用均匀设计法优选参附汤的半仿生提取工艺条件

［摘要］目的：为参附汤剂改研究优选提取工艺。方法：以人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏为指标，采用均匀设计优选其半仿生提取法(简称SBE法)的条件。结果：三煎用水的pH值依次为3.50，7.00，8.00；煎煮时间依次为：2，1，0.5 h。结论：用均匀设计优选SBE工艺条件，简便可行。
［关键词］　参附汤；半仿生提取法；均匀设计；工艺条件
［中图分类号］ R283　［文献标识码］ B　
［文章编号］ 1001-5203(2000)06-0345-03

　　参附汤出自明代*薛己《正体类要》一书，具益气活血，回阳救脱，强心生脉功能。用于元气大亏，阳气暴脱，手足厥冷，呼吸微弱，脉微等症，临床上用于治疗冠心病、各种原因引起的休克。为对其进行剂改研究，依据SBE法理论^［1，2］，以人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏为指标，用均匀设计法^［3］优选其SBE法工艺条件。

　　pHS-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；MA110型电子分析天平(上海第三天平仪器厂)；751-GW型分光光度计(上海分析仪器厂)；CS-930型薄层扫描仪(日本岛津)；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机(上海医疗器械三厂)。
　　药材经作者鉴定：人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根，生附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品。
　　人参二醇、人参三醇、乌头碱(中国药品生物制品检定所)。其余试剂均为分析纯。

2.1　确定考察因素与水平
　　根据SBE法及附子炮制原理，在药材粒度、煎提温度、煎煮加水量、滤过、浓缩等条件相同的前提下，确定考察主要因素及水平。
2.2　选用均匀设计表安排实验
　　根据中国航天工业总公司第三研究所提供的U₉(9¹×3³)表安排各因素水平进行实验，实验方案见表1。

　　　　表1　U₉(9¹×3³)均匀设计表

3.1　提取液的制备
　　将处方药材分别粉碎，取12～20目粗粉，人参28 g，生附子21 g，混匀。常压下加热回流提取3次(溶剂量分别为药材重量的10，6，6倍；3次提取时间比为2∶1∶0.5)，溶剂水的pH值及提取时间按表1规定，提取液4层纱布加100目筛分别滤过，离心，合并上清液并浓缩定容至500 ml。制得1～9号提取液(每1 ml相当于原药材0.098 g)。
3.2　人参二醇与人参三醇的含量测定
3.2.1　供试液的制备　精取3.1项下提取液50 ml，浓缩至约35 ml，加乙醇12.5 ml和浓硫酸2.5 ml，水浴回流4 h，加水稀释至70 ml，精取50 ml，用适量氯化钠饱和，乙醚萃取5次(20，20，20，15，10 ml)，合并萃取液，用0.125 mol^.L^-1的氢氧化钠溶液(50，30 ml)洗涤乙醚液2次，再用少量水洗涤乙醚液至中性，用无水硫酸钠脱水，滤过，回收乙醚至干，残留物用氯仿溶解并定容至2 ml,即得(每1 ml相当于原药材1.75 g)。
3.2.2　对照液的制备　精密称取人参二醇1.4 mg，人参三醇1.2 mg，分别用氯仿定容至2 ml，即得。
3.2.3　标准曲线的制备
3.2.3.1　薄层扫描条件：人参二醇λ_s 535 nm,λ_R 700 nm;人参三醇λ_s 530 nm,λ_R 700 nm;灵敏度:中；SX=3；狭缝1.20 mm×1.20 mm；双波长反射式锯齿形扫描。
3.2.3.2　标准曲线的制备：在0.3%CMCNa-硅胶G薄层板上分别点人参二醇对照液2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μl；人参三醇对照液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 μl，用氯仿-乙醚(1∶1)展开15 cm，挥干溶剂，喷10%硫酸乙醇，80 ℃烘10 min，显色，扫描。以点样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，二者均得一不过原点的直线。人参二醇线性范围1.4～14.0 μg，回归方程为Y=1775.0655X-957.1459，r=0.9987(n=6)；人参三醇线性范围1.2～7.2　μg，回归方程为Y=2444.4542X-1756.0173，r=0.9973(n=6)。
3.2.4　供试液的含量测定　精取3.2.1项下供试液24.0 μl，3.2.2项下人参二醇对照液4.0，6.0 μl，人参三醇对照液4.0，12.0 μl，分别点于同一块薄层板上，按3.2.3项下方法展开，显色，扫描，结果见表2。
3.3　总生物碱的含量测定
　　按文献［4］方法，依法测定，结果见表2。
3.4　酯型生物碱的含量测定
3.4.1　对照液的制备　精密称取乌头碱对照品9.8 mg，置10 ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度。
3.4.2　标准曲线的制备　按文献［4］方法，依法测定，以乌头碱含量为横坐标，吸收度为纵坐标作图，得一不过原点的直线，乌头碱线性范围0.245～2.450 mg，回归方程为Y=0.1100X-0.0073,r=0.9979(n=6)。
3.4.3　含量测定　按文献［4］方法，依法测定，结果见表2。
3.5　总糖的含量测定
3.5.1　供试液的制备　分别精取3.1项下提取液2.0 ml，加95%乙醇，使含醇量达85%，静置冷藏24 h，抽滤，取沉淀加适量水溶解，滤过，加水定容于250 ml容量瓶中，即得。
3.5.2　对照液与显色剂的配制　精密称取干燥至恒重的葡萄糖5.0 mg，置50 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照液。称取蒽酮0.12 g，置100 ml容量瓶中，加入95%硫酸溶解并稀释至刻度，冷却至室温，即得0.12%蒽酮显色试剂(临用现配)。
3.5.3　标准曲线的制备　精取葡萄糖对照液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，分别置干燥具塞试管中，补加蒸馏水使成2.00 ml，分别加入0.12%蒽酮试剂4.00 ml，混匀，放至室温。以蒸馏水2.00 ml，加蒽酮试剂4.00 ml为随行空白，在625 nm处测定吸收度。以葡萄糖含量为横坐标，吸收度为纵坐标作图，得一不过原点的直线，葡萄糖线性范围0.02～0.10 mg，回归方程为Y=7.35X-0.026,r=0.9992(n=5)。
3.5.4　含量测定　按3.5.3项下方法，精取3.5.1项下供试液0.5 ml，自“分别置干燥具塞试管中”起，依法测定，结果见表2。
3.6　干浸膏得率的测定　精取3.1项下提取液50 ml，置已烘干恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘至恒重，计算干浸膏得率，结果见表2。

