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用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用

来源:www.sepu.net 作者: 2010-4-20
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摘要: 转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的谷丙转氨酶(GlutamicPyruvicTransaminase,GPT)活性较高,它催化如下反应: α—酮戊二酸+丙氨酸(4)把测定管放沸水浴中煮......


 
    转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中,是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化,此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基酸上。各种转氨酶的活性不同,其中肝脏的谷丙转氨酶(Glutamic  Pyruvic  Transaminase ,GPT)活性较高,它催化如下反应:                     
          α—酮戊二酸 + 丙氨酸 

(4)把测定管放沸水浴中煮5分钟,取出后冷却。
(5)两管皆离心2000rpm 5分钟,把上清夜分别移入小试管中,标清管号,供层析用。
3.层析
把手洗净,操作中尽可能少用手接触滤纸,以免污染。
(1)取圆形滤纸一张(直径10cm)放洁白纸上,以圆点为中心,约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点(见图10-1)。
(2)点样:用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。具体方法是用毛细玻璃管吸取少量液体,点到滤纸点上。注意点样点不宜过大(应在直径0.4cm以下)。如果测定液中氨基酸浓度低时,可在第一次点样点干后,再在原处同样点1~2次。
(3)层析:先在滤纸圆心处打一小孔(铅笔芯粗细),再取同样滤纸一条(约1Χ2.5cm
卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中。
(4)把层析溶剂(酚:水= 4:1溶液)数ml放入干燥的直径约5 cm的表面皿内。
把此皿放在直径10 cm的培养皿中。
(5)把滤纸平放在上述培养皿上,使纸芯下浸入酚液中,盖上培养皿盖(图-2)。
可见酚液沿纸芯上升到滤纸中心,渐向四周扩散。当酚液前缘到离滤纸边缘约1cm时(约30~50分钟),取出滤纸,用镊子小心取下纸芯,并用吹风机吹干滤纸。

4.显色
用喷雾器向上述滤纸均匀喷上0.5 %茚三酮溶液,用吹风机热风吹干,可见出现同心
弧状色斑,用铅笔圈下各色斑。比较各色斑的位置及颜色深浅,并按下列公式计算各色斑的Rf值,以此判定结果。


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