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高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

来源:www.sepu.net 作者: 2010-4-20
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摘要: 高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)。...


    (一) 原理
  根据离子交换原理,将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上,通过增加洗脱液中的离子强度,洗脱并收集蛋白峰。
  (二)操作步骤
  腹水10,000g离心10min,除去细胞和杂质,在4℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液,
  使终浓度为40%饱和硫酸铵
                ↓搅拌20~30min
  离心,沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS,对缓冲液A(PH8.5 20mM Tris缓
  冲液)透析除盐
                ↓4℃过夜
  用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的
  TSK DEAE SPW离子交换层析柱
                ↓
  洗脱流速1ml/min
  0~1min:0→5%缓冲液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸钠)
  1~20min(线性梯度洗脱):5→20%缓冲液B
  20~22min:20→0%缓冲液B
                ↓
         洗脱液用紫外280nm进行监测
                ↓
        收集蛋白峰,进行含量、纯度和活性测定
 
  (三) 试剂和器材
  1. TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5mm, Bio Rad)
  2. 高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)。
  3. PBS,缓冲液A和B
  (四) 注意事项
  1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22μm滤膜过滤。
  2. 在本实验条件下,IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11~12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。

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