　　综合人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏得率结果于表2。并将各个数据按公式进行标准化处理，X为9次实验每种指标成分结果的平均值，S为其标准差。将表1及表2中Y的数据输入计算机，用JYSYSJ的数据分析模块处理(贵阳中医学院林亚平教授提供)，经多元线性逐步回归统计处理，F检验未通过，改用二次多项式逐步回归得回归方程(选入、剔除阈值均为0.1)：
　　Y=421.6545+17.20905A-39.26821C-110.4891D-2.516703AA+3.944085DD+0.2897563AD+7.729469CD
　　r=0.9999811,S=2.797384E-02,F=3780.865
　　查F值表F^0.05_(7，1)=236.8，F^0.05_(7，1)＜F，所以F检验通过，回归方程有意义。再将方程在计算机上进行优化处理(Y的期望方向：大)，得出优化结果。结合生产实际，确定优选结果为：三煎用水的pH值依次为3.50，7.00，8.00；煎煮时间为3.5　h。

　　　　表2　综合各指标成分含量及标准化处理结果
　　　　g^.100g^-1　

5.1　采用均匀设计法对参附汤SBE法工艺条件进行优选，根据GLP(good lattice point)法优选结果，结合生产实际，三煎用水pH值依次为3.50，7.00，8.00；煎煮时间依次为2，1，0.5 h。
5.2　中医用药绝不只是单体成分，而是多种成分综合作用的结果，种综合作用从化学成分方面考虑可能是同中药共存成分之间或(和)多种中药共存成分之间的复合作用，故优选参附汤“SBE法”工艺条件时，根据SBE法理论和附子炮制原理，以人参二醇、人参三醇、总生物碱、酯型生物碱、总糖和干浸膏为指标。同时，根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，确定综合评价Y值的关系式：Y=(人参二醇+人参三醇+总生物碱-酯型生物碱)×6+总糖×4+干浸膏×3。并对6指标的数据进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响，以标准化指标加权后求和得Y值作为综合指标，优选出SBE法较佳的条件，这样加科学、合理。
5.3　SBE法是模仿口服药物经胃肠道转运吸收过程，采用选定pH的酸性水、中性水和碱性水依次连续提取。中药成分为弱有机酸或弱有机碱，经过酸性和碱性的溶剂连续提取，可以提得含指标成分更多的“活性混合物”。“SBE法”与纯化学观点的“酸碱法”是不能等同的，“酸碱法”是针对单体成分的溶解度与酸碱度有关的性质，在溶液中加入适量酸或碱，调节pH值到一定范围，其目的是使单体成分溶解或析出。
5.4　在酯型生物碱的测定中，人参成分对改良异羟肟酸铁法测定有干扰，当加入pH 0.5的高氯酸8.0ml后出现胶体沉淀，参考文献［5］，改为“加13.0 ml高氯酸铁，加pH 0.5的高氯酸3.0 ml，加无水乙醇至25 ml”后，获得较满意的测定结果。

［责任编缉　李　禾］

张兆旺（山东中医药大学，山东 济南　250014）
修彦凤（山东中医药大学，山东 济南　250014）
孙秀梅（山东中医药大学，山东 济南　250014）

［参考文献］

［1］　 张兆旺，孙秀梅.试论“半仿生提取法”制备中药口服制剂.中国中药杂志，1995，20(11)：670.
［2］　 张瑞亭，张兆旺，孙秀梅.思维方式的转换与中药“半仿生提取法”.中国中药杂志，1997，22(9)：542.
［3］　 方开泰.均匀设计-数论方法在试验设计中的应用.应用数学学报，1980，3(4)：363.
［4］　 张兆旺，孙秀梅，尉小慧，等.川乌两种方法提取液的成分比较.中成药，1999，21(1)：5.
［5］　 李兰芳，赵淑云，蓝庆荣，等.附子及其几种制剂中剧毒生物碱的含量测定.中成药研究，1987，(9)：13.

［收稿日期］　1999-04-27

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