【关键词】 神经凝胶复合嗅鞘细胞移植 大鼠 脊髓横断伤 实验研究
脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后神经再生和肢体功能恢复一直困扰医学临床的一大难题。近年来，随着神经细胞生物学、分子生物学、神经电生理学、神经移植等技术和组织工程材料的飞速发展，人们对损伤后神经轴突再生及其调控有了深入的了解，但对脊髓完全性横断伤后神经再生和肢功能恢复并没有取得突破性进展。近年来逐渐兴起的神经凝胶(neurogel，NG)[1~4]为利用神经生物工程技术实现脊髓完全性横断伤后神经再生和肢体功能恢复带来了新的希望，其有效性、安全性和可行性等方面已经取得了明确结论，并已作为商品投放科研市场;同样对嗅鞘细胞(OECs)促进损伤后神经细胞存活和轴突再生也已得到充分证实[5~8]。本研究拟以NG为支架，使高度纯化的OECs在其表面粘附、生长，构建NG-OECs复合体移植修复大鼠脊髓横断损伤，以观察和分析其对神经元存活和神经轴突再生的作用和意义。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM-F12(DF12)培养基购自Hyclone公司，小牛血清(NCS)、胰蛋白酶购自Gibico公司，hoechst33342、多聚赖氨1093酸(PLL)购自Sigma公司，P75抗体、EnVision试剂盒购自Dako公司(单克隆抗人抗体)、NF-200、Synaptophysin(多克隆抗体)抗体及DAB显色试剂盒均购自博士德公司。成年雌性Wistar大鼠60只，重250～300g，由河北医科大学实验动物中心提供。
1.2 OECs的取材、分离
OECs的分离、培养、纯化和标记：取2.5个月龄雌性Wistar大鼠的嗅球神经层及颗粒层;以0.25%胰蛋白酶消化，终止消化后用含20%胎牛血清的DF12培养基吹打成单细胞悬液，接种于未涂胶的玻璃培养瓶，置5%CO2孵箱37℃培养12h后将培养上清连同未贴壁细胞转种于另一个未涂胶的玻璃培养瓶，再培养12h;调整细胞密度为1×106/ml，种植于经poly-L-Lysine处理的6孔板，培养7天，加入Ara-C(终浓度为10-5mol/L)作用48h，清洗后培养液中添加forskolin和BPE(终浓度分别为20μmol/L和20μg/ml)，继续培养10天左右，行S-100常规免疫组化染色以确定纯度。细胞移植前培养液中加入BrdU孵育48h(作用浓度5μmol/L)。
1.3 OECs免疫细胞化学染色及纯度鉴定
将获得的OECs分别在原代分离后第2、7、14天做P75免疫细胞化学染色。取出6孔板内盖玻片，放入40g/L多聚甲醛室温下固定40min，PBS冲洗3次，加入封闭血清，室温下作用20min，PBS冲洗后，按DAKO公司提供EnVision工作程序加入P75抗体(抗人单抗)及其他试剂。显微镜观察，每个标本随机选取3个视野计数阳性细胞并计算平均阳性百分率。
1.4 构建NG-OECs复合体
筛选合适的细胞密度，利用微注射技术将OECs顺柱形NG主孔方向注入，与NG支架共培养，并利用光镜及电镜观察细胞在支架中的形态特点及生物学特性。
1.5 脊髓神经元与NG-OECs复合体共培养
取胎龄E16的大鼠脊髓神经元微注射法沿主孔方向接种于无血清培养NG-OECs复合体中，另将其接种于无OECs的NG中作为对照组。分别于接种后1、3、5、7、14天观察神经元生长情况。以NF-160抗体为一抗，进行细胞免疫组化染色，观察脊髓神经元的存活情况。用免疫荧光、免疫电镜等方法检测OECs与脊髓神经元体外共培养时生长整合情况。
1.6 实验动物分组
实验拟用雌性Wistar大鼠60只，分为单纯损伤和NG-OECs复合体移植两组，每组30只。
1.7 大鼠脊髓横断性损伤模型
按40mg/kg剂量麻醉大鼠，麻醉后固定于立体定向仪上，以T10为中心，设计切口。在显微镜下，无菌操作切除T10全椎板及T9、T11部分椎板，显露脊髓，剪开硬膜，以特制探针横预置3-0丝线于待损伤脊髓腹侧硬膜内。以剃须刀片于预置线头侧0.5mm(T9水平)将脊髓横断，顺利由腹侧向背侧提出预置线，明胶海绵轻柔压迫止血。移植后缝合硬膜及切口。
