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高效液相色谱指纹图谱在中药知母上的应用

来源:药分网 作者: 2006-7-14
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摘要: 关键词:知母。指纹图谱。高效液相色谱。质量控制摘要:目的:建立知母高效液相色谱指纹图谱。...


关键词:知母;指纹图谱;高效液相色谱;质量控制
摘要:目的:建立知母高效液相色谱指纹图谱。方法:利用高效液相色谱对7个产地的知母进行分析比较。色谱条件:色谱柱为HypersilODS C18柱(5μm, 150 mm ×4. 6 mm) ;流动相为水∶甲醇(V∶V = 96∶4) ;检测波长λ= 270 nm;流速为1. 0mL/min。结果:根据相对保留值α定性、相对峰面积Sr 定量, 5个色谱特征峰为10批样品共有。结论:本研究为中药样品的鉴定提供了较为全面的信息,能用于中药知母的质量控制。
    中药知母,别名羊胡子根、蒜辫子草等,为百合科(L iliaceae)植物Anem arrhena asphodeloides的干燥根茎。鉴于炮制过程有所不同,可分为“毛知母”、“知母肉或光知母”等。
    知母性味苦寒,有清热泻火、生津润燥的功效,用于治疗外感热病、高热烦渴等症,是一常用的苦寒清热药。
    知母的化学成分主要为甾体皂苷和芒果苷,此外还有木脂素、β2谷甾醇、脂肪油、鞣酸、泛酸、胆碱、粘液质等。《中国药典》采用薄层扫描法测定知母中菝葜皂苷元( Sarsasapogenin)的含量,马长华等对该方法作了研究和改进。王天勇等利用反相高效液相色谱法测定了知母中菝葜皂苷元和萨尔萨皂苷元的含量。由于知母中含有多种化学成分,按照中医药理论,其1种或2种成分的测定不足以全面表征中药知母的质量。
    指纹图谱质控技术是一种充分利用现代科技手段所能达到的最好表证中药方剂复杂体系特性的技术。它不但表达了成品的质量,更可以用于工艺操作和原料中药材的质量控制,即可从指纹图谱来追根溯源寻找工艺操作中的问题和实现对异地药材优良农业规范(GAP)的质量要求。无论是中药材,还是中药方剂,从现代科学观点来看,都是复杂体系。对于复杂体系必须采用多种技术来表征其不同的特征。中药指纹图谱质控新技术和中药药效物质基础研究在我国受到了中药和各交叉学科的广泛关注,并已经取得了一定的研究成果。本文采用高效液相色谱(HPLC)对中药知母的色谱指纹图谱进行研究。对不同产地、不同规格的知母进行分析比较。根据相对保留值α进行定性分析、根据相对峰面积Sr 进行定量分析,以此对色谱指纹图谱进行分析对比研究。建立了快速鉴别知母样品的色谱指纹图谱分析方法。研究表明,高效液相色谱指纹图谱为中药样品的鉴定提供了较为全面的信息,可用于中药知母的质量控制。
1 实验部分
1. 1 主要仪器、试剂与材料
    LC-6A高效液相色谱仪(岛津,日本) ; SPD-6 AV可调波长紫外检测器(岛津,日本) ; 8022型离心沉淀机(上海手术器械厂) ;数据处理: HW色谱工作站(南京千谱软件有限公司) 。
    流动相所用甲醇(色谱纯) ,二次重蒸水;配制供试品所用醋酸乙酯和甲醇均为分析纯。知母药材样品的产地和采收时间见表1。
1. 2 供试品的制备
    分别称取不同编号知母样品各50 g,加水250 mL,回流5 h,过滤,滤液用醋酸乙酯提取3次(醋酸乙酯用量分别为30 mL, 20 mL和20 mL) ,合并有机相提取液。浓缩去有机溶剂后用50 mL甲醇溶解,用0. 45μm滤膜过滤,滤液作为知母样品供试液进行HPLC分析。
1. 3 色谱条件
    HypersilODS C18色谱柱( 5μm, 150 mm ×4. 6 mm) ;检测波长为270 nm;流速为1. 0 mL/min ;流动相为水甲醇(V /V = 96∶4) ;进样量10μL。
2 结果与讨论
2. 1 知母色谱指纹图谱的建立
    用知母样品提取物的醋酸乙酯溶液配成供试液。知母样品在上述实验条件下得到的色谱峰较为密集。在色谱指纹图谱中选择一个特定色谱峰,该峰具有位于色谱图较中心位置、有较高强度、为所有样品所共有等特征,以此峰作为参照峰求出其他所有色谱峰的相对保留值。
    相对保留值计算公式为:α = tri / trs。其中tri为待测峰的保留时间, trs为参考峰的保留时间。相对面积计算公式为:Sr = (待测峰i的相对面积/标准样品的总面积) ×100 。其中,知母8号样品的液相色谱指纹图谱如图1所示。
