肾宝合剂HPLC指纹图谱的研究
摘要：【摘要】目的:研究肾宝合剂的高效液相指纹图谱,为科学评价及有效控制合剂的质量提供了有效可靠的方法。方法:利用高效液相色谱法,梯度洗脱,测定了10批肾宝合剂样品。结果:10批肾宝合剂样品得到的色谱指纹图谱有8个共有峰,体现了淫羊藿、补骨脂和蛇床子3种药材的特征。结论:肾宝合剂的指纹图谱特征性及专属性强,可用于全面......
【摘要】目的:研究肾宝合剂的高效液相指纹图谱,为科学评价及有效控制合剂的质量提供了有效可靠的方法。方法:利用高效液相色谱法,梯度洗脱,测定了10批肾宝合剂样品。色谱条件为:Alltech C18柱(250mm×4.6 mm ,5μm) ,流动相A 为乙腈;流动相B为0.1%醋酸水溶液,B相浓度梯度为0 min ,76 %;15 min ,70 %;40min ,53 %;50min ,30%;60min ,停止。结果:10批肾宝合剂样品得到的色谱指纹图谱有8
共有峰,体现了淫羊藿、补骨脂和蛇床子3种药材的特征。方法精密度、稳定性、重复性均符合有关规定。结论:肾宝合剂的指纹图谱特征性及专属性强,可用于全面控制肾宝合剂的质量,确保每一批产品的均一性。
【关键词】肾宝合剂;高效液相色谱;指纹图谱
肾宝合剂是由淫羊藿、当归、补骨脂、蛇床子等22味中药组成,多年应用表明本品具有调和阴阳, 温阳补肾,安神固精,扶正固本的作用。由于肾宝合剂药味较多,成分复杂,仅仅测定其中的一个或几个有效成分的含量难以较好地控制整个合剂的质量,中药指纹图谱为中药分析提供了有效的分析手段,能从整体上进行质量控制。本文采用梯度洗脱的方式对肾宝合剂的指纹图谱进行了研究,为全面控制肾宝合剂的质量提供了可靠的方法。
1 材 料
1.1 仪 器
日本岛津高效液相色谱仪(包括LC210AD VP二元泵; SPD210A VP 紫外2可见检测器) ;N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所) 。
1.2 药材与试剂
淫羊藿药材、补骨脂药材、蛇床子药材(江西汇仁制药有限公司提供,经中国药科大学生药学教研室宋学华教授分别鉴定为淫羊藿( Epimedium brevicomum Maxim1) 、补骨脂( Psoralea corylifolia L) 和蛇床子Cnidium monnieri (L1) Cuss1),肾宝合剂(江西汇仁制药有限公司提供,淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、蛇床子素对照品(中国药品生物制品检定所提供) 。乙腈(色谱纯,美国Tedia 公司) ;水(纯净水) 。其余试剂均为分析纯。
2 方 法
2.1 色谱条件
色谱柱:Alltech C18 (4.6mm×250mm,5μm) ;流动相:A ,乙腈;B ,0.1%醋酸水溶液。梯度洗脱:B 相,0～15min (76 %～70 %) ,15～40min(70%～53%) , 40～50min(53%～30%),50～60min(30 %) ,60min(停止),流速: 1.0mL/ min ; 检测波长:0 min ,254nm;50min ,325nm;进样量:20μL ;柱温:25℃。
2.2 供试品溶液制备
精密吸取肾宝合剂5mL ,置100mL 量瓶中,加70%乙醇稀释至刻度,混匀。经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,作为供试品溶液。
2.3 测定方法
吸取供试品溶液20μL ,注入高效液相色谱仪。另吸取溶剂20μL作为空白溶液注入高效液相色谱仪,结果表明,溶剂对肾宝合剂指纹图谱中共有峰检出无干扰。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 取批号为0201008 的样品,按“2.2”项下方法制备供试品,连续进样6次,检测指纹图谱。测得其相对保留时间的RSD小于3% ,各共有峰相对峰面积比值的RSD小于5% ,表明方法精密度良好。
2.2.4 重复性试验 取批号为0201008 的样品6份,按“2.2”项下方法制备供试品,分别进样,测得其相对保留时间的RSD小于3%,各共有峰相对峰面积比值的RSD小于5%,表明方法重复性较好。