1.8 NG-OECs移植
各组分别于损伤后即时采用显微外科技术将构建好的NG-OECs复合体移植于脊髓断端，标准化操作。OECs对照组使用显微注射法将OECs悬液10μl(107/ml)注入距伤部3mm脊髓两断端处，留针10min后缓慢拔针。
1.9 脊髓神经功能恢复情况的评价
行为学评分：2组均于移植后1、2、3、4、6周及8周进行行为学检查，采用双盲法进行大鼠后肢运动功能评分(BBB记分法)，21分为功能正常，0分为功能完全丧失。BBB评分观察时间为5min。
1.10 脊髓前角运动神经元结构重建情况评价
应用组织学染色、免疫组化等方法评价脊髓损伤的结构重建情况，利用神经电生理和BBB评分观察其功能恢复情况。(1)组织切片病理染色观察各组脊髓损伤区神经纤维与胶质瘢痕生成情况，应用HE、FB和Holzer等染色方法。(2)超薄切片电镜观察再生神经纤维生长与延伸情况、再生纤维与OECs整合及突触形成等超微结构。
1.11 NG-OECs复合体移植技术的安全性检测
(1)免疫组织化学(NGFR、GFAP、BrdU)和免疫荧光技术检测细胞增殖分化状态及迁移情况。(2)移植细胞成瘤性检测：利用移植后长时间(大于半年)存活的动物，观察移植细胞是否具有异型性。
1.12 统计学分析
根据每一实验步骤取得的结果数据形式，应用SPSS12.0统计软件。组间比较采用t检验，P≤0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BBB运动功能评分
所有大鼠脊髓全横断后第1、2周的BBB评分均为0分;伤后3周实验组和对照组后肢运动功能有轻微恢复;细胞移植4周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分明显高于对照组，差异有显著性(P<0.05)。6周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分提高更为显著，且两组BBB评分差值有增大趋势，提示NG-OECs复合体移植可能对SCI大鼠后肢运动功能恢复有促进作用(表1)。
2.2 组织学观察
术后3周脊髓损伤区苏木精-伊红染色显示NG-OECs复合体移植组脊髓损伤区结构紊乱，纤维走行方向扭曲、不一致，细胞数目较多，嗜银染色结果显示无论在损伤区还是损伤头、尾端，NG-OECs复合体移植组神经纤维数量多于对照组。NG-OECs复合体移植组损伤头端神经纤维数量多于损伤尾端，对照组损伤头、尾端神经纤维数量基本一致。利用图像分析系统对嗅鞘细胞移植组、对照组脊髓损伤区和对照组相同节段CST区域嗜银染色进行神经纤维计数，其结果见表1。表1 NG-OECs组和对照组各阶段BBB运动功能评分结果
2.3 NG-OECs复合体移植修复脊髓损伤超微结构观察
术后3周临近脊髓损伤区近端的脊髓前、后角取出组织透射电镜观察可见，NG-OECs复合体移植组脊髓有较多增生组织填充，脊髓组织中无明显空腔，空泡小而少，神经纤维及细胞坏死较少，色泽较亮;而对照组有较多空腔状，白质中有许多微囊，神经纤维及细胞坏死，颜色较暗，在横断处附近形成较多空泡;8周时上述差别更明显。
2.4 脊髓组织切片的荧光观察和免疫组织化学染色结果
冰冻切片荧光显微镜下表现，NG-OECs复合体实验组：3周标本，hoechst标记的OECs多集中于注射部位，荧光比较强;6周后荧光强度渐弱和密度降低(对比3周)，细胞可迁移至原注射部位15～3.5mm远处，提示细胞移植后向周围迁移。对照组为阴性。移植细胞成瘤性检测：利用移植后长时间(大于半年)存活的动物，采集20只，在电镜下观察移植OECs均未发现明显异型性。
3 讨论