    基于8号样品色谱峰总面积较大,峰数较多且具有代表性,将其指定为标准,以求出待测峰i的相对面积。将样品中各组分的相对保留值α按大小排列,并在每个α值项下标出该组分的相对面积Sr ,再将不同样品中具有相同α值的Sr 做比较分析如表2所示。表中无对应的相对面积Sr 时表示该样品没有具有该α值的色谱峰。
2. 2 知母样品的色谱指纹图谱特征
    各样品的色谱指纹图谱具有一定的相似性。含量较高的色谱峰集中在α值为0. 127 ~1. 000 区域,其中α值为0. 185、0. 633、1. 000的3个色谱峰,特别是α值为1. 000处有一个独立的强峰为其主要特征。
    色谱指纹图谱八强峰是指某样品的色谱峰中相对面积值Sr 较大的前8个色谱峰。分析比较八强峰可以从量的角度对比不同产地、不同炮制条件下10个知母药材组分的差异性。8号样品亦被选择为基准,以此求出其余9个样品的色谱指纹图谱总面积比值,其分析结果如表3所示。
    色谱指纹图谱重叠率(Rate of overlap: Rov)是从质的角度考虑待测样品与标准样品之间的相关性。其计算公式为:重叠率Rov = [ (2 ×待测样品与标准样品共有峰) / (待测样品峰数+标准样品峰数) ] ×100。
    8号样品的指纹图谱亦被指定作为基准,以此求出其余9个样品的色谱指纹图谱重叠率。10个样品的色谱指纹图谱重叠率( ) 从1 号到10 号分别为: 66. 7, 57. 1, 64. 5,50. 0, 58. 8, 64. 5, 73. 3, 100. 0 ( 8 号样品为标准) , 74. 1 和88. 9。表中,八强峰总面积比Smi /Sm8 = (对应i样品八强峰峰面积之和/8号样品八强峰面积之和) ×100 。
2. 3 讨论
    在用色谱指纹图谱研究的样品中,具有相同相对保留值α的峰,即为色谱指纹图谱共有峰。从表2中10个样品的色谱指纹图谱分析可以看出,α值分别为0. 127, 0. 185,0. 633, 1. 000, 1. 457的5个色谱峰为10个样品所共有,为样品的100 共有峰。因此可以认为这5个组分为知母的基本组成成分,可作为控制知母质量的必要条件之一。此外,另有2个色谱峰为9个样品所共有(90 ) 。如此类推, 1个色谱峰为知母8个样品所共有(80 ) ; 1个色谱峰为知母7个样品所共有( 70 ) ;此9个色谱峰可作为判别知母的群体特征峰。其余峰为部分样品所共有,这些色谱峰没有特定的规律,可作为不同样品的特征峰。
    从表3知母10个样品的色谱指纹图谱八强峰可以看出,α值为0. 185, 0. 633, 1. 000在八强峰之列且都为100 共有峰,表明这3种组分为知母的最主要组分。α值为0. 127的色谱峰为10 个样品所共有, 其中该峰有9 个样品已进入八强峰。α值为0. 156的色谱峰为10个样品所共有,其中该峰有8个样品已进入八强峰。从表3中色谱指纹图谱八强峰分析:除3号、4号、6号样品在强峰的顺序上存在明显差异外,其余样品的八强峰并不存在本质的区别。从药材间的八强峰总面积比(Smi /Sm8 )来看: 2号、3号、6号、7号药材样品的提取成分含量较低,八强峰总面积比小于100 。1号、4号、5号、8号、9号、10号药材样品的提取成分含量较高,八强峰总面积比大于100 。由此看出, 8号、9号、10号知母药材在提取成分及相对含量上具有一定的相似性。从重叠率的数值可以看出:重叠率与知母药材的产地有一定的联系。同为河南的2号、6号药材样品,其重叠率分别为57. 1 和64. 5 ,较为近似。同为山西安康的药材样品,虽然4号为毛知母、5 号为知母肉,而其重叠率分别为50. 0 和58. 8 ,同样较为近似。从重叠率数据分析, 8号、9号、10号样品的重叠率均较高,而且从八强峰的分析来看,相同α值对应的Sr 值较为相近。
    中药提取物在给定实验条件下得到的色谱指纹图谱反映了该中药的化学组成及其含量分布状况,其特征峰可作为鉴别中药的依据。研究结果表明:在有效成分不完全明确的前提下,利用色谱指纹图谱作为中药质量控制手段是切实可行的。色谱指纹图谱能较全面反映中药所含成分,能有效体现中药成分的复杂性,能为不同产地、不同炮制条件样品间的鉴别提供科学依据。

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