2.4.3 稳定性试验 取批号为0201008 的样品,按“2.2”项下方法制备供试品,分别在0 ,2 ,4 ,6 ,12 ,24h 检测指纹图谱。结果表明测得其相对保留时间的RSD小于3% ,各共有峰相对峰面积比值的RSD小于5% ,表明样品溶液在24h内稳定。
2.5 指纹图谱及各项技术参数
通过对肾宝合剂10 批供试品溶液HPLC的分析,参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行) 》,表明其中8 个峰是各批供试品所共有的,体现了3种药材的特征,保留时间15～22min 处,出现了5个色谱峰,表征了合剂中淫羊藿药材的指纹特征;保留时间30～34 min 出现了2 个色谱峰,表征了合剂中补骨脂药材的指纹特征; 保留时间52～54min 处出现了一个色谱峰,表征了合剂中蛇床子药材的指纹特征。因此确定
8个峰为共有指纹峰。用二极管阵列检测器作峰纯度检查,匹配度达999,表明这8个峰为纯的色谱峰。在共有峰中,以5号峰的峰面积作为1 ,1、2、3、5号峰的峰面积大于总峰面积的5% ,计算峰面积比值。其余各共有峰均按其相对保留时间定性。
技术参数:共有峰峰号( 相对保留时间) : 1 ( 0.745) , 2(0.855) , 3 (0.895) , 4 (0.928) , 5 (1) , 6 ( 1.453) , 7(1.520) ,8 (2.488) 。峰面积比值范围:1 (0.618～01926) ,2 (0.155～0.287) ,3 (0.407～0.678) ;10 批供试品溶液检测结果。
3 讨 论
3. 1 流动相及洗脱方式的考察优化分别用甲醇2水、乙腈-水、乙腈-水(含乙酸) 等体系进行洗脱,结果以乙腈-水(乙酸浓度为0.1%)体系得到的色谱峰峰形好且稳定。但等度洗脱时, 有效成分出峰时间较长且分离效果不够理想,梯度洗脱在60min内可使色谱峰全部洗出,且大都达到基线分离。实验中,以梯度洗脱程序运行50min然后以终浓度等度洗脱至60min后回到起始浓度。该色谱条件可以使肾宝合剂中的主要药味淫羊藿、补骨脂和蛇床子药材在指纹图谱中得到充分表征。为确保下次分析时色谱峰的峰形及分离度,每次运行后柱平衡时间不少于10 min。
3. 2 检测波长的选择
对190～400 nm 扫描的各波长下的色谱图进行分析比较,在254nm 波长得到的峰数多,故在前50 min 确定检测波长为254 nm。又因为合剂中的主要成分蛇床子素在50min 后出峰,其含量低,在254nm处几乎检测不到。故50 min 后改变检测波长,选择在蛇床子素最大波长325 nm 处检测。
3. 3 主要色谱峰的鉴定
在同样色谱条件下,测定淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素和蛇床子素对照品,并与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较,发现样品指纹图谱中5 ,6 ,7 ,8号峰的保留时间及紫外光谱分别与淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素和蛇床子素标准品吻合,故样品指纹图谱中5 ,6 ,7 ,8 号特征峰分别鉴定为淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素、蛇床子素。本指纹图谱不仅可以用于合剂中淫羊藿、补骨脂和蛇床子药材的鉴别,同时还可以有效地控制这3 种药材中的主要成分的含量。
淫羊藿为肾宝合剂中的君药,其指标性成
淫羊藿苷的含量较高且相对稳定,因此选其作为参照物。1号峰,2 号峰,3号峰大于总峰面积的5%,且相对峰面积稳定,故考虑控制其相对峰面积范围。
【参考文献】
[1] 屠鹏飞(Tu PF) .中药指纹图谱指定的方法学探讨[C].现代化中药产业关键技术系列研讨会(一) :国际色谱指纹图评价中药质量研讨会.
[2] 国家中医药管理局编.中华本草[M].1910.3348 ,5109.
发布日期：2007-5-18
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