传统观点认为，哺乳动物的脑和脊髓损伤后不能再生，因而半瘫或全瘫症状如果不能在伤后24h内得到改善，则不会有明显的功能恢复。最近，经研究发现CNS有再生功能，神经损伤后的修复能力取决于多种因素的影响。目前认为脊髓损伤后难以恢复的主要原因包括：(1)对脊髓的直接打击及继发炎症使脊髓内功能神经元大量坏死，右旋糖苷生物素顺行标记显示：再生的皮质脊髓束损伤凋亡且神经元再生困难;(2)脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子及继发形成的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连入灰质形成终末分支。(3)损伤造成局部细胞凋亡，致使细胞分泌的神经营养因子减少，破坏了支持轴突再生的有利微环境[9]。本实验中观察到：伤后3周实验组和对照组后肢运动功能有轻微恢复;细胞移植4周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分明显高于对照组，有统计学差异(P<0.05)。6周后，NG-OECs复合体移植组BBB评分提高更为显著，且两组BBB评分差值有增大趋势，提示NG-OECs复合体移植可能对SCI大鼠后肢运动功能恢复有促进作用(表1)。组织学方面对嗅鞘细胞移植组、对照组脊髓损伤区和对照组相同节段CST区域嗜银染色进行神经纤维计数，其结果为NG-OECs复合体移植组(544.7±102.2)，对照组(2212.8±175.4)。两组之间差异有显著性(P<0.05)。这也与实验中BBB运动功能评分所得到结果相符。细胞移植后3周左右，注射部位可检测到强而且密集的蓝色荧光;6周后检测到荧光强度渐弱和密度降低但分布更为广泛。提示细胞由注射部位向周围缓慢迁移，部分细胞甚至越过损伤头尾两端(P75染色)，迁移至原注射部位1.5~3.5mm远处，在迁移过程中和周围组织逐渐融合并发挥支持作用。笔者认为移植的NG-OECs复合体在脊髓损伤修复过程中可能发挥如下作用：(1)支持脊髓神经元轴突再生和突触重建。嗅神经终身可以再生，并且再生轴突可穿越周围神经系统与中枢神经系统的交接区，重新长入中枢神经系统的嗅球并建立起突触联系，嗅神经元(olfactory sensory neumns，OSNs)的强再生能力与嗅觉系统内嗅鞘细胞的独特作用密不可分，OECs包被着嗅神经轴突，并且诱导嗅神经长入神经中枢，决定了OsNs轴突终身再生的生理特性;(2)OECs能表达多种细胞表面粘附分子，如层粘连蛋白(1aminin)、细胞粘连分子LI(cell adhesion molecule)等促进神经轴突生长;(3)OECs还能分泌多种神经营养因子，如神经营养素(NT-3)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等，这些神经营养因子对于神经元的成熟具有促进作用。临床上，脊髓损伤患者中横断伤疗效最差，笔者的动物实验模型与其相吻合：因此本实验结果为临床脊髓损伤患者嗅鞘细胞移植后的神经功能恢复，从理论上奠定了基础、提供了依据。结合实验研究笔者认为，嗅鞘细胞移植后，脊髓损伤晚期患者神经功能恢复的机制在早期可能以脱髓鞘后髓鞘化等损伤修复作用为主，随后可能兼有损伤修复和神经再生两方面的作用，最后则可能以神经再生的作用为主。
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【摘要】 目的 探讨急性脊髓损伤后8h内应用甲基强的松龙冲击疗法治疗，通过治疗前、治疗中和疗效的观察，有效地促进患者脊髓功能的恢复。方法 对75例急性脊髓损伤后8h内患者进行大剂量甲基强的松龙冲击治疗,治疗前给予心理护理和常规护理,掌握治疗方案,保证药量准确输入;治疗后观察肢体功能恢复情况,预防消化道出血、水电解质紊乱及感染等不良反应。结果 75例患者中有66例在用药2天后临床症状与体征明显改善,肌力有不同程度的恢复,9例无明显变化。结论 急性脊髓损伤后8h内应用大剂量甲基强的松龙冲击治疗,同时加强护理和观察,能有效促进患者脊髓功能的恢复。
【关键词】 急性脊髓损伤;甲基泼尼松龙;冲击治疗;护理
