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从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究

来源:www.pharmgarden.com 作者: 2007-6-16
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摘要: 从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究 紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年,Wani等就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。然而,在实际药物生产中,紫杉醇的大规模制备仍存在许多问题。首先,紫杉醇来源匮乏,其主要存在于红豆杉树皮和针叶中,其次,紫杉醇在植物中含量......


从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究   紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是当今一种重要的抗癌新药。早在1971年,Wani等 就从红豆杉树皮中发现并分离出了这种物质。由于它特异的临床抗癌疗效,1992年被美国FA D批准为治疗晚期乳腺癌的特效药而上市。然而,在实际药物生产中,紫杉醇的大规模制备仍 存在许多问题。首先,紫杉醇来源匮乏,其主要存在于红豆杉树皮和针叶中,其次,紫杉醇 在植物中含量极低,大约为0.010%~0.013%,而紫杉醇与其它紫杉烷化合物在化学结构和极性 等方面又极为相似,要将它们完全分离困难很大。   关于紫杉醇提取分离方法,已有过不少的研究。其中以液-液萃取应用最为广泛,在文献 报道的每一种工艺中,几乎都采用过它。Willey等和Mattina等在测定样品中紫杉醇浓度时, 选择了固相萃取作为HPLC分析的预处理。以分子间吸附为机理的硅胶柱层析,是制备紫杉醇 最常用的方法之一。1984年,Senilh等曾采用氧化铝柱层析处理红豆杉浸膏,但所报道的分 离效果不是太理想。1995年,Matysik等曾用制备薄层层析来少量获取紫杉醇。本研究的目的 ,在于寻找一条切实可行的工艺路线,最大程度地提高紫杉醇的回收率,以充分利用有限的 红豆杉资源;采用一些高效、经济的提取分离方法,减少过程步骤,快速、简捷地提取出紫 杉醇。   1 材料方法   1.1 材料   红豆杉树皮提取浸膏,云南张峰植物加工厂;紫杉醇对照品,纯度大于95%,Sigma;固 相萃取柱(C18填料,10ml),大连化学物理研究所;GF254硅胶和粗孔硅胶(100~140目), 青岛海洋化工厂;层析氧化铝(200~300目),上海新诚精细化学品有限公司。   DU-7紫外/可见分光光度计及FL-750HPLC仪,Beckman公司;XZ-6A旋转蒸发器,北京科龙 仪器公司;常压层析系统,Pharmacia公司。   1.2 方法   1.2.1 液-液萃取 称取红豆杉树皮浸膏于锥形瓶中,加CH2Cl2(浸膏CH2Cl2的重量比为 1:50),充分溶解,再加入与CH2Cl2等量的水,充分混合后静置分层,分液回收有机相,弃 水相。有机相再加水萃取,重复三次。将有机相中的CH2Cl2减压 蒸出回收,所得固相物溶解 于甲醇中,用HPLC作定性定量分析。   1.2.2 固相萃取 固相萃取过程包括四个步骤,即固定相活化、样品上柱、淋洗、样品的 洗脱。全过程将速度稳定控制在5~8ml/min。固定相活化:取乙酸乙酯10ml加入柱中,抽空。 依资助加入甲醇10ml和0.01mol/L(pH5.0)的乙酸铵缓冲液10ml(乙酸铵水溶液),将液面维 持在胶层上1~2mm。上样及淋洗:将样品溶于80%~90%的甲醇乙酸铵溶液中,取0.5ml加入柱中 ,抽空。依次用0.01mol/L的乙酸铵溶液10ml、50%的甲醇乙酸铵溶液淋洗,抽空。紫杉醇的 洗脱:在淋洗好的柱子中加入80%的甲醇乙酸铵溶液10ml,收集洗脱液,减压蒸发。从洗脱液 蒸发所得的固体物中取样,溶解于甲醇,作HPLC定性定量分析。   1.2.3 硅胶柱层析 硅胶用CHCl2浸泡,超声波脱气5min,重力沉降法装柱(15mm-×260 mm),用CHCl2充分洗出硅胶中的杂质至柱床透明。样品溶解于CHCl3后上柱,再用CHCl3充分 洗去未被吸附的杂质,然后用3:97(v/v)的CH3OH:CHCl3进一步洗脱,收集洗脱峰,HPLC 测定紫杉醇的浓度和纯度。柱层析过程在常温常压下操作。   1.2.4 氧化铝柱层析 CH3OH、CHCl3用分子筛脱水,层析用氧化铝190℃真空干燥6h后, 用脱水CHCl3浸泡,超声波脱气5min,装成15mm×260mm的层析柱。清洗柱后上样,用CHCl3洗 去未被吸附的杂质,再用1%的CH3OH、CHCl3(v/v)淋洗,最后用5%的CH3OH溶液洗脱出紫杉 醇。HPLC测定其纯度,柱层析过程在常温常压下操作。   1.2.5 制备薄层层析 用GF254硅胶自制100mm×200mm层析薄板,105℃活化0.5h,样品用 CH3OH溶解,配成10mg/ml的溶液。毛细管点样,成线状,每板点样量在2mg左右。在对照板中 点标准品和样品,用氯仿-甲醇(95:5)展开,254nm紫外光下确定紫杉醇的Rf值。切割并收 集制备板上的紫杉醇带,用CH3OH洗脱下硅胶上吸附的紫杉醇,HPLC测定其纯度。   1.2.6 紫杉醇的定量定性分析 采用HPLC对紫杉醇作定性定量分析:4.6mm×250mm的C18 柱,检测波长为227nm,等梯度洗脱,流动相为甲醇-乙腈-水(20:32:48),流速1.0ml/m in。