椎不稳、胸腰段后凸畸形、侧凸和椎管狭窄。本组病例中骨骼畸形的5例,其中脊柱胸腰段后凸畸形3例、脊柱侧凸2例,持续的后凸畸形可以导致脊髓病变,1例出现截瘫。2例患者存在间隙性跛行等腰椎管狭窄的症状。
   
  近几年对脊柱侧凸的治疗进展可以应用后路椎弓根内固定系统进行治疗[4],但手术操作仍然存在较大的风险,必须注意此类患者解剖形态常异常、骨发育不良,有时应用内固定困难。因为正常肺的发育至8岁左右,对于年幼的患者(小于8岁)可先应用石膏、支具或Halo氏牵引架治疗来延缓最终的融合[5、6]。手术方法应该根据患者的病因、症状和影像学资料来选择。由于骨发育异常患者常存在限制性肺病、阻塞性和中枢性窒息、短颈畸形、颈椎不稳或后凸,麻醉风险较高[7]。

  骨软骨发育不良常见脊柱畸形,虽然这些罕见疾病的基因病因很多,但表达的脊柱畸形有相似之处,颈椎不稳、胸腰段后凸畸形、侧凸和椎管狭窄是常见的表现,可以较特发性侧凸更早期进行手术治疗,术前必须进行详尽的麻醉科和影像评估。虽然器械有了进展,但很多患者因骨发育不良内固定困难而仍需要先用Halo支架或支具制动治疗。

【参考文献】
    [1]Alman BA.A classification for genetic disorders of interest to orthopaedists[J]. Clin Orthop Relat Res, 2002,401:17-26.

  [2]Hall CM. International nosology and classification of constitutional disorders of bone (2001)[J]. Am J Med Genet, 2002,1:65-77.

  [3]Ain MC, Browne JA. Spinal arthrodesis with instrumentation for thoracolumbar kyphosis in pediatric achondroplasia[J].Spine, 2004,18:2075-2080.

  [4]张云海,陈博昌,张菁.成骨不全[J].中国矫形外科杂志,2005, 8: 1189 - 1190.

  [5]Gillingham BL, Fan RA, Akbarnia BA. Early onset idiopathic scoliosis[J]. J Am Acad Orthop Surg, 2006,2:101-112.

  [6]Roberts W, Henson LC. Anesthesia for scoliosis: dwarfism and congenitally absent odontoid process[J]. AANA J, 1995,4:332-337.

  [7]Chen CW, Tsou MY, Tsai SK,et al.Airway management of an achondroplastic dwarf with hydrocephalus undergoing decompression surgery[J]. Acta Anaesthesiol Taiwan, 2005,3:169-726059-S.


作者单位:1.北京大学第九临床医学院 北京世纪坛医院骨科 100038;2,中国中医科学院骨伤科研究所,北京 100700

日期:2010年1月13日 - 来自[2009年第17卷第21期]栏目
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