脊髓损伤 (SCI)是脊柱骨折或骨折脱位的严重并发症(14%～60%并发脊髓损伤),也是对人打击最大的一种致残性疾患[1]。随着经济的发展 ,社会的进步 ,交通工具以及建筑业的迅猛发展 ,交通伤、坠落伤等原因所造成的脊髓损伤在我们的生活中越来越多。SCI最多发生于颈椎下部 ,其次为脊柱胸腰段。由于SCI的高度致残性 ,SCI的治疗与护理越来越多地引起了人们的广泛重视。在冲击治疗过程中进行严密的观察和护理,对于预防和减少并发症的发生是非常重要的。我科从2005年5月-2006年1月对75例急性脊髓损伤的患者实施了大剂量甲基强的松龙的冲击治疗，取得满意疗效，现将护理体会报告如下。
1 临床资料
1.1 一般资料 2005年5月-2006年1月,我科收治急性脊髓损伤患者75例,其中男55例,女20例;年龄15～78岁，平均年龄28.9岁。损伤原因：摔伤28例，交通事故28例，高处坠落19例，均出现不同程度的肢体感觉运动功能障碍。由于核磁共振(MRI)能够直接显示脊髓损伤,并根据信号的改变判断脊髓损伤的程度,患者入院后均经MRI检查及X线摄片,确诊为脊柱脊髓损伤。按Franckle分级标准， 75例中A级5例，B级20例，C级26例，D级24例。
1.2 治疗方法 根据美国第二次全国急性脊髓损伤研究证实,对急性脊髓损伤患者早期进行甲基强的松龙(methylpredisolone,MP)的治疗,效果明显。应用甲基强的松龙冲击治疗,初始剂量为每公斤体重30mg，15min静脉注射。大剂量注射后暂停45min,随后以5.4mg/(kg·h)的速度持续静脉滴23h。连续应用24h,治疗5～7天观察疗效。采取早期、大剂量、短程的特殊治疗方案，可减缓或终止脊髓损伤后的继发性损害,促进其功能恢复,并被美国脊髓损伤研究会(NASCIA)组织的临床试验和大量的试验研究所证实。
2 护理
2.1 治疗前的护理 皮质类固醇此类药物可维持细胞膜、血管壁细胞的完整，在脊髓灰质出血时，稳定白质、抗炎、减轻水肿及纤维细胞的活动，减少纤维素沉着于伤部，减少脊髓破裂溶解微粒酶等释放，从而减少脊髓的破坏。由于大剂量皮质类固醇激素可以引起严重的电解质紊乱、溃疡出血、诱发或加重感染等并发症和副作用[2]，因此,治疗前应该按常规抽血化验,了解患者的血清电解质、出凝血时间、血小板等情况,准备好抗酸药物及冲击治疗用的甲基泼尼松龙及输液泵。做好病史的采集、体格检查、详细记录治疗前T、P、R、BP及24h内出入量。尽可能将患者安排在监护病房,保持清洁舒适,空气清新,以防交叉感染。治疗前主动向患者讲清此项治疗的目的、方法及必要性,介绍成功病例,解除患者对激素治疗的恐惧感,使其积极配合治疗，消除患者的思想顾虑,增强其战胜疾病的信心。
2.2 治疗中的护理
2.2.1 严格按要求控制输液速度 颈椎骨折并脊髓损伤患者受伤后8h内大剂量甲基强地松龙冲击疗法，按照20mg/kg体重冲击15min，间隔45min后再给予5.4mg/kg维持22h。护士必须熟悉冲击治疗方案,根据输入液量,准确计算出滴速,使用输液泵。输液时巡视病房,注意滴速是否准确,如有异常及时调整,保证药量按计划输入，以达到减缓脊髓损伤后的继发性损伤。冲击疗法输入的激素量较大,通常需要维持,输液速度持续太快可以引起心律紊乱,甚至造成心搏骤停,突然死亡,因此除了向患者讲明重要性外,护士应该密切观察生命体征的变化。
2.2.2 注意水电解质平衡, 严防高血糖 冲击治疗前检查血K+、Na+、Cl-、Ca2+、血糖,冲击期及冲击后24h内应密切注意水电质的平衡。因激素有排钾升糖作用,又因脊髓损伤后常规使用脱水剂减轻脊髓受压,排出大量的钾。因此必须静脉补钾,补钾速度不宜过快,补钾量依生化分析结果而定。本组有1例患者在冲击治疗2天后出现发热、神志模糊、无力、腹胀等症状,经检验为低血钾,静脉补钾后症状逐渐消失。临床上护士要准确记录出入量,根据肾功能及尿量的多少适当补充钾和钙。
2.2.3 密切观察T、P、R、BP的变化 脊髓损伤后由于副交感神经受损使心率减慢至50次/min左右,加之甲基强的松龙又有减慢心率的作用, 循环性虚脱及心脏停搏,所以冲击治疗前必须备好除颤器。冲击期给予心电监护及生命体征监测，随时将监测数据提供给医生。