以紫杉醇标准品为对照,外标法作定量分析。   2 结果及分析   2.1 液-液萃取   以1:1的二氯甲烷-水对粗品液-液萃取,紫杉醇富集到有机相。实验中发现,有机相与 水相的分层速度慢,并有乳化现象。液-液萃取的紫杉醇回收率为94.6%,紫杉醇含量从0.65 %提高到1.23%。液-液萃取的缺点在于产生的废水较多。   2.2 固相萃取   用50%的CH3OH洗涤,紫杉醇不会被洗下,而浓度加大到80%,即可将紫杉醇从萃取柱洗脱 。样品经一步固相萃取,紫杉醇浓度可提高8.9倍,回收率为100%。与液-液萃取相比较,固 相萃取的优点体现在快速、简单、便于自动化。同时,固相萃取的分离效率明显高于液-液萃 取。   2.3 硅胶柱层析   紫杉醇在硅胶柱上的保留较强,用CHCl3淋洗时,紫杉醇不被洗出。而用3%的CH3-OH:C HCl3(v/v)洗脱,可分离出两个峰。HPLC分析表明,其中的第二个峰,即图1中峰1为紫杉醇 。实验中还发现,在层析流动相中添加0.05%4 水时,分离出的紫杉醇纯度有所提高,分离速 度也能显著加快。经硅胶柱层析,能获得纯化20倍以上、纯度大于14%、回收率大于98%的紫 杉醇。   2.4 氧化铝柱层析   紫杉醇在氧化铝柱上的保留和分离大致相同。用最佳流动相和高活性(即含水量低)的 吸附剂分离芳烃异构体,氧化铝柱往往要比硅胶效果好得多。用5%的甲醇洗脱,可将大部分 紫杉醇洗出。Carver等认为,氧化铝能使糖基化的紫杉醇转化为紫杉醇,从而增加了紫杉醇 的总量,使紫杉醇的回收率可能大于100%。我们的实验也发现了这一现象,这一现象的确切 原因还有待于深入探索。   2.5 制备薄层层析   硅胶薄层层析(TLC)原理与硅胶柱层析原理一致。TLC可将样品分离出11条以上的色带 ,紫杉醇带在薄板的中部(Rf≈0.5),呈现紫红色。应用TLC纯化紫杉醇,一步可将紫杉醇 含量从0 .65%提高到13.9%,回收率为99.7%。   2.6 预处理的比较   各处理步骤比较如表1。表1中数据可知,以氧化铝柱层析纯化紫杉醇的效率最高。氧化 铝介质便宜,能充分利用有限的红豆杉原料,是一可行的纯化紫杉醇方法。其次是硅胶柱层 析,浸泡好的硅胶半透明,在玻璃层析柱上能观察到层析进展情况,操作很直观。TLC的优点 是设备简单、有机溶剂消耗很少。但TLC处理量较小,工业放大困难。固相萃取的优点体现在 简单、便于自动化、能显著减少溶剂的用量。    表1 预处理步骤对紫杉醇纯化效果的比较 ------------------------------------------------------------------------- 步骤       样品量(mg) 紫杉醇(mg) 纯度(%) 回收率(%) 纯化倍数 粗品       22.50     0.146   0.65   100    1 液-液萃取     11.79     0.145   1.23    99.3   1.9 固相萃取      2.27     0.146   6.44   100    9.9 硅胶柱层析     0.98     0.144   14.63   98.9   22.5 氧化铝柱层析    0.79     0.205   26.3   140.5   40.5 薄层层析      1.05     0.146   13.91   99.7   21.4 -------------------------------------------------------------------------   2.7 初分离工艺的提出   HPLC分析表明,粗品经过氧化铝柱层析处理后,极性比紫杉醇弱的物质基本被除 去,而极性比紫杉醇稍强的杂质用正相柱已很难分离。仅经一步正相柱层析,样品中 的成分还较复杂,若直接上HPLC制备,必将影响HPLC柱的使用寿命、进料量等。因此, 有必要对样品作进一步的处理。较理想的工艺集成是氧化铝正相柱层析处理后采用一 步反相层析,即采用一步C18固相萃取,以除去极性比紫杉醇稍强的杂质。实验结果如 表2,预处理工艺纯化紫杉醇的纯化倍数达60以上,紫杉醇回收率为135.5%,纯度为42.2%。            表2 预处理工艺纯化紫杉醇结果 -------------------------------------------------------------------------- 步骤       样品量(mg) 紫杉醇(mg) 纯度(%) 回收率(%) 纯化倍数 粗品       85.50     0.555   0.65   100   1 氧化铝柱层析    2.99     0.775   25.9    139.7   39.8 固相萃取      1.78     0.752   42.2    135.5   64.9 --------------------------------------------------------------------------   3 结 论   本工艺主要目的是简便除去紫杉醇类似物及其它生物碱,获得初步纯化的紫杉醇。过程 采用价格低谦的氧化铝为层析介质,省略了液-液萃取步骤,简化了分离工艺,提高了分离效 率,有利于工业放大。   氧化铝柱层析处理云南红豆杉针叶浸膏,紫杉醇的回收率大于140%,这使有限的红豆杉 资源能得以充分的利用。   采用优化的初分离工艺,从浸膏中有效地分离出了紫杉醇。样品经此初分离工艺处理后 ,可直接上HPLC制备柱。初分离工艺提取紫杉醇的纯化倍数为64.9,纯度为42.2%。  

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