2.2.4 预防上消化道出血 急性脊髓损伤往往是车祸、高处坠落等外伤所致,意外的打击、巨大的创伤可引发应激性溃疡,而大剂量激素冲击治疗更易诱发消化道出血。因此,使用甲基泼尼松龙冲击治疗前须常规应用抗酸药物,可使用洛赛克40mg静脉推注或雷尼替丁200mg静滴[3]。治疗过程中及治疗结束后均应密切观察有无消化道出血的征象:注意观察呕吐物和粪便颜色,进行呕吐物及大便隐血试验检查,监测血压、脉搏等生命体征的变化;治疗过程中经常询问患者有无不适。对于一些老年人和有胃病史的患者,除服用抗酸剂保护胃黏膜,饮食护理是非常有效的方法。做到定时、定量、少食、多餐,进食高热量易消化的食物。勿进食生冷饮食,不要吃得太饱。保持大便通畅,同时加强观察腹部体征和大便颜色的变化。
2.2.5 积极采取措施,防止感染发生 大剂量使用皮质类固醇激素可以使免疫功能降低而继发感染[4]。一旦发热应该做细菌培养和药敏试验,明确感染的性质,选择适当药物治疗。同时做好保持病室清洁,空气新鲜,温度适宜,并减少探视。每日用洗必泰液漱口,预防口腔感染。加强皮肤护理,每日用温水擦洗全身皮肤,按摩受压部位,保持床铺清洁干燥,避免机械性刺激。
2.2.6 加强蛋白质和钙的补充,防止骨质疏松,避免剧烈活动 另外,激素可以引起许多精神症状，如兴奋、失眠、甚至躁狂等症状,这类患者除了对症治疗外,应加强护理,防止外伤和自伤。
3 疗效观察
应用甲基强的松龙冲击治疗,根据灭活时间通常在给药4～6h后可以观察到临床反应。所以在冲击治疗过程中及用药后的5～7天内观察用药后的反应。观察患者肢体功能恢复情况,注意倾听患者的主诉,了解患者感觉障碍平面有无变化,肌力有无增强,嘱患者作握拳、活动脚趾等动作,了解药物的治疗效果。本组患者中28例冲击12h后出现肌力明显改善,双上肢及双下肢肌力均在4～5级之间,感觉恢复,观察1周痊愈出院。26例患者在冲击治疗2～7天内出现肌力有所改善,肌力由0级恢复到2～3级。待各项检查完善后进一步手术治疗。4 小结
大剂量甲基泼尼松龙治疗急性脊髓损伤的机制，早期应用大剂量甲基泼尼松龙能够抑制脊髓脂质过氧化反应和减少脊髓继发性损伤;可以减少炎性介质的释放和创伤后脊髓的缺血,改善微循环状态,最大限度地减轻脊髓组织损害的进展,有效地保护脊髓的功能。应用大剂量甲基强的松龙冲击治疗急性颈脊髓损伤护士必须具备高度的责任心和慎独精神;同时具备丰富的医学护理知识,这样患者才能得到有效的治疗,获得满意疗效。
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德国法兰克福大学医院研究人员日前宣布，他们已通过技术改进，使目前普遍用于脑肿瘤手术的弥散张量纤维束成像技术用于脊髓肿瘤检查，这将明显提高脊髓肿瘤手术的安全性。
法兰克福大学医院日前发表新闻公报说，目前脊髓肿瘤在诊断和手术上存在很大难度。对于生长在脊髓外部、只是挤压脊髓的良性肿瘤，通过先进的显微外科手术可以进行很好的切除治疗。但对于生长在脊髓内部的肿瘤，利用现有磁共振成像或CT扫描技术手段还难以将肿瘤和正常组织区分开。
弥散张量纤维束成像技术是在常规磁共振成像和弥散加权成像技术基础上发展起来的一种新的磁共振成像技术，主要应用于观察大脑蛋白质纤维结构特性，也为神经外科手术术前、术中检查提供诊断依据。清晰的脑部影像可减少手术伤害正常脑组织的风险。但是弥散张量纤维束成像技术用于脊髓检查还很困难，除了脊髓体积较小的原因外，呼吸、心跳、脑脊液脉动还会给成像造成所谓运动伪影，影响成像结果。
法兰克福大学医院研究人员说，他们利用新研发的具有较高磁场强度和优化磁共振脉冲序列的磁共振设备，很好地解决了弥散张量纤维束成像用于脊髓检查的问题。在临床试验中，研究人员利用新方法对脊髓肿瘤患者进行实际检查，并已能够预测肿瘤是否可以切除。他们表示，利用新方法可以有效提高脊髓肿瘤切除手术的安全性，但正式投入临床使用前还需要进一步研究。
